专利名称：一种用于控制河道底泥二次污染的固定化复合菌剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于控制河道底泥二次污染的固定化复合菌剂的制备方法。
背景技术：
由于生活污染物的长期沉降、累积，导致城市河道黑臭底泥淤积，城市河道底泥污染是水体黑臭的重要来源，特别是当水体外源污染得到控制后，底泥污染成为水体污染的主要来源。河道底泥中含有大量有机物质、营养物质，耗氧速率高，一般处于强还原环境，底泥二次污染易导致水体中氨氮、亚硝酸盐、硫化物、粪臭素等有害物质含量过高，造成水体“黑臭”，影响城市景观和居民生活。因此控制底泥二次污染，是城市河道水环境改良的重要环节。以往用于控制底泥二次污染的措施主要是疏竣清淤，这种方法成本较高，底泥的再处置也是一个复杂环保难题；通过水体嚗气复氧，可一定程度减少底泥污染，但对较浅的河道易导致底泥再悬浮；在河道中投加微生物制剂，这种方法对增强水体自净能力有一定作用，缺点是在河道中微生物制剂易流失，频繁投加，成本过高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于控制底泥二次污染的固定化复合菌的制备方法。
用于生产本发明所述固定化复合菌的微生物是芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，该菌为杆状、短链，杆端半圆型，革蓝氏阳性；以及光合细菌红假单胞菌属(Rhodpseudomonas sp)的沼泽红假单胞菌(Rhodpseudomonas palustris)，该菌为杆状、光能异养菌，革蓝氏阴性。上述两种微生物在文献中已公开记载(参考文献1.马建华，高杨，牛秀田，等.枯草芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶的纯化及性质研究.中国生物化学与分子生物学报，1999，15(1)79-82；2.崔福绵，石家骥，鲁苗壮.枯草芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶的产生及性质.微生物学报，1999，39(1)60-63；3.孔建，王文夕，赵白鸽，等.枯草芽孢杆菌B-903菌株的研究I.对植物病原菌的抑制作用和防治试验.中国生物防治，1999，15(4)157-161；4.扬柳，张克旭，刘淑云，等.枯草芽孢杆菌D-核糖摇瓶发酵条件的研究.天津轻工业学院学报，2001，(1)11-13；5.顾祖宜，戚蓓静，翁稣颖.沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的分离与鉴定.华东师范大学学报(自然科学版)，1982，(4)77-84；6.郭庆文，吉海平.紫色非硫光合细菌的研究.饲料工业，1994，15(3)36-39；7.祝国琴，姜静颖，刘卫，等.高活性光合细菌的分离培养及应用.水产科学，1994，13(1)6-9.)，其中枯草芽孢杆菌已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.0912，此外还有一系列枯草芽孢杆菌菌株保藏在中国科学院微生物研究所，普通微生物菌种保藏管理中心，例如编号为AS 1.398的菌株。上述两种微生物菌种本发明人也持有，保证可以在本发明申请日起的20年内提供。
本发明是通过以下方式实现的(1)分别制备光合细菌发酵培养液和芽孢杆菌发酵培养液光合细菌发酵培养液的制备选用沼泽红假单胞菌(Rhodpseudomonas palustris)菌种，将菌种接入液体培养基，缺氧条件下光照度1000～3000lx光照培养，温度25～35℃，培养时间48～72小时，获得种子培养液；再按质量分数5％～15％的接种量接入液体培养基放大培养，在缺氧条件下 光照度1000～3000lx光照培养，温度25～35℃，培养时间72～96小时，获得含菌量10×108～20×108个/毫升的光合细菌发酵培养液；所述的液体培养基的配方按质量分数计为氯化铵(NH4Cl)0.10％～0.12％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.02％～0.03％，醋酸钠(CH3COONa)0.40％～0.50％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％～0.07％，氯化钠(NaCl)0.40％～0.50％，氯化钙(CaCl2)0.02％～0.04％，酵母膏0.02％～0.04％，水98.7％～98.99％；芽孢杆菌发酵培养液的制备选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为菌种，将菌种接入经灭菌的种子培养基，在恒温摇床中进行好氧培养，温度30～35℃，培养时间24～48小时，获得种子培养液；按质量分数5％～15％的接种量接入经灭菌的发酵培养基，进行好氧培养，温度30～35℃，培养时间24～48小时，获得含菌量10×108～20×108个/毫升的芽孢杆菌发酵培养液；所述的种子培养基的配方按质量分数计为酵母膏0.10％～0.12％，葡萄糖1.0％～1.5％，柠檬酸钠0.05％～0.06％，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01％～0.02％，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.05％～0.06％，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.01％～0.02％，水98.22％～98.78％；所述的发酵培养基的配方按质量分数计为酵母膏0.10％～0.12％，糖蜜2.0％～2.5％，柠檬酸钠0.05％～0.06％，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01％～0.02％，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.05％～0.06％，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.01％～0.02％，水97.22％～97.78％；(2)制备固定化复合菌剂按质量分数2％～3％光合细菌发酵培养液，质量分数2％～3％芽孢杆菌发酵培养液的接种量，接入固体发酵培养基并拌匀，铺开，厚度为5～10厘米，在光照度200～1000lx下光照培养120～144小时，培养过程中保持温度25～35℃，培养结束后，在60～70℃条件下烘干，并粉碎，获得总含菌量5×108～10×108个/克的复合菌剂；所述的固体发酵培养基的配方按质量分数计为麸皮粉17％～19％，硫酸铵0.5％～1.0％，过磷酸钙0.5％～1.0％；黄腐酸钾0.5％～1.0％，碳酸钙0.5％～1.0％，沸石粉37％～39％，水38％～44％。
本发明固定化复合菌剂用于控制河道底泥二次污染的使用方法
使用时将固定化复合菌剂均匀干撒到污染河道，并沉降到底，使用量为30～90克/米2。
本发明的优点本发明的固定化复合菌剂投入污染河道后，不易流失，不仅发挥微生物菌剂对污染物的降解作用，还可发挥沸石粉对底泥释放污染物的吸附固定作用，达到减少底泥对上覆水体污染的目的。试验表明，使用本发明中开发的固定化复合菌剂，可使底泥对上覆水体的污染释放明显下降。
具体实施例方式
下面仅用本发明实验室分离得到的沼泽红假单胞菌(Rhodpseudomonas palustris)菌株和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株说明本发明的实施方案和效果，但本发明并不限于下述实施例1首先制备固定化复合菌剂，然后在模拟河道中进行应用对比实验。
固定化复合菌剂制备方法如下用沼泽红假单胞菌(Rhodpseudomonas palustris)ZZH-01菌株为菌种，将菌种接入液体培养基，缺氧条件下光照度1000lx光照培养，温度30℃，培养时间72小时，获得种子培养液；再按10％的接种量接入液体培养基放大培养，缺氧条件下光照度1000lx光照培养，温度30℃，培养时间96小时，获得含菌量20×108个/毫升的光合细菌发酵培养液。光合细菌液体培养基的配方按质量分数计为氯化铵(NH4Cl)0.11％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.025％，醋酸钠(CH3COONa)0.45％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.06％，氯化钠(NaCl)0.45％，氯化钙(CaCl2)0.03％，酵母膏0.03％，水98.845％。
用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC-01菌株为菌种，将菌种接入经灭菌的种子培养基，在恒温摇床中进行好氧培养，温度35℃，培养时间48小时，获得种子培养液；按质量分数10％的接种量接入经灭菌的发酵培养基，进行好氧培养，温度35℃，培养时间48小时，获得含菌量15×108个/毫升的芽孢杆菌发酵培养液。芽孢杆菌种子培养基的配方按质量分数计为酵母膏0.11％，葡萄糖1.20％，柠檬酸钠0.05％，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01％，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.05％，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.01％，水98.57％。芽胞杆菌发酵培养基的配方按质量分数为酵母膏0.11％，糖蜜2.2％，柠檬酸钠0.05％，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01％，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.05％，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.01％，水97.57％。
按质量分数2％光合细菌发酵培养液，质量分数2％芽孢杆菌发酵培养液的接种量，接入固体发酵培养基并拌匀，在清洁水泥地面上铺开，厚度约为5厘米，在光照度200lx光照培养120小时，保持温度30℃，培养结束后，在70℃条件下烘干，并粉碎，获得总含菌量9×108个/克的固定化复合菌剂。固体发酵培养基的配方按质量分数为麸皮粉18％，硫酸铵0.5％，过磷酸钙1.0％，黄腐酸钾0.5％，碳酸钙1.0％，沸石粉39％，水40％。
模拟河道为水族箱改建，长100厘米，宽40厘米，高50米，污染底泥取自广州受污染内河涌，污染底泥厚度5厘米，上覆水量(自来水)120升，配有循环水泵，循环流量5升/小时。实验时，设一实验组，另一组为对比组。实验组施加复合菌剂90克/米2，对比组不施加固定化复合菌剂，经6天运行，对比组上覆水体中耗氧有机物CODcr含量上升到68毫克/升，氨氮上升到4.1毫克/升，硫化物上升到0.09毫克/升，而实验组上覆水体中耗氧有机物CODcr为31毫克/升，氨氮为1.0毫克/升，硫化物为零。投加复合菌剂可明显减少底泥对上覆水体的污染。
实施例2用沼泽红假单胞菌(Rhodpseudomonas palustris)ZZH-02菌株为菌种，将菌种接入液体培养基，缺氧条件下光照度2000lx光照培养，温度25℃，培养时间48小时，获得种子培养液；再按质量分数5％的接种量接入液体培养基放大培养，缺氧条件下光照度1000lx光照培养，温度25℃，培养时间72小时，获得含菌量10×108个/毫升的光合细菌发酵培养液。光合细菌液体培养基的配方按质量分数计为氯化铵(NH4Cl)0.10％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.02％，醋酸钠(CH3COONa)0.40％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％，氯化钠(NaCl)0.40％，氯化钙(CaCl2)0.02％，酵母膏0.02％，水98.99％。
用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC-02菌株为菌种，将菌种接入经灭菌的种子培养基，在恒温摇床中进行好氧培养，温度30℃，培养时间24小时，获得种子培养液；按质量分数5％的接种量接入经灭菌的发酵培养基，进行好氧培养，温度30℃，培养时间24小时，获得含菌量10×108个/毫升的芽孢杆菌发酵培养液。芽孢杆菌种子培养基的配方按质量分数计为酵母膏0.10％，葡萄糖1.0％，柠檬酸钠0.06％，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.02％，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.06％，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.02％，水98.74％。芽胞杆菌发酵培养基的配方按质量分数计为酵母膏0.10％，糖蜜2.0％，柠檬酸钠0.06％，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.02％，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.06％，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.02％，水97.74％。
按质量分数3％光合细菌发酵培养液，质量分数3％芽孢杆菌发酵培养液的接种量，接入固体发酵培养基并拌匀，在清洁水泥地面上铺开，厚度约为10厘米，在光照度500lx光照培养120小时，保持温度25℃，培养结束后，在60℃条件下烘干，并粉碎，获得总含菌量5×108个/克的固定化复合菌剂。固体发酵培养基的配方按质量分数计为麸皮粉17％，硫酸铵1.0％，过磷酸钙0.5％，黄腐酸钾1.0％，碳酸钙0.5％，沸石粉37％，水43％。
如实施例1在模拟河道中进行应用对比实验，所不同之处，是将固定化复合菌剂投加量为60克/米2，经6天运行，对比组上覆水体中耗氧有机物CODcr为68毫克/升，氨氮为4.1毫克/升，硫化物为0.09毫克/升，而实验组上覆水体中耗氧有机物CODcr39毫克/升，氨氮1.1毫克/升，硫化物为0.01毫克/升，投加固定化复合菌剂对控制底泥污染具有较好效果。
实施例3用沼泽红假单胞菌(Rhodpseudomonas palustris)ZZH-03菌株为菌种，将菌种接入液体培养基，缺氧条件下光照度3000lx光照培养，温度35℃，培养时间72小时，获得种子培养液；再按15％的接种量接入液体培养基放大培养，缺氧条件下光照度3000lx光照培养，温度35℃，培养时间96小时，获得含菌量20×108个/毫升的光合细菌发酵培养液。光合细菌液体培养基的配方按质量分数计为氯化铵(NH4Cl)0.12％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.03％，醋酸钠(CH3COONa)0.5％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.07％，氯化钠(NaCl)0.5％，氯化钙(CaCl2)0.04％，酵母膏0.04％，水98.7％。
用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KC-03菌株为菌种，将菌种接入经灭菌的种子培养基，在恒温摇床中进行好氧培养，温度35℃，培养时间48小时，获得种子培养液；按质量分数15％的接种量接入经灭菌的发酵培养基，进行好氧培养，温度35℃，培养时间48小时，获得含菌量20×108个/毫升的芽孢杆菌发酵培养液。芽孢杆菌种子培养基的配方按质量分数计为酵母膏0.12％，葡萄糖1.5％，柠檬酸钠0.05％，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01％，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.05％，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.01％，水98.26％。芽胞杆菌发酵培养基的配方按质量分数为酵母膏0.12％，糖蜜2.5％，柠檬酸钠0.05％，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01％，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.05％，氯化钙(CaCl2·2H2O)0.01％，水97.26％。
按质量分数3％光合细菌发酵培养液，质量分数3％芽孢杆菌发酵培养液的接种量，接入固体发酵培养基并拌匀，在清洁水泥地面上铺开，厚度约为10厘米，在光照度1000lx光照培养144小时，保持温度35℃，培养结束后，在70℃条件下烘干，并粉碎，获得总含菌量10×108个/克的固定化复合菌剂。固体发酵培养基的配方按质量分数计为麸皮粉19％，硫酸铵0.5％，过磷酸钙1.0％，黄腐酸钾0.5％，碳酸钙1.0％，沸石粉39％，水39％。
按实施例1在模拟河道中进行应用对比实验，所不同之处，是将固定化复合菌剂投加量减为30克/米2，经6天运行，对比组上覆水体中耗氧有机物CODcr为68毫克/升，氨氮为4.1毫克/升，硫化物为0.09毫克/升，而实验组上覆水体中耗氧有机物CODcr40毫克/升，氨氮1.5毫克/升，硫化物为零，投加固定化复合菌剂对控制底泥污染作用明显。
权利要求
1.一种用于控制河道底泥二次污染的固定化复合菌剂的制备方法，其特征包括(1)分别制备光合细菌发酵培养液和芽孢杆菌发酵培养液光合细菌发酵培养液的制备选用沼泽红假单胞菌(Rhodpseudomonas palustris)菌种，将菌种接入液体培养基，缺氧条件下光照度1000～3000lx光照培养，温度25～352，培养时间48～72小时，获得种子培养液；再按质量分数5％～15％的接种量接入液体培养基放大培养，在缺氧条件下光照度1000～3000lx光照培养，温度25～35℃，培养时间72～96小时，获得含菌量10×108～20×108个/毫升的光合细菌发酵培养液；所述的液体培养基的配方按质量分数计为氯化铵NH4Cl 0.10％～0.12％，磷酸氢二钾K2HPO40.02％～0.03％，醋酸钠CH3COONa 0.40％～0.50％，硫酸镁MgSO4·7H2O0.05％～0.07％，氯化钠NaCl 0.40％～0.50％，氯化钙CaCl20.02％～0.04％，酵母膏0.02％～0.04％，水98.7％～98.99％；芽孢杆菌发酵培养液的制备选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为菌种，将菌种接入经灭菌的种子培养基，在恒温摇床中进行好氧培养，温度30～35℃，培养时间24～48小时，获得种子培养液；按质量分数5％～15％的接种量接入经灭菌的发酵培养基，进行好氧培养，温度30～35℃，培养时间24～48小时，获得含菌量10×108～20×108个/毫升的芽孢杆菌发酵培养液；所述的种子培养基的配方按质量分数计为酵母膏0.10％～0.12％，葡萄糖1.0％～1.5％，柠檬酸钠0.05％～0.06％，硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.01％～0.02％，硫酸锰MnSO4·H2O 0.05％～0.06％，氯化钙CaCl2·2H2O0.01％～0.02％，水98.22％～98.78％；所述的发酵培养基的配方按质量分数计为酵母膏0.10％～0.12％，糖蜜2.0％～2.5％，柠檬酸钠0.05％～0.06％，硫酸亚铁FeSO4·7H2O 0.01％～0.02％，硫酸锰MnSO4·H2O 0.05％～0.06％，氯化钙CaCl2·2H2O 0.01％～0.02％，水97.22％～97.78％；(2)制备固定化复合菌剂按质量分数2％～3％光合细菌发酵培养液，质量分数2％～3％芽孢杆菌发酵培养液的接种量，接入固体发酵培养基并拌匀，铺开，厚度为5～10厘米，在光照度200～1000lx下光照培养120～144小时，培养过程中保持温度25～35℃，培养结束后，在60～70℃条件下烘干，并粉碎，获得总含菌量5×108～10×108个/克的复合菌剂；所述的固体发酵培养基的配方按质量分数计为麸皮粉17％～19％，硫酸铵0.5％～1.0％，过磷酸钙0.5％～1.0％；黄腐酸钾0.5％～1.0％，碳酸钙0.5％～1.0％，沸石粉37％～39％，水38％～44％。
全文摘要
本发明涉及一种用于控制河道底泥二次污染的固定化复合菌剂的制备方法，其特征包括分别制备光合细菌发酵培养液和芽孢杆菌发酵培养液，以及在固体发酵培养基中制备固定化复合菌剂。本发明的固定化复合菌剂投入污染河道后，不易流失，不仅发挥微生物菌剂对污染物的降解作用，还可发挥沸石粉对底泥释放污染物的吸附固定作用，达到减少底泥对上覆水体污染的目的。试验表明，使用本发明中开发的固定化复合菌剂，可使底泥对上覆水体的污染释放明显下降。
文档编号C12N1/20GK1690190SQ200410026930
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月21日 优先权日2004年4月21日
发明者陈繁忠, 徐文新, 盛彦清, 傅家谟 申请人:中国科学院广州地球化学研究所