专利名称：重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法
技术领域：
本发明涉及药用蛋白物质的制备，尤其涉及利用基因工程菌进行目的蛋白制备的方法，特别涉及重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的制备方法。
背景技术：
肿瘤是严重威胁人类生命的常见病和多发病，患者的高致死率占全死因的第二位。但是，历经数十年临床应用的反馈数据表明，虽然化疗是目前首选的抗肿瘤方案，但是大多数抗肿瘤化疗药物存在两个严重的问题对正常细胞的强毒副作用和肿瘤细胞的耐药性，造成肿瘤患者不能得到有效治疗。传统化疗药物杀伤肿瘤的同时，“敌我不分”，对正常细胞具有强烈的毒副作用，对造血系统和免疫系统造成极大损害。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis inducing ligand，简称TRAIL)最早由Wiley实验室于1995年克隆并命名(Wiley SR，Schooley K，Smolak PJ，et al，Identification and characterizations of a new member of the TNF family that inducesapoptosis，Immunity，1995，3673-682)。人的TRAIL基因定位于3号染色体长臂2区6带(3q26)，其转录体为1.8-2.0kb，分子量32.5kDa，理论等电点为7.63。TRAIL蛋白是一种典型的跨膜糖蛋白，其中胞浆区有17个氨基酸残基，跨膜区有21个氨基酸残基，胞外区有243个氨基酸残基。
TRAIL在体内多种组织中广泛表达，如脾、肺、前列腺、肝、肾、心脏、骨骼肌、小肠、结肠和外周血淋巴细胞等，其中在脾、肺和前列腺中表达量最高，但在脑组织中未见表达。TRAIL蛋白与受体结合后能够诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有毒害作用。体外活性分析表明，多种肿瘤细胞株，包括大肠、肺、乳腺、中枢神经系统、肾、恶性黑色素瘤等对TRAIL的刺激有应答，与对照比较，对肿瘤细胞生长的抑制率可达50～100％。因此，TRAIL显示了潜在的临床应用前景，TRAIL将开辟肿瘤治疗的新篇章。
目前，世界上大多数治疗性蛋白药物都是采用大肠杆菌作为宿主表达，主要是由于技术成熟，表达稳定。而作为大肠杆菌高密度表达通常以没有活性的包涵体形式产生，需要变性、复性。变性复性过程中存在蛋白错配、复性率低、操作繁琐和时间较长等不足，已经成为世界性技术难题。
中国专利申请02104519.4“肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体胞外区突变多肽及其制法与用途”中公开了一种基因重组的工程菌rsTRAIL96-281-pET15b-BL21(DE3)CGMCC No.0659，并提到了采用该工程菌制备可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的实验室方法，也提到了可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在人体抗肿瘤药物中的潜在应用前景。
TRAIL要真正应用于制药，造福人类，为肿瘤患者减轻痛苦，产业化生产是必经之路。而目前TRAIL还处于实验室研究阶段，未见有中试和产业化方面的报道。
发明内容
本发明目的在于满足生物医药产业化的需要，而提出一种能够实现工业化生产的TRAIL制备方法。
本发明实现上述目的所采用的技术方案是，提出一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，包括步骤a.选用工程菌rsTRAIL96-281-pET15b-BL21(DE3)CGMCC No.0659做菌株进行发酵培养，还包括步骤b.对发酵培养所得菌体进行洗涤和超声破碎；c.对破碎所得菌体物质进行盐析处理；d.对盐析处理所得菌体物质进行层析纯化处理；e.对层析纯化处理所得菌体物质进行缓冲液体系更换处理。
同现有技术相比较，采用本发明的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，可以实现TRAIL蛋白的工业化生产，为TRAIL蛋白的实际应用提供可能。
具体实施例方式
以下对本发明予以进一步详尽说明。
本发明的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，包括步骤a.选用工程菌rsTRAIL96-281-pET15b-BL21(DE3)CGMCC No.0659做菌株进行发酵培养，还包括步骤b.对发酵培养所得菌体进行洗涤和超声破碎；c.对破碎所得菌体物质进行盐析处理；d.对盐析处理所得菌体物质进行层析纯化处理；e.对层析纯化处理所得菌体物质进行缓冲液体系更换处理。
所述步骤b包括子步骤①.在发酵所得菌体中加入含NaCl的Tris·Cl[三(羟甲基)氨基甲烷盐酸]溶液，进行离心处理，获取菌体沉淀；②.在菌体沉淀中加入含EDTANa2(乙二胺四乙酸二钠)和DTT(二巯基苏糖醇)的Tris·Cl溶液，搅拌均匀；③.进行超声破碎，直至菌体破碎率达到98％以上；④.进行离心处理，上清即为破碎所得菌体物质。
所述步骤c包括在破碎所得菌体物质中加入(NH4)2SO4(硫酸铵)，使(NH4)2SO4饱和度达到60％，搅拌至全部溶解，静置30分钟以上，进行离心处理，沉淀即为盐析处理所得菌体物质。
所述步骤d包括子步骤①.在盐析处理所得菌体物质中加入Tris·Cl溶液，离心处理，保留上清；②.上Octyl 4 Fast Flow疏水柱，收集穿柱峰；i.对收集物进行分子筛凝胶层析柱脱盐处理；③.上Q-Sepharose-Fast Flow阴离子交换层析柱，收集20％盐浓度目的峰；ii.对收集物进行分子筛凝胶层析柱脱盐处理；④.上Source30Q阴离子交换层析柱，收集8％盐浓度目的峰。
所述步骤e包括①.对层析纯化处理所得菌体物质进行分子筛凝胶层析处理；②.把层析纯化处理所得菌体物质中的缓冲液转换为Na2HPO4-NaH2PO4(磷酸氢二钠-磷酸二氢钠)溶液。
采用本发明方法进行制备，最终可得到纯度达到95％以上的可溶性活性蛋白，该TRAIL蛋白可应用于制备抗肿瘤药品。
以下给出本发明制备方法整个过程一个具体实施例洗涤把发酵培养获得的工程菌rsTRAIL96-281-pET15b-BL21(DE3)CGMCC No.0659菌体(简称TRAIL菌体)放入离心杯，每一离心杯加入80g菌体和800-900ml溶液A，用玻璃棒搅拌均匀；将混匀液进行离心，离心机型号为BECKMAN J6-HC，离心参数为4000rpm，30min，15℃，保留离心后沉淀，称重；将洗好的菌体放置于-50℃冰柜中保存；超声破碎称量200g-50℃冰柜中保存的TRAIL菌体，加1000ml溶液B，用组织捣碎机搅拌10min使其混匀；用一容器装入碎冰及少量水，将盛有菌体的烧杯放入其中；将超声探头浸入混合液，距烧杯底部1cm，开始超声破碎，超声强度800W 60s/次，共超声30次，控制温度≤13℃，每次超声后搅拌使其均匀；将破碎混合液离心，条件为14000rpm，40min，15℃，保留上清，弃沉淀，测体积；盐析处理依据0-25％(饱和度)14.4g(NH4)2SO4/100ml上清液25％-60％ 22.7g(NH4)2SO4/100ml上清液第一步0-25％，按比例将称量好的(NH4)2SO4固体加入到超声破碎上清液中，搅拌至全部溶解，室温静置30min。将混合液离心，离心条件12000rpm，30min，15℃，保留上清，弃沉淀，测体积；第二步25％-60％，按比例将称量好的(NH4)2SO4固体加入到25％饱和度离心后上清液中，搅拌至全部溶解，室温静置30min。将混合液离心，离心条件，12000rpm，30min，15℃，保留沉淀，弃上清；层析纯化处理对60％盐析沉淀的溶解量取1000ml溶液C和40ml溶液D，倒入烧杯混匀，将60％盐析沉淀转入烧杯，搅拌至溶解。将混合液离心，离心条件12000rpm，30min，15℃，弃沉淀，保留上清；上Octyl 4 Fast Flow疏水柱规格BPG 100/12 CV(柱体积)＝900ml；用溶液C平衡柱子，流速30ml/min，平衡4-5个柱体积；以30ml/min上盐析制备样品；以30ml/min，用溶液C继续淋洗；收集穿透样品(UV0.5-0.5，紫外监测器型号为8823A-UV，北京市新技术应用研究所提供，以下同)；经Sephadex G25层析柱脱盐规格Φ100/30 CV＝2400ml；以40ml/min，用溶液D液平衡柱子，平衡1-1.5个柱体积；以40ml/min上疏水样品；收集第一个峰；至走完1个柱体积，结束操作；上Q-Sepharose-Fast Flow阴离子交换层析柱规格XK50/10，CV＝200ml；以40ml/min，先用溶液E走1个柱体积，再用溶液D平衡柱子，5-8个柱体积；以40ml/min上G25脱盐样品；以40ml/min，用溶液D淋洗2个柱体积；以40ml/min，先用10％溶液E洗脱2个柱体积，再用20％溶液E洗脱，收集20％洗脱峰样品(UV0.3-0.3)；经Sephadex G25层析柱脱盐规格Φ100/21 CV＝1650ml；以40ml/min，用溶液D液平衡柱子，平衡1-1.5个柱体积；以40ml/min上Q-Sepharose-Fast Flow阴离子交换层析获得的20％洗脱峰样品；收集第一个峰；至走完1个柱体积结束操作；上Source30Q阴离子交换层析柱规格XK26/11 CV＝55ml；以20ml/min，先用溶液E平衡1个柱体积，再用溶液D平衡柱子，8-10个柱体积；以20ml/min上G25脱盐样品的1/2；以20ml/min，用溶液D淋洗2个柱体积；设定盐梯度8％，收集样品(UV0.3-0.3)；用溶液E洗脱1个柱体积，用溶液D平衡至基线，重复上述操作，进行第二次洗脱。
过Superdex 75凝胶层析规格XK50/85，CV＝1700ml；以F液平衡2个柱体积；以4.0ml/min上Source30Q样品，上样体积≤50ml；收集第一个峰，测量体积；获得目的蛋白经SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶)鉴定为一条带，单体分子量为21kDa，等电点为7.2，HPLC显示一个主峰。
经上述制备过程，采用200g的TRAIL菌体，可得到1000mg以上的TRAIL可溶性活性蛋白，该TRAIL蛋白除去了热原，可应用于制备人体抗肿瘤药品。
上述制备过程提到的有关溶液的定义A30mM Tris·Cl，0.9％NaCl，pH8.0；B50mM Tris·Cl，5mM EDTANa2，1mM DTT，pH8.5C30mM Tris·Cl，1.1M(NH4)2SO4D30mM Tris·Cl，pH8.5；E30mM Tris·Cl，1M NaClF100mM Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.3。
以上所述之最佳实施例意在具体说明本发明之设计思路通过选用特定的工程菌和特定的层析纯化工艺组合，以达到提纯TRAIL可溶性活性蛋白，并除去了热原和更换缓冲液体系，使得制备物可应用于制备人体抗肿瘤药品。本发明之实施，并不限于以上最佳实施例所公开的方式，凡基于本发明之设计思路，进行简单推演与替换，得到的具体的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备实施方式，都属于本发明的具体实施。
权利要求
1.一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，包括步骤a.选用工程菌rsTRAIL96-281-pET15b-BL21(DE3)CGMCC No.0659做菌株进行发酵培养，其特征在于，还包括步骤b.对发酵培养所得菌体进行洗涤和超声破碎；c.对破碎所得菌体物质进行盐析处理；d.对盐析处理所得菌体物质进行层析纯化处理。
2.如权利要求1所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，其特征在于，还包括步骤e.对层析纯化处理所得菌体物质进行缓冲液体系更换处理。
3.如权利要求1所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，其特征在于，所述步骤b包括子步骤①.在发酵所得菌体中加入含NaCl的Tris·Cl溶液，进行离心处理，获取菌体沉淀；②.在菌体沉淀中加入含EDTANa2和DTT的Tris·Cl溶液，搅拌均匀；③.进行超声破碎，直至菌体破碎率达到98％以上；④.进行离心处理，离心上清液即为破碎所得菌体物质。
4.如权利要求1所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，其特征在于，所述步骤c包括在破碎所得菌体物质中加入(NH4)2SO4，使(NH4)2SO4饱和度达到60％，搅拌至全部溶解，静置30分钟以上，进行离心处理，沉淀即为盐析处理所得菌体物质。
5.如权利要求1所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，其特征在于，所述步骤d包括子步骤①.在盐析处理所得菌体物质中加入Tris·Cl溶液，进行离心处理，保留上清；②.上疏水柱，收集穿柱峰；③.上第一阴离子交换层析柱，收集20％盐浓度目的峰；④.上第二阴离子交换层析柱，收集8％盐浓度目的峰。
6.如权利要求5所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，其特征在于所述子步骤②和③之间还包括子步骤i.对收集物进行分子筛凝胶层析柱脱盐处理。
7.如权利要求6所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，其特征在于所述子步骤③和④之间还包括子步骤ii.对收集物进行分子筛凝胶层析柱脱盐处理。
8.如权利要求5所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，其特征在于所述子步骤②中疏水柱介质为Octyl 4 Fast Flow；所述子步骤③中第一阴离子交换层析柱介质为Q-Sepharose-Fast Flow；所述子步骤④中第二阴离子交换层析柱介质为Source30Q。
9.如权利要求2所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，其特征在于所述步骤e包括①.对层析纯化处理所得菌体物质进行分子筛凝胶层析处理；②.把层析纯化处理所得菌体物质中的缓冲液更换为Na2HPO4-NaH2PO4溶液。
10.如权利要求9所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体制备方法，其特征在于制得的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白纯度大于95％。
全文摘要
一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)制备方法，包括步骤a.选用工程菌rsTRAIL96－281－pET15b－BL21(DE3)CGMCC No.0659做菌株进行发酵培养，还包括步骤b.对发酵培养所得菌体进行洗涤和超声破碎；c.对破碎所得菌体物质进行盐析处理；d.对盐析处理所得菌体物质进行层析纯化处理；e.对层析纯化处理所得菌体物质进行缓冲液体系更换处理。同现有技术相比较，采用本制备方法，可以实现TRAIL蛋白的工业化生产，为TRAIL蛋白的实际应用提供可能。
文档编号C12P21/00GK1696304SQ20041002717
公开日2005年11月16日 申请日期2004年5月13日 优先权日2004年5月13日
发明者李政海, 胡家华, 田宾, 李继东 申请人:深圳新鹏生物工程有限公司