专利名称：番茄溃疡病菌的检测基因及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明番茄溃疡病菌的检测基因及其检测试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，尤其是对番茄溃疡病菌Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis(Cmm)的检测。专用于番茄溃疡病菌的田间预防及海关植物检疫的Cmm的快速检测。
二、技术背景番茄溃疡病是我国的三类危险性病害。1909年首次由Erwin F.Smith在美国的密歇根州发现，现在北美洲、南美洲、非洲、澳大利亚、新西兰、亚洲，中国的新疆和北京地区均报道有发生，除危害番茄外，还可以危害辣椒、龙葵等茄科植物。番茄溃疡病菌属于革兰氏阳性菌，可侵染番茄及其他茄科植物的种子、根、茎杆或子叶。番茄溃疡病菌存在两种侵染方式一种是通过表面侵染，可引起叶片边缘的坏死和果实斑。在田间叶片边缘坏死症状最普遍。果实斑点俗称鸟眼斑，在相对温度高的条件下病情会扩展，病斑最初为白色，白斑逐渐发展形成一个坏死中心，一般直径在3-6mm，中心有褐色凸起。鸟眼斑作为番茄溃疡病的一个典型症状常用来鉴定该病害。此外还可以通过维管束侵染，引起系统性病害。病植株常表现为萎蔫症状，维管束组织变褐，髓部形成空腔。最近研究发现，在花期两天后，番茄溃疡病菌还可以通过番茄花侵染。每年此病害能在世界范围内造成很大的经济损失。
到目前为止该病害还没有特别有效的化学药剂或抗性品种来防治此病害。由于Cmm可以借种子传播，目前各国主要通过种子检疫来控制此病害。全世界的学者都认为，有必要建立一种准确率和灵敏度高的快速检测方法来检测Cmm，尤其对无症状植株和种子的检测，提前预防病菌的扩散，建立预警系统，及早扑灭病菌，提出防治策略。番茄溃疡病菌在我国只有局部地区发生，因此我国要严格限制或禁止从发生番茄溃疡病害的国家或地区进口或调运番茄种子、果实和植株。从其他国家进口的种子和果实必须进行有关的检验。目前Cmm具体检验手段主要是(1)症状观察，但只能作为初步检验，做出初步判断；(2)分离、纯化培养病原菌，进行革蓝氏、鞭毛染色和生理生化反应特性测定。对于Cmm还可以使用D2和SCM两种选择性培养基作为分离培养基(参考文献)。(3)利用BIOLOG鉴定系统来检测。BIOLOG鉴定系统是一种快速、相对准确且标准化程度高的鉴定系统，主要根据细菌鉴定对95种碳源的利用情况，将结果经计算机处理后并与数据库内已知的细菌比较，实现对待测菌的快速鉴定及检测。但此系统对Cmm来说，只能在种水平上进行鉴定，而且还需对病原菌先进行分离。(4)血清学方法酶联免疫方法和多克隆抗体免疫荧光法。有人在实验中制备几种来源的的单克隆抗体，进行ELISA检测。结果表明除两个无致病性菌株NCPPB254和NCPPB861外与所有的Cmm菌株都发生了反应。此外还与所有的C.michiganensis亚种和棒形细菌中的一些腐生菌也发生了反应。由于C.michiganensis不同亚种的抗原决定位点都普遍相似，造成交叉反应非常明显。ELISA只能检测到104CFU纯培养菌体，且只能从表现症状的植物组织中检测到Cmm。事实上用于检测Cmm筛选出的单克隆或多克隆抗体在特异性和灵敏度上都存在缺陷，十分影响其阳性鉴定。
最近的一个可选择的检测方法是分子生物学方法。在国外已有许多较好的例子应用。德国曾报道对不同的Cmm菌株的质粒作标记，分析发现他们都存在一个共同的致病基因CelA，该基因分别存在两个质粒上PCM1和PCM2。在研究过程中他们还发现由CelA基因编码的一段Pat-1区域，对Cmm菌株具有特异鉴别性，然后根据此片段的序列设计出一对特异性引物，可以特异的鉴别所有的Cmm菌株，而其它细菌均无反应。(参考)众所周知，危险性植物病原菌的检测、鉴定方法要求灵敏、特异、快速。目前，病原菌检测技术繁多，各国主要采用选择培养基法、凝集和免疫荧光检测及血清检测等方法进行检疫控制病害的传播。由于这些检测鉴定方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定，很难在成功检测到病菌，不适宜广泛应用。
随着近年来我国口岸进口番茄果实、种子的增多以及国内蔬菜的大量调运，势必增加该病菌由疫区传入非疫区的危险性，但我国口岸缺乏必要的对该病菌的检测方法。病害防治、预测、预报及植物检疫需要有准确快速的病菌检测技术，尤其是需要我国拥有自主知识产权的检测方法，从而可以将之投入到商业生产和应用中。目前在这一领域还没有一种灵敏、特异性强、简便快速检测Cmm方法所属技术领域的报道。
发明内容
技术问题 本发明的目的是克服现有的植物病原菌检测方灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足，提供番茄溃疡病菌的检测基因及其检测试剂盒，克隆Cmm的一段位于16S-23SrDNA间的ITS序列，并以此设计出一对Cmm的特异性引物和其检测试剂盒，使用该试剂盒达到对样本中Cmm的快速准确检测。
技术方案番茄溃疡病菌(Cmm)的检测基因，其特征在于，Cmm的ITS全序列为516bp1 AGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGAT CACCTCCTTTCTAAGGAGCA61 TGTGCACCTCTCCTCTGTATACAGGGAGATCAAGGGTGCC AAGTCACGCGTCAGGCGTCT121 GTTCTGGCGGTGGCGCTCATGGGTGGAACATTGACATTGA TGCCGGCTGATGTGTCGGGC181 TGCTAGTACGCCTCCTTGTGGGGTGGGAACGTGGTCTGGT GTGTCGAGGGCATGTTGCAC241 GCTGTTGGGTCCTGAGGGACCGGGCCGCACCTTTTGGGTG TGTCTGGTTTCTTGTCGGAC301 CCTTTCCGTCGTCCTGTTGTGGATGGTGGTGGGGTACCGC CCGTATATTGAGAACTACAC241 GCTGTTGGGTCCTGAGGGACCGGGCCGCACCTTTTGGGTG TGTCTGGTTTCTTGTCGGAC301 CCTTTCCGTCGTCCTGTTGTGGATGGTGGTGGGGTACCGC CCGTATATTGAGAACTACAC361 AGTGGACGCGAGCATCTTAGATTCACCGGTTTTCCGGTGG ATCACAAAGATCTATTTATA421 GATCATTGGTCAATTCTGTCTCCCTTCGGGGAGGCGAAAC GATTCAATCTCATGTGATTT481 CAAGATTCTAAGGGCAAACGGTGGATGCCTTGGCAC上述番茄溃疡病菌(Cmm)的检测基因，其特征在于，其检测引物序列为CmmF15‘-CCTTTCCGTCGTCCTGTTGT-3’CmmR25‘-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3’上述番茄溃疡病菌(Cmm)的检测基因的检测试剂盒，包括管号 名称浓度1 超纯水 99％～100％2 PCR反应缓冲液9×～10×3 dNTPs9mM～10mM4 Mg2+20mM～25mM5 阳性对照DNA 95ng/μl～100ng/μl6 DNA marker 2Kb7 上样缓冲液 5×～6×8 正向引物(CmmF1) 20μM～25μM9 反向引物(CmmR2) 20μM～25μM使用该试剂盒对参试细菌进行PCR扩增，Cmm产生分子量为425bp的特异性扩增产物。
有益效果本发明番茄溃疡病菌的检测基因及其检测试剂盒，涉及一种检测危险性植物病原菌的分子技术，尤其是能快速、简便、准确的检测病原菌的试剂盒，在36h内就可以完成检测。
本发明提供了一种依赖PCR的分子检测试剂盒，克服现有的植物病原菌检测方灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足该试剂盒能快速、灵敏、准确的检测到病原菌，并直接可从植物种子、组织中检测病原菌。大大简化了检测程序，提高了我国口岸的检疫水平，同时为病害防治策略的制定提供了依据。
通过对番茄溃疡病菌的特异性检测，引物CmmF1-CmmR2和优化的PCR条件对目标菌和其他44个供试菌株进行特异性扩增，只有目标菌株扩增得到了一段长425bp的PCR产物，其他三个致病变种和腐生菌等无扩增产物。本检测试剂盒的使用，引物CmmF1/CmmR2可以稳定地扩增Cmm得到分子量为425bp的特异性产物，可以特异的检测目标菌。
通过灵敏度的检测，利用不同浓度的Cla模板DNA(10ng-1pg)进行灵敏性检测，Cff最低检出量是50pg纯DNA或3×102CFU/ml细胞。
通过对大豆植株、蕃茄植株种子、海关进口的Cmm其它寄主种子等的检测，准确稳定地电泳检测到目标菌425bp的清晰产物(呈阳性反应)。
四
图1是本试剂盒的检测原理图。
图2是通用引物U1/U2对16个测序棒形细菌菌株的扩增结果1-16依次代表2607、6165、2566、2594、2632、3496、2626、7221、MH、1369、3298、2550、1373、1372、1371、1370图3是引物CmmF1/引物CmmR2对44个供试菌的扩增结果电泳图。
泳道序列(上排1-25)2632、1349、2584、20135、6887、2594、2566、15828、15830、15831、49174、19096、Marker2Kb DNA ladder、1370、1371、1372、1373、2550、BR、T30、Pn-2、A6、JM101、Ga、Ck(下排1-25)5833、6162、6163、6164、6165、10002T、2607、1483、9667T、MH、2621、1369、Marker2Kb DNA ladder、1370、1371、1372、1373、2550、3298、9666T、7221、2574、Ta-10、2626、3496图4是目标菌的灵敏性检测Marker2Kb DNA ladder；10ng，9ng，8ng，7ng，6ng，5ng，4ng，3ng，2ng，1ng，100pg，50pg，10pg，5pg，1pg，0.1pg
五具体实施例方式
实施例1Cmm的特异性引物CmmF1-CmmR2的PCR扩增。通过原核生物ITS通用引物U1/U2(5’-GTGGATCACCTCCTTC-3’；5’-TTCGCTCGCCCTAC-3’)，分别对Cmm及其它相关细菌和对照细菌的基因组DNA进行PCR扩增，均得到了一条长度为700bp左右的PCR产物(图1)。这些细菌包括萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种Curtobacterium flaccumfaciens pv.flaccumfaciens(ICMP2584)，萎蔫短小杆菌甜菜致病变种Cur.f.pv.betae(ICMP2594)，萎蔫短小杆菌奥氏致病变种Cur.f.pv.oortii(ICMP 2632)，萎蔫短小杆菌一品红致病变种Cur.f.pv.poinsettiae(ICMP2566)；密执安棒形杆菌密执安亚种Clavibacter michiganensis subsp.Michiganensis(ICMP 2550，JCM1370、1371、1372、1373)；带化红球菌Rhodococcusfascians(JCM6165)；密执安棒形杆菌内布拉斯亚种Cl.michiganensis subsp.nebraskensis(ATCC3298)；密执安棒形杆菌诡谲亚种Cl.michiganensis subsp.insidisus(JCM1369)；密执安棒形杆菌花叶亚种Cl.michiganensis subsp.tesselarius(ATCC7221)；密执安棒形杆菌环腐亚种Cl.michiganensis subsp.sepedonicus(JCM1483)；美国冬青节杆菌Arthobacter ilicis(ICMP2607)；小麦棒形杆菌Cl.tritici(ICMP2626)。
将PCR产物进行回收，并连接到PUC-T载体中，转化到大肠杆菌JM110感受态细胞中，进行测序，获得所有的参试菌株的ITS序列。其中Cmm的ITS全序列(SEQ ID NO.1)为(516bp)1 AGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAGCA61 TGTGCACCTCTCCTCTGTATACAGGGAGATCAAGGGTGCCAAGTCACGCGTCAGGCGTCT121 GTTCTGGCGGTGGCGCTCATGGGTGGAACATTGACATTGATGCCGGCTGATGTGTCGGGC181 TGCTAGTACGCCTCCTTGTGGGGTGGGAACGTGGTCTGGTGTGTCGAGGGCATGTTGCAC241 GCTGTTGGGTCCTGAGGGACCGGGCCGCACCTTTTGGGTGTGTCTGGTTTCTTGTCGGAC301 CCTTTCCGTCGTCCTGTTGTGGATGGTGGTGGGGTACCGCCCGTATATTGAGAACTACAC361 AGTGGACGCGAGCATCTTAGATTCACCGGTTTTCCGGTGGATCACAAAGATCTATTTATA421 GATCATTGGTCAATTCTGTCTCCCTTCGGGGAGGCGAAACGATTCAATCTCATGTGATTT481 CAAGATTCTAAGGGCAAACGGTGGATGCCTTGGCAC应用分子生物学软件，将所得序列及数据库中已报道序列进行同源性比较，设计出以下Cmm引物序列CmmF1 5‘-CCTTTCCGTCGTCCTGTTGT-3’CmmR2 5‘-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3’。
设计番茄溃疡病菌(Cmm)检测基因的检测试剂盒，包括
管号 名称 浓度1 超纯水99％～100％2 PCR反应缓冲液 9×～10×3 dNTPs 9mM～10mM4 Mg2+20mM～25mM5 阳性对照DNA 95ng/μl～100ng/μl6 DNA marker2Kb7 上样缓冲液5×～6×8 正向引物(CmmF1) 20μM～25μM9 反向引物(CmmR2) 20μM～25μM使用本发明的试剂盒配方分别对Cmm和其它39个参试菌株的提取的Cmm的DNA和纯培养物进行PCR扩增。
反应组成(25μl体系)采用25ul反应体系。反应混合液包括1倍PCR反应缓冲液，10ng模板DNA；1.5mM MgCl2；1.5mMdNTPs和1U TaqDNA聚合酶，引物各50pmol。
扩增条件94℃预变性3min，以后30个循环，94℃变性30s，62.5℃退火45s，72℃引物延伸30s；最后72℃延伸5min。
44个参试细菌除Cmm外的39个参试菌株分别是Cl.michiganensis subsp.Nebraskensis(ATCC3298)；Cl.michiganensis subsp.Insidisus(JCM1369)；Cl.michiganensis subsp.Tesselarius(ATCC7221)；Cl.michiganensis subsp.Sepedonicus(JCM1483)；Cl.tritici(ICMP2626)；Cur.f.pv.betae(2594)、Cur.f.pv.oortii(2632)、Cur.f.pv.poinsettias(2566)、Cur.flaccumfaciens pv.basellae(BR)、Cur.f.pv.beticila(CV30)、Curtobacterium citreum(15828)、Cur.luteum(15830)、Cur.albidum(15831)、Cur.pusillum(19096)、Cur.plantarum(49174)、R.tritici(2626)、Cl.fangii(Ta-19)、带化红球菌(Rhodococcus facians，ICMP 5833，JCM6162、6163、6164、6165、10002T)，美国冬青节杆菌(Arthrobacter ilicis，ICMP 2607)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，Ga5)，茄青枯菌(Ralstonia solanacearum，LE24)，丁香假单胞菌菜豆致病变种(pseudomonas syringae，psp2)，菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi，Ch10)，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，A6)，大肠杆菌(Escherichia coli，JM110)[任欣正，植物病原细菌的分类和鉴定。1994，农业出版社]。引物CmmF1/CmmR2可以稳定地扩增Cmm得到分子量为425bp的特异性产物利用不同浓度的Cmm模板DNA(10ng-1pg)进行灵敏性检测，Cff低检出量是50pg纯DNA或3×102CFU/ml细胞。用生物素标记的引物扩增的PCR产物作为探针，进行Southern杂交，检出灵敏度未能有提高。
实施例2对海关截获的带病番茄种子进行的检测。
用2％的次氯酸钠将30克种子表面消毒，无菌条件下打碎，加45ml的0.01M PBS缓冲液(pH7.2)。在样本中加入本发明的试剂盒各组分进行PCR反应。反应组成和循环参数下反应组成(25μl体系)(1)10×PCR缓冲液350mM KCl；10mMMgCl2；80mMTris-HCl；8％PVP；(2)10×dNTP(Mixture)8mM；(3)10×引物CffA1/引物CffA28μM；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA5μl提取液。
循环参数预扩增95℃5分钟；94℃ 30秒，64℃ 30秒，72℃ 40秒，28个循环；72℃10分钟延伸。
电泳检测到425bp的清晰产物(呈阳性反应)，阴性对照是相同重量的国内健康的番茄种子。
实施例3对接种番茄植株体的检测利用浓度为106-108CFU/ml细菌悬浮液接种二叶期Cmm，番茄品种为农友矮生菜豆。接种方法为针刺法，在真叶和子叶之间的茎上，用针划出约1cm的垂直伤口，涂上菌液，凡士林封伤口，16℃-18℃培养20天。共取50株接种植株分别提取汁液，并在每个样本中加入本发明中的试剂盒各组分进行PCR扩增。反应组成、循环参数如下反应组成(25μl体系)(1)10×PCR缓冲液450mM KCl；17mM MgCl2；90mMTris-HCl；8％菲可；(2)10×dNTP(Mixture)6mM；(3)10×引物CmmF1/引物CmmR260pmol；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA(20ng/μl)5μl。循环参数同实施例3。同时用组织印迹免疫结合分析(tissue blot-immunobinding assay，TB-IBA)的结果作比较(所用的抗体是Cff的多克隆抗体)。结果显示PCR法能从50株接种植株中成功检测到40株，而TB-IBA法只能检测到37株，此外TB-IBA法本身在实验中易出现假阳性结果。因此说明本发明提供的PCR方法对Cmm的检测灵敏度和准确性都高于组织印迹免疫法(如下)。
注+表示检测出Cmm；-表示未检出Cmm。
实施例4对自然侵染的大豆植株体的检测随机选取海关获取的大豆种子，在灭菌土中播种，25～30℃条件下生长10天后共取50株幼苗分别提取汁液(提取方法同实施例4)；进行以下PCR扩增反应组成(25μl体系)(1)10×PCR缓冲液400mM KCl；13mM MgCl2；60mMTris-HCl；8％PVP；(2)10×dNTP(Mixture)5mM；(3)10×引物CmmF1/引物CmmR260pmol；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA5μl。循环参数同实施例3。同时用组织印迹免疫结合分析(tissue blot-immunobinding assay，TB-IBA)的结果作比较(所用的抗体是Cmm的多克隆抗体)。比较结果显示本发明提供的PCR方法PCR方法对50株自然侵染的大豆植株体的检测效果与组织印迹免疫法的检测效果相当，分别能检测到13株和14株被侵染的大豆植株(如下)。
注+表示检测出Cmm；-表示未检出Cmm。
实施例5CfmmF1/CmmR2对海关进口的Cmm其它寄主种子的检测结果每种寄主分别检查4批种子，每一批随机抽取5份样本，即每个寄主共20个样本。每个样本取30g种子进行处理(处理方法同实施例4)，进行以下PCR扩增反应组成(25μl体系)(1)10×PCR缓冲液350mM KCl；16mM MgCl2；70mMTris-HCl；8％PVP；(2)10×dNTP(Mixture)10mM；(3)10×引物CmmF1/引物CmmR260pmol；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA5μl。循环参数同实施例4。对照实验依然是用Cmm的多克隆抗体进行TB-IBA试验。结果显示PCR方法和TB-IBA可以从部分寄主中检测到Cmm，PCR法可以从四批番茄种子成功检测到两批种子带菌，而TB-IBA法只能检测到一批。此外PCR法还可以从甜胡椒种子内检测到Cmm。说明本发明提供的PCR法比TB-IBA法检测灵敏度高(如下)。
注以上数字表示检测出的阳性样本数。
序列表SEQUENCE LISTING<110>
南京农业大学<120>
番茄溃疡病菌的检测基因及其检测试剂盒<130>
说明书<140> 00<141> 2004-06-10<160> 1<170>
PatentIn version 3.1<210> 1<211> 516<212>DNA<213>
密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis)<220><221>
gene<222> (1)..(516)<223> <400>1agtcgtaaca aggtagccgt accggaaggt gcggctggat cacctccttt ctaaggagca 60tgtgcacctc tcctctgtat acagggagat caagggtgcc aagtcacgcg tcaggcgtct 120gttctggcgg tggcgctcat gggtggaaca ttgacattga tgccggctga tgtgtcgggc 180tgctagtacg cctccttgtg gggtgggaac gtggtctggt gtgtcgaggg catgttgcac 240gctgttgggt cctgagggac cgggccgcac cttttgggtg tgtctggttt cttgtcggac 300cctttccgtc gtcctgttgt ggatggtggt ggggtaccgc ccgtatattg agaactacac 360agtggacgcg agcatcttag attcaccggt tttccggtgg atcacaaaga tctatttata 420gatcattggt caattctgtc tcccttcggg gaggcgaaac gattcaatct catgtgattt 480caagattcta agggcaaacg gtggatgcct tggcac 51权利要求
1.番茄溃疡病菌(Cmm)的检测基因，其特征在于，Cmm的ITS全序列(SEQ ID NO.1)为516bp1 AGTCGTAACA AGGTAGCCGT ACCGGAAGGT GCGGCTGGAT CACCTCCTTTCTAAGGAGCA61 TGTGCACCTC TCCTCTGTAT ACAGGGAGAT CAAGGGTGCC AAGTCACGCGTCAGGCGTCT121 GTTCTGGCGG TGGCGCTCAT GGGTGGAACA TTGACATTGA TGCCGGCTGATGTGTCGGGC181 TGCTAGTACG CCTCCTTGTG GGGTGGGAAC GTGGTCTGGT GTGTCGAGGGCATGTTGCAC241 GCTGTTGGGT CCTGAGGGAC CGGGCCGCAC CTTTTGGGTG TGTCTGGTTTCTTGTCGGAC301 CCTTTCCGTC GTCCTGTTGT GGATGGTGGT GGGGTACCGC CCGTATATTGAGAACTACAC361 AGTGGACGCG AGCATCTTAG ATTCACCGGT TTTCCGGTGG ATCACAAAGATCTATTTATA421 GATCATTGGT CAATTCTGTC TCCCTTCGGG GAGGCGAAAC GATTCAATCTCATGTGATTT481 CAAGATTCTA AGGGCAAACG GTGGATGCCT TGGCAC
2.根据权利要求1所述番茄溃疡病菌(Cmm)的检测基因，其特征在于，其检测引物序列为CmmF1 5 ‘-CCTTTCCGTCGTCCTGTTGT-3’CmmR2 5 ‘-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3’
3.权利要求1或2所述番茄溃疡病菌(Cmm)的检测基因的检测试剂盒，包括管号 名称 浓度1 超纯水99％～100％2 PCR反应缓冲液 9×～10×3 dNTPs 9mM～10mM4 Mg2+20mM～25mM5 阳性对照DNA 95ng/μl～1100ng/μl6 DNA marker2Kb7 上样缓冲液5×～6×8 正向引物(CmmF1) 20μM～25μM9 反向引物(CmmR2) 20μM～25μM使用该试剂盒对参试细菌进行PCR扩增，Cmm产生分子量为425bp的特异性扩增产物。
全文摘要
番茄溃疡病菌(Cmm)的检测基因及其检测试剂盒，属于农作物防病治病及植物检疫范畴。基因位于16S－23S rDNA间的内源转录间隔区的核酸序列。试剂盒包括超纯水；PCR反应缓冲液10×；dNTPs 10mM；Mg2+25mM；阳性对照DNA 100ng/μl；DNAmarker；上样缓冲液5×；正向引物(CmmF1)20μM；反向引物(CmmR2)20μM。使用该试剂盒对44个参试细菌进行PCR扩增，Cmm产生分子量为425bp的特异性扩增产物，其余无产物。达到对Cmm快速、简便、准确、灵敏的检测效果。
文档编号C12Q1/68GK1584054SQ20041004128
公开日2005年2月23日 申请日期2004年6月16日 优先权日2004年6月16日
发明者郭坚华, 张晓梅 申请人:南京农业大学