专利名称：一种发卡结构探针的脱氧核糖核酸芯片及其应用方法
技术领域：
本发明涉及的是一种核酸检测的芯片，尤其是一种用于所有提取的DNA、RNA或它们的核酸序列扩增产物检测的芯片，属于检测芯片制造的技术领域。
背景技术：
分子信标(molecular beacon MB)是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子。该探针5’和3’末端自身可以形成一5-8个碱基左右的茎-环结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板的时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针的茎结构，由于荧光能量共振转移(FRET)的作用，溶液中便产生荧光，荧光强度与溶液中探针的量成正比。因此可以用来溶液中核酸的检测。后来随着生物芯片技术的不断发展，分子信标技术又被固定到固相载体上制备分子信标芯片用于SNP的高通量筛选。作为一种核酸的检测和实时定量分析试剂，分子信标探针正在被越来越多的研究者和实验室所接受，并且近年来也已针对MB和相关技术进行了许多有益的改进和商业开发。尽管如此，在MB的设计、合成和纯化等技术领域仍存在许多有待解决的问题。例如，目前的标记合成和纯化手段有限，因而导致MB的生产成本很高，特别是在使用有较长序列的MB的情况下。更为不幸的是，对于一个设计并合成好的特定MB，甚至有高达70％的终产品经试验证实是无效或不能使用的。而且MB的特点是采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光合成时标记较复杂，成本非常昂贵，探针自身复性不完全或荧光淬灭效率等原因而导致探针荧光背景的干扰。
发明内容
技术问题本发明的目的是建立一种发卡结构的DNA(deoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸)探针芯片及其应用方法，以实现高特异性、低成本的核酸检测。
技术方案本发明涉及的是一种核酸检测的芯片，这里的核酸是指所有提取的DNA、RNA(RibonucleicAcid核糖核酸)或它们的核酸序列PCR(polymerasechain reaction聚合酶链反应)扩增产物。本发明的发卡结构探针的DNA芯片是采取以下方案实现的该探针近5’端和近3’端之间有3～20个碱基互补而形成一个发卡结构，该探针无需任何荧光标记物，该探针的5’端设计一段10～20个碱基的间隔序列，并在该末端标记手臂分子以固定在固体基质表面。
该探针3，端至中间的环状序列与被检测的靶标核酸完全或部分互补。
该探针的固定基质采用微球、尼龙膜、醋酸纤维素膜、塑料、橡胶、陶瓷、琼脂糖膜、聚丙烯酰氨膜或玻璃片中的一种。
该芯片与非标记的靶标核酸杂交后在片延伸反应，在反应过程中引入标记分子，然后进行杂交信号检测；与标记过的核酸杂交后直接进行信号检测。
与该芯片杂交的核酸靶标为低拷贝的PCR产物、反转录的cDNA(complementary DNA互补DNA)、基因组DNA或RNA。
该芯片探针的杂交区域的中间碱基上引入一个突变位点，用于SNP(Singlenucleotide polymorphisms单碱基多态性)、点突变的高通量检测。
有益效果本发明与现有技术相比，具有如下优点1、本发明的最大优点是探针制备成本低(与分子信标比)。MB的特点是采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光合成时标记较复杂，成本非常昂贵，而本发明的探针无需任何荧光标记。
2、本发明的芯片具有很高的特异性，同时由于探针没有任何荧光标记物，避免了探针自身荧光背景的干扰。
3、本发明的芯片可以对大量的核酸位点进行检测，反映的生物学意义更全面，同时可以节省大量的检测成本。
4、本发明可以不需要对靶标核酸进行标记，杂交后在片延伸掺入标记物。
5、由于本发明的芯片在检测时可以在片延伸，所以靶标核酸可以是低拷贝的PCR产物或直接为基因组DNA或cDNA，避免了由于高拷贝的PCR产物污染。
该芯片可以同时进行对多种基因、RNA以及SNP的检测。该芯片的特点为检测特异性高、检测成本低等特点。
以下将结合附图对本发明作进一步说明。
图1是本发明芯片的探针制备示意图。
图2是本发明芯片荧光标记的核酸检测应用方法示意图。
图3是本发明芯片非标记的核酸检测应用方法示意图。
图4是本发明芯片点突变或单碱基多态性(SNP)检测应用方法示意图。
图5本发明芯片点突变或单碱基多态性(SNP)非标记检测应用方法示意图。
图6是本发明芯片点突变或单碱基多态性(SNP)定量检测应用方法示意图。
图7是小片断核酸(如microRNA)的检测应用方法示意图。
其中有环状区1，茎干区2，间隔序列3，手臂分子4，基底5，突变位点6，荧光分子7。
具体实施例方式
该探针3’端至中间的环状序列与被检测的靶标核酸部分或完全互补。
实例1 荧光标记的核酸检测1、探针的制备根据待检测的核酸序列，设计一段寡核苷酸其5’端有10个重复碱基(如T、G)的间隔序列并在末段标记一个氨基；近5’端(不含间隔序列)与近3’端有8个碱基互补而形成一个发卡结构；环状区与待检测的核酸序列检测区互补，即该探针3’端至中间的环状序列与被检测的靶标核酸部分互补；该探针无任何荧光标记物。(如图1)。
2、DNA芯片的制备根据步骤1制备的探针，将标有氨基的探针固定在尼龙膜、醋酸纤维素膜或玻璃片等表面。其中每一个探针对应一种待检测的核酸靶标。
3、芯片的杂交与信号检测制备好的芯片先在37℃自身复性，使探针形成发卡结构，然后将标记的PCR扩增产物与芯片杂交1～2小时。用洗脱液清洗游离的靶标DNA，在CCD显微镜、共聚焦显微镜或芯片扫描仪上对杂交后芯片进行荧光信号检测。(如图2)。
实例2 非标记的核酸检测1、探针的制备同实例1。不同的是该探针3’末端至中间的环状序列与被检测的靶标核酸完全互补。
2、DNA芯片的制备和杂交。
同实例1。不同的是杂交靶标为非标记的PCR产物或提取的基因组DNA(RNA)。
3、荧光分子的掺入杂交后芯片在DNA聚合酶(DNA靶标)或RNA反转录酶(RNA靶标)延伸体系下作用1小时，引入Cy3-dNTP(一种荧光标记的脱氧核苷三磷酸)。用杂交清洗液清洗游离的Cy3-dNTP(如图3)。
4、荧光信号的检测及结果分析在CCD显微镜、共聚焦显微镜或芯片扫描仪上对杂交后芯片进行荧光信号检测。
实例3 点突变或单碱基多态性(SNP)检测1、探针的制备同实例1。不同的是对应每一个可能的突变位点，设计两条探针，一条杂交区(环状区)与靶标序列检测区完全互补，另一条在杂交区的中间碱基引入待检测的突变位点。
2、DNA芯片的制备同实例1。
3、芯片的杂交与信号检测同实例1(如图4)。
实例4 点突变或单碱基多态性(SNP)非标记检测1、探针的制备同实例3。不同的是该探针3’末端端至中间的环状序列与被检测的靶标核酸完全互补。
2、DNA芯片的制备和杂交。
同实例3。不同的是杂交靶标为非标记的PCR产物或提取的基因组DNA(RNA)。
3、荧光分子的掺入杂交后芯片在DNA聚合酶(DNA靶标)或RNA反转录酶(RNA靶标)延伸体系下作用1小时，引入Cy3-dNTP。用杂交清洗液清洗游离的Cy3-dNTP(如图5)。
4、荧光信号的检测及结果分析在CCD显微镜、共聚焦显微镜或商业芯片扫描仪上对杂交后芯片进行荧光信号检测。
实例5 点突变或单碱基多态性(SNP)定量检测1、探针的制备同实例3。
2、DNA芯片的制备和杂交。
同实例43、荧光分子的掺入杂交后芯片在DNA聚合酶(DNA靶标)或RNA反转录酶(RNA靶标)延伸体系下作用1小时，引入Cy3-ddNTP(一种荧光标记的双脱氧核苷三磷酸)。用杂交清洗液清洗游离的Cy3-ddNTP(如图6)。
4、荧光信号的检测在CCD(Charge Coupled Device，电荷耦合装置)显微镜、共聚焦显微镜或商业芯片扫描仪上对杂交后芯片进行荧光信号检测。
5.结果分析由于在片延伸掺入的为荧光标记的ddNTP，所以每个杂交有靶标序列的探针在聚合酶的作用下只能掺入一个荧光分子。根据荧光分子个数与荧光强度作一个标准曲线。然后将扫描结果与标准曲线对比，定量得出突变的相关信息。
实例6 小片断核酸(如microRNA)的检测一种新的发卡结构探针的DNA芯片1、探针的制备同实例1。不同的是探针只有环状区域与小片段核酸完全互补，其3’端除了与5’端互补序列外，另有20个碱基左右的重复序列(如ATCG)，以便于在片延伸引入标记物(如图7)。
2、DNA芯片的制备和杂交。
同实例4。其中如果是用于小RNA检测，先将RNA逆转录为DNA。但也可以直接将小RNA与芯片杂交，但后步在片延伸必须为特殊的可以以RNA为引物的酶。
3、荧光分子的掺入杂交后芯片在DNA聚合酶(DNA靶标)或特殊的RNA引发酶延伸体系下作用1小时，引入Cy3-dNTP。用杂交清洗液清洗游离的Cy3-dNTP(如图7)。
4、荧光信号的检测在CCD显微镜、共聚焦显微镜或商业芯片扫描仪上对杂交后芯片进行荧光信号检测。
该方法的优势之一是检测成本低于分子信标，但同样具有很高的检测特异性。非常适用于大规模的核酸检测和SNP分析等研究领域。
权利要求
1.一种发卡结构探针的脱氧核糖核酸芯片，由固定基质和探针所组成，其特征在于其探针近5’端和近3’端之间的核酸碱基形成一个由环状区(1)和有3～20个互补碱基构成的茎干区(2)组成的发卡结构；该探针无任何荧光标记物；该探针的5’端有一段间隔核酸序列(3)，并在该端通过手臂分子(4)固定在基底(5)表面。
2.按照权利要求1所述的一种发卡结构探针的脱氧核糖核酸芯片，其特征在于该探针3’端至中间环状的部分序列与被检测的靶标核酸完全或部分互补。
3.按照权利要求1或2所述的一种发卡结构探针的脱氧核糖核酸芯片，其特征在于该探针的固定基质采用微球、尼龙膜、醋酸纤维素膜、塑料、橡胶、陶瓷、琼脂糖膜、聚丙烯酰氨膜或玻璃片中的一种。
4.按照权利要求1所述的一种发卡结构探针的脱氧核糖核酸芯片的应用方法，其特征在于该芯片与标记的的核酸靶标杂交，与标记过的核酸杂交后直接进行信号检测。
5.按照权利要求1所述的一种发卡结构探针的脱氧核糖核酸芯片的应用方法，其特征在于该芯片与非标记的核酸靶标杂交，与非标记的核酸靶标杂交后在片延伸反应，在反应过程中引入标记分子，然后进行杂交信号检测。
6.按照权利要求4或5所述的一种发卡结构探针的脱氧核糖核酸芯片的应用方法，其特征在于与该芯片杂交的核酸靶标为PCR产物、反转录的cDNA、基因组DNA或RNA片段。
7.按照权利要求4和5所述的一种发卡结构探针的脱氧核糖核酸芯片的应用方法，其特征在于该芯片探针的杂交区域的中间碱基上引入一个突变位点(7)，用于SNP、点突变的高通量检测。
全文摘要
一种发卡结构探针的DNA芯片及其应用方法是一种用于所有提取的DNA、RNA或它们的核酸序列扩增产物检测的芯片及其应用方法，芯片由固定基质和探针所组成，该探针近5’端和近3’端之间有3～20个碱基互补而形成一个发卡结构，该探针无需任何荧光标记物，其5’端固定在固体基质表面，3’端至中间的环状序列与被检测的靶标核酸完全或部分互补。该芯片与标记的或非标记的靶标核酸杂交，与非标记的靶标核酸杂交后在片延伸反应，在反应过程中引入标记分子，与标记的核酸杂交后便可之间进行信号检测。该芯片探针的杂交区域的中间碱基上引入一个突变位点，可用于SNP、点突变的高通量检测。
文档编号C12Q1/68GK1597986SQ20041004145
公开日2005年3月23日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者白云飞, 刘全俊, 葛芹玉, 陆祖宏 申请人:东南大学