专利名称：心肌细胞m的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种心肌细胞的新用途，具体说以心肌细胞毒蕈碱样乙酰胆碱受体M3亚型及IKM3电流为靶标的筛选抗心律失常药物的用途。
背景技术：
心律失常严重危害人类健康，是造成人类死亡的主要原因之一，流行病学研究表明，50％的心力衰竭患者死于心律失常。尽管一些抗心律失常药物使患者病情得到改善，但仍均存在明显不足①抗心律失常药物存在总有效率不高，仅为30％～60％；②对某些顽固心律失常无效；③长期应用对患者生存率改善作用不佳；④易于出现致心律失常副作用等问题。而且，在没有实际应用之前，人们很难判断哪种药物具有治疗心律失常的作用，在筛选治疗心律失常药物时，人们也找不到一个确定的、有效的标准，高效低毒抗心律失常新药的研制迫在眉睫。
现代新药研制的核心是以药物作用靶标为基础，在此基础上筛选出能够激动或拮抗靶标介导的生物功能，具有治疗作用的高效低毒药物或先导化合物。药物靶标是在疾病发生发展过程中起关键作用的生物大分子物质，如受体、离子通道、蛋白酶等。心脏毒蕈碱样乙酰胆碱受体(以下简称M受体)在调节心脏电活动和心肌收缩力中具有重要作用。目前已经发现并克隆出M受体5种亚型，分别命名为M1-M5。但长期以来人们认为心脏仅存在M2亚型。发明者首先在研究中发现激动心脏M3受体及IKM3可以介导一种新的钾电流，首次命名为IKM3(Shi H，Wang H，Lu Y，Yang B，Wang Z.Choline modulates cardiacmembrane repolarization by activating an M3 muscarinic receptor and its coupled K+channel.J Membr Biol.1999；169(1)55-64)，并发现人心脏中存在M3受体mRNA和蛋白表达，从功能学及分子生物学角度证实心脏中存在M3受体(Baofeng Yang Zhiguo Wang Cardiac M3 receptorto be or not to be，that is thequestion Recent Res.Devel.Life Sci.2003；173-95)。进一步研究发现，M3受体具有超极化膜电位、缩短动作电位时程、减慢心率等生理功能(刘艳、王玥、马满玲、张妍、李厚伟、陈庆文、杨宝峰M3受体激动剂对大鼠和家兔心脏血流动力学的影响 药学学报，2001；36(2)84-87)，更为重要的是发现心脏M3受体与心律失常及心肌细胞凋亡有密切的关系(刘艳 荆玉红 孙宏丽 李乎伦 杨宝峰M3受体与大鼠缺血性心肌细胞凋亡关系的研究药学学报2004，39(5)；338-341)，但迄今为止，尚不知道心脏M3受体及IKM3的功能性用途。
发明内容
本发明就是针对人们在筛选治疗心律失常药物时由于缺少有效的药物靶标至使无法筛选出高效低毒的药物，本发明的目的在于提供一种可以实际应用的心肌细胞M3受体及IKM3作为筛选治疗心律失常药物的新用途，它的特征即为心肌细胞M3受体及IKM3具有筛选治疗心律失常药物的用途。根据心肌细胞M3受体及IKM3为靶标进行筛选药物的方法，具有准确性高，特异性强，易于操作优点。利用心肌细胞M3受体及IKM3筛选的药物不仅具有高度专一性，而且将明显降低目前抗心律失常药物的不良反应，提高药物疗效。发明者实验研究表明，作用在M3受体及IKM3靶标药物较钠通道阻断剂、IKr阻断剂致心律失常副作用发生率下降30～50％，疗效提高30～40％，且有改善心肌细胞电重构作用。例如，根据本发明获得的药物具有缩短动作电位时程及超极化膜电位特征，这与目前已知的抗心律失常药物明显不同。根据发明者研究，具有这样特征的药物将有效克服抗心律失常药物疗效不佳、致心律失常副作用、对患者生存率改善作用不佳等问题。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式所述心肌细胞M3受体及IKM3具有筛选治疗心律失常药物的用途。在细胞外液中加入待筛选的药物，记录全细胞模式下电流强度，在50mv电压下电流强度较用药前下降则为具有疗效的治疗心律失常的药物，前述筛选方法可以用于筛选具有抑制作用的药物。
具体实施例方式
二本实施方式为利用心肌细胞M3受体及IKM3进行筛选治疗心律失常药物的方法包括以下步骤a.分离单个心肌细胞；b.建立全细胞膜片钳检测模式；c.细胞外液中加入M3受体激动剂；d.细胞外液中加入其它离子通道阻滞剂；e.细胞外液中加入不同溶度的药物，记录全细胞模式下电流强度，在50mv电压下电流强度较用药前下降则为具有疗效的治疗心律失常的药物。具体过程如下a.分离单个心肌细胞分离单个心肌细胞通过以下方法获得
将实验动物用2％的戊巴比妥钠麻醉后开胸，迅速取出心脏，主动脉逆行插管连于Langendorff灌流装置上，以正常台氏液约8ml.min-1连续灌流5分钟，洗去心脏残血，然后用无钙台氏液灌流约10分钟。心脏停止搏动后，应用含0.05％II型胶原酶的无钙液灌流分离心脏单细胞，当心脏变软、色泽变浅时开始取心肌组织，每隔2分钟取1次。以上操作均在37℃恒温、并充95％O2+5％CO2条件下进行，将不同时间取下的心肌组织放于装有KB液的试管中，用吸管轻轻吹打，使之分散成单个细胞。置于4℃冰箱稳定1小时待用。选择杆状、耐钙、横纹清晰无颗粒的细胞进行实验。
所述实验动物指豚鼠、大鼠、犬。
所述心肌组织指心房或心室组织。
所述正常台式液，按如下方法配制136 NaCl，5.4KCl，1 MgCl2，0.33NaH2PO4，5 HEPES，10葡萄糖和1 CaCl2；用NaOH调整pH至7.4。
所述KB液，按如下方法配制(mM)20 KCl，10 KH2PO4，25葡萄糖，70谷氨酸钾，10β羟丁酸，20牛磺酸，10 EGTA，0.1％白蛋白和40甘露醇，用KOH将pH调整至7.4。
b.建立全细胞膜片钳检测模式所述建立全细胞膜片钳检测模式，按如下方案进行所用微电极用两步法拉制而成，制成的微电极充灌电极液后电阻在3～5Ω之间。将准备好的微电极连于膜片钳仪探头上，分离好的单细胞置于浴槽中。用正常台氏液以3ml.min-1恒速灌流冲洗细胞表面，形成高阻封接(10GΩ)后，用脉冲式抽吸打破细胞膜，形成全细胞模式。设定protocol，用电压钳模式进行刺激。实验过程由计算机软件控制，数/模转换器完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。
所述充灌的电极液，按以下方案配制(mM)GTP 0.1，天门冬氨酸钾110，KCl 20，MgCl21，Mg-ATP 5，HEPES 10，EGTA 10，磷酸肌酸5，用KOH调整pH至7.3。
所述protocol的设定，按如下方案经行保持电位-50mV；刺激电压范围从-40mV至+60mV，持续时间2秒，然后恢复至-30mV，持续时间1秒；刺激电压步阶10mV，间隔时间5秒。
c.细胞外液中加入M3受体激动剂所述在细胞外液中加入M3受体激动剂是指10mM胆碱(choline)或10μM匹鲁卡品(pilocarpine)。
d.细胞外液中加入其它离子通道阻滞剂所述在细胞外液中加入其它离子通道阻滞剂是指1mM多菲莱德，20mM293B，10mM格列苯脲，200mM 4氨基吡啶和200mM CdCL2。
e.细胞外液中加入不同溶度的药物，记录全细胞模式下电流强度，在50mv电压下电流强度较用药前下降则为具有疗效的治疗心律失常的药物。
本发明提供的用于筛选抗心律失常药物作用靶标即心肌细胞M3是在心律失常中起关键作用的膜蛋白，具有超极化膜电位、缩短动作电位时程及抗心肌细胞凋亡等作用机制特点。
具体实施例方式
三本实施方式的筛选过程为将豚鼠用2％的戊巴比妥钠麻醉后开胸，迅速取出心脏，主动脉逆行插管连于Langendorff灌流装置上，以正常台氏液约8ml.min-1连续灌流5分钟，洗去心脏残血，然后用无钙台氏液灌流约10分钟。心脏停止搏动后，应用含0.05％II型胶原酶的无钙液灌流分离心脏单细胞，当心脏变软、色泽变浅时开始取心肌组织，每隔2分钟取1次。以上操作均在37℃恒温、并充95％O2+5％CO2条件下进行，将不同时间取下的心房肌组织放于装有KB液的试管中，用吸管轻轻吹打，使之分散成单个细胞。置于4℃冰箱稳定1小时待用。选择杆状、耐钙、横纹清晰无颗粒的细胞进行实验。正常台式液按如下方法配制136 NaCl，5.4KCl，1 MgCl2，0.33 NaH2PO4，5 HEPES，10葡萄糖和1 CaCl2；用NaOH调整pH至7.4。KB液按如下方法配制(mM)20 KCl，10 KH2PO4，25葡萄糖，70谷氨酸钾，10β羟丁酸，20牛磺酸，10 EGTA，0.1％白蛋白和40甘露醇，用KOH将pH调整至7.4。
建立全细胞膜片钳检测模式，按如下方案进行所用微电极用两步法拉制而成，制成的微电极充灌电极液后电阻在3～5Ω之间。电极液按以下方案配制(mM)GTP 0.1，天门冬氨酸钾110，KCl 20，MgCl21，Mg-ATP 5，HEPES10，EGTA 10，磷酸肌酸5，用KOH调整pH至7.3。将准备好的微电极连于膜片钳仪探头上，分离好的单细胞置于浴槽中。用正常台氏液以3ml.min-1恒速灌流冲洗细胞表面，形成高阻封接(10GΩ)后，用脉冲式抽吸打破细胞膜，形成全细胞模式。设定protocol，用电压钳模式进行刺激。实验过程由计算机软件控制，数/模转换器完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。所述protocol的设定，按如下方案经行保持电位-50mV；刺激电压范围从-40mV至+60mV，持续时间2秒，然后恢复至-30mV，持续时间1秒；刺激电压步阶10mV，间隔时间5秒。
在细胞外液中加入M3受体激动剂10mM胆碱(choline)。在细胞外液中加入其它离子通道阻滞剂1mM多菲莱德，20mM293B，10mM格列苯脲，200mM 4氨基吡啶和200mM CdCL2。
细胞外液中加入不同溶度的药物，记录全细胞模式下电流强度，在50mv电压下电流强度较用药前下降则为具有疗效的治疗心律失常的药物。
具体实施例方式
四本实施方式的筛选过程为将豚鼠用2％的戊巴比妥钠麻醉后开胸，迅速取出心脏，主动脉逆行插管连于Langendorf罐流装置上，以正常台氏液约8ml.min-1连续灌流5分钟，洗去心脏残血，然后用无钙台氏液灌流约10分钟。心脏停止搏动后，应用含0.05％II型胶原酶的无钙液灌流分离心脏单细胞，当心脏变软、色泽变浅时开始取心肌组织，每隔2分钟取1次。以上操作均在37℃恒温、并充95％O2+5％CO2条件下进行，将不同时间取下的心房肌组织放于装有KB液的试管中，用吸管轻轻吹打，使之分散成单个细胞。置于4℃冰箱稳定1小时待用。选择杆状、耐钙、横纹清晰无颗粒的细胞进行实验。正常台式液按如下方法配制136 NaCl，5.4KCl，1 MgCl2，0.33 NaH2PO4，5 HEPES，10葡萄糖和1 CaCl2；用NaOH调整pH至7.4。KB液按如下方法配制(mM)20 KCl，10 KH2PO4，25葡萄糖，70谷氨酸钾，10β羟丁酸，20牛磺酸，10 EGTA，0.1％白蛋白和40甘露醇，用KOH将pH调整至7.4。
建立全细胞膜片钳检测模式，按如下方案进行所用微电极用两步法拉制而成，制成的微电极充灌电极液后电阻在3～5Ω之间。电极液按以下方案配制(mM)GTP 0.1，天门冬氨酸钾110，KCl 20，MgCl2·1，Mg-ATP 5，HEPES10，EGTA 10，磷酸肌酸5，用KOH调整pH至7.3。将准备好的微电极连于膜片钳仪探头上，分离好的单细胞置于浴槽中。用正常台氏液以3ml.min-1恒速灌流冲洗细胞表面，形成高阻封接(10GΩ)后，用脉冲式抽吸打破细胞膜，形成全细胞模式。设定protocol，用电压钳模式进行刺激。实验过程由计算机软件控制，数/模转换器完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。所述protocol的设定，按如下方案经行保持电位-50mV；刺激电压范围从-40mV至+60mV，持续时间2秒，然后恢复至-30mV，持续时间1秒；刺激电压步阶10mV，间隔时间5秒。
在细胞外液中加入M3受体激动剂10μM匹鲁卡品(pilocarpine)。在细胞外液中加入其它离子通道阻滞剂1mM多菲莱德，20mM293B，10mM格列苯脲，200mM 4氨基吡啶和200mM CdCL2。
细胞外液中加入不同溶度的药物，记录全细胞模式下电流强度，在50mv电压下电流强度较用药前下降则为具有疗效的治疗心律失常的药物。
具体实施例方式
五本实施方式的筛选过程为将大鼠用2％的戊巴比妥钠麻醉后开胸，迅速取出心脏，主动脉逆行插管连于Langendorff灌流装置上，以正常台氏液约8ml.min-1连续灌流5分钟，洗去心脏残血，然后用无钙台氏液灌流约10分钟。心脏停止搏动后，应用含0.05％II型胶原酶的无钙液灌流分离心脏单细胞，当心脏变软、色泽变浅时开始取心肌组织，每隔2分钟取1次。以上操作均在37℃恒温、并充95％O2+5％CO2条件下进行，将不同时间取下的心房肌组织放于装有KB液的试管中，用吸管轻轻吹打，使之分散成单个细胞。置于4℃冰箱稳定1小时待用。选择杆状、耐钙、横纹清晰无颗粒的细胞进行实验。正常台式液按如下方法配制136 NaCl，5.4 KCl，1 MgCl2，0.33 NaH2PO4，5 HEPES，10葡萄糖和1 CaCl2；用NaOH调整pH至7.4。KB液按如下方法配制(mM)20 KCl，10 KH2PO4，25葡萄糖，70谷氨酸钾，10β羟丁酸，20牛磺酸，10 EGTA，0.1％白蛋白和40甘露醇，用KOH将pH调整至7.4。
建立全细胞膜片钳检测模式，按如下方案进行所用微电极用两步法拉制而成，制成的微电极充灌电极液后电阻在3～5Ω之间。电极液按以下方案配制(mM)GTP 0.1，天门冬氨酸钾110，KCl 20，MgCl21，Mg-ATP 5，HEPES10，EGTA 10，磷酸肌酸5，用KOH调整pH至7.3。将准备好的微电极连于膜片钳仪探头上，分离好的单细胞置于浴槽中。用正常台氏液以3ml.min-1恒速灌流冲洗细胞表面，形成高阻封接(10GΩ)后，用脉冲式抽吸打破细胞膜，形成全细胞模式。设定protocol，用电压钳模式进行刺激。实验过程由计算机软件控制，数/模转换器完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。所述protocol的设定，按如下方案经行保持电位-50mV；刺激电压范围从-40mV至+60mV，持续时间2秒，然后恢复至-30mV，持续时间1秒；刺激电压步阶10mV，间隔时间5秒。
在细胞外液中加入M3受体激动剂10mM胆碱(choline)。在细胞外液中加入其它离子通道阻滞剂1mM多菲莱德，20mM293B，10mM格列苯脲，200mM 4氨基吡啶和200mM CdCL2。
细胞外液中加入不同溶度的药物，记录全细胞模式下电流强度，在50mv电压下电流强度较用药前下降则为具有疗效的治疗心律失常的药物。
具体实施例方式
六本实施方式的筛选过程为将大鼠用2％的戊巴比妥钠麻醉后开胸，迅速取出心脏，主动脉逆行插管连于Langendorff灌流装置上，以正常台氏液约8ml.min-1连续灌流5分钟，洗去心脏残血，然后用无钙台氏液灌流约10分钟。心脏停止搏动后，应用含0.05％II型胶原酶的无钙液灌流分离心脏单细胞，当心脏变软、色泽变浅时开始取心肌组织，每隔2分钟取1次。以上操作均在37℃恒温、并充95％O2+5％CO2条件下进行，将不同时间取下的心房肌组织放于装有KB液的试管中，用吸管轻轻吹打，使之分散成单个细胞。置于4℃冰箱稳定1小时待用。选择杆状、耐钙、横纹清晰无颗粒的细胞进行实验。正常台式液按如下方法配制136 NaCl，5.4KCl，1 MgCl2，0.33 NaH2PO4，5 HEPES，10葡萄糖和1 CaCl2；用NaOH调整pH至7.4。KB液按如下方法配制(mM)20 KCl，10 KH2PO4，25葡萄糖，70谷氨酸钾，10β羟丁酸，20牛磺酸，10 EGTA，0.1％白蛋白和40甘露醇，用KOH将pH调整至7.4。
建立全细胞膜片钳检测模式，按如下方案进行所用微电极用两步法拉制而成，制成的微电极充灌电极液后电阻在3～5Ω之间。电极液按以下方案配制(mM)GTP 0.1，天门冬氨酸钾110，KCl 20，MgCl21，Mg-ATP 5，HEPES10，EGTA 10，磷酸肌酸5，用KOH调整pH至7.3。将准备好的微电极连于膜片钳仪探头上，分离好的单细胞置于浴槽中。用正常台氏液以3ml.min-1恒速灌流冲洗细胞表面，形成高阻封接(10GΩ)后，用脉冲式抽吸打破细胞膜，形成全细胞模式。设定protocol，用电压钳模式进行刺激。实验过程由计算机软件控制，数/模转换器完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。所述protocol的设定，按如下方案经行保持电位-50mV；刺激电压范围从-40mV至+60mV，持续时间2秒，然后恢复至-30mV，持续时间1秒；刺激电压步阶10mV，间隔时间5秒。
在细胞外液中加入M3受体激动剂10μM匹鲁卡品(pilocarpine)。在细胞外液中加入其它离子通道阻滞剂1mM多菲莱德，20mM293B，10mM格列苯脲，200mM 4氨基吡啶和200mM CdCL2。
细胞外液中加入不同溶度的药物，记录全细胞模式下电流强度，在50mv电压下电流强度较用药前下降则为具有疗效的治疗心律失常的药物。
权利要求
1.一种心肌细胞M3受体及IKM3作为筛选治疗心律失常药物的新用途，其特征在于心肌细胞M3受体及IKM3具有筛选治疗心律失常药物的用途。
2.根据权利要求1所述的心肌细胞M3受体及IKM3作为筛选治疗心律失常药物的新用途，其特征在于细胞外液中加入待筛选的药物，记录全细胞模式下电流强度，在50mv电压下电流强度较用药前下降则为具有疗效的治疗心律失常的药物。
3.权利要求1或2所述的心肌细胞M3受体及IKM3作为筛选治疗心律失常药物的新用途，其特征在于所述筛选方法用于筛选具有抑制作用的药物。
4.根据权利要求1或2所述的心肌细胞M3受体及IKM3作为筛选治疗心律失常药物的新用途，其特征在于利用心肌细胞M3受体及IKM3进行筛选治疗心律失常药物的方法包括以下步骤a.分离单个心肌细胞；b.建立全细胞膜片钳检测模式；c.细胞外液中加入M3受体激动剂；d.细胞外液中加入其它离子通道阻滞剂；e.细胞外液中加入不同溶度的药物，记录全细胞模式下电流强度，在50mv电压下电流强度较用药前下降则为具有疗效的治疗心律失常的药物。
全文摘要
心肌细胞M
文档编号C12Q1/02GK1635140SQ20041004394
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月19日 优先权日2004年10月19日
发明者杨宝峰, 王慧珍, 董德利 申请人:哈尔滨医科大学