一株高抗金属盐的微紫青霉菌的制作方法

专利名称：：一株高抗金属盐的微紫青霉菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新的青霉属(Penicillium)真菌。更具体地，本发明涉及一种高抗铜盐、兼具高抗多种其它金属盐的同时可用于吸附铜的微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)。
背景技术：
：一、铜离子在生物体中的作用需氧生物需要象铜(copper)之类的痕量(traceamount)元素，此类元素一般具有获得和失去电子的双重功能。在活的生物体内，铜离子以化合物形式与高浓度富电子分子共存，如硫或抗坏血酸等[1]，或者参予RNA和DNA的结构的构建[2-3]或参予其它生物代谢活动并促进生物体生长[4-5]。因此，铜离子可作为许多蛋白酶的催化中心，这些蛋白涉及到多种关键性的酶催化过程，如电子运输蛋白Cyt氧化酶、解除氧自由基毒性的蛋白如铜/锌SOD蛋白、抗坏血酸氧化酶、二胺氧化酶和酚氧化酶等[6-8]。由于“嗜好”参加氧化还原反应，过量的铜会导致产生对细胞具有极度毒性的伤害性羟基，从而引起脂类的过氧化作用和核酸的断裂[9]。二、铜在细胞内的转运机制及转运因子在实验室条件下，铜是一个上佳的催化剂，氧化破坏那些富电子分子。但在细胞内它与其它具有氧还活性的金属一样，是以非活性形式被螯合并转运到细胞内的，之后通过细胞组分转运至细胞的特定部位和反应区[1]。到目前为止，对于参予转运铜的组分和向膜转运的机制仍有许多细节不清楚。相对而言，在酵母中关于铜的代谢研究得相对比较深入[10]。在酵母中，铜是以一价铜(Cu+)的形式由Ctr1蛋白介导进行跨膜转运，并被转运到小的可溶性的细胞质铜转运子或铜转运伴侣蛋白(chaperones)[11]。在酵母中，至少有5种细胞内的铜转运因子位于分泌途径中的Ccc2(一种P型ATP酶)和多铜氧化酶Fet3、线粒体中的细胞色素氧化酶、细胞核中的铜转录因子、胞质溶胶中的铜/锌SODi蛋白、胞质中的Atx1p蛋白[9-13]。已鉴定出了4种不同的铜转运介导蛋白，其中的3种介导性的铜转运路线是由Ctr1蛋白上将铜转运到3个不同的细胞位点[1]1)Cox17蛋白引导铜转运到线粒体并插入其呼吸链的末端氧化酶一细胞色素C氧化酶中。2)Lys7蛋白指导铜定位于细胞质溶胶使其形成一种基本的抗氧化物酶CuZnSOD。3)Atx1则将铜引导到后高尔基体(post-Golgi)腔，并借助于Ccc2(一种P型ATP酶)而最终插入具有高亲和性的离子吸收所必须的多铜氧化酶Fet3。4)Atx1p蛋白是将细胞表面的转运因子中的铜离子转运到Ccc2和Fet3，但还不知道该蛋白是否与铜向线粒体，细胞核或胞质溶胶中的铜/锌SOD1蛋白的转运有关[13]。在研究过的生物体中，铜代谢涉及的转运因子均具有同源性。在酵母的铜代谢中涉及的转运因子中有铜的金属伴侣蛋白(Coppermetallochaperone)和膜转运子[1-3，13-20]，其中有些与人类的一些蛋白同源酵母Atx1/人Hah1、酵母Lys7/人Ccs1、酵母Cox17/人Cox17、酵母Ccc2/人Wilson病蛋白[21]。这些结果说明，在许多方面，酵母和人类之间的铜和离子的体内稳定机制是相似的。铜在生物体内的转运途径并不是固定不变的，可随铜离子的浓度而发生变化。在酵母中，在低浓度铜条件下，铜离子的细胞内的转运采用一种转运路线。当培养基中铜盐浓度较高时，铜离子转运完全采用其它的旁侧途径[1]。三、生物体的抗铜机制如同其它重金属，铜是构成地壳的元素之一。自然状态下，铜多存在于各种矿物中，其含量一般低于0.1％，属微量重金属元素[15]。从生物利用角度，重金属的特点是不能被降解而从环境中彻底消失、只能从一种形态转化为另一种形态、从高浓度变为低浓度、部分可在毒性一无毒或低毒状态之间转化、能在生物体内积累富集[16]。部分重金属可以一定量(微量)的水平或某种离子价态参予生物体的一些特殊的生长代谢活动[17]。生物在演化过程中，在其细胞体内发展了一套感应、转运和螯合铜的系统，以维持铜的基本需求和其毒性水平之间的精细平衡[4，18-20，22]，因而生物体或多或少的具有铜抗性，并演化出一套复杂的抗铜机制。原核生物主要依靠P-型的ATPase输出泵调节体内的铜离子浓度而获得铜的抗性[13，23-25]；真核生物主要依赖关闭铜离子的吸收通道和合成金属硫蛋白两种机制获得铜抗性[26]。实际上铜抗性涉及到多个代谢过程和复杂的机制，例如与铜抗性相关的铜内平衡过程是和导致细胞伤害的氧自由基的代谢的部分过程相互重叠的[4，24]。四、铜的污染及危害工业化的发展加之铜的广泛使用已使包括自然水、各种有机废水、工业废弃物如媒阡、沉积的淤泥、金属加工生产区的周边环境等均出现铜污染现象[15，27-37]。铜过量之后便会产生污染，污染一般会造成植物植株的矮化、生长缓慢、生物量大幅度下降[27，38-39]；铜过量后也会造成人体的代谢紊乱，可造成多种疾病，代表性疾病如Menkes综合症和Wilson病[21，40-41]、神经退化病(NeurodegenerativeDiseases)[42]、致死性运动神经元病(fatalmotorneurondisease)[3]等许多其它疾病[44-45]。其中原因之一是在分子水平上可造成DNA和RNA损伤[42]。铜的毒性是氧依赖性，其过程遵循Harber-Weiss反应，产生活性氧中间体[45]或者是以不适当方式与生物分子相结合[19]；重金属离子对微生物群落的影响有两方面低浓度时对微生物群落的发展有促进作用，高浓度时则有抑制作用，不同类群微生物的敏感度不同，通常是放线菌＞细菌＞真菌[17，46-47]。土壤受重金属污染愈重，微生物种群数量愈少；耐单一种类重金属的相对较多；耐2种或2种以上的重金属离子的极少；土壤中的微生物较之空气微生物的抗(耐)性高。以铜污染为例，有研究报道表明，对照土壤(Cu＜100mg/L)有35种真菌，中度污染土(1000mgCu/L)中有25种真菌，高度污染土(10000mgCu/L)仅有13种真菌[47-48]。空气中的许多微生物对重金属的耐性仅在10mM左右，如已报道的从空气分离到的82种真菌分离物中，52种(链孢属(Alernaria)、曲霉属(Aspergillus)、枝孢霉属(Cladosporium)、青霉属(Penicillium)、红酵母属(Rhodotorula)、葡萄穗霉属等)分离物只耐1种金属(As2+、Cd2+、Co2+、Cr2+、Hg2+、Ni2+、Pb2+)，仅有15种霉菌和1种酵母耐浓度为10mM的2种以上金属[27，38-39，49]。五、铜的污染的治理现状及其研究发展方向如同其它重金属，铜污染的工业治理技术主要采用物理化学的方法，如吸附、离子交换、膜和化学沉淀以及溶剂抽提等，效果虽为明显，但投资、运行费极高，操作复杂难以推广，对于大流域低浓度的污染更是无法施展[50]。与其它重金属一样，由于铜不能被生物体代谢为另一种元素物质，目前对其造成的污染的生物治理主要以去除(removal)或回收(recovery)的生物修复(bioremedation)为主，主要途径有两种1)通过在污染农田、土壤中种植某些木本、经济植物利用其对重金属的吸收、累积、耐性和滤过性除去重金属。2)利用生物化学、生物有效性和生物活性特性，把重金属转化为较低毒性的产物(络合态、脱烷基、改变价态等)，或者利用重金属与微生物的亲合性进行吸附及生物学活性来固化、转化降低重金属的毒性和迁移能力[16，47，51-53]。目前用于重金属污染修复的生物物种主要有植物、微生物、藻类三大类[13，16-18，28-31，33-34，49，51-63]，有死体和活体生物修复技术之分[29，49-50，57]。生物修复的机理大致有活体细胞的主动吸收、被动吸收、淋滤、解析和转化等过程[54，61-62]。六、铜污染的生物修复发展方向目前包括铜在内的许多重金属的大面积土壤污染是以植物生物修复为主，同时也已克隆了许多抗重金属的基因(参见http//www.ncbi.nlm.nih.govGenBank)，最具代表性的是在多种生物体内克隆到的能与多种重金属结合的结合肽或金属硫蛋白(MTs)、金属硫蛋白样蛋白、植物螯合素(phtochelatin)和金属抗性调节蛋白基因等，并以此类基因构建修复重金属污染的转基因生物[21，45，50，64]。但是绝大部分克隆报道的是单一重金属抗性基因(参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov；GenBank)。虽然，转MTs蛋白基因的植物报道很多并在局部的重金属污染修复中取得了较为满意的结果，由于基因工程研究中固有的技术问题仍然存在，如启动子的表达效率不稳定、在植物受体中表达部位不确定，或因受体内部复杂的原因导致表达的异源MTs蛋白失活等[57]，从而限制了进一步推广应用。重金属污染生物修复的发展方向之一是微生物展示技术(microbialdisplaytechnology)，这是将与重金属高度亲合的肽或蛋白通过基因工程技术使其定位表达在微生物的表面，提高微生物对重金属的吸附能力，从而消除重金属的污染或回收稀有贵重金属，但是这一技术本身并不能增强微生物对重金属的抗耐受水平[45]。近年来，在真菌中，已经尝试利用含铜诱导的启动子(该启动子来自酵母金属硫蛋白基因)的多拷贝质粒，克隆编码锌指(zinc-finger)转录因子的基因并转化酵母(S.cerevisiae)，构建细胞表面工程酵母，以其回收和去除铜离子[62]。另一发展方向是免(未)培养微生物技术(unculturedmicrobes)，此项技术发展也十分迅速，成为寻找抗重金属的新的微生物种群及克隆新的重金属抗性基因的一条新颖的途径。但这一技术目前主要集中在菌体的鉴定。在细菌中已通过克隆、测序分析细菌16srRNA基因鉴定了许多抗性类群(参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov；GenBank)，存在的问题是即使已发现免(未)培养微生物，因受现有技术所限而无法获得其培养物。七、微生物铜抗性研究和应用中的问题高抗铜性同时兼具高抗多种其它重金属盐的、具有高吸附能力的微生物菌株的开发无疑在生物体的铜抗性的理论研究如抗铜代谢途径、抗铜和耐高渗透压新基因的克隆、铜污染的微生物修复应用中具有重要意义。这类菌株也可进一步开发为构建可降解重金属盐一有机物混合污染环境中的有机污染物的基因工程菌的受体菌株。但目前微生物铜抗性研究和应用中的问题存在如下问题1)迄今为止，在真菌中发现的单抗铜的抗性水平最高的是一种白假丝酵母(Candidaalbicans)，其抗铜水平最高也只为50mMCuSO4[26]。2)对于包括铜(Cu)在内的重金属与青霉属的菌株(Penicilliumspp.)生长、代谢等的关系的研究已十分广泛[65-66]。虽然报道认为Penicilliumjanthineleum是最常见的锌(Zn)的积累者[67]。也在该种菌中分离到了可高抗100mMAlCl3的株系[68]。但是迄今尚未见报道有极高抗铜盐、富集铜并能析出铜的、耐高浓度的盐(NaCl)，同时又兼具高抗多种其它有毒重金属盐的Penicilliumjanthineleum的分离株系或其它真菌属种。3)如果某种微生物能够在高浓度铜盐环境中不断生长，而且其菌体具有较高的铜离子吸附能力，至少可以做到一次投加菌体可以无需复加而达到延长菌体的长时期的去除能力，减少操作环节和工艺从而降低成本。但目前无此方面的研究报道、应用实例和菌种专利。
发明内容本发明的一个方面涉及一种微生物微紫青霉菌株(Penicilliumjanthinellum)，其属于青霉属(Penicillium)真菌，能够高抗铜盐，富集并能析出铜的兼具高抗多种其它金属盐。该菌株于2003年10月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京，中关村，北一条)，保藏号为CGMCC1027。本发明的另一个方面，涉及微紫青霉菌株GXCR在吸附和/或抗铜盐和/或锌盐方面的应用。本发明的另一个方面，涉及微紫青霉菌株GXCR在吸附和/或抗铜盐或锌盐以外的金属盐方面的应用。本发明的另一个方面，涉及微紫青霉菌株GXCR在浸矿方面的应用。本发明的另一个方面，涉及微紫青霉菌株GXCR在制备用于治理重金属环境污染的生物吸附剂方面的应用。本发明的另一个方面，涉及微紫青霉菌株GXCR在构建可降解重金属盐—有机物混合污染环境中的有机污染物的基因工程菌中的应用。图1微紫青霉菌株GXCR的ITS序列。图2显示在500ml体积的三角瓶中，加入200ml的液体培养基PDL，并接种105个微紫青霉菌株GXCR分生孢子，在不同温度下，150rpm摇床培养7天后的菌体生长量的图表(图中的直条线为3个独立实验的平均值标准误)。图3显示在500ml体积的三角瓶中，加入200ml的不同pH的液体培养基PDL，并接种105个微紫青霉菌株GXCR分生孢子，32℃，150rpm摇床培养7天后的菌体生长量的图表(图中的直条线为3个独立实验的平均值标准误)。图4显示在500ml体积的三角瓶中，加入200ml的不同pH的含金属盐的液体培养基PDL，并接种105个微紫青霉菌株GXCR分生孢子，32℃下培养5天时，该菌的菌体生长量的图表(◆Cu；■Cr6+；▲Pb；×Zn，图中的直条线为3个独立实验的平均值标准误)。图5显示微紫青霉菌株GXCR在含Cu和Mn的PDA培养基上32℃培养7天的生长状况的图片，其中APDA-Cu；BPDA-Cu-5mM的Mn；CPDA-Cu-5mM的Mn-添加有机营养(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)(图中的数字代表Cu的浓度)。图6显示微紫青霉菌株GXCR在含Cu、Zn/Al的PDA培养基上32℃培养7天的生长状况的图片，其中APDA-Cu；BPDA-Cu-5mM的Zn；CPDA-Cu-5mM的Zn-添加有机营养(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)；DPDA-Cu-5mM的Al；EPDA-Cu-5mM的Al-添加有机营养(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)(图中的数字代表Cu的浓度)。图7显示微紫青霉菌株GXCR在含Cu和Cd的PDA培养基上32℃培养7天的生长状况的图片，其中APDA-Cu；BPDA-Cu-2mM的Cd；CPDA-Cu-2mM的Cd-添加有机营养(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物)(图中的数字代表Cu的浓度)。图8显示微紫青霉菌株GXCR在PDA培养基上的生长状况的图片，其中A未添加Cu的PDA，32℃培养7天；B未添加Cu的PDA，32℃培养20天；C含40mM的Cu的PDA，32℃培养20大(C1正面气生菌落)；C2气生菌落的背面)；D含40mM的Cu的PDA，32℃培养20d以上。图9显示微紫青霉菌株GXCR的气生菌丝体的扫描电镜(SEM)观察的图片，其中A1-2未添加Cu的PDA在32℃培养20天以上；B1-4含40mM的Cu的PDA，32℃培养20天以上。图10显示在未添加或添加40mMCu的PDA上，32℃培养20天以上，微紫青霉菌株GXCR气生菌落正面菌丝体成份的能谱分析(EDAX)，A1未添加Cu的PDA培养基；A2未添加Cu的PDA上的气生菌落；B1添加40mMCu的PDA上的正面气生菌落；B2添加40mMCu的PDA上的正面气生菌落下方的PDA培养基。图11显示在500ml体积的三角瓶中，加入200ml的含不同浓度Cu的液体培养基PDL，并接种105个微紫青霉菌株GXCR分生孢子，28℃，150rpm摇床培养5天后，生长菌丝表面对Cu的生物吸附和菌体细胞内的Cu积累的图表(□生物吸附；◇生物累积(累积量太小，累积曲线与X轴重合)；图中的直条线为3个独立实验的平均值标准误)。图12显示在500ml体积的三角瓶中，加入200ml的含不同浓度Cu的去离子水中(自然pH)，接种1.5g的微紫青霉菌株GXCR菌体，28℃，150rpm摇床培养30分钟，0.5mM的NaOH预先处理(浸泡)30分钟的微紫青霉菌株GXCR菌体和未经0.5mMNaOH预处理(自然状态的)的微紫青霉菌株GXCR菌体表面的Cu的生物吸附的图表(◇0.5mM的NaOH预处理(浸泡)的菌体；◆未经0.5mMNaOH预处理的菌体；虚线表示对照菌株桔青霉(Penicilliumcitrinum)。直条线表示3个独立实验的平均值标准误)。本发明的微紫青霉菌株GXCR于2003年10月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京，中关村，北一条)，保藏号为CGMCC1027。具体实施例方式下面参考实施例详细描述本发明。应当理解，下述实施例是为了更好地理解本发明，而不是为限制本发明的目的。培养微紫青霉菌株GXCR所用的培养基如下1)PDA(1000ml)20％(w/v)马铃薯，1.5％葡萄糖，1.5％琼脂，pH7.02)PDL无琼脂的PDA培养细菌所用的培养基如下LB培养基(1000ml)胰蛋白胨10.0g；酵母提取物5.0g；NaCl5.0g；pH7.0本发明所用金属盐Al(Al2(SO4)3)；Cd(CdCl2·2.5H2O)；Cr6+(K2Cr2O7)；Cr3+(CrCl3·6H2O)；Cu(CuSO4·5H2O)；Mn(MnCl2·4H2O)；Ni(NiCl2·6H2O)；Pb(PbAc2·3H2O)；Zn(ZnSO4·7H2O))均购自广西科学器材进出口公司。实施例1微紫青霉菌株的获得土样品的采集和真菌菌株的筛选从铜矿矿区洗矿水排水沟的上、中、下游三处采集底泥(表层以下10cm)，每处约500g，装入玻璃瓶。称取所采泥样10g，放入250ml三角瓶中，加入无菌水100ml，用玻璃棒充分搅拌，静置30分钟后，取上清液1ml，用无菌水将上清液按10倍梯度稀释后涂布于含有5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mMCu的PDA平板上，28℃培养7天，将长出的候选真菌菌落转移至新的含相应浓度的Cu的PDA培养基平板上纯化后作候选菌株保存。将所有得到的候选真菌菌株再接种至含有40mM的Cu的PDA平板上，28℃培养7天，将能够继续生长的真菌菌落转至新的含40mM的Cu的PDA平板上，28℃培养后保存。用此方法获得了一株在含40mM的Cu的PDA平板上正常生长的真菌菌株，并将该菌株编号为GXCR。实施例2GXCR生物学特征及其特性1)GXCR的固体培养特征GXCR菌株在PDA上28℃培养时，其菌落呈圆形或接近圆形，菌落扁平，培养初期(48小时)气生菌丝呈白色。随着培养时间的增加，由于分生孢子的产生，菌落会逐渐由灰绿色变成淡黄褐色(图8B)。光学显微镜镜鉴结果表明，该菌菌丝及孢子梗光滑，初生孢子梗呈指状一级分枝，顶生1～4个柱状小梗，小梗顶串生10～20个分生孢子，分生孢子圆形或椭圆形，根据上述形态特征和文献[69]，该菌属于青霉属(Penicillium)真菌。2)GXCR的染色体的内转录间隔区(internaltranscribedspacer；ITS)的DNA序列真核生物的染色体DNA内转录间隔区ITS的序列是染色体DNA上一段保守的rDNA的核苷酸序列，由于该序列具有种的特异性，因此，它现在是被广泛采用的鉴定真核生物物种的重要的分子生物学标准。(a)GXCR的总DNA的制备在100ml的PDL培养基中，接种105个GXCR的分生孢子，28℃下培养48小时，用210目筛绢过滤收集菌体，用吸水纸将水分吸干。移入-20℃预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成粉末。立即将粉末转入预冷的50ml离心管中，加入10ml的DNA提取液(200mM的NaCl，4mM的EDTA-Na，0.2％的SDS，0.1M的Tris-HCl，pH8.0)，缓慢颠倒混匀；加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀后4℃，12000rpm离心15分钟，将上清液转移至新的灭菌离心管中。用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)再抽提一次，将上清转移至新的离心管，加入1/10体积的8M的LiCl，混匀，置冰上1小时。然后，4℃，12000rpm离心10分钟。取上清，加入2.5倍体积无水乙醇，混匀后-80℃放置30分钟。4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀块用75％乙醇洗涤2次，室温干燥后溶于1×TE缓冲液(10mM的Tris-HCl(pH8.0)，10mM的EDTA)中备用。(b)用于PCR扩增GXCR的ITS序列的引物引物按文献报道设计[70，71]，引物由上海生工公司合成。引物15’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQIDNO1)引物25’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQIDNO2)(c)PCR扩增[70]反应体系10×缓冲液(Takara公司)10μldNTPs(Takara公司)4μlGXCR菌体的DNA模板20μg/2μl引物1(25pM)4μl引物2(25pM)4μlDMSO(二甲亚砜)6μlTaq-酶(5U/μl)(Takara公司)1μl灭菌去离子水(ddH2O)69μl总体积100μlPCR反应条件第一阶段95℃，2分钟；第二阶段(35个循环)96℃，30秒，55℃，1分钟，72℃，1分钟第三阶段72℃，10分钟。PCR产物回收PCR产物用0.8％琼脂糖凝胶，5v/cm条件下电泳1小时，溴乙锭染色后，长波长紫外灯下切取600bp处的目标DNA带，用华瞬公司的胶回收试剂盒回收DNA。将回收产物溶于30μl的1×TE缓冲液中备用。(d)PCR产物的克隆试剂采用上海生工公司的pUCM-TVector试剂盒，并按说明书使用。胶回收PCR产物回收后，连接克隆到pUCM-T载体。连接反应体系如下10×连接缓冲液1μlpUCm-T载体1μl胶回收的PCR产物1μl(10μg)灭菌ddH2O6μlT4DNA连接酶1μl(1U)总体积10μl连接温度条件将连接反应体系液放在16℃，24小时。连接产物的纯化将连接液在65℃放置5分钟中止反应。加入1/10体积5M的醋酸钾(KAc)和2倍体积无水乙醇。-80℃放置30分钟以上(或20℃过夜)。离心，去上清，沉淀用75％乙醇洗涤4～5次，12000pm离心，小心吸取残余的乙醇液。室温干燥后，溶于5μl的ddH2O中。转化将5μl连接好的重组载体DNA(PUCm-ITSDNA片段)水溶液，与40μl的EscherichiacoliJM109感受态细胞(Takara公司)混匀后，移入预冷的电脉冲杯中，200Ω、25μD、12.5KV/cm电击，电击后马上在电脉冲杯中加入1ml预冷的SOC培养基(InvitrogenTM公司)，加盖摇匀后吸出菌液，37℃摇床培养1小时，将细菌涂布在含有氨苄青霉素Amp(100μg/ml)且表面预先用20μl的100mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(上海生工公司)和100μl的20mg/mlX-gal(上海生工公司)涂布的LA培养基平板上，37℃培养16小时。挑取白色转化子菌落转接于含有氨苄青霉素Amp(100μg/ml)，的LA培养基平板上，37℃培养16小时后，4℃保存。转化子的质粒提取挑取白色的转化子菌落，接种在含有Amp的10ml的LB培养基中，37℃摇床培养16小时。然后用快速碱裂解法提取质粒[72]，用PstI酶切(Promega公司)，0.7％琼脂糖凝胶电泳，将连接有600bp左右的DNA片段的转化子菌体克隆保存备用。之后，用快速碱裂解法提取这些白色转化子的质粒用于测序。DNA测序委托上海基康生物工程公司进行。序列参见图1。如此获得了GXCR的ITS序列(SEQIDNO3)，DNA测序结果表明，GXCR的ITS序列全长586bp(图1)。利用Genbank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中的核苷酸同源行分析软件BlastN对GXCR的ITS序列进行同源比较分析发现，GXCR的ITS序列与102株已报道的Penicilliumspp.的ITS序列有≥97％的一致性，其中与PenicilliumjanthinellumATCC4845的ITS序列(Genbank索引号AY373921)同源性最高同源性得分值(Score)＝1134，E值(Expect)＝0.0，一致性(Identities)＝586/588(99％)，间隔(Gaps)＝2/588(0％)。据此结果并结合形态鉴定，将GXCR鉴定为微紫青霉菌株(Penicilliumjanthinellum)，编号为GXCR，全称为PenicilliumjanthinellumGXCR。3)微紫青霉菌株GXCR的生长温度和pH范围在500ml的三角瓶中，加入200ml的PDL培养基，之后，接种105个微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，在不同温度下，培养7天，用210目筛绢过滤收集菌体，收集的菌体置于65℃烘烤4小时后称重，根据该菌的菌体干重(g/L)，可知该菌的生长温度范围为22-42℃，最佳生长温度为32℃(图2)；在最佳生长温度32℃条件下，按同样的方法，测定菌体干重，根据该菌的菌体干重(g/L)，可知该菌的生长的pH范围为2.0-9.0，最佳生长pH为5.0(图3)。4)微紫青霉菌株GXCR菌株与其它参考菌株的抗铜性比较为了验证GXCR菌株的高抗铜盐的能力，我们作了如下对比试验。例1将微紫青霉菌株GXCR菌体、购自Invitrogen公司的2株酵母Pichiapastoris、P.methanolica和Saccharomycescereivisae分别接种于含40mM的Cu的PDA和不添加Cu的PDA培养基，置于32℃培养5天。结果发现，只有微紫青霉菌株GXCR既可同时在含40mM的Cu的PDA和不添加Cu的PDA培养基上同时生长。三种酵母菌不能在含40mM的Cu的PDA培养基上生长，只能在不添加Cu的PDA培养基上生长(表1)。表1微紫青霉菌株GXCR与其它酵母菌的生长比较+生长；-不生长例2将微紫青霉菌株GXCR菌体和购自中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC(中国科学院微生物研究所)的3株恶臭假单孢菌(Pseudomonasputida)1.761、恶臭假单孢菌(P.putida)1.781和恶臭假单孢菌(P.putida)1.924；购自Invitrogen公司的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH10B和购自TakaRa公司的大肠杆菌JM109分别接种于含40mM的Cu的PDA和不添加Cu的PDA培养基，置于32℃培养5天。结果发现，只有微紫青霉菌株GXCR既可同时在含40mM的Cu的PDA和不添加Cu的PDA培养基上同时生长。3株假单孢菌和2株大肠杆菌均不能在含40mM的Cu的PDA培养基上生长，只能在不添加Cu的PDA培养基上生长(表2)。表2微紫青霉菌株GXCR与其细菌菌株的生长比较+生长-不生长例3将未预先接种任何菌体的和接种了微紫青霉菌株GXCR菌体的含40mM的Cu的PDA、40mM的Cu的LA、不添加Cu的PDA、和不添加的Cu的LA培养基平板(培养均盛在培养皿)，然后不盖皿盖，在培养基表面放置一团湿棉球，然后，置于室外(温度约为夜28-昼37℃)放置10天(培养期间保持棉球湿润，维持培养基不干燥)。结果是在40mM的Cu的PDA、40mM的Cu的LA培养基上只有微紫青霉菌株GXCR菌体生长，而无其它杂菌出现。在不添加Cu的PDA、和不添加的Cu的LA培养基平板，除预先接种的微紫青霉菌株GXCR的菌落外，尚有大量的杂菌的菌落出现(表3)。这些结果在一定程度上说明了GXCR是一株高抗Cu菌株。表3暴露在空气中的PDA和LA培养基上的菌体培养结果+有菌落形成；-无菌落形成5)微紫青霉菌株GXCR对金属盐的抗性特征a)pH与微紫青霉菌株GXCR的对单一金属盐抗性在500ml的三角瓶中，加入200ml的含金属盐的不同pH的PDL培养基，之后，接种105个微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，32℃下培养7天，用210目筛绢过滤收集菌体，收集的菌体置于65℃烘烤4小时后称重，该菌的菌体干重(g/L)。在测试盐浓度条件下(40mM的Cu、2mM的Cr6+、5mM的Pb和40mM的Zn)，该菌对Cu、Cr6+和Pb的抗性随pH增大而下降，在pH为3时，其抗性最强。但是，在pH为6时，对Zn的抗性最强，总体上pH的变化对该菌的Zn的抗性影响不大(图4)。b)限制微紫青霉菌株GXCR生长的金属盐的最小浓度用灭菌的打孔器(直径0.2cm)从不含Cu的PDA培养基平板上32℃培养5天的微紫青霉菌株GXCR菌落边缘打菌饼，将菌饼接种于含不同浓度金属盐的PDA培养基(自然pH)上，32℃培养7天，同时以不添加金属盐的PDA培养物作平行对照，观察菌落的生长状况；在500ml的三角瓶中，加入200ml的含不同金属盐的PDL培养基(自然pH)，之后，接种105个微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，32℃，150rpm摇床培养7天，同时以不添加金属盐的PDL培养物作平行对照。根据PDA培养基上的是否有明显的菌落生长及PDL培养基中是否有菌丝体形成判断限制微紫青霉菌株GXCR生长的各金属盐的浓度。结果见表4。表4限制微紫青霉菌株GXCR生长的金属盐的最小浓度*重复3次c)微紫青霉菌株GXCR对三种金属盐混合物的抗性在500ml的三角瓶中，加入200ml的含不同浓度、不同种金属盐的PDL培养基(自然pH)，之后，接种105个微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，32℃，150rpm摇床培养5天，同时以不添加金属盐的PDL培养物作平行对照。用210目筛绢过滤收集菌体，收集的菌体置于65℃烘烤4小时后称重，该菌的菌体干重(g/L)。根据正交实验(L9(43))结果，在设计的盐浓度(20mM和40mM的Cu，1mM和3mM的Cd，1mM和3mM的Pb，100mM和200mM的Zn)条件下(表5)，表6结果表明，各处理间的F值的大小顺序为AF＞CF＞BF＞DF，其AF、CF和BF值均大于F0.01(2，10)＝7.56，达到极显著差异，但处理D的值DF小于F0.05(2，10)＝4.10，未达到显极著差异水平。说明，在本设计浓度下的单一金属盐对该菌的生长影响的顺序为Cu＞Cd＞Zn＞Pb(表6)。Dunca’sLSR(表7)及方差分析(表8)结果表明该菌在含3mM的Cd-3mM的Pb-200mM的Zn(处理3)，20mM的Cu-1mM的Pb-200mM的Zn(处理6)、40mM的Cu-3mM的Pb-100mM的Zn(处理8)或40mM的Cu-1mM的Cd-200mM的Zn(处理9)混合盐的PDL培养基中能够生长。在含20mM的Cu-1mM的Cd-3mM的Pb(处理4)混合盐的PDL培养基中生长相对较差。但不能在含20mM的Cu-3mM的Cd-100mM的Zn(处理5)或40mM的Cu-3mM的Cd-1mM的Pb(处理7)混合盐的PDL培养基中生长。表5.三种金属盐组合对微紫青霉菌株GXCR生长影响的正交实验(L9(43))DM干菌体表6.因素(Cu、Cd、PbandZn)之间的方差分析*F0.05(2，10)＝4.10；F0.01(2，10)＝7.56**极显著差异表7.Dunca’s新复极差测验中的LSR值表8.不同的金属盐混合物处理间的微紫青霉菌株GXCR菌体干重的显著性比较※※大于LSR0.01值，达到极显著差异d)金属盐之间的相互作用对微紫青霉菌株GXCR生长的影响i)Mn的存在能显著提高GXCR对Cu的抗性用灭菌的打孔器(直径0.2cm)从不含Cu的PDA培养基平板上32℃培养5天的微紫青霉菌株GXCR菌落边缘打菌饼，将菌饼接种于含不同浓度(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu、(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Mn和(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Mn-添加有机营养(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培养基(自然pH)上，32℃培养7天，观察菌落的生长状况。结果表明，微紫青霉菌株GXCR可在含800mM的Cu-5mM的Mn的PDA固体培养基上生长(图5，B)；在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Mn-添加有机营养(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培养基上的菌落虽然较小但却明显的致密(图5，C)。表明Mn能有效提高微紫青霉菌株GXCR对Cu的抗性。ii)Zn或Al与Cu同时存在时，未对微紫青霉菌株GXCR的生长产生无毒性协同效应用灭菌的打孔器(直径0.2cm)从不含Cu的PDA培养基平板上32℃培养5天的微紫青霉菌株GXCR菌落边缘打菌饼，将菌饼接种于含不同浓度(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu、(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Zn/Al和(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Zn/Al-添加有机营养(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培养基(自然pH)上，32℃培养7天，观察菌落的生长状况。图6结果表明，与在只含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu的PDA上PenicilliumjanthinellumGXCR菌落相比较(图6，A)，在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Zn的PDA培养基上的菌落大小没有明显的变化(图6，B)，表明Zn与Cu同时存在时，未对微紫青霉菌株GXCR的生长产生毒性协同效应。与在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Zn的PDA培养基上的菌落相比(图6，B)，在(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Zn-添加有机营养(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培养基上的菌落无明显的变化，但菌落明显致密(图6，C)。与在只含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu的PDA上微紫青霉菌株GXCR菌落相比较(图6，A)，在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Al的PDA培养基上的菌落大小没有明显的变化(图6，D)，表明Al与Cu同时存在时，未对微紫青霉菌株GXCR的生长产生毒性协同效应。与在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Al的PDA培养基上的菌落相比(图6，D)，在(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-5mM的Al-添加有机营养(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培养基上的菌落明显的致密(图6，E)。iii)Cd与Cu同时存在时，对微紫青霉菌株GXCR的生长产生显著的毒性协同效应用灭菌的打孔器(直径0.2cm)从不含Cu的PDA培养基平板上32℃培养5天的微紫青霉菌株GXCR菌落边缘打菌饼，将菌饼接种于含不同浓度(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu、(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-2mM的Cd和(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-2mM的Cd-添加有机营养(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培养基(自然pH)上，32℃培养7天，观察菌落的生长状况。与在只含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu的PDA上微紫青霉菌株GXCR菌落相比较(图7，A)，在含(40mM、200mM、400mM和800mM)Cu-2mM的Cd的PDA培养基上的菌落明显变小，菌体的几乎不能生长(图7，B)，表明Cd与Cu同时存在时，对微紫青霉菌株GXCR的生长产生强烈的毒性协同效应。与在含200mM的Cu-2mM的Cd的PDA培养基上的菌落相比(图7，B)，在200mM的Cu-2mM的Cd-添加有机营养(1％的胰蛋白胨；0.5％的酵母提取物)的PDA培养基上的菌落明显较大而且致密(图7，C)。上述结果同时也说明，有机营养能够有效提高微紫青霉菌株GXCR对金属盐的抗性。6)微紫青霉菌株GXCR对Cu的富集及Cu2+化合物的析出用灭菌的打孔器(直径0.2cm)从不含Cu的PDA培养基平板上32℃培养5天的微紫青霉菌株GXCR菌落边缘打菌饼，将菌饼接种于含40mM的Cu的PDA培养基上，32℃，培养20天时，微紫青霉菌株GXCR的菌落表面出现在自然光下呈现金属光泽的蓝色的结晶物(图8C1，C2，D)，而在不添加Cu的PDA培养基上的微紫青霉菌株GXCR的对照菌落表面无此现象(图8A，B)。切取在含40mM的Cu的PDA和不含Cu的PDA培养基上，32℃，培养20d时，培养的微紫青霉菌株GXCR的3块(大小为0.1×0.1×0.1cm)菌块(连同菌落下的PDA培养基)，表面喷金后，用日本日立S-570型扫描电镜(SEM)扫描观察。电镜扫描结果表明在含40mM的Cu的PDA上的微紫青霉菌株GXCR菌丝体表面有存在大量的结晶体并填充着菌丝体之间的空间(图9B1-4)，但是在未添加Cu的PDA上生长的微紫青霉菌株GXCR菌体表面无结晶体存在(图9A1-2)；用日本菲利浦PV9900型能谱分析仪(EDAX)分析的结果表明未添加Cu的PDA及在未添加Cu的PDA上的微紫青霉菌株GXCR的气生菌落无Cu2+峰(图10A1，A2)，在含40mM的Cu的PDA上的微紫青霉菌株GXCR的菌块的正面(即有气生菌丝的菌块的面)的Cu2+的能谱峰值很高(图10B1)，相反，对应于同一菌块的反面(即菌块的无菌丝的面)检测到Cu2+的能谱峰值很低(图10B2)。这一结果表明，培养基中添加的Cu已被的微紫青霉菌株GXCR菌丝体富集、吸收并分泌(析出)到菌体细胞表面。因而，导致添加了Cu的PDA培养基中Cu含量降低。7)微紫青霉菌株GXCR对Cu的生物吸附和在其细胞内Cu的累积注其中Cu离子浓度的测定采用原子吸收法[73]i)连续的长时间培养条件下的生物吸附和累积在500ml的三角瓶中，加入200ml的含不同浓度Cu的PDL培养基(自然pH)，之后，接种105个微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，28℃，150rpm摇床培养5天，用210目筛绢过滤收集菌体之后再用滤纸包住菌丝体，反复挤压至无残液。将菌体转入三角瓶中，加入100ml的50mM的Tris-HCl和20mM的EDTA(pH7.0)混合液，磁力搅拌器充分打散菌体，再将三角瓶放置在28℃摇床，200rpm震摇10分钟，用210目筛绢过滤收集菌体和收集残的洗脱液，再用锡箔纸包住菌丝体，反复挤压并收集残余的洗脱液之后，5000rpm离心5分钟，分别收集菌体和合并所有洗脱液，用合并的洗脱液按同样的方法重复洗脱菌体4次，最后合并收集的洗脱液并定容至100ml。洗脱后收集的菌体置于65℃烘烤4小时。用原子吸收法分别测定滤液中的Cu(生物吸附)和菌体细胞中的Cu(生物体内的累积)量。测定结果表明，菌体表面对Cu的生物吸附和细胞内的Cu的积累是浓度依赖型的。在20-40mM的Cu浓度下，菌丝表面对Cu的生物吸附量分别为26.0mgCu/g干菌体和26.19mgCu/g干菌体。但是在60mM的Cu浓度时，细胞内的Cu的累积达到最大，但仅为0.176mgCu/g干菌体。因此，与最大Cu的生物吸附量相比，细胞内的Cu的累积几乎可以忽略不计(图11)。ii)在含Cu的去离子水中，碱预浸泡处理的和未预处理(自然状态的)的菌体对Cu的快速生物吸附在500ml的三角瓶中，加入200ml的PDL培养基，之后，接种105个微紫青霉菌株GXCR的分生孢子，28℃，150rpm摇床培养5天，用210目筛绢过滤收集菌体之后再用滤纸包住菌丝体，反复挤压至无残液，5000rpm离心5分钟。将离心后的菌体分两份一份转入200ml的0.2M的NaOH溶液中，磁力搅拌器充分打散菌体，静置30分钟，用210目筛绢过滤收集菌体之后再用滤纸包住菌丝体，反复挤压至无残余NaOH液，然后取其中的1.5g菌体转入200ml的含不同浓度的Cu的去离子水中，磁力搅拌器充分打散菌体，28℃，150rpm摇床培养30分钟后，用210目筛绢过滤收集菌体并用锡箔纸包住菌丝体，反复挤压至无残余液，然后将菌体转入三角瓶中，加入100ml的50mM的Tris-HCl和20mM的EDTA(pH7.0)，磁力搅拌器充分打散菌体，200rpm震摇10分钟，用210目筛绢过滤收集菌体之后再用滤纸包住菌丝体，反复挤压至无残余液，分别收集菌体和合并所有洗脱液，用合并的洗脱液按同样的方法重复洗脱菌体4次，最后合并收集的洗脱液并定容至100ml。与此同时，用同样的方法处理一株作为参照柑桔上的桔青霉Penicilliumcitrinum3.4039(中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC，中国科学院微生物研究所)。用原子吸收法分别测定滤液中的Cu含量(代表生物吸附量)。测定结果表明，无论是0.2MNaOH预浸泡处理30分钟的微紫青霉菌株GXCR和0.2MNaOH预浸泡处理30分钟的参照桔青霉菌体还是未预浸泡处理(自然状态的)的微紫青霉菌株GXCR和未预浸泡处理(自然状态的)的参照的微紫青霉菌株的菌体，在测试的0-20mM的Cu浓度范围内，其生物吸附能力均随着Cu浓度的的增加而增加，而且0.2mM的NaOH预浸泡处理的微紫青霉菌株GXCR菌体的Cu的生物吸附大约是未经0.2mM的NaOH预浸泡处理的微紫青霉菌株GXCR菌体的3倍(图12)。在20mM的Cu浓度时微紫青霉菌株GXCR菌体和参照桔青霉的菌体，生物吸附量最大，0.2mM的NaOH预浸泡处理30分钟的微紫青霉菌株GXCR菌体对Cu的生物吸附可达76.9mgCu/g干菌体，未用0.2M的NaOH预浸泡处理的微紫青霉菌株GXCR菌体则为38.1mgCu/g干菌体(图12)；0.2M的NaOH预浸泡处理30分钟的参照的桔青霉菌体生物吸附量为8.98mgCu/g干菌体，未用0.2M的NaOH预浸泡处理的参照的桔青霉菌体生物吸附量仅为7.67mgCu/g干菌体。微紫青霉菌株GXCR的0.2M的NaOH预浸泡处理的菌体的生物吸附量是0.2M的NaOH预浸泡处理的参照菌株桔青霉的菌体的生物吸附量的8.65倍。未经0.2M的NaOH预浸泡处理的微紫青霉菌株GXCR的菌体的生物吸附量是未经0.2M的NaOH预浸泡处理的参照的桔青霉菌体生物吸附量的4.9倍(图12)。从图12的曲线图的走势分析，随着Cu浓度的进一步提高，Cu的吸附量有进一步提高的可能。参考文献1.ValentineSJandGrallaEB(1997)EnhancedDeliveringCopperInsideYeastandHumanScience.278817-818.2.EnnifarE，WalterP，DumasP(2003)Acrystallographicstudyofthebindingof13metalionstotworelatedRNAduplexes.NucleicAcidsRes.31(10)2671-2682.3.OHalloranTVandCulottaVC(2000)Metallochaperones，anIntracellularShuttleServiceforMetalIons.JBiolChem.275(33)25057-25060.4.CulottaVC，JohHD，LinSJ，etal.(1995)AphysiologicalroleforSaccharomycescerevisiaecopper/zincsuperoxidedismutaseincopperbuffering.JBiolChem.27029991-29997.5.FogartyRV，TobinJM(1996)Fungalmelaninsandtheirinteractionswithmetals.EnzymeMicrobTechnol.19(4)311-317.6.RadiskyD，andKaplanJ(1999)Regulationoftransitionmetaltransportacrosstheyeastplasmamembrane..JBiolChem.2744481-4484.7.PeaMMO，LeeJ，andThieleDJ(1999)ADelicateBalanceHomeostaticControlofCopperUptakeandDistribution.JNutr.1291251-1260.8.BeaudoinJandLabbéS(2001)TheFissionYeastCopper-sensingTranscriptionFactorCuflRegulatestheCopperTransporterGeneExpressionthroughanAcel/Amtl-likeRecognitionSequencJBiolChem.276(18)15472-15480.9.HimelblauE，MiraH，LinSJ，etal.(1998)，IdentificationofaFunctionalHomologoftheYeastCopperHomeostasisGeneATX1fromArabidopsis，PlantPhysiol.117(4)1227-1234.10.DeFreitasJ，WintzH，KimJH，etal.(2003)Yeast，amodelorganismforironandcoppermetabolismstudies.Biometals.16(1)185-197.11.RadiskyDandKaplanJ(1999)RegulationofTransitionMetalTransportacrosstheYeastPlasmaMembrane.JBiolChem，84481-4484.12.GlerumDM，ShtankoAandTzagoloffA(1996)CharacterizationofCOX17，aYeastGeneInvolvedinCopperMetabolismandAssemblyofCytochromeOxidase.JBiolChemJun.271(24)14504-14509.13.CulottaVC，LinSJ，SchmidtP，etal.(1999)Interacellularpathwaysofcoppertraffickinginyeastandhumans.Adv.ExpMedBiol.448247-254.14.VulpeCDandPackmanS.(1995)Cellularcoppertransport.AnnuRevNutr.15293-322.15.丛艳国，魏立华(2002)土壤环境重金属污染来源的现状分析，现代农业，118-20.16.夏立江，华珞，李向东(1998)重金属污染生物修复机制及研究进展，核农学报，12(1)59-64.17.陈素华，孙铁，周启星，吴国平(2002)微生物与重金属之间的相互作用及其应用研究，应用生态学报，13(2)239-24219.18.KochK，PenaM，ThieleDJ(1997)Copper-bindingmotifsincatalysisi，transport，detoxificationandsignaling.ChemBiol.4549-560.19.EideDJ(1998)ThemolecularbiologyofmetaliontransportinSaccharomycescerevisiae.AnnuRevNutr.AnnuRevNutr.18441-469.20.Labbé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