专利名称：东北虎毛发dna的提取方法及微卫星dna标记引物序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及东北虎毛发DNA的提取方法及微卫星DNA标记引物序列，特别适用于东北虎DNA分析，也可用于东北虎种群分析和亲子鉴定等领域。
背景技术：
东北虎被国际自然和自然资源保护联盟(IUCN)列为濒危级，属于国家一级重点保护野生动物，国内野生东北虎数量很少，仅在10只左右。饲养东北虎中存在近亲交配的现象，且常采用一雌多雄的交配方式，所产生的后代中可能有2个或以上的父亲，因而导致了血缘关系混乱，谱系不清，因此进行东北虎的遗传学研究对东北虎物种的保护具有重要意义。目前，对东北虎进行遗传分析的分子方法仅仅包括线粒体、染色体、血清同工酶等方面的研究，这些标记的变异率较低，对样品DNA的要求相对较严格，因而受到灵敏度和样品来源的双重限制。微卫星DNA标记是指1～6个碱基的串联重复，分布于真核生物的整个基因组。该标记具有分布广泛、变异度极高、易于检测和重复序列两端保守性较高等特点，因而被广泛应用于分子生态学、遗传学等研究领域。
为了利用微卫星DNA标记方法进行东北虎遗传学研究，特别是进行东北虎的遗传多样性、个体识别和亲子鉴定的研究，为东北虎种群的保护提供遗传学依据，需要提取东北虎DNA样品，并获得准确、可靠的引物序列。
目前大多数DNA的提取方法都对样品材料的要求较严格，需要有足够的样品量，而不利于某些特殊领域的研究，例如珍稀濒危或性情凶猛动物的DNA分析、司法中的物种鉴定等，限制了这些工作的进展。同时，在已有的DNA提取方法中，有一类方法就是利用现成生产的试剂盒进行提取，如中国专利01130127和中国专利01107305、01127872。这些试剂盒虽然能快速提取DNA，但是一般适用于血样或其他损伤性组织等提取材料，不适用于非损伤性DNA提取。
《东北林业大学学报》第28卷第7期第72-77页、《遗传》第23卷第3期第217-219页、《山东畜牧兽医》1999年第2期第1-2页以及中国专利97107478等曾分别提出了从朱鹮、大熊猫等动物毛发提取DNA的方法，进行动物的种群分析、性别鉴定等。
基于上述背景现状和实际要求，本发明提供一种方法，以利用常规的生化试剂，从东北虎毛发中提取DNA，并通过PCR扩增，获得东北虎微卫星DNA标记引物序列，可用于东北虎种群分析和亲子鉴定。
发明内容
为了对东北虎进行DNA分析，本发明提供了一种东北虎毛发DNA的提取方法，并以获得DNA样品通过PCR扩增，获得东北虎微卫星DNA标记引物序列。
该方法是利用常规的生化试剂，经过溶解、离心、沉淀和干燥后，低成本地从毛发获得DNA。与现有方法相比，对所用试剂的配比和方法、过程进行了改进，实现两次重复分离提纯。具体技术方案是将毛发的根部放入灭菌的离心管中，用双蒸水冲洗后，无水乙醇浸洗，室温干燥；加入0.5ml含有三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠(NaCl)的混合液，其中还含十二烷基苯磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)和蛋白酶K，得到液体A，于37℃水浴保温过夜；然后对液体A进行两次提取第一次在A中加入等体积饱和酚，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液B1，并且重复此步骤一次得到溶液B2；第二次在B2中加入等体积氯仿，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液C1，然后重复此步骤一次得到溶液C2；在C2中加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的冰无水乙醇，-20℃过夜；高速离心10分钟弃上清获得D，用70％冰乙醇洗D-次，离心8分钟真空干燥后，再溶于适量的缓冲液中获得DNA样品E，并于-20℃保存。
在DNA样品E中，利用微卫星DNA标记特异性引物通过PCR扩增(聚合酶链式反应)获得微卫星DNA标记引物序列Pti0025’-GCATCTAATATCTTGCCTG-3’；5’-TTCTGAAATAGGATTGGC-3’；Pti0035’-CCTTCCAGGATGCCACTC-3’；5’-TTATTCTCATGCACATTTTCAGA-3’；Pti0075’-ATCAGGAGTTCTATCACC-3’；5’-CATGATTAGGGAGTTGAG-3’；Pti0105’-GGGACAACTGAGAGAAGA-3’；5’-CAAGATATGTTCTCAGACTG-3’。
具体实施例方式
本发明的具体实施方式
是将毛发的根部放入灭菌的离心管中，用双蒸水冲洗后，无水乙醇浸洗，室温干燥；加入0.5ml含有三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠(NaCl)的混合液，其中还含十二烷基苯磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)和蛋白酶K，得到液体A，于37℃水浴保温过夜；然后对液体A进行两次提取第一次在A中加入等体积饱和酚，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液B1，并且重复此步骤一次得到溶液B2；第二次在B2中加入等体积氯仿，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液C1，然后重复此步骤一次得到溶液C2；在C2中加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的冰无水乙醇，-20℃过夜；高速离心10分钟弃上清获得D，用70％冰乙醇洗D一次，离心8分钟真空干燥后，再溶于适量的缓冲液中获得DNA样品E，并于-20℃保存。
在DNA样品E中，利用微卫星DNA标记特异性引物通过PCR扩增(聚合酶链式反应)获得微卫星DNA标记引物序列Pti0025’-GCATCTAATATCTTGCCTG-3’；5’-TTCTGAAATAGGATTGGC-3’；Pti0035’-CCTTCCAGGATGCCACTC-3’；5’-TTATTCTCATGCACATTTTCAGA-3’；Pti0075’-ATCAGGAGTTCTATCACC-3’；5’-CATGATTAGGGAGTTGAG-3’；Pti0105’-GGGACAACTGAGAGAAGA-3’；5’-CAAGATATGTTCTCAGACTG-3’。
权利要求
1.东北虎毛发DNA的提取方法及微卫星DNA标记引物序列，其特征是将东北虎毛发的根部放入灭菌的离心管中，用双蒸水冲洗后，无水乙醇浸洗，室温干燥；加入0.5ml含有三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化钠(NaCl)的混合液，其中还含十二烷基苯磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)和蛋白酶K，得到液体A，于37℃水浴保温过夜；然后对液体A进行两次提取第一次在A中加入等体积饱和酚，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液B1，并且重复此步骤一次得到溶液B2；第二次在B2中加入等体积氯仿，中速离心10分钟后抽提上清液得到溶液C1，然后重复此步骤一次得到溶液C2；在C2中加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5倍体积的冰无水乙醇，-20℃过夜；高速离心10分钟弃上清获得D，用70％冰乙醇洗D一次，离心8分钟后真空干燥，溶于适量的缓冲液中得到DNA样品E，并于-20℃保存；通过PCR扩增从E获得东北虎微卫星DNA标记引物序列。
2.根据权利要求1所述的东北虎微卫星DNA标记引物序列，其特征是引物序列为Pti0025’-GCATCTAATATCTTGCCTG-3’5’-TTCTGAAATAGGATTGGC-3’；Pti0035’-CCTTCCAGGATGCCACTC-3’5’-TTATTCTCATGCACATTTTCAGA-3’；Pti0075’-ATCAGGAGTTCTATCACC-3’5’-CATGATTAGGGAGTTGAG-3’；Pti0105’-GGGACAACTGAGAGAAGA-3’5’-CAAGATATGTTCTCAGACTG-3’。
全文摘要
东北虎毛发DNA的提取方法及微卫星DNA标记引物序列。将毛发的根部放入灭菌的离心管中，分别用双蒸水冲洗和无水乙醇浸洗，室温干燥；加入0.5ml含有Tris－HCl、EDTA、NaCl的混合液，其中还含SDS、DTT和蛋白酶K，得到液体A；对液体A进行两次提取，多次分离后，最后获得DNA样品E；从E获得东北虎微卫星DNA标记引物序列为Pti0025’－GCATCTAATATCTTGCCTG－3’5’－TTCTG AAATAGGATTGGC－3’；Pti0035’－CCTTCCAGGATGCC ACTC－3’5’－TTATTCTCATGCACATTTTCAGA－3’；Pti0075’－ATCAGGAGTTCTATCACC－3’5’－CATG ATTAGGGAGTTGAG－3’；Pti0105’－GGGACAA CTG AGAGAAGA－3’5’－CAAGATATGTTCTCAGACTG－3’。
文档编号C12P19/00GK1706958SQ20041004790
公开日2005年12月14日 申请日期2004年6月10日 优先权日2004年6月10日
发明者李迪强, 张于光 申请人:李迪强, 张于光