专利名称：原始干细胞亚群分离，诱导分化及其治疗心血管疾病的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及首次利用5-氮胞杂苷诱导骨髓原始干细胞亚群向心肌细胞分化，利用血管内皮生长因子VEGF-B诱导原始干细胞亚群向血管内皮细胞分化，并应用于体内治疗急性心肌梗塞。从骨髓中分离、培养的原始干细胞亚群是一类亚全能干细胞，具有分化为心血管组织的潜能。体外经诱导的原始干细胞亚群表达肌凝蛋白重链和肌钙蛋白I，表达VIII因子相关抗原和CD31。在体内标记的原始干细胞亚群表达阳性的肌凝蛋白重链和VIII因子相关抗原，分化为心肌和血管内皮细胞。对急性心肌梗死患者PCI术后自体原始干细胞亚群行冠脉内注射，比较对照组检测表明患者心功能及预后明显改善。这就为心血管再生医学提供理想种子细胞，为治疗心血管疾病，特别是治疗急性心肌梗塞提供了新方法。
目前，我国已经进入老龄化社会，心血管疾病的发病率、致死率呈逐年上升趋势，心血管疾病成为人类三大死亡原因之一。现在临床上对其进行治疗的药物、介入和手术等常用方法较难纠正已经坏死和衰老的心血管组织，而心血管组织自身修复能力有限的。替代治疗为另一种治疗策略，分为器官移植和细胞移植。由于器官来源不足、免疫排斥、费用高昂，严重限制了器官移植的应用。干细胞具有自我更新和多分化能力，为细胞移植的理想细胞，其中，骨髓原始干细胞亚群由于其易获得、扩增等诸多优点，成为首选种子细胞。本发明在国际上首次将骨髓原始干细胞亚群分别在体外和体内诱导分化为心肌和血管内皮细胞，并建立了原始干细胞亚群分离培养及诱导的有效方法，为用于细胞移植以治疗心血管疾病，特别是急性心肌梗塞提供了新的途径。
本发明的目的是通过下述方法实现的一.骨髓原始干细胞亚群的分离和培养
取胎儿骨髓，用Ficoll-Paque(1.077g/ml)分离液分离出单个核细胞，离心取白环及白环上下细胞，将离心后的细胞打散并以1×107个/ml细胞接种在塑料培养瓶内。用含有胎牛血清、抗坏血酸的扩增培养液在含5％的CO2，37℃培养箱内孵育。3天后胰酶消化传代扩增。
二.原始干细胞亚群的免疫表型和细胞周期测定用间接免疫荧光法(FITC荧光标记抗体)检细胞的表型。流式细胞仪测定原始干细胞亚群的周期。结果显示，CD29、CD44、CD105、CD166、Flk-1为阳性，内皮细胞表型vWF、CD31和造血细胞表型CDlla、CD34、CD45均为阴性，HLA-DR亦阴性，见
图1A。通过流式细胞仪分析细胞周期，约95.61％细胞处在G0/G1期，而处在G2-M期和S期的细胞分别为1.65％和2.74％，见图1B。
三.原始干细胞亚群体外分化为心肌细胞和免疫荧光检测将第一代原始干细胞亚群接种贴壁后，加入5-氮胞杂苷(5-aza，5-azacytidine，Sigma公司)24小时后洗去，换用培养基，每3天换液。4周后固定，以红色荧光PE或绿色荧光FITC标记的抗体行免疫荧光检测。研究结果发现经5-aza诱导后，部分原始干细胞亚群更加细长，逐渐相连呈肌管状，但未见自发性跳动。免疫荧光检测结果提示，诱导后的原始干细胞亚群表达心肌细胞特异性蛋白心肌凝蛋白重链和肌钙蛋白I，已分化为心肌细胞，见图2A。
四.原始干细胞亚群体外分化为血管内皮细胞和免疫荧光检测用fibronectin铺底，将第一代原始干细胞亚群接种于24孔板中，加入扩增培养液。贴壁后，换用诱导培养液(不含血清和EGF，但含10ng/ml的VEGF-B)，每3天换液。2周后固定，行免疫荧光检测。经VEGF-B诱导后，部分原始干细胞亚群逐渐聚集，逐渐变得扁平。经抗vWF和CD31的免疫荧光检测，分化的细胞为阳性，提示已分化为血管内皮细胞，见图2B。
五.心肌损伤模型的建立、原始干细胞亚群的注入和体内分化检测选用4只免疫功能严重缺陷的NOD/SCID小鼠(购于中国医学科学院实验动物研究所)，腹腔注射异丙肾上腺素(20mg/kg)一次，制成心肌损伤模型。标记原始干细胞亚群方法为，嘧啶的类似物溴化脱氧尿嘧啶(BrdU，Sigma公司)或荧光PKH26(Sigma公司)。2只小鼠的原始干细胞亚群的标记为BrdU；另2只小鼠给其原始干细胞亚群进行PKH26荧光染色。取原始干细胞亚群经尾静脉缓慢注入。1月后，断颈处死，取出心脏，PKH26荧光标记的小鼠心脏，冰冻切片查荧光可检测到PKH26阳性的细胞，见图3；BrdU标记的小鼠心脏，石蜡切片经免疫荧光检测，可见BrdU标记阳性的细胞心肌凝蛋白重链表达阳性，提示在体内已分化为心肌细胞，并可见和原心肌细胞排列一致，端端相连，见图4A；可见BrdU标记阳性的细胞也表达vWF，提示在体内已分化为血管内皮细胞，见图4B。
六.骨髓原始干细胞亚群诱导分化为心血管组织的应用例作(一)骨髓原始干细胞亚群治疗急性心肌梗塞的实验研究1.原始干细胞亚群的分离、培养和标记选用20-30kg雄性家猪，心梗制作成功后存活者按心梗次序随机分为治疗组和对照组。在无菌条件下抽取髂骨骨髓，分离出原始干细胞亚群体外培养。注射前2天，在培养液中加入BrdU标记；部分猪，在注射前，给具原始干细胞亚群进行PKH26荧光染色。用间接免疫荧光法检测，CD105、CD44、CD29为阳性，内皮细胞表型vWF、CD31和造血细胞表型CD34、CD45均为阴性。流式细胞周期结果显示，约92.00％细胞处在G0/G1期，而处在G2-M期和S期的细胞分别为4.74％和3.25％。
2.急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)模型的制作和细胞注入
氯氨酮麻醉后，送入心导管室，建立耳缘静脉通道，给予咪达唑仑维持麻醉，心电和血氧饱和度监护，无菌条件下穿刺右股动脉，置入动脉鞘管，送入2.0mm×20mm的球囊至前降支中远1/3处，充气阻断冠脉1小时，可见胸前导联ST段抬高。期间输注利多卡因直至再灌注时。拔除导管，压迫止血，送返动物房。8-10天后，消化贴壁的原始干细胞亚群，经100目滤网过滤后，将10MSC重悬于肝素化的生理盐水中，重返导管室，送入球囊至原阻断血流处，充气阻断冠脉数分钟，避免返流，注入原始干细胞亚群至远端，未见ST段抬高和严重的心率失常。对照组注射生理盐水。
3.心肌核素显像检查4周后，核素心肌断层显像检测相对心梗面积、心肌灌注评分和左室射血分数，从图5可见，治疗组和对照组相比，心肌灌注评分(30.0±5.3对41.8±8.8，p＜0.01)和相对心梗面积[(28.6±4.7)％对(33.5±3.4)％，p＜0.05]显著降低，射血数[(44.1±4.3)％对(39.0±5.2)％，p＜0.05]显著增加。
4.经导管的压力检测在心梗前、注入原始干细胞亚群前、处死前三个时间点，经导管检测左室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室舒张末压(leftend-diastolic pressure，LVEDP)、压力升高最大速率(peak rate of pressurerise，+dP/dt)和压力下降最大速率(peak rate of pressure fall，-dP/dt)。研究结果见表1，和对照组相比，LVSP(87.1±8.7mmHg对78.0±4.4mmHg，p＜0.05)、+dP/dt(1818.1±116.7mmHg/s对1610.6±114.5mmHg/s，p＜0.01)和-dP/dt(1800.9±88.5mmHg/s对1618.4±65.7mmHg/s，p＜0.01)显著增加，LVEDP(9.4±1.7mmHg对12.6±2.8mmHg，p＜0.05)显著降低，心功能得以改善。
5.心肌组织学和免疫荧光检测取心梗周围组织，部分送查PKH26荧光，大部分在10％中性甲醛固定，石蜡包埋，切片后行HE染色和免疫荧光检测。HE染色可见，治疗组比对照组，纤维组织减少，血管密度增加[(6.0±1.3)根/0.2mm2对(4.5±0.9)根/0.2mm2，p＜0.05]，未见脂肪和骨骼组织沉积、未见肿瘤组织。图6中可见，检测PKH26和BrdU的标记率，PKH26约为99％(图6A)，BrdU约为80％(图6C)。实验组PKH26荧光检测示，可见在心肌组织内有橙红色荧光(图6B)。免疫荧光检测显示，在心肌细胞、血管内皮和平滑肌细胞中可见BrdU阳性细胞，提示MSC已植入并植活。如图7所显示，BrdU阳性细胞已分化为心肌细胞(图7A)，并和原心肌细胞有缝隙连接形成(图7B)，BrdU阳性细胞也可分化为血管内皮(图7C)和平滑肌细胞(图7D)。
(二)自体骨髓间质干细胞移植修复梗死心肌的临床研究为研究急性心肌梗死患者自体骨髓原始干细胞亚群冠脉内注射治疗的安全性以及对心功能的改善作用，我们选取10例急性心肌梗死患者作为实验组(细胞治疗组，cell therapy group，CT组)；选取10例PCI术后拒绝行细胞治疗的急性心肌梗死患者作为对照组(标准治疗组，standard therapy group，ST组)。
1.骨髓原始干细胞亚群分离、培养及鉴定在无菌状态下穿刺CT组患者髂后上棘，抽取骨髓分离原始干细胞亚群培养，扩增10-14天后当细胞总量达107时胰酶消化，移植术前1小时重悬于生理盐水备用。培养后骨髓原始干细胞亚群移植前均取样进行微生物学检验、细胞周期及流式细胞仪鉴定。24小时可见有贴壁细胞，呈圆形；72小时大多数贴壁细胞有胞浆突起，呈短棒状；一周后呈梭形，胞浆丰富，核大，核仁明显。细胞免疫表型和细胞周期造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型vWF、CD31均为阴性，CD29、CD44、CD105、Flk-1为阳性。细胞周期结果显示，约86.54％细胞处在G0/G1期，而处在G2-M期和S期的细胞分别为1.56％和11.90％。
2.冠脉内注射移植手术常规术前准备同PCI术，PCI术后10~14天，选用合适大小的OTW球囊仔细定位与靶血管支架内近端，以2atm压力充盈球囊，于指引导管内注入造影剂证实球囊远端无造影剂通过后，重新以2atm压力充盈球囊并退出导丝，于球囊中心腔高压注入骨髓间质干细胞悬液5ml(细胞数量2～7×107/ml)，并以0.2ml肝素生理盐水冲洗中心腔，球囊充盈持续2分钟后球囊撤压，间隔2分钟后重复上述操作。根据患者的耐受程度决定注射次数及细胞量。注射结束后复查冠脉造影证实靶血管通畅无损伤后终止手术。术后患者进入CCU病房监护，移植术后24小时白细胞计数、C-反应蛋白及肌钙蛋白I较术前比较没有显著差异(P＞0.05)，移植后无心功能恶化，未出现发热及白细胞计数升高。随访期间细胞治疗组无心悸晕厥发生，随访动态心电图未发现恶性心律失常。
3.随访所有20例患者于PCI术后1周及术后3月进行临床随访，包括心电图、24小时动态心动图，心脏超声心动图以及18氟-脱氧葡萄糖(18F-FDG)核素心肌断层显像。两组患者LVEDV、LVESV及代谢缺损均有不同程度下降，但CT组3月随访较基线下降有显著性差异(P＜0.05)，表明3月随访CT组较ST组改善明显(P＜0.05)，提示细胞治疗组存活心肌增加，梗死面积缩小，左室重构减轻，见表2。研究表明急性心肌梗死患者自体骨髓原始干细胞亚群冠脉内注射安全有效，可以改善患者心功能及预后，骨髓来源的心肌细胞生成及血管新生可能为其机制。
图1原始干细胞亚群的免疫表型和细胞周期 A免疫表型；B细胞周期图2原始干细胞亚群体外分化为心血管组织A诱导为心肌细胞 al诱导前 a2四周后 a3抗心肌凝蛋白重链-FITCa4抗心肌肌钙蛋白I-PE；B诱导为血管内皮细胞 b1诱导前 b2二周后 b3抗vWF-FITC b4抗CD31-PE图3心脏冰冻切片中PKH26荧光检测图4原始干细胞亚群体内分化为心血管组织A a1抗心肌凝蛋白重链-FITC a2抗BrdU-PE a3 a1和a2的合并B b1抗vWF-FITC b2抗BrdU-PE b3 b1和b2的合图5两组的心肌核素检查图6原始干细胞亚群的PKH26荧光和BrdU标记A原始干细胞亚群注射前的PKH26荧光标记B心肌组织中PKH26荧光显色C C1为培养的原始干细胞亚群经BrdU标记后的免疫荧光显色 C2为培养的原始干细胞亚群的光镜观C3为C1和C2的合并7心肌组织的免疫荧光显色A红色为抗心肌凝蛋白重链的PE显色，绿色为抗BrdU的FITC显色B红色为BrdU的PE显色，绿色为抗连接蛋白43的FITC显色C红色为BrdU的PE显色，绿色为抗vWF的FITC显色D红色为BrdU的PE显色，绿色为抗平滑肌肌动蛋白的FITC显色图8两组间左室压力检测结果比较图9两组患者基线及3月随访超声心动图、核素之间指标比较本发明的优点1.本发明报道了骨髓原始干细胞亚群的分离、培养和扩增过程，操作方法简单可行；2.本发明首次报道骨髓原始干细胞亚群在体内和体外分别诱导分化为心肌细胞和血管内皮细胞的过程，并证明了骨髓原始干细胞亚群胞分化为心血管组织的潜能；3.本发明确定了骨髓原始干细胞亚群诱导分化为心血管组织的检测方法，显示分化后的细胞形态及功能性证明，这就为干细胞及组织工程应用研究提供了标准审核的基础；4.本发明为治疗心血管疾病，特别是急性心肌梗塞提供了实验依据和临床研究依据，为细胞移植治疗提供了新的途径。
权利要求
1.一种分离，培养一类原始干细胞亚群的制备工艺，涉及一种原始干细胞亚群用于治疗心血管损伤的方法。其特征在于细胞表型是CD29、CD44、CD105、Flk-1阳性，诱导原始干细胞亚群分化为心血管组织，涉及原始干细胞亚群的分离、培养，在体外经诱导因子诱导培养而分别表达心肌细胞和血管内皮细胞的特异性细胞表面标志和相关抗原分子。在体内标记的原始干细胞亚群诱导后检测出同样的阳性结果，并分化成有功能性的心肌和血管内皮细胞。对急性心肌梗死患者PCI术后自体原始干细胞亚群行冠脉内注射，比较对照组检测表明患者心功能及预后明显改善。这就为心血管损伤，特别是治疗急性心肌梗塞提供了新途径。
2.根据权利要求1所述的一类干细胞亚群的制备工艺，其特征在于从骨髓中分离出单个核细胞，用扩增培养液进行培养，从而获得了一类原始干细胞亚群。如扩增培养液含有胎牛血清、抗坏血酸等。
3.根据权利要求1所述的心肌细胞诱导方法，其特征在于在体外和体内分别利用5-氮胞杂苷诱导原始干细胞亚群向心肌细胞分化。经免疫荧光检测出诱导的细胞表面表达心肌细胞特异性的表面标志分子和相关抗原，如体外经诱导的原始干细胞亚群表达肌凝蛋白重链和肌钙蛋白I；在体内标记的原始干细胞亚群表达阳性的肌凝蛋白重链，分化为有功能的心肌细胞。
4.根据权利要求1所述的血管内皮细胞诱导方法，其特征在于在体外和体内分别利用血管内皮生长因子VEGF-B诱导原始干细胞亚群向血管内皮细胞分化。经免疫荧光检测诱导的细胞表面表达血管内皮细胞特异性的表面标志分子和相关抗原，如体外经诱导的原始干细胞亚群表达VIII因子相关抗原和CD31。在体内标记的原始干细胞亚群表达阳性的VIII因子相关抗原，分化为血管内皮细胞。
5.根据权利要求1所述的应用于心血管疾病的治疗干细胞亚群的制备工艺，其特征在于对急性心肌梗死患者行自体原始干细胞亚群冠脉内注射治疗，和未使用原始干细胞亚群注射治疗的对照组相比，可明显改善患者心功能及预后。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于应用于治疗各种先天性或获得性心血管疾病引起的心肌及血管缺损，特别是急性心肌梗塞干细胞亚群的制备工艺。
全文摘要
本发明公开了一种分离、培养一类原始干细胞亚群的制备工艺，涉及一种原始干细胞亚群用于治疗心血管损伤的方法。从骨髓中分离、培养的一类原始干细胞亚群，细胞表型是CD29、CD44、CD105、Flk－1阳性，诱导原始干细胞亚群分化为心血管组织，涉及原始干细胞亚群的分离、培养，在体外经诱导因子诱导培养而分别表达心肌细胞和血管内皮细胞的特异性细胞表面标志和相关抗原分子。在体内标记的原始干细胞亚群诱导后检测出同样的阳性结果，并分化成有功能性的心肌和血管内皮细胞。对急性心肌梗死患者PCI术后自体原始干细胞亚群行冠脉内注射，比较对照组检测表明患者心功能及预后明显改善。这就为心血管损伤，特别是治疗急性心肌梗塞提供了新途径。
文档编号C12N5/0789GK1712520SQ200410049670
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月24日 优先权日2004年6月24日
发明者赵春华 申请人:赵春华