专利名称：一种拟南芥锌指蛋白基因AtRINGF1的耐干旱应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种拟南芥锌指蛋白基因的应用。
背景技术：
植物的生长发育和它们所存在的环境息息相关。植物通常在不利的环境条件下生长，如盐碱、贫瘠、干旱的土地，寒冷、冰冻的气候，各种病原微生物的侵害等等。研究植物在逆境条件下的生长发育特性，是培育能在逆境条件下正常生长发育的植物的重要基础；尤其在分子水平揭示这种特性，更是利用现代生物技术改良植物获得抗逆性强的植物的先决条件。
环境胁迫已极大的限制了全世界粮食产量的提高。干旱是限制农业生产的最主要因素。因此，认识植物对干旱的反应机制，提高植物的抗旱性，是农业增产的重要基础。干旱对植物的影响主要引起渗透胁迫并抑制植物的生长、损伤植物细胞，最终引起DNA的降解而导致植物细胞的死亡。干旱对植物的影响，仅有一部分可能是植物的一种适应反应，许多反应是因胁迫而致的生理损伤结果。这一过程与植物对高盐及低温引起的渗透胁迫的反应相似。干旱等逆境均可导致植物产生脱落酸(ABA)，因此也经常把ABA与干旱等逆境结合在一起进行研究。
现有的研究表明，当遇到干旱时，植物会对干旱做出反应，包括信号传递、基因表达及各种代谢变化，建立渗透调节平衡，保护植物免受伤害，以适应干旱的环境，维持植物的生长及发育。在真核单细胞酵母中，其渗透调节途径起始于独立的双组分信号组氨酸激酶Sln1或含SH3结构域的膜蛋白Sho1，通过激活共同的Hog1激酶而导致合成及积累渗透调节物质。在动物细胞中，渗透胁迫至少要激活p38，JNK，ERK5三种蛋白激酶。受这些研究的启发，科学家也在植物中寻找能被渗透激活的蛋白激酶。目前在植物中，已发现有许多激酶基因或激酶可被渗透胁迫诱导或激活，但所有这些基因或激酶的确切功能尚不清楚。干旱可调控植物中许多基因的表达，这些基因可分为ABA依赖型及非ABA依赖型两类。一些直接调控干旱诱导基因的调控因子已经被克隆。在植物中高表达某些调控因子，即使在非干旱的条件下也可以调控一些干旱诱导基因的表达，不同程度地提高植物的抗旱性。
泛素蛋白(Ubiquitin)是一种存在于各种真核生物中的非常保守的遍在蛋白。研究显示，泛素蛋白介导引起的蛋白质降解是生物体维持自身正常生长发育和在逆境条件下生长的重要生理生化过程。泛素蛋白通过泛素蛋白系统起作用，该系统由3部分组成泛素蛋白(Ub)，蛋白泛素蛋白化(Ubiquitination)酶系(E1泛素激活酶，E2泛素结合酶，和E3泛素连接酶)和泛素蛋白循环酶系(Ub-C末端水解酶)，泛素蛋白化蛋白降解酶系(26S蛋白酶复合体)。通常，多聚泛素蛋白与靶蛋白结合转运到26S蛋白体使其降解。目前，在拟南芥中，对参与蛋白降解调控的泛素连接酶研究取得一些进展，其中以COP1环指蛋白参与光调控途径、单个亚基蛋白SINAT5参与生长素信号调控等具有深入的研究；而复合蛋白作为泛素连接酶的则以SCF-TIR1复合物降解IAA/AUX家族蛋白及SCF-COI1参与茉莉酸信号途径调节研究较深入。
发明内容
本发明的目的是提供一种拟南芥锌指蛋白基因AtRINGFl在提高植物耐干旱能力上的应用。
本发明采用基因芯片的方法从干旱、冷和盐诱导处理的拟南芥cDNA文库中筛选发现拟南芥锌指蛋白基因AtRINGFl，其在GenBank中的编号是AT3G55530，该基因的cDNA长822bp，编码273aa的蛋白。用SMART程序来分析预测AtRINGFl基因所编码的蛋白，发现其C-端(211-252位)具有一个保守环指(RING FINGER)结构域(C3H2C3)，其N-端具有两个跨膜区(35-52位，62-81位)。
本发明发现所述拟南芥锌指蛋白基因AtRINGFl的表达蛋白具有泛素蛋白系统中泛素连接酶(E3)活性；通过将AtRINGFl基因与GUS基因融合后转化拟南芥，试验结果发现干旱处理不仅提高了根和叶片GUS的表达，而且还提高了气孔保卫细胞及周围叶肉细胞GUS的表达。该AtRINGFl基因可用于提高农作物对干旱的耐受程度，降低农作物生长过程中水灌溉的成本，并可增加农作物的产量，具有重要的经济意义和应用前景。
本发明的有益效果本发明通过基因芯片的方法发现了受干旱胁迫诱导基因AtRINGFl，利用体外实验鉴定发现其具有泛素蛋白系统中泛素连接酶(E3)活性；通过将AtRINGFl基因与GUS基因融合后转化拟南芥，试验结果发现干旱处理不仅提高了根和叶片GUS的表达，而且还提高了气孔保卫细胞及周围叶肉细胞GUS的表达。AtRINGFl基因可用于提高农作物对干旱的耐受程度，降低农作物生长过程中水灌溉的成本，并可增加农作物的产量，具有重要的经济意义和应用前景。
图1为SMART程序分析显示AtRINGFl蛋白的两个跨膜区；图2为AtRINGFl蛋白及其突变后蛋白的体外泛素连接酶活性；图3为ABA和干旱处理下AtRINGFl基因的表达；图4为AtRINGFl基因在拟南芥植物不同组织中的表达结果；图5为AtRINGFl基因在不同的发育阶段及不同胁迫处理下的表达结果；图6为35S-AtRINGFl植株过量表达和突变体atringfl植株的分子鉴定及其表型；图7为35S-AtRINGFl及atringfl突变体对ABA的敏感性；图8为35S-AtRINGFl及atringfl突变体对干旱的响应情况。
其中，在图2中，左分别在E1，E2和32P-标记的泛素的作用下，MBP-AtRINGFl融合蛋白的泛素连接酶活性；右MBP-AtRINGFl融合蛋白及AtRINGFl蛋白的234位氨基酸突变后融合蛋白的泛素连接酶活性。在图3中，上ABA处理；下干旱处理。在图5中，A为不同发育时期GUS的表达模式(a.发芽1天种子，b.发芽2天种子，c.3天龄幼苗，d.4天龄幼苗，e.5天龄幼苗，f.花，g.种荚)；B.NaCl和干旱处理后的转AtRINGFl启动子-GUS的拟南芥幼苗中GUS表达(a.对照；b.300mM NaCl处理5小时；c.干旱处理5小时)；C.干旱处理后转基因拟南芥保卫细胞中的GUS的表达(a.对照；b.干旱处理30分钟)(标尺20μm.)。在图6中，AT-DNA插入突变体的叶片PCR设计示意图；BT-DNA插入突变体的叶片PCR检测的电泳图(第1、2道野生型；第3、4道T-DNA插入突变体的F2代；M分子量标记)；C野生型、35S-AtRINGFl和atringfl植物Northern-blot分析；(28S rRNA为上样量对照；第1、2道野生型；第3～7道5条35S-AtRINGFl的转基因植株；第8、9道突变体atringfl)；D转入土中生长3周的野生型、35S-AtRINGFl的转基因植株和突变体atringfl植物的表型。在图8中，(A)干旱处理16天后植物的生长状况及再浇水1天后恢复状况；(B)离体叶片失水情况统计(剪取相同生长状况的叶片于不同的时间点对其进行称重)(n＝8)；(C)植物在超净台脱水处理4小时后的萎蔫情况；(D)野生型(a)，35S-AtRINGFl(b)和atringfl突变体(c)的气孔电镜图。
具体实施例方式
实施例1 AtRINGFl蛋白的泛素连接酶活性采用体外表达AtRINGFl蛋白方法来考察其是否具有泛素蛋白连接酶活性，以pMal-C2为载体构建表达MBP-AtRINGFl融合蛋白的表达载体，并在大肠杆菌中表达，通过Amylose Resin纯化后进行了AtRINGFl蛋白的泛素连接酶活性分析。在体外蛋白反应中，纯化的MBP-AtRINGFl在合适的E1、E2、ATP和Ub的共同作用下，由于Ub是32P标记而便于检测，32P-Ub可以与MBP-AtRINGFl连接，并且随着32P-Ub的不断增加，形成多聚链，从图2左图可以看出，MBP-AtRINGFl蛋白随着32P-Ub的增加，其分子量也随之增加，出现多条信号带，而对照则没有任何信号带，该结果表明AtRINGFl蛋白具有泛素连接酶活性，能催化单体或多聚泛素的形成。
实施例2 AtRINGFl蛋白环指结构域为了研究环指结构域的完整性是否是AtRINGFl蛋白具有泛素连接酶活性所必需因素，通过对环指蛋白AtRINGFl蛋白的保守锌连接配体进行点突变，构建了234位点的H(组氨酸)突变成Y(酪氨酸)的AtRINGFl蛋白突变体，研究发现该突变蛋白没有泛素反应，如图2右图所示。该结果表明环指结构域的完整性决定了AtRINGFl蛋白的泛素连接酶活性。
实施例3 受干旱诱导的拟南芥AtRINGFl基因微阵列(Microarray)分析的结果分析表明拟南芥AtRINGFl基因是一个受干旱诱导的基因。为了进一步验证该结果，我们进行了Northern杂交分析。用生长2周的拟南芥幼苗通过干旱胁迫处理后，提取总RNA，作Northern分析。从图3可见，干旱处理，AtRINGFl基因的表达随着时间的延长，其表达量也相对增加。该结果与微阵列分析的结果是相一致的，表明AtRINGFl基因在植物干旱胁迫信号传导过程具有重要的作用。
实施例4 AtRINGFl基因的体内表达分别提取生长了4周后的拟南芥的根、茎、叶、花和果荚的总RNA，采用AtRINGFl基因特异引物和Actin的特异引物进行RT-PCR，检测AtRINGFl在拟南芥各个器官的表达。结果显示拟南芥的根、茎、叶、花和果实均能检测到AtRINGFl基因的表达，表明AtRINGFl基因的表达无组织特异性，在拟南芥各个器官均能表达，如图4所示。
实施例5 AtRINGFl基因在发育过程中表达为了研究AtRINGFl在发育过程中的表达情况，我们根据拟南芥已公布的序列，设计一对引物(5’-AAGCTTCCCAACCAGAACATCAAAC-3’HindIII；5’-GGATCCGTCTTCCAAATTCACAAGAG-3’BamH I)，通过PCR扩增并克隆了AtRINGFl基因ATG上游(不包括起始密码子ATG)的启动子区1.3Kb片断，经HindIII和BamH I双切后与酶切后的pBI101载体连接使其与GUS基因融合，该载体通过真空渗透法转化野生型的拟南芥，通过组织化学染色观察拟南芥各个生育阶段GUS的表达情况。萌发2天后，在刚长出来的胚轴能检测到较强的GUS；而萌发3天后，在根尖、根毛区和根毛具有强的GUS表达，而下胚轴则没有；5天后，除了下胚轴不能检测到GUS表达，其它部位均能检测到；而在花中的柱头和花药具有强的GUS表达；在果荚中主要在其顶端和基部；叶片表面的气孔也能检测到较强的GUS表达。经300mM NaCl和干旱处理5小时后，提高了叶片和根的GUS表达，见图5B；干旱处理还提高气孔保卫细胞及周围叶肉细胞GUS的表达，见图5C。这与AtRINGFl基因是一个受盐和干旱诱导的基因是相一致的。
实施例6 AtRINGFl过量表达及突变体的分子及表型鉴定为了进一步研究AtRINGFl的功能，我们从SALK得到了其T-DNA插入突变体，其插入位置位于第5个外显子中，见图6A。首先我们通过观察T2代的遗传分离比，发现后代出现没有分离的植株；为了进一步鉴定这些突变体是纯合体，我们设计了两对引物P1+P2和P1+P3(P1，正义；P2，反义；P3，反义，与T-DNA插入区的左侧配对)，见图6B。采用叶片PCR方法，用WT和突变体atringfl T2代的叶片同时扩增，结果发现用引物P1、P2扩增后，WT有一条650bp左右的带，而atringfl则没有。用P1、P3，则得到相反的结果，见图6B。因此我们得到了T-DNA插入突变体是纯合体。
通过将AtRINGFl基因的全长cDNA序列同强的启动子35S融合，构建了正义表达载体并通过农杆菌介导真空渗透法转化野生型的拟南芥。通过在含有Basta抗性的MS平板上筛选，得到了15株转基因植株。并对其中的5株进行Northern杂交分析，其AtRINGFl表达水平均大大提高，图6C。将过量表达AtRINGFl植株，WT(野生型)和其突变体atringfl植物种在土壤中，观察其表型，三者之间没有差异，见图6D。
实施例7 35S-AtRINGFl植物及其突变体atringfl对ABA的敏感性实验利用正向和反向遗传学揭示植物ABA信号传导中作用，种子萌发的抑制实验是一种非常有用的方法(Giraudat，1995)。为了比较35S-AtRINGFl，WT和突变体atringfl对ABA的敏感性。我们将WT、35S-AtRINGFl和atringfl植物的种子播在包含各种浓度(分别为0μM，0.5μM，1μM，2μM和5μM)的ABA的MS培养基上萌发，当ABA浓度等于或高于0.5μM时，与WT和atringfl相比，35S-AtRINGFl植株对ABA较敏感，其种子萌发和根的生长受到严重的抑制，如图7A。同时将在没有ABA的MS培养基上萌发4天的幼苗，移到包含5μM ABA的MS培养基上垂直板上生长，8天后，观察发现35S-AtRINGFl植株叶片最小、根最短，而其突变体atringfl植株叶片最大、根最长，见图7B。此结果表明35S-AtRINGFl的萌发和其后生长均对ABA敏感。
实施例8 35S-AtRINGFl及atringfl突变体对干旱的响应干旱胁迫下，植物感应胁迫的器官合成并输送某些信号物质到响应胁迫的器官，使之做出保护植物的反应。气孔关闭则是重要的应答反应之一。ABA在干旱胁迫诱导气孔关闭的过程中起着信号转导作用。为了研究AtRINGFl基因与水分吸收及气孔的关系，我们将MS板上生长14天的WT、AtRINGFl和atringfl幼苗移到小盆中，正常生长10天后，持续干旱处理16天后，WT、35S-AtRINGFl和atringfl植株均出现萎焉，浇水恢复1天后发现，AtRINGFl植株75％能恢复正常生长，WT植株50％能恢复正常生长，而atringfl植株只有20％能恢复正常生长，如图8A所示。这表明AtRINGFl基因的过量表达提高了植物耐水分亏缺能力。
转基因植物能提高耐水分亏缺能力，部分是由于具有较低的水分蒸发速率。因而我们也测定WT、35S-AtRINGFl和atringfl植物叶片失水的速率，失水150分钟后，35S-AtRINGFl叶片的鲜重下降至65％左右，而atringfl叶片的鲜重下降至35％左右，如图8B所示，这表明35S-AtRINGFl具有较慢的失水速率，而atringfl叶片具有更快的失水速率。为了进一步验证三者之间的失水速率，将生长2周且在同一块MS板上WT、35S-AtRINGFl和atringfl植株，连同培养基置于超净台上，发现atringfl的最快出现萎蔫症状，脱水处理4小时后，atringfl幼苗的77％出现萎蔫症状，WT幼苗的46％出现萎蔫症状，而35S-AtRINGFl幼苗只有23％出现萎蔫症状，如图8C所示。
由于气孔关闭是水分胁迫最重要的应答反应。我们观察了WT、35S-AtRINGFl和atringfl生长于土壤中且灌溉良好和光照正常条件下的气孔变化，如图8D所示。发现发现转35S-AtRINGFl植物的气孔关闭的直径及气孔关闭的数量＞WT＞atringfl。
权利要求
1.一种拟南芥锌指蛋白基因AtRINGF1在提高植物耐干旱能力上的应用，其特征在于所述基因AtRINGF1来源于拟南芥cDNA文库，其在GenBank中的编号是AT3G55530，编码273个氨基酸。
全文摘要
本发明公开了一种拟南芥锌指蛋白基因AtRINGF1的耐干旱应用。本发明所述的AtRINGF1基因是用基因芯片的方法从干旱、冷和盐诱导处理的拟南芥cDNA文库中筛选发现的，其在GenBank中的编号是AT3G55530，该基因的cDNA长822bp，编码273 aa的蛋白。用SMART程序来分析预测AtRINGF1基因所编码的蛋白，发现其C－端(211－252位)具有一个保守环指(RING FINGER)结构域(C3H2C3)，其N－端具有两个跨膜区(35－52位，62－81位)。该AtRINGF1基因可用于提高农作物对干旱的耐受程度，降低农作物生长过程中水灌溉的成本，并可增加农作物的产量。
文档编号C12N15/82GK1614020SQ200410052370
公开日2005年5月11日 申请日期2004年11月25日 优先权日2004年11月25日
发明者谢旗, 阳成伟, 黎茵 申请人:中山大学