专利名称：白菜育性相关基因bcmf4及其分离方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，特别地，涉及一种白菜育性相关基因BCMF4及其分离的方法。
背景技术：
cDNA-AFLP方法可以用于分析同一基因表达上的差异，获得与重要农艺性状相关的标记探针。结合文库筛选、染色体步移、RACE技术等实验手段，能够得到与重要农艺性状相关的全长基因序列。本发明采用cDNA-AFLP技术对‘矮脚黄’白菜(Brasscia campestris L.ssp.chinensis Makino var.communis Tsen et Lee cv.Aijiaohuang)核不育两用系(A/B line)表达差异分析，发现可育株系与不育株系的表达差异主要存在于花药。配合RACE技术分离获得与花药发育相关基因BCMF4，为进一步搞清楚花药发育过程中导致不育株系花粉败育的原因，以及阐明植物雄性不育发生的分子机制提供研究基础，进而为人工创建不育材料提供物质条件。
发明内容
本发明的目的在于提供一种白菜育性相关基因BCMF4及其分离方法。
本发明提供的白菜育性相关基因BCMF4具有SEQ ID No.1的序列。BCMF3的最大ORF从第10号碱基开始，1008号碱基终止，999个碱基编码332个氨基酸。
本发明提供的白菜育性相关基因BCMF4的分离方法，包括以下步骤1、经过cDNA-AFLP对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行分析，在A17和T14引物组合中获得可育株系特异基因片段BCMF-A17T14。
2、将差异片段BCMF-A17T14进行回收、克隆和测序。
3、根据BCMF-A17T14片段的序列，设计两条特异引物(SP1和SP2)与3’RACE锚定引物进行配合，获得与BCMF-A17T14片段相关的基因的cDNA的3’末端序列。
4、回收SP3和SP4与5’RACE锚定引物的扩增条带，克隆并进行测序，获得与BCMF-A17T14片段相关基因的cDNA的5’末端序列。
5、将三次测序结果拼接，得到与白菜育性相关基因BCMF3的cDNA全长序列，基因全长为1142bp。
6、应用BLAST和DNAStar软件对BCMF4序列进行分析比较以及ORF及其氨基酸序列的确定。
本发明采用cDNA-AFLP技术对‘矮脚黄’白菜核不育两用系表达差异分析，同时配合RACE技术分离获得与花药发育相关基因BCMF4，为进一步搞清楚花药发育过程中导致不育株系花粉败育的原因，以及阐明植物雄性不育发生的分子机制提供研究基础，进而为人工创建不育材料提供物质条件。
图1是RT-PCR分析BCMF4基因不同部位不同时期的表达差异。1、3、5、7、9和11泳道分别为可育莲座期叶片、开花叶片、花茎、小蕾、中蕾和大蕾；2、4、6、8、10和12泳道分别为可育莲座期叶片、开花叶片、花茎、小蕾、中蕾和大蕾具体实施方式
下面以白菜育性相关基因BCMF4的克隆为例详细说明本发明。
1.cDNA-AFLP技术预扩增和选择性扩增体系的优化(1)预扩增退火温度的选择cDNA酶切连接产物进行预扩增，预扩增中退火温度分别设定变50℃、52℃、54℃、56℃、58℃和60℃5个温度梯。测序胶电泳结果表明，52～56℃带纹稳定。
(2)预扩增循环次数的选择cDNA酶切连接产物进行预扩增，预扩增分别进行15、18、21和24不同的循环次数，PCR产物取5μL，在1.8％琼脂糖胶上电泳，四种不同循环次数的PCR结果都能看到一条弥散的带，但是带的强弱不同。随着循环次数的增加，电泳条带的亮度提高。
预扩增主物稀释20倍作为模板进行选择性扩增，产物经测序胶电泳结果显示，随着循环次数的增加，电泳带的颜色加深。综合分析电泳结果，预扩增循环次数为15～21是较佳条件，均可获得稳定的电泳结果。
(3)cDNA-AFLP技术预扩增和选择性扩增体系中Mg2+浓度的选择试验结果表明，Mg2+浓度2.0～2.8mM范围内，测序胶电泳结果都比较好。
综上所述，在后面的试验中，cDNA-AFLP预扩增退火温度确定为53℃，预扩增循环次为20个循环，预扩增和选择性扩增的PCR体系中Mg2+浓度为2.3mM。
2.与BCMF-A17T14片段相关的基因在不同发育时期、不同器官的表达分析以‘矮脚黄’白菜两用系可育株系和不育株系的莲座期叶片、开花叶片、花茎、小蕾、中蕾和大蕾双链cDNA为模板，以5’RACE特异引物和SP14(5’-CCA TGA CGT CTT TTT GGC TCC A-3’)为引物做PCR扩增，电泳结果表明，该基因只在可育中蕾和大蕾中表达，其它不同部位和不同时期未表达；不育株系的不同部位和不同时期都没有表达。
3.与BCMF-A17T14片段相关的基因的cDNA全长的获得(1)BCMF-A17T14基因片段的克隆测序 将BCMF-A17T14片段克隆至T载体(pGEM-T Easy Vector，购自Promega公司)上，随后把该重组质粒pBCMF-A17T14送至上海博亚生物技术有限公司测序，测序结果该序列为445bp，具体序列见SEQ ID No.2。
(3)与BCMF-A17T14片段相关的基因的cDNA的3’末端的获得 根据测序结果及网上同源比较结果，设计了3’RACE特异引物SP15’-GGA GGGGAC CTT CAG ATA TTT G-3’和SP25’-CTT GTG TGG TGC ACC TCT TCA G-3’。第一次PCR以SP1与3’RACE锚定引物(5’-AGG CCG AGG CGG CCG ACA TGTTTT-3’，双链cDNA合成试剂盒)为引物，可育中蕾的双链cDNA为模板进行PCR扩增；第二次PCR以第一次PCR的产物为模板，SP2与3’RACE锚定引物为引物进行PCR扩增。将第二次PCR产物回收克隆，送上海博亚生物技术有限公司测序，其结果表明，3’RACE扩增产物测序长度为187bp，减去锚定引物碱基，实际测序长度为168bp。具体序列见SEQ ID.3。
(4)与BCMF-A17T14片段相关基因的cDNA的5’末端的获得 根据BCMF-A17T14基因片段设计5’RACE的特异引物SP35’-GAG TAA GCT CTT TCCATT GAA C-3’和SP45’-CCA TGA CGT CTT TTT GGC TCC A-3’。SP3引物最后一个碱基与SP4第一个碱基相差99个碱基。与5’RACE锚定引物(5’-AAGCAG TGG TAT CAA CGC AGA GT-3’，双链cDNA合成试剂盒)为引物进行嵌套式PCR扩增，电泳结果表明RACE扩增是正确的。将该片段克隆到T载体上，送上海博亚生物技术有限公司测序，结果显示，测序结果长度为760bp。去掉引物的长度，5’末端长度为742bp。具体序列见SEQ ID No.4。
(5)与BCMF-A17T14片段相关的基因(BCMF4)的cDNA的全长序列的拼接 将三次测序结果拼接，得到与BCMF-A17T14片段相关基因的全长序列，基因全长为1142bp，我们将其命名为BCMF4基因。具体序列见SEQ ID No.1；4.BCMF4基因的cDNA全长序列的分析将得到的BCMF3基因的cDNA全长序列上国际互联网同源性搜索比较，结果发现与油菜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(PGIP4)相似性最高，为85％。利用DNAStar软件对BCMF4基因ORF分析，表明该基因最大ORF为999bp。起始密码子ATG位于第10位，终止密码子为TAA，位于第1008位。ATG上游-3位核苷酸分别为A，+4位为核苷酸为G，这是一个典型的Kozak结构。这一结构对于蛋白质合成的40S起始复合物正确识别启始密码子具有很重要的作用。将ORF翻译成氨基酸，其编码332个氨基酸。
按照上述的操作步骤，即可以获得白菜育性相关基因BCMF3的全长序列。
图1是RT-PCR分析BCMF4基因不同部位不同时期的表达差异。1、3、5、7、9和11泳道分别为可育莲座期叶片、开花叶片、花茎、小蕾、中蕾和大蕾；2、4、6、8、10和12泳道分别为可育莲座期叶片、开花叶片、花茎、小蕾、中蕾和大蕾。
根据图1可见，BCMF4基因只在可育株系中蕾和大蕾花药中特异表达，由此确定该基因是与花药发育相关的基因。本发明将为人工创建不育材料提供物质条件。
白菜育性相关基因BCMF4的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5的序列表
<110>浙江大学<120>白菜育性相关基因BCMF4及其分离方法<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1142<212>DNA<213>Brassica sp.
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<213>Brassica sp.
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<400>5Met Asp Lys Ile Thr Thr Thr Leu Leu Phe Ser Leu Phe Ala Leu Leu1 5 10 15Leu Thr Ala Ser Leu Ser Lys Asp Leu Cys His Lys Asp Asp Glu Asn20 25 30Ala Leu Leu Lys Ile Lys Lys Ser Leu Asn Asn Pro Tyr Thr Ile Ile35 40 45Ser Trp Asp Pro Lys Asp Asp Cys Cys Thr Trp Val Ser Val Glu Cys50 55 60Gly Asp Ala Thr Val Asp His Arg Val Ile Ser Leu Asp Ile Ser Asn65 70 75 80Asp Asp Val Ser Ala Gln Ile Pro Pro Glu Val Gly Asp Leu Ser Tyr85 90 95Leu Gln Thr Leu Ile Phe Arg Lys Leu Pro Asn Leu Thr Gly Glu Ile100 105 110Lys Pro Thr Ile Ala Lys Leu Lys Tyr Leu Arg Phe Leu Trp Leu Ser115 120 125Trp Thr Asn Leu Thr Gly Pro Val Pro Glu Phe Leu Ser Gln Leu Lys130 135 140Asp Leu Glu Tyr Ile Asn Leu Ser Phe Asn Asp Leu Ser Gly Ser Ile
145 150 155 160Pro Gly Ser Leu Ser Leu Leu Pro Lys Leu Gly Ile Leu Glu Leu Ser165 170 175Arg Asn Lys Leu Thr Gly Ser Ile Pro Glu Ser Phe Gly Ala Phe Lys180 185 190Gly Val Val Pro Pro Glu Leu Phe Leu Ser His Asn Gln Leu Ser Gly195 200 205Ser Ile Pro Lys Ser Leu Gly Asn Leu Asp Phe His Arg Ile Asp Phe210 215 220Ser His Asn Lys Leu Glu Gly Asp Ala Ser Met Met Phe Gly Ala Lys225 230 235 240Lys Thr Ser Trp Ser Val Asp Leu Ser Arg Asn Lys Leu Gln Phe Asp245 250 255Ile Ser Lys Val Lys Val Ala Thr Thr Val Asn Asn Leu Asp Leu Asn260 265 270His Asn Lys Ile Thr Gly Ser Ile Pro Val Gln Trp Thr Glu Leu Thr275 280 285Leu Gln Ser Phe Asn Val Ser Tyr Asn Arg Leu Cys Gly Arg Ile Pro290 295 300Gln Gly Gly Asp Leu Gln Ile Phe Asp Ala Tyr Glu Tyr Leu His Asn305 310 315 320Lys Cys Leu Cys Asp Ala Pro Leu Gln Ser Cys Lys325 330
权利要求
1.一种白菜育性相关基因BCMF4，其特征在于，它具有SEQ ID No.1的序列。
2.一种分离白菜育性相关基因BCMF4的方法，其特征在于，包括以下步骤1)可育株系特异BCMF-A17T14基因片段的获得用A17/T14引物对‘矮脚黄’白菜核雄性不育两用系的不育株系与可育株系的表达差异进行cDNA-AFLP分析，发现可育株系的中蕾和大蕾中特异表达的一条带在不育株系的中蕾和大蕾中中未表达，而且在可育株系和不育株系的其它时期也未表达；将该基因片段命名为BCMF-A17T14。2)BCMF-A17T14基因片段的回收、克隆与测序用针尖将上述BCMF-A17T14特异条带挑一点作为模板进行PCR扩增，引物为A17和T14；PCR产物电泳检测表明，该片段长度大约为450bp；克隆到T载体，将该重组质粒命名为pBCMF-A17T14；提取质粒，经酶切鉴定，结果表明，BCMF-A17T14片段已重组到T载体上，测序得出该片段为445bp，具有SEQ ID No.2的序列。3)与BCMF-A17T14片段相关的基因的cDNA的3’末端的获得设计两条特异引物SP1和SP2，第一次PCR以SP1与3’RACE锚定引物为引物，可育中蕾的双链cDNA为模板进行PCR扩增；第二次PCR以第一次PCR的产物为模板，SP2与3’RACE锚定引物进行PCR扩增。将第二次PCR产物回收克隆，送上海博亚生物技术有限公司测序，结果表明，3’RACE扩增产物测序长度为187bp，减去锚定引物碱基，得到长度为168bp与BCMF-A17T14片段相关基因的3’末端具有SEQ ID No.3的序列。4)与BCMF-A17T14片段相关基因的cDNA的5’末端的获得设计5’RACE的特异引物SP3和SP4，其中SP3引物最后一个碱基与SP4第一个碱基相差99个碱基。与5’RACE锚定引物通过嵌套式PCR进行扩增，回收并测序获得长度为742bp与BCMF-A17T14片段相关基因的5’末端的具有SEQ IDNo.4的序列。5)与BCMF-A15T17片段相关的基因BCMF1的cDNA的全长序列的拼接将三次测序结果拼接，得到与BCMF-A17T14片段相关基因的全长序列，基因全长为1142bp，我们将其命名为BCMF4基因，该基因具有SEQ ID No.1的序列；6)BCMF4的ORF及其氨基酸序列的确定通过BLAST分析比较，BCMF4基因的cDNA全长序列与油菜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Brassica napuspolygalacturonase inhibitory protein(PGIP4)gene)相似性高达85％。利用DNA Star软件对BCMF4基因ORF分析，表明该基因最大ORF为999 bp。起始密码子ATG位于第10位，终止密码子为TAA，位于第1008位。ATG上游-3位核苷酸分别为A，+4位为核苷酸为G，这是一个典型的Kozak结构。这一结构对于蛋白质合成的40S起始复合物正确识别启始密码子具有很重要的作用。利用DNA Star软件将ORF翻译成氨基酸，其编码332个氨基酸，该氨基酸具有SEQ IDNo.5的序列。
3.根据权要求2所述的白菜育性相关基因BCMF4的分离方法，其特征在于，所述用DNAStar软件进行氨基酸序列的确定中，BCMF4的最大ORF从第10号碱基开始，1008号碱基终止，999个碱基编码332个氨基酸，该氨基酸具有SEQ ID No.5的序列。
4.根据权利要求2所述的白菜育性相关基因BCMF4的分离方法，其特征在于，所设计的两条3’RACE嵌套式特异引物为SP15’-GGA GGG GAC CTT CAGATA TTT G-3’和SP25’-CTT GTG TGG TGC ACC TCT TCA G-3’。
5.根据权利要求2所述的白菜育性相关基因BCMF4的分离方法，其特征在于，所设计的两条5’RACE嵌套式特异引物为SP35’-GAG TAA GCT CTT TCC ATTGAA C-3’和SP45’-CCA TGA CGT CTT TTT GGC TCC A-3’。
全文摘要
本发明以“矮脚黄”白菜隐性雄性不育两用系为材料，采用cDNA－AFLP方法对白菜可育株系和不育株系的时空表达特征进行分析，分离与育性基因相关的差异表达基因，RT－PCR进一步验证其空间表达特征；通过RACE技术获得BCMF4的cDNA全长序列，并对全长序列进行生物信息学分析。该方法适用于所有等基因系或近等基因系的植物群体，进而为人工创建不育材料提供物质条件。
文档编号C12Q1/68GK1587414SQ20041005285
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月12日 优先权日2004年7月12日
发明者曹家树, 王永勤, 余小林, 叶纨芝, 向珣, 卢钢 申请人:浙江大学