专利名称：用于检测肺炎支原体的靶序列和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和核酸检测领域，特别涉及一种利用聚合酶链式反应扩增P1细胞粘附蛋白基因(P1 Cytadhesin Gene)从而高灵敏度地特异检测临床样本中的肺炎支原体的方法及利用该方法获得的实时荧光PCR检测试剂盒。
背景技术：
支原体肺炎是一种非常严重的传染性疾病，在肺炎中，支原体肺炎约占15％～20％，并且导致多种并发症。支原体肺炎是由肺炎支原体引起的急性肺部感染。肺炎支原体能侵犯任何年龄人群的呼吸系统，此外还对人体的其他多个系统致病，临床表现复杂。近年来，肺炎支原体感染患者增多，因此肺炎支原体对人类的危害日益受到重视。
要消灭肺炎支原体需多方努力如发展快速诊断方法、研制新药、进行分子机制研究和疫苗研究等，其中发展快速诊断方法最为紧迫。由于肺炎支原体生长缓慢，通过培养患者的标本来鉴定肺炎支原体需要2～3周的时间，因此培养法对临床帮助不大。为了更快地检查出标本中的肺炎支原体从而能在早期阶段治疗支原体肺炎，需要开发利用聚合酶链式反应(PCR)对肺炎支原体的核酸进行扩增检测。
近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，特异性好，速度快等优点在基因表达水平分析、病原体的定性检测和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量的主要方法。国内目前也已有关于乙肝、艾滋病、结核定量检测的试剂盒上市。
对于聚合酶链式反应来说，选择待扩增的靶DNA的碱基序列是最为重要的。针对肺炎支原体，这个碱基序列必须为肺炎支原体特异拥有并且不能存在于人类DNA及可能发生合并感染的其他物种中。许多研究者已经报道了类似的碱基序列。具有代表性的是原核生物中高度保守基因序列的16S rRNA。16S rRNA基因的大小为1500碱基对左右，具有(1)保守性高，在生物进化中比其他基因演变得慢，有“分子化石”之称；(2)保守性是相对的，不同科、属、种间都有不同程度的差异；(3)不能侧向转移；(4)大小适度，能满足进行比较、扩增的要求。所以，通过聚合酶链式反应扩增检测肺炎支原体，16S rRNA基因具有一定优势。因此，16S rRNA基因一直被广泛应用为聚合酶链式反应的靶序列。
然而据最近的报道，肺炎支原体和生殖支原体的16S rRNA序列极为相近，在此基础上设计的引物，肺炎支原体和生殖支原体均会高效扩增。临床检测中，肺炎支原体感染患者的样本中经常发现混合有生殖支原体，所以为了能准确区分二者，有必要寻找另外的肺炎支原体特异的碱基序列。
因此，本领域迫切需要开发新高特异性地检测肺炎支原体的方法和试剂盒，以便能够既有效检测肺炎支原体，又可有效区别肺炎支原体和生殖支原体。
发明内容
本发明的目的就是提供一种既有效检测肺炎支原体，又可有效区别肺炎支原体和生殖支原体的方法和试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的遗传标记物，它具有SEQ ID NO1中连续的70-300个核苷酸。
在另一优选例中，所述的遗传标记物具有SEQ ID NO2中第1-160位中连续的160个核苷酸。
在本发明的第二方面，提供了一种检测肺炎支原体的试剂盒，它含有特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且一个引物的序列与SEQ ID NO1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO1所示的序列互补，且扩增产物的长度为70-300bp。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有探针，所述探针的长度为20-50bp，且该探针的序列与SEQ ID NO1所示的序列相同或互补。
在另一优选例中，所述引物对中的一个引物选自下组SEQ ID NO3或6；另一个引物选自下组SEQ ID NO4或7；并且所述的探针是Taqman探针，其序列选自下组SEQ ID NO5或8。
在另一优选例中，该试剂盒还包括a)DNA裂解液，b)荧光定量反应液，c)定量校准品，d)阳性对照品，e)阴性对照品。
在本发明的第三方面，提供了一种检测样品中肺炎支原体的方法，它包括步骤(a)抽提样品的DNA；(b)将抽提的DNA作为模板，用特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对进行PCR扩增，其中所述的引物长度为15-35个核苷酸，一个引物的序列与SEQ IDNO1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO1所示的序列互补；(c)检测扩增产物是否存在，存在扩增产物就表示样品中存在肺炎支原体。
在另一优选例中，所述的步骤(c)是通过检测荧光信号的强弱来定量检测样品中的肺炎支原体。
在本发明的第四方面，提供了一种支原体P1细胞粘附蛋白基因的用途，它被用作体外检测肺炎支原体是否存在的遗传标记物。
在另一优选例中，P1细胞粘附蛋白基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，从肺炎支原体中发现的一段新的约5000个碱基对的基因-P1细胞粘附蛋白基因(P1 Cytadhesin Gene)(J.WENDELIENDORIGO-ZETSMA，INFECTION AND IMMUNITY，Sept.2001，p.5612-5618)中发现较合适的扩增序列。该基因为肺炎支原体本身特有的功能性基因序列，所编码的结构蛋白称为粘附蛋白。P1细胞粘附蛋白集聚于菌体顶端的突出部分，与肺炎支原体粘附宿主细胞有关，甚至可能与其致病性有关；另外，P1细胞粘附蛋白的抗原性可引起被感染宿主的抗体反应。因此，选择这一特定结构性、功能性蛋白的核酸序列作为引物，具有很好的特征性。
如本文所用，术语“P1 Cytadhesin Gene”或“P1细胞粘附蛋白”指编码肺炎支原体P1细胞粘附蛋白的核苷酸序列，其GenBank登录号M18639，具体序列示于SEQ ID NO1。
根据P1细胞粘附蛋白基因设计的引物可在肺炎支原体的标准株及临床标本中扩增出相应的DNA片段。而且，该引物未在其他相关支原体(如生殖支原体)上扩增出相应片段，说明以P1细胞粘附蛋白基因为基础设计的PCR反应系统具有良好特异性。
就敏感性而言，P1细胞粘附蛋白基因由重复序列RepMP2/3和RepMP4组成，二者在基因组中分别为10个拷贝和8个拷贝。当以此序列为基础设计引物并对对肺炎支原体患者的临床标本进行PCR扩增时，结果显示其敏感性等同于16SrRNA基因。
P1细胞粘附蛋白基因在肺炎支原体仅有的两个型中均存在。对两个型共6株的P1细胞粘附蛋自基因分别测序，随后的同源性比较结果表明两型的P1细胞粘附蛋白基因序列高度保守，并且主要的差异区域集中在相近位点。
虽然通过同源比较，P1细胞粘附蛋白基因的全长基因中有多个区域作为合适的特异性标志区域，然而SEQ ID NO2所示的核苷酸序列是一种特别优选的适合作为肺炎支原体特异性遗传标志的序列。
因此，基于SEQ ID NO1和2，本发明提供了一种利用聚合酶链式反应扩增P1细胞粘附蛋白基因检测肺炎支原体的方法；还提供一种快速定量检测肺炎支原体的荧光定量PCR试剂盒。其中的关键是使用了特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且一个引物的序列与SEQ IDNO1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO1所示的序列互补，且扩增产物的长度为70-300bp。例如，SEQ ID NO3与SEQ ID NO1所示的序列相同，且另一个引物的序列SEQ ID NO4与SEQ ID NO1所示的序列互补，且扩增产物的长度为160bp。SEQ ID NO3和4分别对应于SEQ ID NO1的4275和4417bp位置。
本发明所述的特异性扩增肺炎支原体的引物以及检测用探针，可根据本发明的遗传标记物的序列(SEQ ID NO1或2)进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得(例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成)。
本发明的这些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光索或其他化学发光物质进行标记。
本发明所述肺炎支原体专一性核酸分子引物具有极好的种特异性。用本发明引物进行常规PCR反应，结果能从含有肺炎支原体的材料的DNA提取物中扩增出大小为160bp特异性PCR产物。因此，以本发明引物进行常规PCR反应，并通过判断相应大小PCR产物的有无可以准确、快速地检测肺炎支原体，而且所需的样品量很少。
为了减少假阳性，还可对扩增产物用肺炎支原体特异性探针进行杂交。一种优选的探针是Taqman探针，它可在PCR反应中直接实时地通过荧光信号反映扩增产物的存在与否以及数量的高低。
本发明的探针可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。将该序列的5’端用报告荧光基团如羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)等标记，3’端用淬灭荧光基团如TAMRA或Dabcyl等标记后即可用于对肺炎支原体进行定性和定量分析的PCR反应。
虽然引物和探针与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有本发明的P1细胞粘附蛋白基因或其片段。
虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为70-1000bp，较佳地为90-500bp，更佳地为100-300bp。
将本发明的引物与Taqman探针技术结合，便得到了本发明的同时对肺炎支原体进行定性检测和定量计数分析方法这种分析方法不仅克服了常规定量PCR方法中的误差，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。
在一优选例中一种快速定量检测肺炎支原体的荧光PCR试剂盒，该试剂盒包括a)DNA裂解液，b)荧光定量反应液，c)定量校准品，d)阳性对照品，e)阴性对照品。其特征是1)荧光定量反应液含有PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl2溶液，特异性扩增P1细胞粘附蛋白基因遗传标记物的引物和荧光探针(例如引物序列为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，荧光探针序列为SEQ ID NO5)，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA。
2)定量校准品是含有SEQ ID NO2共160个核苷酸片段构成的pGEM-T载体，且该载体可在大肠杆菌中增殖。阳性对照品是肺炎支原体标准菌株M129培养物。
在本发明的一个优选方案中，荧光定量反应液包含50mM KCl，10mMTris-HCl PH8.3(25℃)，2mM MgCl2，3％甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，荧光探针0.5pmol，0.2mM dNTPs、无菌双蒸水和1.5个单位的Taq酶(ROCHE，瑞士)。其中引物为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列，荧光探针为SEQ ID NO5所示的核苷酸序列，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA。
在本发明的一个优选方案中，定量校准品是含有SEQ ID NO2共160个核苷酸片段构成的pGEM-T载体，且该载体可在大肠杆菌中增殖。贮存浓度为5×109拷贝/ul，使用前10倍梯度稀释。含有目的片段的质粒转化大肠杆菌增殖后，用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释至5×109拷贝/ul，-20℃保存。
在本发明的一个优选方案中，DNA裂解液包含10mM Tris-HCl pH 8.0，0.05mMEDTA，1％ NP-40，1％ Triton，0.05M NaCl。
在本发明提供检测肺炎支原体的荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团的特异性探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离靠近，5’端报告基团产生的荧光应为荧光共振能量转移(FRET)而被3’端淬灭基团淬灭，故体系中检测不到荧光。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’-3’外切活性对荧光探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量PCR仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈正比例关系。对肺炎支原体的定量可以通过与定量校准品的循环阈值(Ct，ThresholdCycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量底循环数。Ct值与起始模板数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多；相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用梯度定量校准品的Ct值制成标准曲线，再根据代测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
本发明提供的检测肺炎支原体的荧光定量PCR试剂盒，经过对各组分，如引物浓度、荧光探针浓度、Mg2+浓度、退火温度等的优化，将FQ-PCR技术和实时荧光PCR系统(包括PE 5700，Lightcycler，Rotorgene)相结合。通过优化方案，反复实验，试剂盒完全可以满足快速特异检测肺炎支原体的实际需求。
本发明还提供了一种利用本发明试剂盒检测肺炎支原体的方法，该方法包括如下检测步骤a)用DNA裂解液从阳性对照品和待测样本中提取DNA；b)分别取上步提取的DNA、梯度定量校准品加入荧光反应液中用实时荧光PCR仪进行扩增检测；c)通过比较待测样品和标准品的循环阈值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。
本发明与现常用的培养法相比具有以下主要优点和效果a)检测速度快，加上DNA的提取，2～3小时完成；b)荧光探针的存在，保证了检测的特异性和灵敏度。
c)操作简单；d)定量准确；e)可同时进行高通量的样品检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1分离用于PCR分析的肺炎支原体DNA为了从待测样本中分离用于聚合酶链式反应检测的肺炎支原体DNA，必须使用不影响聚合酶链式反应的简单方法。首先，用灭菌生理盐水漂洗临床样本(咽拭子)，将漂洗液15,000rpm离心15分钟后弃上清，从而漂洗液中可能含有的肺炎支原体被收集起来。沉淀中加入DNA裂解液后，振荡混匀，100℃沸水浴15分钟，裂解肺炎支原体释放DNA。最后15,000rpm离心15分钟，DNA溶解至上清液中，取上清液作为用于PCR分析的肺炎支原体DNA。
实施例2检测试剂盒的制备用常规方法制备一种快速定量检测肺炎支原体的荧光PCR试剂盒，该试剂盒包括a)DNA裂解液，b)荧光定量反应液，c)定量校准品，d)阳性对照品，e)阴性对照品。其中1)荧光定量反应液含有PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl2溶液，特异性扩增P1细胞粘附蛋白基因遗传标记物的引物序列为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，荧光探针序列为SEQ ID NO5，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团是TAMRA。(扩增产物大小为160bp)具体地，荧光定量反应液包含50mM KCl，10mM Tris-HCl PH8.3(25℃)，2mM MgCl2，3％甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，荧光探针0.5pmol，0.2mMdNTPs、无菌双蒸水和1.5个单位的Taq酶(ROCHE，瑞士)。
2)定量校准品是含有SEQ ID NO2共160个核苷酸的pGEM-T载体(该载体购自Promega公司，SEQ ID NO2插入β-内酰胺酶编码区)，且该载体可在大肠杆菌中增殖。阳性对照品是肺炎支原体标准菌株M129培养物。
具体地，定量校准品的贮存浓度为5×109拷贝/ul，使用前10倍梯度稀释。含有目的片段的质粒转化大肠杆菌增殖后，用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释至5×109拷贝/ul，-20℃保存。
3)DNA裂解液包含10mM Tris-HCl pH 8.0，0.05mM EDTA，1％ NP-40，1％Triton，0.05M NaCl。
实施例3用肺炎支原体进行聚合酶链式反应分别取实施例2中的荧光反应液各26ul加入到不同的PCR反应管中，将实施例1所得的DNA和定量校准品向荧光定量反应液中加入4ul，总体积30ul在实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)上开始扩增检测。扩增参数设置为变性温度93℃ 10秒，退火温度55℃ 10秒，延伸温度72℃ 20秒的循环下，进行40个循环的PCR扩增。把荧光检测的程序设置在每个循环的退火步骤结束时，检测波长为530nm。
循环结束后，运用仪器配套软件，读取待检样本拷贝数。结果为定量校准品5×105拷贝数/ul、5×104拷贝数/ul、5×103拷贝数/ul的Ct值分别为21.56、24.77、27.68；待测样本的Ct值范围为21～38，经标准曲线换算定量范围为1.150×106拷贝数/ul～2拷贝数/ul。具体结果如下表
这表明，本发明试剂盒中可在1.15×106拷贝数/μl～2拷贝数/μl的广大范围内极其灵敏地扩增出肺炎支原体。
实施例4用各种病原体进行聚合酶链式反应用实施例1-3相同的方法进行扩增检测，不同点在于本实施例的反应模板选取其他相近种类病原体的DNA，如生殖支原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、人形支原体、金黄色葡萄球菌、人白细胞DNA。
检测结果如下表
如上所述，本实施例对其他相近的病原体基因无交叉反应，可特异地扩增出肺炎支原体，特别是可以极其有效地区别肺炎支原体和生殖支原体。
因此，本发明第一次揭示了扩增P1 Cytadhesin Gene检测肺炎支原体在敏感性、特异性方面的优势，同时提供了一种在此基础上快速特异检测肺炎支原体的荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒对肺炎支原体的检测灵敏度高、特异性强、重复性好，仅需2～3小时，大大缩短了检测时间。整个操作过程只需一人，一次可检测32～96(实时荧光PCR仪型号决定)个样品，减少了人力资源的浪费。
实施例5用各种病原体进行聚合酶链式反应重复实施例1-4的相同方法，不同点仅在于用SEQ ID NO6和7所示的引物替换SEQ ID NO3和4所示的引物，用SEQ ID NO8所示的探针替换SEQ ID NO5所示的探针。
检测结果表明，该引物对和探针同样可以特异地扩增出肺炎支原体，特别是可以极其有效地区别肺炎支原体和生殖支原体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海华泰生物工程实业有限公司上海复星医学科技发展有限公司<120>用于检测肺炎支原体的靶序列和试剂盒<130>042145<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5169<212>DNA<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)<400>1aattccgtag taacggaatt aacgtacgcg aagtagcttt aaagtatggt ggcgggggtc 60atattcaggc cagcggtgca gttcttaaaa gcaagcgcga cataattcgt gtagttcaag120attgccaaaa gcaaattgct gtataatttt taacaactat gcaccaaacc aaaaaaactg180ccttgtccaa gtccacttgg attctcatcc tcaccgccac cgcctccctc gcgacgggac240tcaccgtagt gggacacttc acaagtacca ccacgacgct caagcgccag caatttagct300acacccgccc tgacgaggtc gcgctgcgcc acaccaatgc catcaacccg cgcttaaccc360cgtgaacgta tcgtaacacg agcttttcct ccctccccct cacgggtgaa aatcccgggg420cgtgggcctt agtgcgcgac aacagcgcta agggcatcac tgccggcagt ggcagtcaac480aaaccacgta tgatcccacc cgaaccgaag cggctttgac cgcatcaacc acctttgcgt540tacgccggta tgacctcgcc gggcgcgcct tatacgacct cgatttttcg aagttaaacc600cgcaaacgcc cacgcgcgac caaaccgggc agatcacctt taaccccttt ggcggctttg660gtttgagtgg ggctgcaccc caacagtgaa acgaggtcaa aaacaaggtc cccgtcgagg720tggcgcaaga cccctccaat ccctaccggt ttgccgtttt actcgtgccg cgcagcgtgg780tgtactatga gcagttgcaa agggggttgg gcttaccaca gcagcgaacc gagagtggtc840aaaatacttc caccaccggg gcaatgtttg gcttgaaggt gaagaacgcc gaggcggaca900ccgcgaagag caatgaaaaa ctccagggcg ctgaggccac tggttcttca accacatctg960gatctggcca atccacccaa cgtgggggtt cgtcagggga caccaaagtc aaggctttaa 1020aaatagaggt gaaaaagaaa tcggactcgg aggacaatgg tcagctgcag ttagaaaaaa 1080atgatctcgc caacgctccc attaagcgga gcgaggagtc gggtcagtcc gtccaactca 1140aggcggacga ttttggtact gccctttcca gttcgggatc aggcggcaac tccaatcccg 1200gttcccccac cccctgaagg ccgtggcttg cgactgagca aattcacaag gacctcccca 1260aatgatccgc ctcgatcctg attctgtacg atgcgcctta tgcgcgcaac cgtaccgcca 1320ttgaccgcgt tgatcacttg gatcccaagg ccatgaccgc gaactatccg cccagttgaa 1380gaacgcccaa gtgaaaccac cacggtttgt gggactgaaa ggcgcgcgat gttttgctcc 1440aaaccaccgg gttcttcaac ccgcgccgcc accccgagtg gtttgatggc gggcagacgg 1500tcgcggataa cgaaaagacc gggtttgatg tggataactc tgaaaacacc aagcagggct 1560ttcaaaagga agctgactcc gacaagtcgg ccccgatcgc cctcccgttt gaagcgtact 1620tcgccaacat tggcaacctc acctggttcg ggcaagcgct tttggtgttt ggtggcaatg 1680gccatgttac caagtcggcc cacaccgcgc ctttgagtat aggtgtcttt agggtgcgct 1740ataatgcaac tggtaccagt gctactgtaa ctggttgacc atatgcctta ctgttctcag 1800gcatggtcaa caaacaaact gacgggttaa aggatctacc ctttaacaat aaccgctggt 1860
ttgaatatgt accacggatg gcagttgctg gcgctaagtt cgttggtagg gaactcgttt 1920tagcgggtac cattaccatg ggtgataccg ctaccgtacc tcgcttactg tacgatgaac 1980ttgaaagcaa cctgaactta gtagcgcaag gccaaggtct tttacgcgaa gacttgcaac 2040tcttcacacc ctacggatga gccaatcgtc cggatttacc aatcggggct tgaagtagta 2100gtagtagtag tagtcacaac gcaccctact acttccacaa taaccccgat tgacaagacc 2160gtccaatcca aaatgtggtt gatgccttta ttaagccctg agaggacaag aacggtaagg 2220atgatgccaa atacatctac ccttaccgtt acagtggcat gtgagcttga caggtataca 2280actggtccaa taagctcact gaccaaccat taagtgctga ctttgtcaat gagaatgctt 2340accaaccaaa ctccttgttt gctgctattc tcaatccgga attgttagca gctcttcccg 2400acaaggttaa atacggtaag gaaaacgagt ttgctgctaa cgagtacgag cgctttaacc 2460agaagttaac ggtagctcct acccaaggaa caaactgatc ccacttctcc cccacgcttt 2520cccgtttctc caccgggttc aaccttgtgg ggtcggtgct cgaccaggtg ttggattatg 2580tgccctggat tgggaatggg tacaggtatg gcaataacca ccggggcgtg gatgatataa 2640ccgcgcctca aaccagcgcg gggtcgtcca gcggaattag tacgaacaca agtggttcgc 2700gttcctttct cccgacgttt tccaacatcg gcgtcggcct caaagcgaat gtccaagcca 2760ccctcggggg cagtcagacg atgattacag gcggttcgcc tcgaagaacc ctcgaccaag 2820ccaacctcca gctctgaacg ggggcggggt gaaggaatga taaggcttca agtggacaaa 2880gtgacgaaaa ccacaccaag ttcacgagcg ctacggggat ggaccagcag ggacaatcag 2940gtacctccgc ggggaatccc gactcgttaa agcaggataa tattagtaag agtggggata 3000gtttaaccac gcaggacggc aatgcgatcg atcaacaaga ggccaccaac tacaccaacc 3060tcccccccaa cctcaccccc accgctgatt gaccgaacgc gctgtcattc accaacaaga 3120acaacgcgca gcgcgcccag ctcttcctcc gcggcttgtt gggcagcatc ccggtgttgg 3180tgaatcgaag tgggtccgat tccaacaaat tccaagccac cgaccaaaaa tggtcctaca 3240ccgacttaca ttcggaccaa accaaactga acctccccgc ttacggtgag gtgaatgggt 3300tgttgaatcc ggcgttggtg gaaacctatt ttgggaacac gcgagcgggt ggttcggggt 3360ccaacacgac cagttcaccc ggtatcggtt ttaaaattcc cgaacaaaat aatgattcca 3420aagccaccct gatcaccccc gggttggctt gaacgcccca ggacgtcggt aacctcgttg 3480tcagtggcac cacggtgagc ttccagctcg gcgggtggct ggtcaccttc acggactttg 3540tcaaaccccg cgcgggttac ctcggtctcc agttaacggg cttggatgca agtgatgcga 3600cgcagcgcgc cctcatttgg gccccccggc cctgagcggc ctttcgtggc agttgggtca 3660accggttggg ccgcgtggag agtgtgtggg atttgaaggg ggtgtgggcg gatcaagctc 3720agtccgactc gcaaggatct accaccaccg caacaaggaa cgccttaccg gagcacccga 3780atgctttggc ctttcaggtg agtgtggtgg aagcgagtgc ttacaagcca aacacgagct 3840ccggccaaac ccaatccact aacagttccc cctacctgca cttggtgaag cctaagaaag 3900ttacccaatc cgacaagtta gacgacgatc ttaaaaacct gttggacccc aaccaggttc 3960gcaccaagct gcgccaaagc tttggtacag accattccac ccagccccag ccccaatcgc 4020tcaaaacaac gacaccggta tttgggacga gtagtggtaa cctcagtagt gtgcttagtg 4080gtgggggtgc tggagggggt tcttcaggct caggtcaatc tggcgtggat ctctcccccg 4140ttgaaaaagt gagtgggtgg cttgtggggc agttaccaag cacgagtgac ggaaacacct 4200cctccaccaa caacctcgcg cctaatacta atacggggaa tgatgtggtg ggggttggtc 4260gactttctga aagcaacgcc gcaaagatga atgacgatgt tgatggtatt gtacgcaccc 4320cactcgctga actgttagat ggggaaggac aaacagctga cactggtcca caaagcgtga 4380agttcaagtc tcctgaccaa attgacttca accgcttgtt tacccaccca gtcaccgatc 4440tgtttgatcc ggtaactatg ttggtgtatg accagtacat accgctgttt attgatatcc 4500cagcaagtgt gaaccctaaa atggttcgtt taaaggtctt gagctttgac accaacgaac 4560agagcttagg tctccgctta gagttcttta aacctgatca agatacccaa ccaaacaaca 4620acgttcaggt caatccgaat aacggtgact tcttaccact gttaacggcc tccagtcaag 4680gtccccaaac cttgtttagt ccgtttaacc agtgacctga ttacgtgttg ccgttagcga 4740tcactgtacc tattgttgtg attgtgctca gtgttacctt aggacttgcc attggaatcc 4800caatgcacaa gaacaaacag gccttgaagg ctgggtttgc gctatcaaac caaaaggttg 4860
atgtgttgac caaagcggtt ggtagtgtct ttaaggaaat cattaaccgc acaggtatca4920gtcaagcgcc aaaacgcttg aaacaaacca gtgcggctaa accaggagca ccccgcccac4980cagtaccacc aaagccaggg gctcctaagc caccagtgca accacctaaa aaacccgctt5040agtatttatg aaatcgaagc taaagttaaa acgttattta ctgtttttac cacttttacc5100gctaggacgt tgtcactagc caacacctac ctcctccaag accacaacac cctcaccccc5160tacacgccc5169<210>2<211>160<212>DNA<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)<400>2aacgccgcaa agatgaatga cgatgttgat ggtattgtac gcaccccact cgctgaactg 60ttagatgggg aaggacaaac agctgacact ggtccacaaa gcgtgaagtt caagtctcct 120gaccaaattg acttcaaccg cttgtttacc cacccagtca 160<210>3<211>17<212>DNA<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)<400>3aacgccgcaa agatgaa 17<210>4<211>19<212>DNA<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)<400>4tgactgggtg ggtaaacaa 19<210>5<211>23<212>DNA<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)<400>5acgatgttga tggtattgta cgc 23<210>6<211>20<212>DNA<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
<400>6gcgacataat tcgtgtagtt20<210>7<211>16<212>DNA<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)<400>7ggcggtgagg atgaga16<210>8<211>20<212>DNA<213>肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)<400>8aagtggactt ggacaaggca20
权利要求
1.一种检测肺炎支原体的遗传标记物，其特征在于，它具有SEQ ID NO1中连续的70-300个核苷酸。
2.如权利要求1所述的遗传标记物，其特征在于，它具有SEQ ID NO2中第1-160位中连续的160个核苷酸。
3.一种检测肺炎支原体的试剂盒，其特征在于，它含有特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且一个引物的序列与SEQID NO1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO1所示的序列互补，且扩增产物的长度为70-300bp。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还含有探针，所述探针的长度为20-50bp，且该探针的序列与SEQ ID NO1所示的序列相同或互补。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对中的一个引物选自下组SEQ ID NO3或6；另一个引物选自下组SEQ ID NO4或7；并且所述的探针是Taqman探针，其序列选自下组SEQ ID NO5或8。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括a)DNA裂解液，b)荧光定量反应液，c)定量校准品，d)阳性对照品，e)阴性对照品。
7.一种检测样品中肺炎支原体的方法，其特征在于，它包括步骤(a)抽提样品的DNA；(b)将抽提的DNA作为模板，用特异性扩增肺炎支原体遗传标记物的引物对进行PCR扩增，其中所述的引物长度为15-35个核苷酸，一个引物的序列与SEQ IDNO1所示的序列相同，且另一个引物的序列与SEQ ID NO1所示的序列互补；(c)检测扩增产物是否存在，存在扩增产物就表示样品中存在肺炎支原体。
8.如权利要求7.所述的方法，其特征在于，所述的步骤(c)是通过检测荧光信号的强弱来定量检测样品中的肺炎支原体。
9.一种支原体P1细胞粘附蛋白基因的用途，其特征在于，它被用作体外检测肺炎支原体是否存在的遗传标记物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，P1细胞粘附蛋白基因具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了快速定量检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)的遗传标记和方法，具体地，本发明提供了肺炎支原体P1细胞粘附蛋白基因(P1 CytadhesinGene)的核苷酸序列，以及以该序列为基础设计的寡核苷酸引物和探针。本发明还提供了用这些引物快速特异性检测肺炎支原体的方法。本发明可方便、快速、准确地定性检测和定量计数肺炎支原体。
文档编号C12Q1/68GK1724686SQ20041005294
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月19日 优先权日2004年7月19日
发明者李超, 周煜, 夏懿 申请人:上海华泰生物工程实业有限公司, 上海复星医学科技发展有限公司