专利名称：控制甜菜碱合成的胆碱单氧化酶，甜菜碱醛脱氢酶双基因表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及构建植物双基因载体，并期望利用转基因技术将载体转入植物中，提高植物的抗旱、耐盐能力。
背景技术：
自然界中广泛存在着一类被称为渗透保护剂或渗透调节剂的无毒小分子化合物，当外界环境存在不利因素时，例如干旱、盐害、冷热时，许多生物体内便会积累一定浓度的渗透保护剂，起着调节胞内渗透压，保护胞内酶活性的作用。甜菜碱是一种比较重要的渗透保护剂，它的积累使得许多代谢中的重要酶类在渗透胁迫下能保持活性。在研究过的150多种代谢物中，甜菜碱是最好的渗透调节剂，甜菜碱合成途径简单，进行遗传操作方便，甜菜碱合成酶基因是最重要和最有希望的胁追抗性基因之一。甜菜碱由胆碱经由两步氧化反应合成胆碱→甜菜碱醛→甜菜碱，其中由胆碱单氧化物酶(CMO)催化的第一步氧化反应，甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化第二步氧化反应，因此CMO和BADH是控制甜菜碱合成的两个关键基因。使用CMO和BADH单基因载体的转基因植株都提高了一定的抗旱性。为了进一步提高转基因植株的抗旱能力，我们研究将CMO和BADH两个基因整合在同一个表达载体中的可能性，并在载体构建成功后研究双基因载体转化植株的可能性，同时将观察转基因植株的抗性变化。
发明内容
本发明不仅考虑了双基因载体在单子叶植物方面的转化，而且还考虑了在双基因植物方面的转化，构建了两种含有不同启动子的载体，使双基因载体可以在单、双子叶植物中都可转化，具体包括1、分别从本实验室已有的pBI-CMO，pBI-BADH质粒上得到CMO和BADH基因；2、用上述1中得到的基因和实验室所拥有的载体，分别构建带有不同启动子的CMO单基因载体和BADH单基因载体(有带Ubi和35S启动子的两种CMO单基因载体，BADH单基因载体带35S启动子)；3、用2中得到的带有不同启动子的单基因载体，进行酶切，将带有启动子和BADH的基因片段连到CMO单基因载体上，得到两种不同启动子的双基因植物表达载体；4、用得到的双基因植物表达载体转入大肠杆菌和农杆菌，为将来单子叶植株和双子叶植株基因转化打下基础。
其中CMO的基因是通过酶切回收得到的，BADH的基因通过PCR方法扩增得到，其中BADH的引物加入了BamH I酶切位点序列。
实验的其他步骤如植物表达载体的构建、植株的转化，抗性苗的筛选均是按已知方法进行的。
附图简要说明
图1表示带有Ubi启动子的CMO和带有35S启动子的BADH双基因载体质粒图(pCUC35SB是对这个载体的命名，其他的酶切位点是构建过程中所利用的)；图2表示将图1构建的载体转化到农杆菌后，对经过抗性板筛选长出的菌斑进行PCR鉴定(从左往右，泳道1至12用的是CMO的引物，其他泳道用的是BADH的引物)；图3表示对构建的载体进行酶切鉴定，用限制性内切酶BamH I对载体进行酶切，并跑电泳，得到如图所示的酶切电泳图像；图4表示两个启动子都是35S的CMO-BADH双基因载体质粒图(pC35SC35SB是对这个载体的命名，其他的酶切位点是构建过程中所利用的)；图5泳道1到4表示将图4构建的载体转化到农杆菌后，对经过抗性板筛选长出的菌斑进行PCR检测(1和3用的是BADH的引物，2和4用的是CMO的引物)；泳道5、6表示对构建的载体进行酶切鉴定，用限制性内切酶BamH I对载体进行酶切，并跑电泳，得到如图所示的酶切电泳图像；实施例实施例一1、CMO-BADH双基因双子叶植物表达载体的构建(一)植物表达中间载体pCUC1303的构建用Sma I和Sac I双酶切质粒pBI-CMO，回收1.2kb CMO基因片段，与经Sma I和Sac I双酶切，回收的pCU1303质粒大片段连接，获得重组质粒pCUC1303。
(二)植物表达中间载体pC35S B1391的构建设计带有BamH I酶切位点序列的PCR引物，用pfu聚合酶对pBI-BADH进行BDAH高保真PCR扩增，回收扩增产物，与PMD-18T体载体进行了连接，送交公司进行测序，然后用BamH I和BstE II双酶切PMD-18T-BADH，回收BADH基因片段，将此基因片段与经BamH I和BstE II双酶切，回收的pC35S1391大片段连接，获得重组质粒pC35S B1391。
(三)植物表达载体pCUC35SB的构建用BstE II和HindIII双酶切中间载体pC35S B1391，回收2.4kb的带35S启动子和BADH基因片段，与经BstE II和HindIII双酶切，回收的中间载体pCUC1303大片段连接，获得植物双基因表达载体pCUC35SB。
2、CMO-BADH双基因单子叶植物表达载体的构建(一)植物表达中间载体pC35S B1391的构建与构建双子叶植物表达载体相同(二)植物表达中间载体pC35SC1303的构建用BamH I和HindIII双酶切pC35S B1391和pCU1303，电泳，分别回收小片段和大片段，连接，检测获得表达中间载体pC35SC1303。
(三)植物表达载体pC35S C35SB的构建用BstE II和HindIII双酶切中间载体pC35S B1391，回收2.4kb的带35S启动子和BADH基因片段，与经BstE II和HindIII双酶切，回收的中间载体pC35SC1303大片段连接，获得植物双基因表达载体pC35SC35SB。
实施例二1、农杆菌转化烟草植株(一)烟草叶片的无菌处理及切片取温室生长的烟草叶片，洗去表面杂物，分别用70％乙醇和2.5％次氯酸钠进行灭菌处理，最后用无菌水洗涤；无菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉，切成指甲盖大小。
(二)农杆菌侵染及培养切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡10分钟，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入MS基本培养基，28℃暗培养。三天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基中进行培养。
2、基因枪转化草坪草(一)建立草坪草高频再生体系采用草坪草成熟种子、胚和胚轴等作为外植体，诱导草坪草的胚性愈伤组织，建立草坪草高频再生体系。
(二)金粉处理与DNA包被采用美国Bio-Rad公司PDS-1000/He型基因枪，按照其说明书上的方法处理金粉和包被外源DNA。
(三)基因枪转化把诱导2-5个月的胚性愈伤组织作为基因枪转化的靶材料，按照说明书的方法对愈伤组织进行轰击。轰击后的愈伤组织转入愈伤组织恢复培养基，后转入含有抗生素的诱导培养基进一步筛选，最后在含有抗生素的分化培养基中最后筛选抗性植株。
(四)转基因植株的获得对得到的抗性植株进行PCR和Southern杂交分析，最终获得转基因植株。
权利要求
1.一种提高植物抗旱耐盐能力的植物转基因育种技术，包括a、双子叶植物的双基因表达载体构建；b、单子叶植物的双基因表达载体构建；c、单、双子叶植物的转基因育种。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物表达载体为pCAMBIA1303。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单子叶植物表达载体的构建中，双基因分别为Ubi启动子-胆碱单氧化酶编码基因(CMO)和35S启动子-甜菜碱醛脱氢酶编码基因(BADH)。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的双子叶植物表达载体的构建中，双基因分别为35S启动子-胆碱单氧化酶编码基因(CMO)和35S启动子-甜菜碱醛脱氢酶编码基因(BADH)。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单子叶植物的转基因育种包括一年生黑麦草、多年生黑麦草、草地早熟禾、日本结缕草。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的双子叶植物的转基因育种包括烟草、胡枝子、草木犀、苜蓿。
全文摘要
本发明通过构建出植物双基因载体，运用转基因技术来将载体转入草坪草中，实现提高草坪草的抗性能力。在构建过程中，不仅考虑了双基因载体在单子叶植物方面的转化，而且还考虑了在双基因植物方面的转化，因此构建了两种含有不同启动子的载体，使双基因载体可以在单、双子叶植物中都可转化。主要通过以下步骤来实现这一目的1.从本实验室已有质粒上获得CMO和BADH基因；2.运用实验室已有的载体和获得的两个基因，构建出带有不同启动子的单基因载体；3.经过多次不同的酶切和连接，得到两种含不同启动子的双基因植物表达载体；4.用得到的双基因植物表达载体转入大肠杆菌和农杆菌，为将来单子叶植株和双子叶植株基因转化打下基础。
文档编号C12N15/70GK1597968SQ20041005727
公开日2005年3月23日 申请日期2004年8月30日 优先权日2004年8月30日
发明者韩烈保, 刘君, 何宇锋, 陈其军, 信金娜 申请人:北京林业大学, 韩烈保, 曾会明