用于epothilone生物合成的基因的制作方法

专利名称：用于epothilone生物合成的基因的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及聚酮化合物(polyketide)和用于合成它们的基因。特别的，本发明涉及从纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)中分离和鉴定生物合成epothilone A和B必需的新的聚酮化合物合酶和非核糖体肽合成酶基因。
背景技术：
聚酮化合物是由二碳结构单元合成的化合物，其β-碳总是携带酮基，由此命名为聚酮化合物。这些化合物包括许多重要的抗生素、免疫抑制剂、癌症化疗剂、和其它具有广泛生物学特性的化合物。巨大的结构多样性源于聚酮化合物链的不同长度、(作为二碳结构单元的一部分或在聚酮化合物主链形成之后)引入的不同侧链、和这些基团的立体化学。酮基还可以被还原成羟基、烯酰基、或完全除去。每一轮二碳的加入是由叫做聚酮化合物合酶(polyketide synthase，PKS)的酶复合物以与脂肪酸生物合成相似的方式进行的。
已经分离得到并测序的聚酮化合物的生物合成基因与日俱增。例如，见美国专利号5,639,949、5,693,774、和5,716,849描述了用于soraphen生物合成的基因，所有这些此处引用作为参考。还可见Schupp等人，FEMS微生物学通讯(FEMS Microbiology Letters)159201-207(1998)和WO 98/07868(其中描述了用于利福霉素生物合成的基因)，和美国专利号5,876,991(其中描述了用于tylactone生物合成的基因，所有这些此处引用作为参考。编码的蛋白质通常分为两类第一类和第二类。第一类蛋白质是多功能的，有多个进行不同酶步骤的催化结构域共价连接在一起(如用于红霉素、soraphen、利福霉素、和除虫菌素的PKS(MacNeil等人，工业微生物基础和应用分子遗传学(Industrial MicroorganismsBasic and AppliedMolecular Genetics)，(编辑Baltz等人)，美国微生物学协会，华盛顿特区，pp.245-256(1993))；而第二类蛋白质是单功能的(Hutchinson等人，工业微生物基础和应用分子遗传学，(编辑Baltz等人)，美国微生物学协会，华盛顿特区，pp.203-216(1993))。
对于较简单的聚酮化合物诸如放线菌紫素(由天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)产生)，几轮二碳的加入在由一组PKS基因编码的PKS酶上重复进行。相反的，更复杂的化合物诸如红霉素和soraphen的合成涉及组织成模块的PKS酶，由此每个模块进行一轮二碳的加入(为了回顾，见Hopwood等人，工业微生物基础和应用分子遗传学，(编辑Baltz等人)，美国微生物学协会，华盛顿特区，pp.267-275(1993))。
复杂的聚酮化合物和次级代谢物通常可能包含氨基酸、而非简单的羧酸衍生的亚结构。这些结构单元的掺入由非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal polypeptide synthetase，NRPS)完成。NRPS是组织成模块的多酶。每个模块负责一个氨基酸结构单元的加入(和额外的处理，如果需要)。NRPS通过形成氨酰腺苷酸激活氨基酸，并将激活的氨基酸捕获于肽基载体蛋白结构域的磷酸泛酰巯基乙胺辅基的硫醇基上。然后，NRPS通过立体异构化、N-甲基化、或环化(如果需要)来修饰氨基酸，并催化被酶结合的氨基酸之间肽键的形成。NRPS负责肽次级代谢物如环孢菌素的生物合成，可以如在雷帕霉素中提供聚酮化合物链终止单位，或如在耶尔森菌素(yersiniabactin)生物合成中与PKS形成混合系统。
Epothilone A和B是16元大环聚酮化合物，具有由细菌纤维堆囊菌菌株So ce90(Gerth等人，抗生素杂志(J.Antibiotics)49560-563(1996)，此处引用作为参考)产生的酰基半胱氨酸衍生的起始单位。Epothilone A和B的结构是(其中R在epothilone A中表示氢，在epothilone B中表示甲基)
epothilone具有窄的抗真菌谱，且在动物细胞培养物中尤其显示高细胞毒性(见H_fle等人，德国专利4138042(1993)，此处引用作为参考)。极其重要的是，epothilone在体内和在培养细胞中都模仿紫杉醇的生物学效应(Bollag等人，癌症研究(Cancer Research)552325-2333(1995)，此处引用作为参考)。稳定细胞微管的紫杉醇和泰索帝(taxotere)是对各种人实体瘤具有显著活性的癌症化疗剂(Rowinsky等人，国家癌症学会会刊(J.Natl.Cancer Inst.)831778-1781(1991))。竞争研究已经揭示了epothilone作为紫杉醇与微管结合的竞争抑制剂，与它们共有相同的微管结合位点和拥有与紫杉醇相似的微管亲和力的解释一致。然而，epothilone具有比紫杉醇显著的优势，因为对多药抗性细胞系epothilone的效力降低比紫杉醇低许多(Bollag等人(1995))。而且，与紫杉醇相比，较少的epothilone有效通过P-糖蛋白排出细胞(Gerth等人(1996))。此外，多种epothilone类似物已经被合成，如它们增强的诱导微管聚合和稳定的能力所示，具有比epothilone A或epothilone B更高的细胞毒性活性(WO 98/25929，此处引用作为参考)。
尽管epothilone有希望作为抗癌药，目前这些化合物的产量限制了它们的商业潜力。这些化合物对于工业规模的化学合成过于复杂，所以必须通过发酵生产。用于粘细菌诸如纤维堆囊菌基因操作的技术描述于美国专利号5,686,295，此处引用作为参考。然而，纤维堆囊菌难以发酵而且epothilone的产量因此低。在更适合发酵的异源宿主中的epothilone重组生产可以解决当前的产量问题。然而，编码负责epothilone生物合成的多肽的基因至今还未分离得到。而且，产生epothilone的菌株，即So ce90，还产生至少一种其它的聚酮化合物spirangien，可能使分离专门负责epothilone生物合成的基因更加复杂。
因此，综上所述，本发明的一个目的是分离涉及epothilone生物合成的基因，特别是在堆囊粘菌/-多囊粘菌属的粘细菌，即纤维堆囊菌菌株So ce90中涉及epothilone A和B合成的基因。本发明的另一个目的是提供应用于抗癌制剂的epothilone的重组生产方法。
发明概述为了促进上述和其它目的，本发明出乎意料的克服了上面提出的困难，首次提供了包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列的核酸分子。在优选的实施方案中，该核苷酸序列是从属于粘细菌目的物种，最优选纤维堆囊菌中分离的。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中多肽包含与选自下组的氨基酸序列基本上相似的氨基酸序列SEQID NO2，SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQ ID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO3，SEQ ID NO3的氨基酸72-81，SEQID NO3的氨基酸118-125，SEQ ID NO3的氨基酸199-212，SEQID NO3的氨基酸353-363，SEQ ID NO3的氨基酸549-565，SEQID NO3的氨基酸588-603，SEQ ID NO3的氨基酸669-684，SEQID NO3的氨基酸815-821，SEQ ID NO3的氨基酸868-892，SEQID NO3的氨基酸903-912，SEQ ID NO3的氨基酸918-940，SEQID NO3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO3的氨基酸973-1256，SEQ ID NO3的氨基酸1344-1351，SEQ ID NO4，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQ ID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048，SEQ IDNO5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO5的氨基酸4729-4974，SEQID NO5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6，SEQID NO6的氨基酸35-454，SEQ ID NO6的氨基酸561-881，SEQ IDNO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQID NO6的氨基酸1522-1946，SEQ ID NO6的氨基酸2053-2373，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551，SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745，SEQ ID NO7，SEQ ID NO7的氨基酸32-450，SEQ IDNO7的氨基酸556-877，SEQ ID NO7的氨基酸887-1051，SEQ IDNO7的氨基酸1478-1790，SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055，SEQID NO7的氨基酸2093-2164，SEQ ID NO7的氨基酸2165-2439，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，和SEQ ID NO22。
在更优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中该多肽包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQ ID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO3，SEQ ID NO3的氨基酸72-81，SEQ ID NO3的氨基酸118-125，SEQ ID NO3的氨基酸199-212，SEQ ID NO3的氨基酸353-363，SEQ ID NO3的氨基酸549-565，SEQ ID NO3的氨基酸588-603，SEQ ID NO3的氨基酸669-684，SEQ ID NO3的氨基酸815-821，SEQ ID NO3的氨基酸868-892，SEQ ID NO3的氨基酸903-912，SEQ ID NO3的氨基酸918-940，SEQ ID NO3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO3的氨基酸973-1256，SEQ ID NO3的氨基酸1344-1351，SEQ ID NO4，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQ ID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ IDNO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQID NO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6，SEQ ID NO6的氨基酸35-454，SEQ ID NO6的氨基酸561-881，SEQ ID NO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946，SEQ ID NO6的氨基酸2053-2373，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551，SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745，SEQ ID NO7，SEQ ID NO7的氨基酸32-450，SEQ ID NO7的氨基酸556-877，SEQ ID NO7的氨基酸887-1051，SEQ ID NO7的氨基酸1478-1790，SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055，SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164，SEQ ID NO7的氨基酸2165-2439，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，和SEQ ID NO22。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本上相似SEQ ID NO1的核苷酸1900-3171的互补序列，SEQ ID NO1的核苷酸3415-5556，SEQ ID NO1的核苷酸7610-11875，SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQ IDNO1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO1的核苷酸14313-14334，SEQID NO1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924，SEQ ID NO1的核苷酸16251-21749，SEQ ID NO1的核苷酸16269-17546，SEQID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO1的核苷酸21746-43519，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO1的核苷酸26045-26263，SEQID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸43524-54920，SEQ ID NO1的核苷酸43626-44885，SEQID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，SEQID NO1的核苷酸54935-62254，SEQ ID NO1的核苷酸55028-56284，SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565，SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254，SEQ ID NO1的核苷酸62369-63628，SEQID NO1的核苷酸67334-68251，和SEQ ID NO1的核苷酸1-68750。
在特别优选的实施方案中，本发明提供了包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸1900-3171的互补序列，SEQ ID NO1的核苷酸3415-5556，SEQ ID NO1的核苷酸7610-11875，SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO1的核苷酸11872-16104，SEQID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO1的核苷酸14473-14547，SEQID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924，SEQ ID NO1的核苷酸16251-21749，SEQ ID NO1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO1的核苷酸17865-18827，SEQID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO1的核苷酸21746-43519，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO1的核苷酸26318-27595，SEQID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO1的核苷酸36773-36991，SEQID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸43524-54920，SEQ ID NO1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO1的核苷酸45204-46166，SEQID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，SEQ ID NO1的核苷酸54935-62254，SEQID NO1的核苷酸55028-56284，SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565，SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254，SEQ ID NO1的核苷酸62369-63628，SEQ ID NO1的核苷酸67334-68251，和SEQ ID NO1的核苷酸1-68750。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分SEQ IDNO1的核苷酸1900-3171的互补序列，SEQ ID NO1的核苷酸3415-5556，SEQ ID NO1的核苷酸7610-11875，SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQID NO1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO1的核苷酸14313-14334，SEQID NO1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924，SEQ ID NO1的核苷酸16251-21749，SEQ ID NO1的核苷酸16269-17546，SEQID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO1的核苷酸21746-43519，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO1的核苷酸26045-26263，SEQID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸43524-54920，SEQ ID NO1的核苷酸43626-44885，SEQID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，SEQID NO1的核苷酸54935-62254，SEQ ID NO1的核苷酸55028-56284，SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565，SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254，SEQ ID NO1的核苷酸62369-63628，SEQID NO1的核苷酸67334-68251，和SEQ ID NO1的核苷酸1-68750。
本发明还提供包含与本发明的核酸分子可操作连接的异源启动子序列的嵌合基因。其次，本发明提供了包含这种嵌合基因的重组载体，其中所述载体能够被稳定的转化到宿主细胞中。再次，本发明提供了包含这种嵌合基因的重组宿主细胞，其中宿主细胞能够表达编码至少一种epothilone生物合成必需的多肽的核苷酸序列。在优选的实施方案中，重组宿主细胞是属于放线菌目的细菌，而且在更优选的实施方案中重组宿主细胞是链霉菌菌株。在其它实施方案中，重组宿主细胞是任何其它适合发酵的细菌，诸如假单胞菌或大肠杆菌。再其次，本发明提供了包含本发明的核酸分子的Bac克隆，优选Bac克隆pEPO15。
在另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码epothilone合酶结构域的核苷酸序列。
根据一个实施方案，epothilone合酶结构域是β-酮脂酰合酶(KS)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQID NO2的氨基酸11-437，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ IDNO5的氨基酸39-457，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ IDNO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525，SEQID NO6的氨基酸35-454，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946，和SEQ ID NO7的氨基酸32-450。根据这个实施方案，优选所述KS结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO6的氨基酸35-454，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946，和SEQ ID NO7的氨基酸32-450。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，和SEQ ID NO1的核苷酸55028-56284。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO1的核苷酸26318-27595，SEQID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，和SEQ ID NO1的核苷酸55028-56284。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQID NO1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，和SEQ ID NO1的核苷酸55028-56284。
根据另一个实施方案，epothilone合酶结构域是酰基转移酶(AT)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO6的氨基酸561-881，SEQ ID NO6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO7的氨基酸556-877。根据这个实施方案，优选所述AT结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO5的氨基酸5631-5951，SEQ IDNO6的氨基酸561-881，SEQ ID NO6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO7的氨基酸556-877。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO1的核苷酸27911-28876，SEQID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，和SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565。根据这个实施方案，更优选所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ IDNO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，和SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，和SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565。
根据另一个实施方案，该epothilone合酶结构域是烯酰基还原酶(ER)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，和SEQ ID NO7的氨基酸1478-1790。根据这个实施方案，优选所述ER结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，和SEQID NO7的氨基酸1478-1790。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，和SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ IDNO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，和SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，和SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是酰基载体蛋白(ACP)结构域，其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQ IDNO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQID NO6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164。根据这个实施方案，优选所述ACP结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO1的核苷酸26045-26263，SEQID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，和SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426。根据这个实施方案，更优选所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ IDNO1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，和SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ IDNO1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，和SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是脱水酶(DH)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551，和SEQ ID NO7的氨基酸887-1051。根据这个实施方案，优选所述DH结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551，和SEQ IDNO7的氨基酸887-1051。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，和SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087。根据这个实施方案，更优选所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分SEQ IDNO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，和SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，和SEQ IDNO1的核苷酸57593-58087。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是β-酮还原酶(KR)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，和SEQID NO7的氨基酸1810-2055。根据这个实施方案，优选所述KR结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，和SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，和SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45、或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，和SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，和SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是甲基转移酶(MT)结构域，其包含与SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045基本相似的氨基酸序列。根据这个实施方案，优选所述MT结构域包含SEQ IDNO6的氨基酸2671-3045。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657基本相似。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657中相应的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列是SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是硫酯酶(TE)结构域，其包含与SEQ ID NO7的氨基酸2165-2439基本相似的氨基酸序列。根据这个实施方案，优选所述TE结构域包含SEQ ID NO7的氨基酸2165-2439。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254基本相似。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254中相应的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列是SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254。
在另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码非核糖体肽合成酶的核苷酸序列，其中所述非核糖体肽合成酶包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO3的氨基酸72-81，SEQ ID NO3的氨基酸118-125，SEQ ID NO3的氨基酸199-212，SEQ ID NO3的氨基酸353-363，SEQ ID NO3的氨基酸549-565，SEQ ID NO3的氨基酸588-603，SEQ ID NO3的氨基酸669-684，SEQ ID NO3的氨基酸815-821，SEQ ID NO3的氨基酸868-892，SEQ ID NO3的氨基酸903-912，SEQ ID NO3的氨基酸918-940，SEQ ID NO3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO3的氨基酸973-1256，和SEQ IDNO3的氨基酸1344-1351。根据这个实施方案，优选所述非核糖体肽合成酶包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO3的氨基酸72-81，SEQ ID NO3的氨基酸118-125，SEQ ID NO3的氨基酸199-212，SEQ ID NO3的氨基酸353-363，SEQ ID NO3的氨基酸549-565，SEQ ID NO3的氨基酸588-603，SEQ ID NO3的氨基酸669-684，SEQ ID NO3的氨基酸815-821，SEQ ID NO3的氨基酸868-892，SEQ ID NO3的氨基酸903-912，SEQ ID NO3的氨基酸918-940，SEQ ID NO3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO3的氨基酸973-1256，和SEQ IDNO3的氨基酸1344-1351。而且，根据这个实施方案，优选所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，和SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924。根据这个实施方案，更优选该核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中相应的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的部分序列相同的连续20、25、30、35、40、45或50(优选20)个碱基对的核苷酸部分SEQ IDNO1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO1的核苷酸14313-14334，SEQID NO1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，和SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924。此外，根据这个实施方案，最优选该核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ IDNO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO1的核苷酸14578-14607，SEQID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，和SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924。
本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码包括选自SEQID NO2-23的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
根据另一方面，本发明还提供了用于重组生产聚酮化合物诸如epothilone的方法，其生产产量足够用于它们的纯化和药用制剂诸如用于治疗癌症。这些生产方法的特殊优势是产生的分子有手性；在转基因有机体中进行生产，避免了产生大量的外消旋混合物，其中一些对映体可能具有降低的活性。特别的，本发明提供了在重组宿主中异源表达epothilone的方法，包括(a)将包含与本发明的核酸分子(其包括编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列)可操作连接的异源启动子序列的嵌合基因导入宿主；和(b)在适合宿主中生物合成epothilone的条件下培养宿主。本发明还提供了生产epothilone的方法，包括(a)用上述方法在重组宿主中表达epothilone；和(b)从重组宿主中提取epothilone。
根据另一方面，本发明提供了一种分离的多肽，其包括由epothilone合酶结构域组成的氨基酸序列。
根据一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是β-酮脂酰合酶(KS)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO6的氨基酸35-454，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946，和SEQ ID NO7的氨基酸32-450。根据这个实施方案，优选所述KS结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525，SEQ IDNO6的氨基酸35-454，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946，和SEQID NO7的氨基酸32-450。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是酰基转移酶(AT)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO6的氨基酸561-881，SEQ ID NO6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO7的氨基酸556-877。根据这个实施方案，优选所述AT结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO5的氨基酸5631-5951，SEQ IDNO6的氨基酸561-881，SEQ ID NO6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO7的氨基酸556-877。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是烯酰基还原酶(ER)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，和SEQ ID NO7的氨基酸1478-1790。根据这个实施方案，优选该ER结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，和SEQ IDNO7的氨基酸1478-1790。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是酰基载体蛋白(ACP)结构域，其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQ IDNO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQID NO6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164。根据这个实施方案，优选所述ACP结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是脱水酶(DH)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551，和SEQ ID NO7的氨基酸887-1051。根据这个实施方案，优选所述DH结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551，和SEQ IDNO7的氨基酸887-1051。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是β-酮还原酶(KR)结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，和SEQID NO7的氨基酸1810-2055。根据这个实施方案，优选所述KR结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，和SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055。
根据另一个实施方案，所述epothilone合酶结构域是甲基转移酶(MT)结构域，其包含与SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045基本相似的氨基酸序列。根据这个实施方案，优选所述MT结构域包含SEQ IDNO6的氨基酸2671-3045。
根据另一个实施方案，所述epothilone合成酶结构域是硫酯酶(TE)结构域，其包含与SEQ ID NO7的氨基酸2165-2439基本相似的氨基酸序列。根据这个实施方案，优选所述TE结构域包含SEQ IDNO7的氨基酸2165-2439。
本发明的其它方面和优点对于那些本领域的技术人员，在研究了本发明的下列描述和非限制性实施例后将是显而易见的。
定义在本发明的描述中，将使用下列术语，并做如下定义。
相关联/可操作连接指物理或功能相关的两种DNA序列。例如，如果将启动子或调控DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA可操作连接或放置，以至于调控DNA序列将影响编码或结构DNA序列的表达水平，则该启动子或调控序列被认为是与该DNA序列“相关联”。
嵌合基因重组DNA序列，其中启动子或调控DNA序列与编码mRNA或表达为蛋白质的DNA序列可操作连接，或与之相关联，以至于调控DNA序列能够调控该相关联的DNA序列的转录或表达。正如在自然界中发现的，嵌合基因的调控DNA序列通常不与该相关联的DNA序列可操作连接的。
编码DNA序列在有机体中翻译成蛋白质的DNA序列。
结构域聚酮化合物合酶中对于特定的独特活性必需的那部分。例子包括酰基载体蛋白(acyl carrier protein，ACP)、β-酮合酶(β-ketosynthase，KS)、酰基转移酶(acyltransferae，AT)、β-酮还原酶(β-ketoreductase，KR)、脱水酶(dehydratase，DH)、烯酰基还原酶(enoylreductase，ER)、和硫酯酶(thioesterase，TE)结构域。
Epothilone由细菌纤维堆囊菌菌株So ce90天然产生的16元大环聚酮化合物，模仿紫杉醇的生物学效应。在本申请中，“epothilone”指聚酮化合物类，包括epothilone A和epothilone B，以及它们的类似物诸如WO 98/25929中描述的那些。
Epothilone合酶负责epothilone生物合成的聚酮化合物合酶。
基因位于基因组内，除了上述编码DNA序列，还包括主要是调控DNA序列(负责调控编码DNA序列的表达即转录和翻译的DNA序列)的确定区域。
异源DNA序列与导入的宿主细胞天然不相关联的DNA序列，包括天然DNA序列的非自然产生的多拷贝。
同源DNA序列与导入的宿主细胞天然相关联的DNA序列。
同源重组同源DNA分子之间互相交换DNA片段。
分离的在本发明的内容中，分离的核酸分子或分离的酶是由人工实现，脱离其自然环境存在并因而不是天然产物的核酸分子或酶。分离的核酸分子或酶可以以纯化形式存在，或者可以在非天然环境诸如重组宿主细胞中存在。
模块编码单轮聚酮化合物生物合成(即一个缩合步骤和所有与此有关的β-羰基处理步骤)需要的所有独特活性的基因元件。每个模块编码ACP、KS、和AT活性以实现生物合成的缩合部分，编码选定的缩合后活性以进行β-羰基处理。
NRPS非核糖体多肽合成酶，是负责将氨基酸加入到次级代谢物中的酶活性，包括，例如，氨基酸腺苷酸化、异构化、N-甲基化、环化、肽酰基载体蛋白、和缩合结构域的复合物。有功能的NRPS催化将氨基酸加入到次级代谢物中。
NRPS基因编码在一个或多个相容的控制元件的指导下产生有功能的次级代谢物(例如epothilone A和B)的NRPS的一个或多个基因。
核酸分子可以从任何来源分离的单链或双链DNA或RNA的线性片段。在本发明的内容中，核酸分子优选是DNA片段。
ORF开放阅读框架。
PKS聚酮化合物合酶，是负责聚酮化合物生物合成的酶活性(结构域)，包括，例如酮还原酶、脱水酶、酰基载体蛋白、烯酰基还原酶、酮脂酰ACP合酶、和酰基转移酶的复合物。有功能的PKS催化聚酮化合物的合成。
PKS基因当在一个或多个相容的控制元件的指导下，编码产生有功能的聚酮化合物(如epothilone A和B)需要的各种多肽的一个或多个基因。
基本相似对于核酸，是指具有与参考核酸分子至少60％序列相同的核酸分子。在优选的实施方案中，基本相似的DNA序列与参考DNA序列至少80％相同；在更优选的实施方案中，基本相似的DNA序列与参考DNA序列至少90％相同；而在最优选的实施方案中，基本相似的DNA序列与参考DNA序列至少95％相同。基本相似的DNA序列优选编码具有与参考DNA序列编码的蛋白质或肽基本相同活性的蛋白质或肽。基本相似的核苷酸序列通常可与参考核酸分子或它们的片段在下列条件下杂交在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4pH7.0、1mM EDTA中于50℃杂交；用2×SSC、1％SDS于50℃漂洗。对于蛋白质或肽，基本相似的氨基酸序列是与参考蛋白质或肽的氨基酸序列至少90％相同而且具有与参考蛋白质或肽基本相同活性的氨基酸序列。
转化将异源核酸导入宿主细胞或有机体的过程。
经转化的/转基因的/重组的指已经导入了异源核酸分子的宿主有机体诸如细菌。核酸分子可以稳定的整合到宿主的基因组中，或者核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这样的染色体外分子可以自主复制。经转化的细胞、组织、或植株应理解为不仅包含转化过程的终产物，而且还有它的转基因后代。“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主指野生型有机体，即细菌，其中不含有异源核酸分子。
核苷酸由它们的碱基依照下列标准缩写表示腺嘌呤(adenine，A)，胞嘧啶(cytosine，C)，胸腺嘧啶(thymine，T)，和鸟嘌呤(guanine，G)。氨基酸类似的依照下列标准缩写表示丙氨酸(alanine；Ala；A)，精氨酸(arginine；Arg；R)，天冬酰胺(asparagine；Asn；N)，天冬氨酸(aspartic acid；Asp；D)，半胱氨酸(cysteine；Cys；C)，谷氨酰胺(glutamine；Gln；Q)，谷氨酸(glutamic acid；Glu；E)，甘氨酸(glycine；Gly；G)，组氨酸(histidine；His；H)，异亮氨酸(isoleucine；Ile；I)，亮氨酸(leucine；Leu；L)，赖氨酸(lysine；Lys；K)，甲硫氨酸(methionine；Met；M)，苯丙氨酸(phenylalanine；Phe；F)，脯氨酸(prol ine；Pro；P)，丝氨酸(serine；Ser；S)，苏氨酸(threonine；Thr；T)，色氨酸(trytophan；Trp；W)，酪氨酸(tyrosine；Tyr；Y)，和缬氨酸(valine；Val；V)。此外，(Xaa；X)代表任何氨基酸。
序列表中序列的描述SEQ ID NO1是含有22个开放阅读框架(ORF)的68750bp毗连序列群的核苷酸序列，包括epothilone生物合成基因。
SEQ ID NO2是由epoA(SEQ ID NO1的核苷酸7610-11875)编码的第一类聚酮化合物合酶(EPOS A)的蛋白质序列。
SEQ ID NO3是由epoP(SEQ ID NO1的核苷酸11872-16104)编码的非核糖体肽合成酶(EPOS P)的蛋白质序列。
SEQ ID NO4是由epoB(SEQ ID NO1的核苷酸16251-21749)编码的第一类聚酮化合物合酶(EPOS B)的蛋白质序列。
SEQ ID NO5是由epoC(SEQ ID NO1的核苷酸21746-43519)编码的第一类聚酮化合物合酶(EPOS C)的蛋白质序列。
SEQ ID NO6是由epoD(SEQ ID NO1的核苷酸43524-54920)编码的第一类聚酮化合物合酶(EPOS D)的蛋白质序列。
SEQ ID NO7是由epoE(SEQ ID NO1的核苷酸54935-62254)编码的第一类聚酮化合物合酶(EPOS E)的蛋白质序列。
SEQ ID NO8是由epoF(SEQ ID NO1的核苷酸62369-63628)编码的细胞色素P450加氧酶同源物(EPOS F)的蛋白质序列。
SEQ ID NO9是由orf1(SEQ ID NO1的核苷酸1-1826)编码的部分蛋白质序列(部分Orf1)。
SEQ ID NO10是由orf2(SEQ ID NO1反向互补链的核苷酸3171-1900)编码的蛋白质序列(Orf2)。
SEQ ID NO11是由orf3(SEQ ID NO1的核苷酸3415-5556)编码的蛋白质序列(Orf3)。
SEQ ID NO12是由orf4(SEQ ID NO1反向互补链的核苷酸5992-5612)编码的蛋白质序列(Orf4)。
SEQ ID NO13是由orf5(SEQ ID NO1的核苷酸6226-6675)编码的蛋白质序列(Orf5)。
SEQ ID NO14是由orf6(SEQ ID NO1的核苷酸63779-64333)编码的蛋白质序列(Orf6)。
SEQ ID NO15是由orf7(SEQ ID NO1反向互补链的核苷酸64290-63853)编码的蛋白质序列(Orf7)。
SEQ ID NO16是由orf8(SEQ ID NO1的核苷酸64363-64920)编码的蛋白质序列(Orf8)。
SEQ ID NO17是由orf9(SEQ ID NO1反向互补链的核苷酸64727-64287)编码的蛋白质序列(Orf9)。
SEQ ID NO18是由orf10(SEQ ID NO1的核苷酸65063-65767)编码的蛋白质序列(Orf10)。
SEQ ID NO19是由orf11(SEQ ID NO1反向互补链的核苷酸65874-65008)编码的蛋白质序列(Orf11)。
SEQ ID NO20是由orf12(SEQ ID NO1反向互补链的核苷酸66338-65871)编码的蛋白质序列(Orf12)。
SEQ ID NO21是由orf13(SEQ ID NO1的核苷酸66667-67137)编码的蛋白质序列(Orf13)。
SEQ ID NO22是由orf14(SEQ ID NO1的核苷酸67334-68251)编码的蛋白质序列(Orf14)。
SEQ ID NO23是由orf15(SEQ ID NO1的核苷酸68346-68750)编码的部分蛋白质序列(部分Orf15)。
SEQ ID NO24是通用的反向PCR引物序列。
SEQ ID NO25是通用的正向PCR引物序列。
SEQ ID NO26是NH24末端“B”PCR引物序列。
SEQ ID NO27是NH2末端“A”PCR引物序列。
SEQ ID NO28是NH2末端“B”PCR引物序列。
SEQ ID NO29是pEPO15-NH6“B”PCR引物序列。
SEQ ID NO30是pEPO15-H2.7“A”PCR引物序列。
保藏信息下列物质已依照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，已经储存于农业研究服务中心(Agricultural Research Service)，专利培养物收藏中心(Patent Culture Collection(NRRL))，1815北方大学街，Peoria，伊利诺斯州61604。所有对获取保藏物的限制在取得专利的授权后将消除。
保藏物保藏号储存日期pEPO15NRRL B-300331998年6月11日pEPO32NRRL B-301191999年4月16日


图1是实施例14中所述的100升发酵的接种链示意图。
发明的详细描述可以使用本发明的技术分离得到涉及epothilone生物合成的基因。分离epothilone生物合成基因的优选步骤，需要从经鉴定产生epothilone A和B的有机体中分离基因组DNA，并将分离的合适质粒或载体上的DNA转移到通常不产生聚酮化合物的宿主有机体中，随后鉴定具有epothilone生产能力的经转化的宿主菌落。使用诸如λ∷Tn5转座子诱变(de Bruijn和Lupski，基因(Gene)27131-149(1984))技术，转化的赋予epothilone的DNA的精确区域可以更准确确定。可替代地或额外地，可以将转化的赋予epothilone的DNA切割成较小的片段，而且可以进一步鉴定维持授予epothilone能力的最小片段。然而，缺乏epothilone生产能力的宿主有机体可能是与产生聚酮化合物的物种不同的物种，这种技术的变更涉及将宿主DNA转化到epothilone生产能力已经被诱变破坏的相同宿主中。在这种方法中，产生epothilone的有机体被突变了，并分离得到不产生epothilone的突变体。然后将这些突变体用从产生epothilone的亲本菌株中分离的基因组DNA弥补。
可以用来分离epothilone生物合成需要的基因的进一步的实例，是使用转座子诱变来产生产生epothilone的有机体的突变体，其被诱变后不能产生聚酮化合物。这样，宿主基因组负责产生epothilone的区域被转座子标以标签，而且可以回收并作为探针使用来从亲代菌株中分离天然基因。由于它们与序列已知的生物合成基因诸如利福霉素或soraphen生物合成的PKS基因的序列同源性，可以分离得到合成聚酮化合物需要的、且与已知的PKS基因相似的PKS基因。利用同源性的合适分离技术，包括由DNA杂交进行常规文库筛选。
可以从在已知聚酮化合物合成中起作用的基因或其它DNA序列中得到的DNA片段，作为优选的探针分子使用。一种优选的探针分子包括编码soraphen PKS第四个模块的酮合酶结构域的1.2kb Sma I DNA片段(美国专利号5,716,849)，更优选的探针分子包括利福霉素PKS第一和第二模块的β-酮脂酰合酶结构域(Schupp等人，FEMS微生物通讯159201-207(1998))。这些探针可以用来探测产生epothilone的微生物的基因库，以分离负责epothilone生物合成的PKS基因。
尽管众所周知分离PKS基因通常很困难，尽管预期分离epothilone生物合成基因将特别困难，通过使用此说明书中描述的方法，可以令人惊讶的从产生epothilone A和B的微生物中克隆得到该聚酮化合物的生物合成基因。使用此说明书中描述的基因操作的方法和重组产物，可以修饰和在转基因宿主有机体中表达被克隆的PKS基因。
可以在异源宿主中表达分离的epothilone生物合成基因，以比天然宿主更高效的生产聚酮化合物。用于这些基因操作的技术，对于不同的可获得的宿主是特异的，而且本领域的技术人员是知道的。例如，使用诸如那些描述于McDaniel等人，科学(Science)2621546-1550(1993)和Kao等人，科学265509-512(1994)(此处引用作为参考)的技术，可以在链霉菌和其它放线菌中表达异源基因。还可见，Rowe等人，基因(Gene)216215-226(1998)；Holmes等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO Journal)12(8)3183-3191(1993)和Bibb等人，基因38215-226(1985)，此处引用作为参考。
或者，还可以在其它宿主有机体诸如假单胞菌和大肠杆菌中表达负责聚酮化合物生物合成的基因，即epothilone生物合成基因。用于这些基因操作的技术对于不同的可获得的宿主是特异的，而且本领域的技术人员是知道的。例如，使用pT7-7载体(使用T7启动子)，已经在大肠杆菌中成功的表达了PKS基因。见，Tabor等人，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)821074-1078(1985)，此处引用作为参考。此外，可以用表达载体pKK223-3和pKK223-2在大肠杆菌中表达异源基因，或以转录或以翻译融合方式，在tac或trc启动子之后。对于编码多ORF的操纵子的表达，最简单的步骤是以转录融合方式将操纵子插入到载体诸如pKK223-3中，使得能够使用异源基因的同类核糖体结合位点。用于在革兰氏阳性物种诸如芽孢杆菌中过量表达的技术，本领域的技术人员也是知道的，而且可以用于本发明中(Quax等人，工业微生物学基础和应用分子遗传学，编辑Baltz等人，美国微生物学学会，华盛顿(1993))。
其它可以与本发明的epothilone生物合成基因使用的表达系统，包括酵母和杆状病毒表达系统。见，例如，“重组蛋白质在酵母中的表达”，P.E.Sudbery，生物技术的流行观点(Curr.Opin.Biotechnol.)7(5)517-524(1996)；“在酵母中表达重组蛋白质的方法”，Mackay等人，编辑Paul R.Carey，蛋白质工程评论(Protein Eng.Des.)105-153，出版商Academic，圣地亚哥，加利福尼亚(1996)；“异源基因产物在酵母中的表达”，Pichuantes等人，编辑J.L.Cleland，C.S.Craik，蛋白质工程(Protein Eng.)129-161，出版商Wiley-Liss，纽约，纽约(1996)；WO 98/27203；Kealey等人，美国国家科学院进展95505-509(1998)；“昆虫细胞培养蛋白质生产的最新进展，生物工程挑战和意义”，Palomares等人，编辑EnriqueGalindo；Octavio T.Ramirez，高级生物工程(Adv.Bioprocess Eng.)第2卷，Invited Pap.Int.Symp.，第二版(1998)25-52，出版商Kluwer，Dordrecht，Neth；“杆状病毒表达载体”，Donald L.Jarvis，编辑Lois K.Miller，杆状病毒(Baculoviruses)389-431，出版商Plenum，纽约，纽约(1997)；“使用杆状病毒/昆虫表达系统生产异源蛋白质”，Grittiths等人，分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)(N.J.Totowa)75(基础细胞培养方案(第二版))427-440(1997)；和“昆虫细胞表达技术”，Verne A.Luckow，蛋白质工程183-218，出版商Wiley-Liss，纽约，纽约(1996)；所有文献均此处引用作为参考。
在异源宿主中表达PKS基因的另一个要考虑的问题，是PKS酶的翻译后修饰(在它们能够合成聚酮化合物之前要磷酸泛酰巯基乙胺基化)需要酶。然而，负责第一类PKS酶的这种修饰的酶，磷酸泛酰巯基乙胺基(P-pant)转移酶在许多宿主诸如大肠杆菌中通常不存在。这个问题可以通过P-pant转移酶与PKS基因在异源宿主中的共表达解决，如Kealey等人，美国国家科学院进展95505-509(1998)描述的，此处引用作为参考。
因此，为了生产聚酮化合物，选择宿主有机体的重要标准是它的操作容易，生长(即发酵)迅速，拥有适当的加工诸如翻译后修饰的分子机制，和对过量表达聚酮化合物不敏感。最优选的宿主有机体是放线菌诸如链霉菌菌株。其它优选的宿主有机体是假单胞菌和大肠杆菌。生产聚酮化合物的上述方法比制备该类化合物使用的现行技术具有明显优势。这些优势包括生产成本更低，生产更大量的化合物的能力，和生产优选生物学对映体的化合物的能力，这与有机合成生产不可避免的外消旋混合物相反。由异源宿主产生的化合物可以用于医疗(例如用epothilone治疗癌症)以及农业应用。
实验本发明将由下列详细实施例作为参考进一步描述。提供这些实施例只是为了例证，而并不是为了限制(除非特殊说明)。此处使用的常规重组DNA和分子克隆技术是本领域的技术人员熟知的，而且由Ausubel(编辑)，分子生物学现行方案(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley and Sons Inc.(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆实验室手册(MolecularCloningA Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)；和T.J.Silhavy，M.L.Berman，和L.W.Enquist，基因融合实验(Experiments with Gene Fusion)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1994)描述。
实施例1生产epothilone的纤维堆囊菌菌株的培养将纤维堆囊菌菌株90(DSM 6773，Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen，Braunschweig)在SolE培养基(0.35％葡萄糖，0.05％胰蛋白胨，0.15％ MgSO4·7H2O，0.05％硫酸铵，0.1％ CaCl2，0.006％ K2HPO4，0.01％连二亚硫酸钠，0.0008％Fe-EDTA，1.2％ HEPES，3.5％[vol/vo/]经灭菌的稳定期纤维堆囊菌培养物的上清液)pH调到7.4的琼脂平板上划线，并于30℃培养。挑取来自1cm2的细胞，接种到5ml G51t液体培养基(0.2％葡萄糖，0.5％淀粉，0.2％胰蛋白胨，0.1％ probion S，0.05％ CaCl2·2H2O，0.05％ MgSO4·7H2O，1.2％ HEPES，pH调到7.4)中，并于30℃振摇225rpm培养。4天后，将培养物转移到50ml G51t中，并如上所述培养5天。用此培养物接种500ml G51t，并如上所述培养6天。将此培养物以4000rpm离心10分钟，并将细胞沉淀重悬于50ml G51t中。
实施例2细菌人工染色体文库的构建为了构建Bac文库，将如实施例1所述培养的纤维堆囊菌细胞包埋于琼脂糖块中，裂解，并将释放出来的基因组DNA用限制酶HindIII部分消化。在琼脂糖凝胶上用脉冲电泳分离经消化的DNA。从琼脂糖凝胶中分离大片段DNA(大约90-150kb)，并连接到载体pBelobacII中。pBelobacII包含编码氯霉素抗性的基因、位于lacZ基因中在适当培养基上提供蓝白斑选择的多克隆位点、以及复制和在每个细胞中维持一个或两个质粒拷贝需要的基因。使用常规电穿孔技术，将连接混合物转化大肠杆菌DH10B电感受态细胞。将氯霉素抗性重组体(白斑、lacZ突变)菌落转移到带正电的384 3×3栅格的尼龙滤膜上。裂解克隆并将DNA交联到滤膜上。将同一克隆以液体培养物的形式保存于-80℃。
实施例3在纤维堆囊菌90的Bac文库中筛选第一类聚酮化合物合酶的相关序列使用常规Southern杂交步骤探测Bac文库滤膜。使用的探针编码利福霉素聚酮化合物合酶第一和第二模块的β-酮脂酰合酶结构域(Schupp等人，FEMS微生物学通讯159210-207(1998))。以质粒pNE95(pNE95即Schupp等人(1998)中描述的粘粒2)作为模板，使用每个酮合酶结构域两侧的引物通过PCR产生探针DNA。从0.5％琼脂糖凝胶分离得到25ng PCR扩增的DNA，并使用随机引物标记试剂盒(Gibco-BRL，Methesda，MD，美国)按照供应商的指示用32P-dCTP标记。杂交于65℃进行36小时，并在高度严谨条件下洗膜(0.1×SSC和0.5％ SDS于65℃20分钟3次)。将经标记的斑点暴露于磷光屏上，并在Phospholmager 445SI上检测信号(屏和445SI购自MolecularDynamics)。结果某些Bac克隆与探针强杂交。选择这些克隆，并在5ml Luria肉汤(LB)培养基中于37℃培养过夜。使用典型的微量制备步骤，从感兴趣的Bac克隆中分离Bac DNA。将细胞重悬于200μl溶菌酶溶液(50mM葡萄糖，10mM EDTA，25mM Tris-HCl，5mg/ml溶菌酶)，在400μl裂解液(0.2N NaOH和2％ SDS)中裂解，沉淀蛋白质(3.0M醋酸钾，用乙酸调到pH5.2)，并用异丙醇沉淀Bac DNA。将DNA重悬于20μl无核酸酶的蒸馏水中，用BamHI(New England Biolabs，Inc.)限制酶消化，并在0.7％琼脂糖凝胶上分离。如上所述通过Southern杂交将凝胶转膜，并在如上所述的条件下用编码soraphen聚酮化合物合酶第四模块的酮合酶结构域的1.2kb Sma I DNA片段作为探针(见，美国专利号5,716,849)探测。观察到五个不同的杂交样式。每种选择一个克隆作为代表，并分别命名为pEPO15、pEPO20、pEPO30、pEPO31、和pEPO33。
实施例4pEPO15、pEPO20、pEPO30、pEPO31、和pEPO33的BamH I片段的亚克隆用BamH I消化五个选择的Bac克隆的DNA，并将随机片段亚克隆到pBluescript II SK+(Stragagene)的BamH I位点。选择插入片段大小在2-10kb之间的亚克隆，以测定插入片段两侧末端的序列，并且还用如上所述的1.2Sma I探针探测。将与已知聚酮化合物合酶具有高度序列同源性和/或与soraphen酮合酶结构域强杂交的亚克隆用于基因破坏实验。
实施例5制备纤维堆囊菌菌株So ce90的链霉素抗性自发突变体取0.1ml纤维堆囊菌菌株So ce90在液体培养基G52-H(0.2％酵母提取物，0.2％脱脂大豆粉，0.8％土豆淀粉，0.2％葡萄糖，0.1％MgSO4·7H2O，0.1％ CaCl2·2H2O，0.008％ Fe-EDTA，用KOH调到pH7.4)中培养3天的培养物，铺在添加100μg/ml链霉素的SolE培养基琼脂平板上。平板于30℃培养2星期。生长在这种培养基上的菌落是链霉素抗性的突变体，将其在含链霉素的相同琼脂培养基上划线并再一次培养以纯化。选择这些链霉素抗性突变体中的一个，并命名为BCE28/2。
实施例6纤维堆囊菌BCE28/2中的基因破坏(使用亚克隆的BamHI片段)分离如上所述由五个选择的Bac克隆产生的亚克隆的BamH I插入片段，并连接到质粒pCIB132(见美国专利号5,716,849)的单一BamHI位点。将携带插入片段的pCIB132衍生物转化含辅助质粒pUZ8的大肠杆菌ED8767(Hedges和Matthew，质粒(Plasmid)2269-278(1979))。使用转化体作为接合实验中的供体，而纤维堆囊菌BCE28/2作为受体。为了接合，将5-10×109个在液体培养基G51b(G51b相当于G51t，其中用蛋白胨替代胰蛋白胨)中于30℃培养的纤维堆囊菌BCE28/2稳定期早期培养物(达到大约5×108细胞/ml)，以1∶1的细胞比率，与含pCIB132衍生物(携带亚克隆的BamH I片段)和辅助质粒pUZ8的大肠杆菌ED8767的指数晚期培养物(在LB液体培养基中)混合。然后将混合的细胞以4000rpm离心10分钟，并重悬于0.5ml G51b培养基中。然后将此细胞悬浮液滴一滴在含50mg/l卡那霉素的SolE琼脂平板的中央铺板。于30℃培养24小时后收获细胞，并重悬于0.8mlG51b培养基，并将0.1-0.3ml此悬浮液在含腐草霉素(30mg/l)、链霉素(300mg/l)、和卡那霉素(50mg/l)的选择性SolE固体培养基上铺板。使用链霉素进行供体大肠杆菌菌株的负选择。于30℃培养8-12天后，用塑料环分离生长在这种选择培养基上的菌落，并在相同琼脂培养基上划线和培养以进行第二轮选择和纯化。于30℃培养7天后生长在此选择琼脂培养基上的菌落衍生的培养物，是通过携带亚克隆BamH I片段的pCIB132衍生物的接合转移获得了腐草霉素抗性的纤维堆囊菌BCE28/2的转接合体。
通过Southern杂交检验证实pCIB132衍生的质粒通过同源重组整合到了纤维堆囊菌BCE28/2的染色体中。为了这个实验，应用Pospiech和Neumann，Trends Genet.11217(1995)描述的方法，每种转移BamH I片段的转接合体取5-10个分离完整DNA(于培养基G52-H中生长了3天的10ml培养物)。为了Southern杂交转膜，将如上所述分离的DNA用限制酶Bgl II、Cla I、或Not I切割，并使用相应的BamHI插入片段或pCIB132作为32P标记的探针。
实施例7分析整合的BamH I片段对纤维堆囊菌在基因破坏后对epothilone生产的影响用无菌塑料环将生长在第二轮选择的选择性SolE平板表面上大约1cm2的转接合细胞(见实施例6)转移到10ml G52-H培养基中(装在50ml Erlenmeyer烧瓶中)。于30℃和180rpm培养3天后，将培养物转移到50ml G52-H培养基中(装在200ml Erlenmeyer烧瓶中)。于30℃和180rpm培养4-5天后，将10ml此培养物转移到50ml 23B3培养基(0.2％葡萄糖，2％土豆淀粉，1.6％脱脂大豆粉，0.0008％Fe-EDTA钠盐，0.5％ HEPES(4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-乙烷磺酸)，2％vol/vol聚苯乙烯树脂XAD16(Rohm和Haas)，用NaOH调pH到7.8)中(装在200ml Erlenmeyer烧瓶中)。
培养物于30℃和180rpm培养7天后，进行产生的epothilone的定量实验。将全部培养液通过150μm尼龙滤膜抽滤过滤。然后将留在滤膜上的树脂重悬于10ml异丙醇，并通过将悬浮液180rpm振摇1小时进行抽提。从此悬浮液中取出1ml，并在Eppendorff微量离心机中以12,000rpm离心。通过HPLC和用UV_DAD检测仪(用Waters-Symetry C18层析柱进行HPLC并用0.02％磷酸60％-0％和乙腈40％-100％的梯度)于250nm检测的方法测定其中的epothilone A和B的量。
以上述方法测试含有从pEPO15亚克隆的三种不同的BamH I整合片段的转接合体，即含有质粒pEPO15-21的BamH I片段的转接合体、含有质粒pEPO15-4-5的BamH I片段的转接合体、和含有质粒pEPO15-4-1的BamH I片段的转接合体。HPLC分析揭示所有转接合体不再产生epothilone A和B。相反的，在整合有pEPO20、pEPO30、pEPO31、pEPO33的BamH I片段的转接合体和亲本菌株BCE28/2中检测到epothilone A和B浓度为2-4mg/l。
实施例8测定克隆的片段的核苷酸序列并构建毗连序列群A.质粒pEPO15-21的BamH I插入片段从大肠杆菌DH10B[pEPO15-21]菌株中分离质粒DNA，并测定插入pEPO15-21的2.3kb BamH I片段的核苷酸序列。自动DNA测序是在双链DNA模板上通过双脱氧核苷酸链终止方法进行的，使用应用Applied Biosystems 377型测序仪。使用的引物是通用反向引物(5’GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3’(SEQ ID NO24))和通用正向引物(5’GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’(SEQ ID NO25))。在随后几轮测序反应中，使用为先前测定的序列的3’末端设计而定制合成的寡核苷酸来延伸并连接毗连序列群。两条链都完全测序，而且每个核苷酸至少测序两次。使用3.0版Sequencher程序(Gene Codes Corporation)编辑核苷酸序列，并使用威斯康星遗传学计算机组程序(WisconsinGenetics Computer Group programs)分析。2213-bp插入片段的核苷酸序列相应于SEQ ID NO1的核苷酸20779-22991。
B.质粒pEPO15-4-1的BamH I插入片段从大肠杆菌DH10B[pEPO15-4-1]菌株中分离质粒DNA，并如上(A)所述测定插入pEPO15-4-1的3.9kb BamH I片段的核苷酸序列。3909-bp插入片段的核苷酸序列相应于SEQ ID NO1的核苷酸16876-20784。
C.质粒pEPO15-4-5的BamH I插入片段从大肠杆菌DH10B[pEPO15-4-5]菌株中分离质粒DNA，并如上(A)所述测定插入pEPO15-4-5的2.3kb BamH I片段的核苷酸序列。
2233-bp插入片段的核苷酸序列相应于SEQ ID NO1的核苷酸42528-44760。
实施例9含有epothilone生物合成基因的pEPO15中的DNA片段的亚克隆和排序将pEPO15用限制酶HindIII完全消化，并将产生的片段亚克隆到已经用HindIII切割且用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化的pBluescript IISK-或pNEB193(New England Biolabs)中。产生了六个不同的克隆，并命名为pEPO15-NH1、pEPO15-NH2、pEPO15-NH6、pEPO15-NH24(都由pNEB193衍生)、和pEPO15-H2.7和pEPO15-H3.0(都由pBluescriptII SK-衍生)。
分离并DIG标记(非放射性DNA标记和检测系统，BoehringerMannheim)pEPO15-21的BamH I插入片段，并在DNA杂交实验中在高度严谨条件下作为针对pEPO15-NH1、pEPO15-NH2、pEPO15-NH6、pEPO15-NH24、pEPO15-H2.7和pEPO15-H3.0的探针使用。对pEPO15-NH24检测到强杂交信号，说明pEPO15-NH24包含pEPO15-21。
如上所述分离并DIG标记pEPO15-4-1的BamH I插入片段，并在DNA杂交实验中在高度严谨条件下作为针对pEPO15-NH1、pEPO15-NH2、pEPO15-NH6、pEPO15-NH24、pEPO15-H2.7和pEPO15-H3.0的探针使用。对pEPO15-NH24和pEPO15-H2.7检测到强杂交信号。由pEPO15-NH24和pEPO15-H2.7的一个末端得到的核苷酸序列信息还与先前测定的pEPO15-4-1的BamH I插入片段的序列完全一致。这些实验证明pEPO15-4-1(含有一个内部的Hind III位点)与pEPO15-H2.7和pEPO15-NH24重叠，而且pEPO15-H2.7和pEPO15-NH24是以这个顺序相邻的。
如上所述分离并DIG标记pEPO15-4-5的BamH I插入片段，并在DNA杂交实验中在高度严谨条件下作为针对pEPO15-NH1、pEPO15-NH2、pEPO15-NH6、pEPO15-NH24、pEPO15-H2.7和pEPO15-H3.0的探针使用。对pEPO15-NH2检测到强杂交信号，说明pEPO15-NH2包含pEPO15-4-5。
由pEPO15-NH2的两个末端和pEPO15-H24不与pEPO15-4-1重叠的那个末端得到核苷酸序列信息。朝向HindIII位点的PCR引物NH24末端“B”GTGACTGGCGCCTGGAATCTGCATGAGC(SEQ ID NO26)、NH2末端“A”AGCGGGAGCTTGCTAGACATTCTGTTTC(SEQ ID NO27)、和NH2末端“B”GACGCGCCTCGGGCAGCGCCCCAA(SEQ ID NO28)是根据这些序列设计的，并用于以pEPO15和在个别实验中以纤维堆囊菌So ce90基因组DNA作为模板的扩增反应。以NH24末端“B”和NH2末端“A”作为引物对，在两种模板中都发现特异扩增。将扩增物克隆到pBluescript II SK-中并完全测序。扩增物的序列相同，而且还与pEPO15-NH24和pEPO15-NH2的末端序列完全一致，并在HindIII位点融合，确定了pEPO15-NH2和pEPO15-NH24的HindIII片段是以此顺序相邻的。
如上所述分离并DIG标记pEPO2.7的HindIII插入片段，并在DNA杂交实验中在高度严谨条件下作为针对经Not I消化的pEPO15的探针使用。大小大约为9kb的一个Not I片段显示强杂交信号，将其进一步亚克隆到已经用Not I消化且用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化的pBluescript II SK-中，从而产生pEPO15-N9-16。如上所述分离并DIG标记pEPO15-N9-16的Not I插入片段，并在DNA杂交实验中在高度严谨条件下作为针对pEPO15-NH1、pEPO15-NH2、pEPO15-NH6、pEPO15-NH24、pEPO15-H2.7和pEPO15-H3.0的探针使用。对pEPO15-NH6、以及预期的克隆pEPO15-H2.7和pEPO15-NH24检测到强杂交信号。由pEPO15-NH6的两个末端和pEPO15-H2.7不与pEPO15-4-1重叠的那个末端得到核苷酸序列信息。设计朝向HindIII位点的PCR引物并用于以pEPO15和在个别实验中以纤维堆囊菌So ce90基因组DNA作为模板的扩增反应。以pEPO15-NH6末端“B”CACCGAAGCGTCGATCTGGTCCATC(SEQ ID NO29)和pEPO15-H2.7末端“A”CGGTCAGATCGACGACGGGCTTTCC(SEQ ID NO30)作为引物对，在两种模板中都发现特异扩增。将扩增物克隆到pBluescript II SK-中并完全测序。扩增物的序列是相同的，而且还与pEPO15-NH6和pEPO15-NH2.7的末端序列完全一致，在HindIII位点融合，确定了pEPO15-NH6和pEPO15-NH2.7的HindIII片段是以此顺序相邻的。
所有这些实验，综合起来，确定了覆盖大约55kb区域并由pEPO15-NH6、pEPO15-H2.7、pEPO15-NH24、和pEPO15-NH2的HindIII插入片段以此顺序组成的HindIII片段毗连序列群。剩余的两个HindIII亚克隆的插入片段(命名为pEPO15-NH1和pEPO15-H3.0)未发现是这个毗连序列群的部分。
实施例10覆盖epothilone生物合成基因的亚克隆毗连序列群的进一步延伸将pEPO15-NH2插入片段下游末端产生、并因此代表实施例9中描述的亚克隆毗连序列群的下游末端的大约2.2kb BamH I-HindIII片段分离出来、DIG标记、并用于针对经多种酶消化的pEPO15和pEPO15-NH2DNA的Southern杂交实验。总是发现在两种目的DNA之间强杂交条带大小相同，说明克隆到pEPO15中的纤维堆囊菌So ce90基因组DNA片段结束于位于pEPO15-NH2下游末端的HindIII位点。
使用已确定的步骤，在pScosTriplex-II(Ji等人，基因组学(Genomics)31185-192(1996))中构建纤维堆囊菌So ce90的粘粒DNA文库。简单的说，将纤维堆囊菌So ce90的高分子量基因组DNA用限制酶Sau3A I部分消化以提供平均大小为大约40kb的片段，并连接到经BamH I和Xba I消化的pScosTriplex-II中。连接混合物用Gigapack III XL(Stratagene)包装，并用于转染大肠杆菌XL1 BlueMR细胞。
用所述大约2.2kb的BamH I-HindIII片段(pEPO15-NH2插入片段的下游末端产生、作为菌落杂交中的探针使用)筛选粘粒文库，选择到一个强杂交克隆，命名为pEPO4E7。
将pEPO4E7DNA分离、用多种限制性内切酶消化、并用2.2kb BamHI-HindIII片段在Southern杂交中探测。选择到一个大小大约为9kb的强杂交的Not I片段，并亚克隆到pBluescript II SK-以产生pEPO4E7-N9-8。进一步的Southern杂交实验揭示了pEPO4E7-N9-8大约9kb的Not I插入片段与pEPO15-NH2的Not I-HindIII片段超过6kb重叠，而剩余的大约3kb HindIII-Not I将延伸实施例9中描述的亚克隆毗连序列群。然而，末端测序揭示pEPO4E7-N9-8插入片段的下游末端包含pScosTriplex-II的BamH I-Not I多克隆位点，由此说明pEPO4E7的基因组DNA插入片段终止于HindIII-Not I延伸片段中的Sau3A I位点，而Not I位点来自pScosTriplex-II。
将pEPO4E7-N9-8的大约3kb HindIII-Not I延伸亚片段衍生的大约1.6kb Pst I-Sal I片段(不含载体，只包含纤维堆囊菌So ce90衍生的序列)，作为针对实施例2中描述的细菌人工染色体文库的探针使用。除了先前分离的EPO15，还发现命名为EPO32的Bac克隆与该探针强杂交。将pEPO32分离、用多种限制性内切酶消化、并与大约1.6kb的Pst I-Sal I探针杂交。发现大小大约为13kb的HindIII-EcoRV片段与该探针强杂交，将其亚克隆到经HindIII和HincII消化的pBluescript II SK-中以产生pEPO32-HEV15。
根据pEPO15-NH2的下游末端序列和pEPO32-HEV15的上游(HindIII)末端序列设计寡核苷酸引物，并用于以pEPO4E7-N9-8为模板的测序反应。序列揭示了在常规限制性分析中检测不到的一个24bp小HindIII片段(EPO4E7-H0.02)的存在，分隔pEPO15-NH2下游末端的HindIII位点和pEPO32-HEV15上游末端的HindIII位点。
由此，描述于实施例9中的亚克隆毗连序列群延伸到了包括EPO4E7-H0.02的HindIII片段和pEPO32-HEV15的插入片段，而且由pEPO15-NH6、pEPO15-H2.7、pEPO15-NH24、pEPO15-NH2、EPO4E7-H0.02和pEPO32-HEV15的插入片段以此顺序组成。
实施例11测定覆盖epothilone生物合成基因的亚克隆毗连序列群的核苷酸序列如下测定实施例10中描述的亚克隆毗连序列群的核苷酸序列。
pEPO15-H2.7。从大肠杆菌DH10B[pEPO15-H2.7]菌株中分离质粒DNA，并测定pEPO15-H2.7的2.7kb BamH I插入片段的核苷酸序列。自动DNA测序在双链DNA模板上通过双脱氧核苷酸链终止方法进行，使用Applied Biosystems 377型测序仪。使用的引物是通用反向引物(5’GGA AAC AGC TAT GAC CAT G 3’(SEQ ID NO24))和通用正向引物(5’GTA AAA CGA CGG CCA GT 3’(SEQ ID NO25))。在随后几轮测序反应中，使用为先前测定的序列的3’末端设计而定制合成的寡核苷酸来延伸并连接毗连序列群。
pEPO15-NH6、pEPO15-NH24和pEPO15-NH2。分离这些质粒的HindIII插入片段并用于随机片段化，使用Hydroshear apparatus(GenomicInstrumentation Services，Inc.)以产生平均大小为1-2kb的片段。使用T4DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶在三磷酸脱氧核苷酸存在时对片段进行末端修复，并用T4DNA激酶在ribo-ATP存在时磷酸化。从琼脂糖凝胶中分离在1.5-2.2kb大小范围内的片段，并连接到经EcoRV切割和去磷酸化的pBluescript II SK-中。使用通用反向引物和通用正向引物对随机亚克隆测序。
pEPO32-HEV15。将pEPO32-HEV15用HindIII和Ssp I消化，分离得到包含纤维堆囊菌So ce90的大约13kb HindIII-EcoRV插入片段和pBluescript II SK-的0.3kb Hinc II-Ssp I片段的大约13.3kb片段，并用HaeIII部分消化以产生平均大小为1-2kb的片段。从琼脂糖凝胶中分离在1.5-2.2kb大小范围内的片段，并连接到经EcoRV切割和去磷酸化的pBluescriptII SK-中。使用通用反向引物和通用正向引物对随机亚克隆测序。
分析了色谱图并用Phred、Phrap和Consed程序(Ewing等人，基因组研究(Genome Res.)8(3)175-185(1998)；Ewing等人，基因组研究8(3)186-194(1998)；Gordon等人，基因组研究8(3)195-202(1998))装配成毗连序列群。填充毗连序列群缺口，分析序列差异，并对低准确度区域使用定制设计的用于原始亚克隆或从随机亚克隆文库中选定克隆测序的寡核苷酸引物重新测序。两条链都完全测序，而且每个碱基对的累计Phred得分至少40(置信度99.99％)。
该68750bp毗连序列群的核苷酸序列显示如SEQ ID NO1。
实施例12分析epothilone生物合成基因的核苷酸序列发现SEQ ID NO1包含22个ORF，详见下表1表1
*在反向互补链上。编号根据SEQ ID NO1。
epoA(SEQ ID NO1的核苷酸7610-11875)编码EPOS A(SEQ IDNO2)，一种第一类聚酮化合物合酶，由单个模块组成，并包含下列结构域β-酮脂酰合酶(KS)(SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQID NO2的氨基酸11-437)、酰基转移酶(acyltransferase，AT)(SEQID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO2的氨基酸543-864)、烯酰基还原酶(enoyl reductase，ER)(SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO2的氨基酸974-1273)、和酰基载体蛋白同源结构域(ACP)(SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385)。序列比较和基元分析(Haydock等人，FEBS通讯(FEBS Lett.)374246-248(1995)；Tang等人，基因216255-265(1998))揭示了EPOS A编码的AT对丙二酸单酰CoA是特异的。EPOS A应当是通过将乙酸根单元上载到多酶复合物上最终形成2-甲基噻唑环的部分(C26和C20)，而涉及epothilone生物合成的起始。
epoP(SEQ ID NO1的核苷酸11872-16104)编码EPOS P(SEQ IDNO3)，一种非核糖体肽合成酶，含有单个模块。EPOS P包含下列结构域●肽键形成结构域，由基元K(SEQ ID NO3的氨基酸72-81[FPLTDIQESY]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置12085-12114)、基元L(SEQ ID NO3的氨基酸118-125[VVARHDML]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置12223-12246)、基元M(SEQ ID NO3的氨基酸199-212[SIDLINVDLGSLSI]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置12466-12507)、和基元O(SEQ ID NO3的氨基酸353-363[GDFTSMVLLDI]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置12928-12960)描绘；●氨酰基腺苷酸形成结构域，由基元A(SEQ ID NO3的氨基酸549-565[LTYEELSRRSRRLGARL]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置13516-13566)、基元B(SEQ ID NO3的氨基酸588-603[VAVLAVLESGAAYVPI]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置13633-13680)、基元C(SEQ ID NO3的氨基酸669-684[AYVIYTSGSTGLPKGV]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置13876-13923)、基元D(SEQ ID NO3的氨基酸815-821[SLGGATE]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置14313-14334)、基元E(SEQ ID NO3的氨基酸868-892[GQLYIGGVGLALGYWRDEEKTRKSF]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置14473-14547)、基元F(SEQ ID NO3的氨基酸903-912[YKTGDLGRYL]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置14578-14607)、基元G(SEQ ID NO3的氨基酸918-940[EFMGREDNQIKLRGYRVELGEIE]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置14623-14692)、基元H(SEQ ID NO3的氨基酸1268-1274[LPEYMVP]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置15673-15693)、和基元I(SEQ ID NO3的氨基酸1285-1297[LTSNGKVDRKALR]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置15724-15762)描绘；●一个未知结构域，插入在氨酰基腺苷酸形成结构域的基元G和H之间(SEQ ID NO3的氨基酸973-1256，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置14788-15639)；和●肽基载体蛋白同源结构域(PCP)，由基元J(SEQ ID NO3的氨基酸1344-1351[GATSIHIV]，相应于SEQ ID NO1的核苷酸位置15901-15924)描绘。
有人提出EPOS P涉及半胱氨酸的腺苷酸化活化(结合经活化的半胱氨酸成为氨酰基-S-PCP，在酶结合的半胱氨酸和EPOS A提供的乙酰基-S-ACP之间形成肽键)和通过分子内杂环化形成最初的噻唑啉环。EPOS P的未知结构域显示与来自芽孢杆菌物种的NAD(P)H氧化酶和还原酶有非常弱的同源性。由此，这个未知结构域和/或EPOS A的ER结构域可能涉及最初的2-甲基噻唑啉环氧化成2-甲基噻唑。
epoB(SEQ ID NO1的核苷酸16251-21749)编码EPOS B(SEQ IDNO4)，一种第一类聚酮化合物合酶，由单个模块组成，并包含下列结构域KS(SEQ ID NO1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO4的氨基酸7-432)、AT(SEQ ID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO4的氨基酸539-859)、脱水酶(DH)(SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO4的氨基酸869-1037)、β-酮还原酶(KR)(SEQ IDNO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684)和ACP(SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792)。序列比较和基元分析揭示了EPOS B编码的AT对甲基丙二酸单酰CoA是特异的。EPOS A可能通过催化2-甲基-4-噻唑羧基-S-PCP起始基团与甲基丙二酸单酰-S-ACP的Claisen样缩合和伴随的C17的β-酮基还原成烯酰基，而参与第一种聚酮化合物链的延伸。
epoC(SEQ ID NO1的核苷酸21746-43519)编码EPOS C(SEQ IDNO5)，一种第一类聚酮化合物合酶，由4个模块组成。第一个模块包含KS结构域(SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO5的氨基酸39-457)、丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO5的氨基酸563-884)、KR(SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399)、和ACP(SEQ ID NO1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506)。这个模块引入乙酸基延伸单元(C14-C13)，并将位于C15的β-酮基还原成参与epothi lone大内酯环最终内酯化的羟基基团。EPOS C的第二个模块包含KS(SEQ ID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950)、丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377)、KR(SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895)、和ACP(SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO5的氨基酸2932-3005)。这个模块引入乙酸基延伸单元(C12-C11)，并将位于C13的β-酮基还原成羟基基团。由此，epothilone的初生聚酮化合物链相当于epothilone A，而在epothilone B中的C12引入甲基侧链将需要PKS后续C-甲基转移酶活性。位于C13-C12的环氧环的形成也将需要PKS后续氧化步骤。EPOS C的第三个模块包含KS(SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449)、丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876)、DH(SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048)、ER(SEQ IDNO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719)、KR(SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO5的氨基酸4729-4974)、和ACP(SEQ ID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082)。这个模块引入乙酸基延伸单元(C10-C9)，并完全还原位于C11的β-酮基。EPOS C的第四个模块包含KS(SEQ IDNO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525)；甲基丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO5的氨基酸5631-5951)、DH(SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132)、ER(SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837)、KR(SEQID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101)、和ACP(SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO5的氨基酸7140-7211)。这个模块引入丙酸基延伸单元(C24和C8-C7)，并完全还原位于C9的β-酮基。
epoD(SEQ ID NO1的核苷酸43524-54920)编码EPOS D(SEQ IDNO6)，一种第一类聚酮化合物合酶，由2个模块组成。第一个模块包含KS结构域(SEQ ID NO1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO6的氨基酸35-454)、甲基丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO6的氨基酸561-881)、KR(SEQ ID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO6的氨基酸1143-1393)、和ACP(SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503)。这个模块引入丙酸基延伸单元(C23和C6-C5)，并将位于C7的β-酮基还原成羟基基团。第二个模块包含KS(SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946)、甲基丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，SEQ IDNO6的氨基酸2053-2373)、DH(SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551)、甲基转移酶(MT，SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045)、KR(SEQID NO1的核苷酸53697-54431，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636)、和ACP(SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745)。这个模块引入丙酸基延伸单元(C21或C22和C4-C3)，并将位于C5的β-酮基还原成羟基基团。这个还原有些出乎意料，因为epothilone在C5含有酮基。然而，PKS模块推断的还原活性和最终聚酮化合物产物相应位置的氧化还原状态之间的这种不一致，已经在文献(见，例如，Schweche等人，美国国家科学院进展927839-7843(1995)和Schupp等人，FEMS微生物学通讯159201-207(1998))中有报导。epothilone的一个重要特征是位于C4的偕甲基侧链基团(C21和C22)的存在。预测EPOS D的第二个模块将丙酸基单元引入到增长的聚酮化合物链，在C4提供一个甲基侧链。这个模块还包含整合到PKS中DH和KR结构域之间的甲基转移酶结构域，与在HMWP1耶尔森菌素合酶(A.M.Gehring，E.DeMoll，J.D.Fetherston，I.Mori，G.F.Mayhew，F.R.Blattner，C.T.Walsh，和R.D.Perry，鼠疫中的铁获取鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)产生的耶尔森菌素的酶生源论中的模块原理(Iron acquisition in plaguemodularlogic in enzymatic biogenesis of yersiniabactin by Yersiniapestis)化学生物学(Chem.Biol.)5，573-586，1998)中看到的排列相似。有人提出EPOS D中的这个MT结构域负责在C4引入该第二个甲基侧链基团(C21或C22)。
epoE(SEQ ID NO1的核苷酸54935-62254)编码EPOS E(SEQ IDNO7)，一种第一类聚酮化合物合酶，由一个模块组成，包含KS(SEQID NO1的核苷酸55028-56284，SEQ ID NO7的氨基酸32-450)、丙二酸单酰CoA特异的AT(SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565，SEQ IDNO7的氨基酸556-877)、DH(SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO7的氨基酸887-1051)、很可能无功能的ER(SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO7的氨基酸1478-1790)、KR(SEQID NO1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055)、ACP(SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164)、和硫酯酶(TE)(SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254，SEQID NO7的氨基酸2165-2439)。这个模块中的ER结构域包含活性位点基元，其中具有一些高度不平常的氨基酸取代，可能使得这个结构域无活性。该模块引入乙酸基延伸单元(C2-C1)，并将位于C3的β-酮基还原成烯酰基基团。epothilone在C3含有羟基基团，所以这个还原也显得多余，如在EPOS D的第二个模块中讨论的。EPOS E的TE结构域参与已增长的聚酮化合物链经由C1羧基基团和C15羟基基团之间的内酯化的释放和环化。
在被测序区域中，epoA上游检测到五个ORF。部分测序的orf1在序列数据库中没有同源序列。orf2(SEQ ID NO1反向互补链上的核苷酸3171-1900)推导的蛋白质产物(Orf2，SEQ ID NO10)显示与分枝杆菌(Mycobacterium)和天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)的假设ORF有强相似性，以及与不同细菌的羧肽酶和DD-肽酶有更远的相似性。orf3(SEQ ID NO1的核苷酸3415-5556)推导出来的蛋白质产物，Orf3(SEQ ID NO11)显示与不同细菌的Na/H反向转运蛋白有同源性。Orf3可能参与从生产菌株中运出epothilone。orf4和orf5在序列数据库中没有同源序列。
在被测序区域中，epoE下游检测到十一个ORF。epoF(SEQ ID NO1的核苷酸62369-63628)编码EPOS F(SEQ ID NO8)，一种推导出来的与细胞色素P450加氧酶有强序列相似性的蛋白质。EPOS F可能参与调整碳C12、C5、和/或C3的氧化还原状态。orf14(SEQ ID NO1的核苷酸67334-68251)推导出来的蛋白质，Orf14(SEQ ID NO22)显示与GI3293544(没有推测出功能的来自天蓝色链霉菌的假设蛋白质)及GI2654559(人胚肺蛋白质)有强相似性。它还更远的与来自热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)阳离子流出系统蛋白质类GI2623026相关，所以它可能还参与从生产细胞中运出epothilone。剩余的ORF(orf6-orf13和orf15)与序列数据库中的条目不显示同源性。
实施例13epothilone生物合成基因的重组表达为了达到比纤维堆囊菌发酵更高的产量，在异源有机体中表达本发明的epothilone合酶基因。用于异源表达的一种优选的宿主是链霉菌，例如天然产生聚酮化合物放线菌紫素的天蓝色链霉菌。用于在此宿主中表达重组PKS基因的技术描述于McDaniel等人，科学2621546-1550(1993)和Kao等人，科学265509-512(1994)。还可见，Holmes等人，欧洲分子生物学杂志12(8)3183-3191(1993)和Bibb等人，基因38215-226(1985)，以及美国专利号5,521,077，5,672,491，和5,712,146，此处引用作为参考。
根据某种方法，处理异源宿主菌株以包含放线菌紫素(act)基因簇的染色体删除。通过将DNA从温度敏感的供体质粒转移到大肠杆菌中的受体穿梭载体(McDaniel等人(1993)和Kao等人(1994))，以至于合酶基因通过载体中的同源重组实现转移，由此构建了含有本发明的epothilone合酶基因的表达质粒。或者，将epothilone合酶基因簇通过限制性片段连接导入载体。按照例如Kao等人(1994)描述的选择后，根据Hopwood等人，链霉菌的基因操作实验室手册(Genetic Manipulation of StreptomycesA Laboratory Manual)(John Innes Foundation，Norwich，United Kingdom，1985)提出的方案，将来自载体的DNA导入act-的天蓝色链霉菌菌株(此处引用作为参考)。在R2YE培养基(Hopwood等人(1985))上培养重组链霉菌菌株并生产epothilone。或者，在其它宿主有机体诸如假单胞菌、芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞和/或大肠杆菌中表达本发明的epothilone合酶基因。PKS和NRPS基因优选在大肠杆菌中使用pT7-7载体(使用T7启动子)表达。见Tabor等人，美国国家科学院进展821074-1078(1985)。在另一个实施方案中，使用表达载体pKK223-3和pKK223-2在大肠杆菌中，以转录或翻译融合形式在tac或trc启动子后表达PKS和NRPS基因。在天然不含有PKS酶翻译后修饰需要的磷酸泛酰巯基乙胺基(phosphopantetheinyl，P-pant)转移酶的异源宿主中表达PKS和NRPS基因，需要在宿主中共表达P-pant转移酶，如Keal ey等人，美国国家科学院进展95505-509(1998)描述的。
实施例14从生产菌株中分离epothiloneWO 93/10121(此处引用作为参考)，在美国专利号5,639,949的实施例57中，在Gerth等人，抗生素杂志49560-563(1996)，和在瑞士专利申请号396/98(申请日期1998年2月19日)，和美国专利申请号09/248,910(还公开了优选的纤维堆囊菌突变菌株)中(此处引用作为参考)给出了培养、发酵、和用来分离聚酮化合物的提取步骤的实施例，对从天然和本发明的重组宿主中提取epothilone有用。下列步骤可以用来从人工培养的纤维堆囊菌菌株诸如So ce90中分离epothilone，而且还可以用来从重组宿主中分离epothilone。
Aepothilone生产菌株的培养菌株纤维堆囊菌Soce-90或本发明的重组宿主菌株菌株保存液氮培养基预培养和中间培养G52主要培养1B12G52培养基酵母提取物，低盐(BioSpringer，Maison Alfort，法国) 2g/lMgSO4(7H2O) 1g/lCaCl2(2H2O) 1g/l脱脂大豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，汉堡，德国)2g/l土豆淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，瑞士) 8g/l葡萄糖，无水 2g/lEDTA-Fe(III)-Na盐(8g/l) 1ml/l用KOH调到pH 7.4灭菌20mins，120℃
1B12培养基土豆淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，瑞士) 20g/l脱脂大豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，汉堡，德国)11g/lEDTA-Fe(III)-Na盐 8mg/l用KOH调到pH 7.8灭菌20mins，120℃添加环糊精和环糊精衍生物不同浓度的环糊精(Fluka，Buchs，瑞士，或Wacker Chemie，Munich，德国)单独灭菌并在接种前加到1B12培养基中。
培养从液氮安瓿瓶中取1ml纤维堆囊菌Soce-90悬浮液，转移到10ml G52培养基中(装在50mlErlenmeyer烧瓶中)并在摇床中于180rpm和30℃，25mm振幅培养3天。取5ml此培养物，加到45ml G52培养基中(装在200mlErlenmeyer烧瓶中)并在摇床中于180rpm和30℃，25mm振幅培养3天。然后取50ml此培养物，加到450ml G52培养基中(装在2升的Erlenmeyer烧瓶中)并在摇床中于180rpm和30℃，50mm振幅培养3天。
维持培养每3-4天通过将50ml培养物加入到450ml G52培养基中(装在2升的Erlenmeyer烧瓶中)将培养物过量接种。所有实验和发酵都是用这种维持培养物开始进行的。
烧瓶中的测试(i)在摇瓶中的预培养由500ml维持培养物开始，用50ml维持培养物接种1×450ml G52培养基并在摇床中以180rpm和30℃，50mm振幅培养4天。
(ii)在摇瓶中的主要培养将添加了5g/l 4-吗啉代-丙烷磺酸(＝MOPS)粉的40ml 1B12培养基(装在200ml Erlenmeyer烧瓶中)与5ml 10×浓缩环糊精溶液混和，接种10ml预培养物并在摇床中180rpm和30℃，50mm振幅培养5天。
发酵以10升、100升和500升的量进行发酵。20升和100升发酵作为中间培养步骤。预培养和中间培养接种10％(v/v)维持培养物，而主要培养接种20％(v/v)中间培养物。重要与振摇培养相反，发酵培养基的成分是根据最终培养液体积(包括接种液)计算的。如果，例如，18升培养基+2升接种液混和，那么称量用于20升的物质但是只配制成18升。
摇瓶中的预培养物由500ml维持培养物开始，4×450ml G52培养基(装在2升Erlenmeyer烧瓶中)每个用50ml维持培养物接种并在摇床中180rpm和30℃，50mm振幅培养4天。
中间培养物，20升或100升20升装在总容量30升的发酵罐中的18升G52培养基接种2升预培养物。培养持续3-4天，条件是30℃，250rpm，0.5升空气每升液体每分钟，0.5巴超压，无pH控制。
100升装在总容量150升的发酵罐中的90升G52培养基接种20升中间培养物中的10升。培养持续3-4天，条件是30℃，150rpm，0.5升空气每升液体每分钟，0.5巴超压，无pH控制。
主要培养物，10升、100升或500升10升用于10升1B12的培养基物质在7升水中灭菌，然后加入1升无菌的10％ 2-(羟丙基)-β-环糊精溶液，并接种2升的20升中间培养物。主要培养的持续时间是6-7天，条件是30℃，250rpm，0.5升空气每升液体每分钟，0.5巴超压，pH用H2SO4/KOH控制到pH7.6+/-0.5(即pH7.1和8.1之间不用控制)。
100升用于100升1B12的培养基物质在70升水中灭菌，然后加入10升无菌的10％ 2-(羟丙基)-β-环糊精溶液，并接种20升的20升中间培养物。主要培养的持续时间是6-7天，条件是30℃，200rpm，0.5升空气每升液体每分钟，0.5巴超压，pH用H2SO4/KOH控制到pH7.6+/-0.5。100升发酵的接种链示意图见图1。
500升用于500升1B12的培养基物质在350升水中灭菌，然后加入50升无菌的10％ 2-(羟丙基)-β-环糊精溶液，并接种100升的100升中间培养物。主要培养的持续时间是6-7天，条件是30℃，120rpm，0.5升空气每升液体每分钟，0.5超压，pH用H2SO4/KOH控制到pH7.6+/-0.5。
产物分析样品的制备将50ml样品与2ml聚苯乙烯树脂Amberlite XAD16(Rohm+Haas，Frankfurt，德国)混和，并于30℃以180rpm振摇一小时。然后使用150μm尼龙筛过滤树脂，用少量水清洗然后与滤器一起加到15ml Nunc试管中。
将产物从树脂上洗脱向盛有滤器和树脂的试管中加入10ml异丙醇(＞99％)。然后，将密封的试管于室温在Rota-Mixer(Labinco BV，荷兰)上振摇30分钟。然后，离心出2ml液体，并使用移液器将上清液加到HPLC管中。
HPLC分析层析柱Waters-Symetry C18，100×4mm，3.5μmWATO66220+预备柱3.9×20mmWATO54225溶剂 A0.02％磷酸B乙腈(HPLC级)梯度 41％ B0-7min100％ B 7.2-7.8min41％ B8-12min烤箱温度30℃检测250nm，UV-DAD检测加样体积10μl保持时间EpoA4.30min EpoB5.38minB加入环糊精和环糊精衍生物对得到的epothilone浓度的影响环糊精是环形(α-1，4)连接的α-D-吡喃型葡萄糖的寡糖，具有相对疏水的中央腔和亲水的外部表面区域。
具体区分下述物质(括号中的数字给出了每个分子的葡萄糖单元的数目)α-环糊精(6)、β-环糊精(7)、γ-环糊精(8)、δ-环糊精(9)、ε-环糊精(10)、ζ-环糊精(11)、η-环糊精(12)、和θ-环糊精(13)。尤其优选δ-环糊精，特别是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精，或者它们的混合物。
环糊精衍生物主要是上述环糊精的衍生物，尤其是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精的衍生物，主要是那些有一个或几个甚至多达所有羟基(每个葡萄糖自由基有3个)被醚化或酯化的衍生物。醚主要是烷基醚，尤其是低级烷基，诸如甲基或乙基醚，还有丙基或丁基醚；芳香基羟烷基醚，诸如苯基羟基低级烷基醚，尤其苯基羟乙基醚；羟烷基醚，特别是羟基低级烷基醚，尤其是2-羟乙基醚，羟丙基醚诸如2-羟丙基醚或羟丁基醚诸如2-羟丁基醚；羧基烷基醚，特别是羧基低级烷基醚，尤其是羧甲基或羧乙基醚；衍生化羧基烷基醚，特别是衍生化羧基低级烷基醚，其中衍生化羧基是醚化或酰胺化的羧基(主要是氨基羰基、单-或二-低级烷基氨基羰基、吗啉代-、哌啶子基-、吡咯烷子基(pyrrolidino)-或哌嗪子基(piperazino)-羰基、或烷氧基羰基)，特别是低级烷氧羰基-低级烷基醚，例如甲氧羰基丙基醚或乙氧羰基丙基醚；磺基烷基醚，特别是磺基低级烷基醚，尤其是磺基丁基醚；其中一个或几个OH基团被具有下式的基团醚化的环糊精-O-[alk-O-]n-H其中alk是烷基，尤其是低级烷基，而且n是2-12的整数，尤其是2-5，特别是2或3；其中一个或几个OH基团被下式的基团醚化的环糊精 其中R’是氢、羟基、-O-(alk-O)z-H、-O-(alk(-R)-O-)p-H或-O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y；alk在所有情况中是烷基，尤其是低级烷基；m、n、p、q和z是1-12的整数，优选1-5，特别是1-3；Y是OR1或NR2R3，其中R1、R2和R3互相独立地是氢或低级烷基，或R2和R3与连接氮一起表示吗啉代、哌啶子基、吡咯烷子基或哌嗪子基；或者分支环糊精，其中存在与其它糖分子的醚化或乙缩醛，尤其是葡糖基-、二葡糖基-、(G2-β-环糊精)、麦芽糖基-或二麦芽糖基环糊精，或N-乙酰氨基葡糖基、氨基葡糖基-、N-乙酰氨基半乳糖基-或氨基半乳糖基-环糊精。
酯主要是烷酰酯，特别是低级烷酰酯，诸如环糊精的乙酰酯。
还有可能环糊精中同时存在两种或更多种不同的所述醚和酯基团。
两种或更多种所述环糊精和/或环糊精衍生物的混合物也可以存在。
特别优选的是α-、β-或γ-环糊精或它们的低级烷基醚，诸如甲基-β-环糊精或特别是2，6-二-O-甲基-β-环糊精，或特别是它们的羟基低级烷基醚，诸如2-羟丙基-α-、2-羟丙基-β-或2-羟丙基-γ-环糊精。
向培养基中加入环糊精或环糊精衍生物，其浓度优选0.02-10，更优选0.05-5，尤其0.1-4，例如0.1-2重量百分比(w/v)。
环糊精或环糊精衍生物是已知的或可以通过已知的方法生产(参阅例如US 3,459,731；US 4,383,992；US 4,535,152；US 4,659,696；EP 0 094 157；EP 0 149 197；EP 0 197 571；EP 0 300 526；EP 0 320032；EP 0 499 322；EP 0 503 710；EP 0 818 469；WO 90/12035；WO 91/11200；WO 93/19061；WO 95/08993；WO 96/14090；GB 2,189,245；DE 3,118,218；DE 3,317,064及其中提到的有关环糊精或环糊精衍生物合成的参考文献或还有T.Loftsson和M.E.Brewster(1996)，环糊精的药物应用药物溶解性和稳定性(PharmaceuticalApplications of CyclodextrinsDrug Solubilization andStabilisation)，药物科学杂志(Journal of PharmaceuticalScience)85(10)1017-1025；R.A.Rajewski和V.J.Stella(1996)，环糊精的药物应用体内药物投递(Pharmaceutical Applications ofCyclodextrinsIn Vivo Drug Delivery)，药物科学杂志85(11)1142-1169)。
这里测试的所有环糊精衍生物可以从Fluka公司，Buchs，CH购得。测试在具有50ml培养容量的200ml摇瓶中进行。作为对照，使用装有吸附剂树脂Amberlite XAD-16(Rohm和Haas，Frankfurt，德国)和无任何吸附剂添加的摇瓶。培养5天后，通过HPLC测定下列epothilone的浓度表2
1)除Amberlite(％v/v)之外，所有百分比均为重量百分比(％w/v)。
少数测试的环糊精(2，6-二-O-甲基-β-环糊精、甲基-β-环糊精)0显示在使用的浓度对epothilone产量没有影响或有负面影响。1-2％2-羟基-丙基-β-环糊精和β-环糊精在实施例中与不使用环糊精生产相比将epothilone产量提高6-8倍。
C有1％ 2-(羟丙基)-β-环糊精的10升发酵发酵在15升玻璃发酵罐中进行。培养基含有10g/l的2-(羟丙基)-β-环糊精(购自Wacker Chemie，Munich，德国)。发酵过程列于表3。发酵在6天后停止并开始提取。
表310升发酵的过程
D有1％ 2-(羟丙基)-β-环糊精的100升发酵发酵在150升发酵罐中进行。培养基含有10g/l的2-(羟丙基)-β-环糊精。发酵过程列于表4。发酵液在7天后收获并提取。
表4100升发酵的过程
E有1％ 2-(羟丙基)-β-环糊精的500升发酵发酵在750升发酵罐中进行。培养基含有10g/l的2-(羟丙基)-β-环糊精。发酵过程列于表5。发酵液在7天后收获并提取。
表5500升发酵的过程
F不加吸附剂的10升发酵比较实施例发酵在15升玻璃发酵罐中进行。培养基不含有任何环糊精或其它吸附剂。发酵过程列于表6。没有收获并提取发酵液。
表6不含吸附剂的10升发酵的过程
G逐步得到epothilone从500升主要培养物中分离从实施例2D的500升主要培养收获的体积是450升，并使用Westfalia澄清分离器(clarifying separator)SA-20-06型(rpm＝6500)分离成液相(离心液+冲洗水＝650升)和固相(细胞＝大约15kg)。发现epothilone的主要部分在离心液中。离心所得的细胞浆含有＜15％的测定的epothilone部分，不再进一步处理。然后将650升离心液置于4000升搅拌器中，与10升Amberlite XAD-16(离心液树脂＝65∶1)混合并搅拌。接触大约2小时后，在Heine溢流式离心机(overflow centrifuge)(桶容量40升；rpm＝2800)中离心下树脂。从离心机上卸下树脂，并用10-15升去离子水清洗。解吸附作用通过两次搅拌树脂进行，每次均将一部分与30升异丙醇在30升玻璃搅拌器中搅拌30分钟。使用抽滤器从树脂中分离出异丙醇相。然后在真空操作的循环蒸发器(Schmid-Verdampfer)中加入15-20升水将异丙醇从混合异丙醇相中除去，并将得到的大约10升水相提取3次，每次用10升乙酸乙酯抽提。提取在30升玻璃搅拌器中进行。在真空操作的循环蒸发器(Schmid-Verdampfer)中将乙酸乙酯提取液浓缩至3-5升，之后在真空下在旋转蒸发器(Büchi型)中浓缩至干燥。得到50.2g乙酸乙酯提取物。将乙酸乙酯提取物溶解于500ml甲醇中，使用折叠滤器将不溶部分滤掉，并将溶液加到10kg Sephadex LH 20层析柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)(层析柱直径20cm，填充高度大约1.2m)上。用甲醇作为洗脱液进行洗脱。epothilone A和B主要存在于级分21-23中(每份级分1升)。在真空中在旋转蒸发器中将这些级分浓缩至干燥(总重量9.0g)。然后将这些Sephadex洗脱峰级分(9.0g)溶解于92ml乙腈∶水∶二氯甲烷＝50∶40∶2中，将溶液用折叠滤器过滤并加到RP层析柱(配备Prepbar200，Merck；2.0kgLiChrospher RP-18，Merch，颗粒大小12μm，柱直径10cm，填充高度42cm；Merch，Darmstadt，德国)上。用乙腈∶水＝3∶7进行洗脱(流速＝500ml/min；epothilone A的保持时间＝大约51-59min；epothilone B的保持时间＝大约60-69min)。级分用UV检测仪于250nm监测。在真空下在Büchi-Rotavapor旋转蒸发器上将级分浓缩至干燥。epothilone A洗脱峰级分的重量是700mg，而且根据HPLC(外部标准)含量是75.1％。epothilone B洗脱峰级分的重量是1980mg，而且含量根据HPLC(外部标准)是86.6％。最后，epothilone A收集部分(700mg)由5ml乙酸乙酯∶甲苯＝2∶3结晶，并产生170mgepothilone A的纯晶体[含量根据HPLC(面积％)＝94.3％]。epothilone B收集部分(1980mg)由18ml甲醇进行结晶并产生1440mgepothilone B的纯晶体[含量根据HPLC(面积％)＝99.2％]。m.p.(epothilone B)例如124-125℃；epothilone B的1H-NMR数据500MHz-NMR，溶剂DMSO-d6。化学取代δ以相对于TMS的ppm表示。s＝单峰；d＝双峰；m＝多重峰δ(峰裂数) integral(H的数目)7.34(s)16.50(s)15.28(d)15.08(d)14.46(d)14.08(m)13.47(m)13.11(m)12.83(dd) 12.64(s)32.36(m)22.09(s)32.04(m)11.83(m)11.61(m)11.47-1.24(m) 41.18(s)6
1.13(m)21.06(d)30.89(d+s，重叠)6∑＝41实施例15重组生产的epothilone的医疗用途包含epothilone的药物制剂或组合物可被用于例如癌症(诸如各种人实体瘤)的治疗。这些抗癌制剂包含(例如)活性剂量的epothilone和一种或几种有机或无机液体或固体的适合药用的载体物质。这些制剂以例如肠道、鼻腔、直肠、口腔、或非肠道方式，尤其是肌肉内或静脉内方式给药。活性成分的剂量取决于病人的体重、年龄和体格和药物动力学状况并进一步取决于给药方式。因为epothilone模仿紫杉醇的生物学效应，故epothilone有可能在使用紫杉醇治疗癌症的组合物和方法中取代紫杉醇。见，例如，美国专利号5,496,804，5,565,478，和5,641,803，引用这些作为参考。
例如，用于治疗时，提供的epothilone B是2ml玻璃瓶单独包装，配制成1mg/ml清亮的、无色静脉注射液浓缩物。该物质用聚乙二醇300(PEG300)配制并用50或100ml 0.9％氯化钠注射液USP稀释以达到药物输液需要的最终浓度。以每21天一次30分钟静脉输液(三周治疗一次)六个循环或者每7天一次30分钟静脉输液(一周治疗一次)进行。
优选的，对于每周一次的治疗，剂量在大约0.1-大约6mg/m2，优选大约0.1-大约5mg/m2，更优选大约0.1-大约3mg/m2，甚至更优选0.1-1.7mg/m2，最优选大约0.3-大约1mg/m2之间；对于三周一次的治疗(每三周一次或每个第三周治疗)，剂量在大约0.3-18mg/m2，优选大约0.3-大约15mg/m2，更优选大约0.3-12mg/m2，甚至更优选大约0.3-大约7.5mg/m2，还要更优选大约0.3-大约5mg/m2，最优选大约1.0-3.0mg/m2之间。优选这个剂量通过对人进行2-180min，优选2-120min，更优选大约5-大约30min，最优选大约10-大约30min(如大约30min)完成静脉内(i.v.)给药。
虽然本发明已经由它们的特定实施方案作为参考描述过，明显的，众多的变化、修饰和实施方案是可能的，相应的，所有这些变化、修饰和实施方案将被看作是在本发明的精神和范围之内。
序列表<110>Novartis AG<120>用于epothilone生物合成的基因<130>4-30582A<140>
<141>
<160>30<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>68750<212>DNA<213>纤维堆囊菌<400>1aagcttcgct cgacgccctc ttcgcccgcg ccacctctgc ccgtgtgctc gatgatggcc 60acggccgggc cacggagcgg catgtgctcg ccgaggcgcg cgggatcgag gacctccgcg 120ccctccgaga gcacctccgc atccaggaag gggggccgtc ctttcactgc atgtgcctcg 180gcgacctgac ggtggagctc ctcgcgcacg accagcccct cgcgtccatc agcttccacc 240atgcccgcag cctgaggcac cccgactgga cctcggacgc gatgctcgtc gacggccccg 300cgctcgtccg gtggctcgcc gcgcgcggcg cgccgggtcc cctccgcgag tacgaagagg 360agcgcgagcg agcccgaacc gcgcaggagg cgaggcgcct gtggctcgcg gccgcgccgc 420cctgcttcgc gcccgatctg ccccgcttcg aggacgacgc caacgggctg ccgctcggcc 480cgatgtcgcc tgaagtcgcc gaggccgagc ggcgcctccg cgcctcgtac gcgactcctg 540agctcgcctg tgccgcgctg ctcgcctggc tcgggacggg cgcgggtccc tggtccggat 600atcccgccta cgagatgctg ccagagaatc tgctcctcgg gtttggcctc ccgaccgcga 660tcgccgcggc ctccgcgccc ggcacatcgg aggccgctct ccgcggcgca gcgcggctgt 720tcgcctcctg ggaggtcgta tcgagcaaga agagccagct cggcaacatc cccgaagccc 780tgtgggagcg gctccggacg atcgtccgcg cgatgggcaa tgccgacaac ctctctcgct 840tcgagcgcgc cgaggcgatc gcggcggagg tgcgccgcct gcgcgcacag ccggcgccct 900tcgcggcggg cgccggcctg gcggtcgctg gggtctcctc gagcggccgg ctctcgggcc 960tcgtgaccga cggagacgca ttgtactccg gcgacggcaa cgacatcgtc atgttccaac 1020ccggccggat ctcgccggtc gtgctgctcg ccggaaccga tcccttcttc gagctcgcac 1080cgcccctcag ccagatgctc ttcgtcgcgc acgccaacgc gggcaccatc tccaaggtcc 1140tgacggaagg cagccccctc atcgtgatgg caagaaacca ggcgcgaccg atgagcctcg 1200tccacgctcg cgggttcatg gcgtgggtca accaggccat ggtgcccgac cccgagcggg 1260gcgcgccctt cgtcgtccag cgctcgacca tcatggaatt cgagcacccc acgcctcgtt 1320gtctccacga gcccgccggc agcgctttct ccctcgcctg cgacgaggag cacctctact 1380ggtgcgagct ttcggctggc cggctcgagc tatggcgcca cccgcaccac cgccccggcg 1440ccccgagccg cttcgcgtac ctcggcgagc accccattgc ggcgacctgg tacccctcgc 1500tcaccctcaa tgcgacccac gtgctgtggg ccgaccctga tcgcagggcc atcctcgggg 1560tcgacaagcg caccggcgta gagcccatcg tcctcgcgga gacgcgccat cccccggcgc 1620acgtcgtgtc cgaggaccgg gacatcttcg cgcttaccgg acagcccgac tcccgcgact 1680ggcacgtcga gcacatccgc tccggcgcct ccaccgtcgt ggccgactac cagcgccagc 1740tatgggaccg ccctgacatg gtgctcaatc ggcgcggcct cttcttcacg acgaacgacc 1800gcatcctgac gctcgcccgc agctgacatc gctcgacgcc gggccgctca tcgagggcgc 1860ccggaccgag ctggcgaccc gccgctggcg ggccgcagct catgccgatt cggtggcgac 1920gtagacgctg cgccagaaac gctcgagagc ccccgagaac aggaagccgg cggattgtgt 1980catcacgatc ccgatcagct cgcggcccgg atcattgatc caggacgtcc cgaacccgcc 2040gtcccaccca tagcgcccgg gcacctccga gaccgcgtcc ggcgccgtga ccacggccat 2100cccataaccc cagccgtgcg tctcgaagaa gcccgggaaa aacgaggacg ccgccttctg 2160ggccggcgtg aggtgatcgg ccgtcatctc gcgcaccgag gcggcgctca agagccgccg 2220gccctcgtgc acaccgccgt tcatgagcat gcgcgcgaac aggaggtagt cgtccaccgt 2280cgacacgagc ccggcggcgc ccgaagggaa cgccggcggg ctggcatagg cgctctcggc 2340cccgtcgcga tccatgcgcg tcttctcccc cgtctgctcg tcggtgaagt aaccgcagcc 2400cgcgaaccga gcgagcttgt ccgccgggac gtgaaagtcg gtgtcccgca tcccgagcgg 2460cgcgaggatg cgctcgcgca cgaacgcatc gaagccctgg tcggccgcgc gccccacgag 2520caccccctgc accaggctcc ccgtgttgta catccactgc gcccccggct gatgcatgag 2580cggcagcgtc ccgagccgcc ggatccactc gtctggcccg tgcggcgtca tcggcaccgg 2640
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Leu Gly Thr Leu Pro Leu Met His Gln Pro Gly Ala Gln Trp Met Tyr195 200 205Asn Thr Gly Ser Leu Val Gln Gly Val Leu Val Gly Arg Ala Ala Asp210 215 220Gln Gly Phe Asp Ala Phe Val Arg Glu Arg Ile Leu Ala Pro Leu Gly225 230 235 240Met Arg Asp Thr Asp Phe His Val Pro Ala Asp Lys Leu Ala Arg Phe245 250 255Ala Gly Cys Gly Tyr Phe Thr Asp Glu Gln Thr Gly Glu Lys Thr Arg260 265 270Met Asp Arg Asp Gly Ala Glu Ser Ala Tyr Ala Ser Pro Pro Ala Phe275 280 285Pro Ser Gly Ala Ala Gly Leu Val Ser Thr Val Asp Asp Tyr Leu Leu290 295 300Phe Ala Arg Met Leu Met Asn Gly Gly Val His Glu Gly Arg Arg Leu305 310 315 320Leu Ser Ala Ala Ser Val Arg Glu Met Thr Ala Asp His Leu Thr Pro325 330 335Ala Gln Lys Ala Ala Ser Ser Phe Phe Pro Gly Phe Phe Glu Thr His340 345 350Gly Trp Gly Tyr Gly Met Ala Val Val Thr Ala Pro Asp Ala Val Ser355 360 365Glu Val Pro Gly Arg Tyr Gly Trp Asp Gly Gly Phe Gly Thr Ser Trp370 375 380Ile Asn Asp Pro Gly Arg Glu Leu Ile Gly Ile Val Met Thr Gln Ser385 390 395 400Ala Gly Phe Leu Phe Ser Gly Ala Leu Glu Arg Phe Trp Arg Ser Val405 410 415Tyr Val Ala Thr Glu Ser Ala420<210>11<211>713<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>11Met His Gly Leu Thr Glu Arg Gln Val Leu Leu Ser Leu Val Thr Leu1 5 10 15Ala Leu Ile Leu Val Thr Ala Arg Ala Ser Gly Glu Leu Ala Arg Arg20 25 30Leu Arg Gln Pro Glu Val Leu Gly Glu Leu Phe Gly Gly Val Val Leu35 40 45Gly Pro Ser Val Val Gly Ala Leu Ala Pro Gly Phe His Arg Ala Leu50 55 60Phe Gln Glu Pro Ala Val Gly Val Val Leu Ser Gly Ile Ser Trp Ile
65 70 75 80Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Met Ala Gly Ile Glu Val Asp Val Gly85 90 95Ile Leu Arg Lys Glu Ala Arg Pro Gly Ala Leu Ser Ala Leu Gly Ala100 105 110Ile Ala Pro Pro Leu Ala Ala Gly Ala Ala Phe Ser Ala Leu Val Leu115 120 125Asp Arg Pro Leu Pro Ser Gly Leu Phe Leu Gly Ile Val Leu Ser Val130 135 140Thr Ala Val Ser Val Ile Ala Lys Val Leu Ile Glu Arg Glu Ser Met145 150 155 160Arg Arg Ser Tyr Ala Gln Val Thr Leu Ala Ala Gly Val Val Ser Glu165 170 175Val Ala Ala Trp Val Leu Val Ala Met Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Ala180 185 190Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Arg Ser Ala Leu Leu Ala Ser Gly Phe195 200 205Leu Leu Phe Met Val Leu Val Gly Arg Arg Leu Thr His Leu Ala Met210 215 220Arg Trp Val Ala Asp Ala Thr Arg Val Ser Lys Gly Gln Val Ser Leu225 230 235 240Val Leu Val Leu Thr Phe Leu Ala Ala Ala Leu Thr Gln Arg Leu Gly245 250 255Leu His Pro Leu Leu Gly Ala Phe Ala Leu Gly Val Leu Leu Asn Ser260 265 270Ala Pro Arg Thr Asn Arg Pro Leu Leu Asp Gly Val Gln Thr Leu Val275 280 285Ala Gly Leu Phe Ala Pro Val Phe Phe Val Leu Ala Gly Met Arg Val290 295 300Asp Val Ser Gln Leu Arg Thr Pro Ala Ala Trp Gly Thr Val Ala Leu305 310 315 320Leu Leu Ala Thr Ala Thr Ala Ala Lys Val Val Pro Ala Ala Leu Gly325 330 335Ala Arg Leu Gly Gly Leu Arg Gly Ser Glu Ala Ala Leu Val Ala Val340 345 350Gly Leu Asn Met Lys Gly Gly Thr Asp Leu Ile Val Ala Ile Val Gly355 360 365Val Glu Leu Gly Leu Leu Ser Asn Glu Ala Tyr Thr Met Tyr Ala Val370 375 380Val Ala Leu Val Thr Val Thr Ala Ser Pro Ala Leu Leu Ile Trp Leu385 390 395 400Glu Lys Arg Ala Pro Pro Thr Gln Glu Glu Ser Ala Arg Leu Glu Arg405 410 415
Glu Glu Ala Ala Arg Arg Ala Tyr Ile Pro Gly Val Glu Arg Ile Leu420 425 430Val Pro Ile Val Ala His Ala Leu Pro Gly Phe Ala Thr Asp Ile Val435 440 445Glu Ser Ile Val Ala Ser Lys Arg Lys Leu Gly Glu Thr Val Asp Ile450 455 460Thr Glu Leu Ser Val Glu Gln Gln Ala Pro Gly Pro Ser Arg Ala Ala465 470 475 480Gly Glu Ala Ser Arg Gly Leu Ala Arg Leu Gly Ala Arg Leu Arg Val485 490 495Gly Ile Trp Arg Gln Arg Arg Glu Leu Arg Gly Ser Ile Gln Ala Ile500 505 510Leu Arg Ala Ser Arg Asp His Asp Leu Leu Val Ile Gly Ala Arg Ser515 520 525Pro Ala Arg Ala Arg Gly Met Ser Phe Gly Arg Leu Gln Asp Ala Ile530 535 540Val Gln Arg Ala Glu Ser Asn Val Leu Val Val Val Gly Asp Pro Pro545 550 555 560Ala Ala Glu Arg Ala Ser Ala Arg Arg Ile Leu Val Pro Ile Ile Gly565 570 575Leu Glu Tyr Ser Phe Ala Ala Ala Asp Leu Ala Ala His Val Ala Leu580 585 590Ala Trp Asp Ala Glu Leu Val Leu Leu Ser Ser Ala Gln Thr Asp Pro595 600 605Gly Ala Val Val Trp Arg Asp Arg Glu Pro Ser Arg Val Arg Ala Val610 615 620Ala Arg Ser Val Val Asp Glu Ala Val Phe Arg Gly Arg Arg Leu Gly625 630 635 640Val Arg Val Ser Ser Arg Val His Val Gly Ala His Pro Ser Asp Glu645 650 655Ile Thr Arg Glu Leu Ala Arg Ala Pro Tyr Asp Leu Leu Val Leu Gly660 665 670Cys Tyr Asp His Gly Pro Leu Gly Arg Leu Tyr Leu Gly Ser Thr Val675 680 685Glu Ser Val Val Val Arg Ser Arg Val Pro Val Ala Leu Leu Val Ala690 695 700His Gly Gly Thr Arg Glu Gln Val Arg705 710<210>12<211>126<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>12Met Asp Lys Pro Ile Gly Arg Thr Arg Cys Ala Ile Ala Glu Gly Tyr
1 5 10 15Ile Pro Gly Gly Ser Asn Gly Pro Glu Pro Gln Met Thr Ser His Glu20 25 30Thr Ala Cys Leu Leu Asn Ala Ser Asp Arg Asp Ala Gln Val Ala Ile35 40 45Thr Val Tyr Phe Ser Asp Arg Asp Pro Ala Gly Pro Tyr Arg Val Thr50 55 60Val Pro Ala Arg Arg Thr Arg His Val Arg Phe Asn Asp Leu Thr Glu65 70 75 80Pro Glu Pro Ile Pro Arg Asp Thr Asp Tyr Ala Ser Val Ile Glu Ser85 90 95Asp Ala Pro Ile Val Val Gln His Thr Arg Leu Asp Ser Arg Gln Ala100 105 110Glu Asn Ala Leu Leu Ser Thr Ile Ala Tyr Thr Asp Arg Glu115 120 125<210>13<211>149<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>13Met Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg Phe Gly Arg Arg Ile Gly His1 5 10 15Thr Leu Gly Leu Leu Ala Ser Met Ala Leu Ala Gly Cys Gly Gly Pro20 25 30Ser Glu Lys Thr Val Gln Gly Thr Arg Leu Ala Pro Gly Ala Asp Ala35 40 45Arg Val Thr Ala Asp Val Asp Pro Asp Ala Ala Thr Thr Arg Leu Ala50 55 60Val Asp Val Val His Leu Ser Pro Pro Glu Arg Leu Glu Ala Gly Ser65 70 75 80Glu Arg Phe Val Val Trp Gln Arg Pro Ser Pro Glu Ser Pro Trp Arg85 90 95Arg Val Gly Val Leu Asp Tyr Asn Ala Asp Ser Arg Arg Gly Lys Leu100 105 110Ala Glu Thr Thr Val Pro Tyr Ala Asn Phe Glu Leu Leu Ile Thr Ala115 120 125Glu Lys Gln Ser Ser Pro Gln Ser Pro Ser Ser Ala Ala Val Ile Gly130 135 140Pro Thr Ser Val Gly145<210>14<211>184<212>PRT<213>纤维堆囊菌
<400>14Val Thr Ser Glu Glu Val Pro Gly Ala Ala Leu Gly Ala Gln Ser Ser1 5 10 15Leu Val Arg Ala Gln His Ala Ala Arg His Val Arg Pro Cys Thr Arg20 25 30Ala Glu Glu Pro Pro Ala Leu Met His Gly Leu Thr GIu Arg Gln Val35 40 45Leu Leu Ser Leu Val Ala Leu Ala Leu Val Leu Leu Thr Ala Arg Ala50 55 60Phe Gly Glu Leu Ala Arg Arg Leu Arg Gln Pro Glu Val Leu Gly Glu65 70 75 80Leu Phe Gly Gly Val Val Leu Gly Pro Ser Val Val Gly Ala Leu Ala85 90 95Pro Gly Phe His Arg Val Leu Phe Gln Asp Pro Ala Val Gly Val Val100 105 110Leu Ser Gly Ile Ser Trp Ile Gly Ala Leu Val Leu Leu Leu Met Ala115 120 125Gly Ile Glu Val Asp Val Ser Ile Leu Arg Lys Glu Ala Arg Pro Gly130 135 140Ala Leu Ser Ala Leu Gly Ala Ile Ala Pro Pro Leu Arg Thr Pro Gly145 150 155 160Pro Leu Val Gln Arg Met Gln Gly Ala Phe Thr Trp Asp Leu Asp Val165 170 175Ser Pro Arg Arg Ser Ala Gln Ala180<210>15<211>145<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>15Val Asn Ala Pro Cys Met Arg Cys Thr Ser Gly Pro Gly Val Arg Ser1 5 10 15Gly Gly Ala Ile Ala Pro Ser Ala Glu Ser Ala Pro Gly Arg Ala Ser20 25 30Leu Arg Arg Met Leu Thr Ser Thr Ser Ile Pro Ala Met Ser Ser Arg35 40 45Thr Ser Ala Pro Ile Gln Glu Met Pro Glu Ser Thr Thr Pro Thr Ala50 55 60Gly Ser Trp Lys Arg Thr Arg Trp Asn Pro Gly Ala Ser Ala Pro Thr65 70 75 80Thr Asp Gly Pro Ser Thr Thr Pro Pro Lys Ser Ser Pro Ser Thr Ser85 90 95Gly Trp Arg Ser Arg Arg Ala Ser Ser Pro Lys Ala Arg Ala Val Arg100 105 110
Arg Thr Ser Ala Arg Ala Thr Ser Glu Ser Arg Thr Cys Arg Ser Val115 120 125Arg Pro Cys Ile Arg Ala Gly Gly Ser Ser Ala Arg Val Gln Gly Arg130 135 140Thr145<210>16<211>185<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>16Val Leu Ala Pro Pro Ala Asp Ile Arg Pro Pro Ala Ala Ala Gln Leu1 5 10 15Glu Pro Asp Ser Pro Asp Asp Glu Ala Asp Glu Ala Asp Glu Ala Leu20 25 30Arg Pro Phe Arg Asp Ala Ile Ala Ala Tyr Ser Glu Ala Val Arg Trp35 40 45Ala Glu Ala Ala Gln Arg Pro Arg Leu Glu Ser Leu Val Arg Leu Ala50 55 60Ile Val Arg Leu Gly Lys Ala Leu Asp Lys Val Pro Phe Ala His Thr65 70 75 80Thr Ala Gly Val Ser Gln Ile Ala Gly Arg Leu Gln Asn Asp Ala Val85 90 95Trp Phe Asp Val Ala Ala Arg Tyr Ala Ser Phe Arg Ala Ala Thr Glu100 105 110His Ala Leu Arg Asp Ala Ala Ser Ala Met Glu Ala Leu Ala Ala Gly115 120 125Pro Tyr Arg Gly Ser Ser Arg Val Ser Ala Ala Val Gly Glu Phe Arg130 135 140Gly Glu Ala Ala Arg Leu His Pro Ala Asp Arg Val Pro Ala Ser Asp145 150 155 160Gln Gln Ile Leu Thr Ala Leu Arg Ala Ala Glu Arg Ala Leu Ile Ala165 170 175Leu Tyr Thr Ala Phe Ala Arg Glu Glu180 185<210>17<211>146<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>17Met Ala Asp Ala Ala Ser Arg Ser Ala Cys Ser Val Ala Ala Arg Lys1 5 10 15Leu Ala Tyr Arg Ala Ala Thr Ser Asn Gln Thr Ala Ser Phe Trp Ser20 25 30
Leu Pro Ala Ile Trp Glu Thr Pro Ala Val Val Cys Ala Lys Gly Thr35 40 45Leu Ser Ser Ala Leu Pro Ser Arg Thr Ile Ala Ser Arg Thr Arg Leu50 55 60Ser Ser Arg Gly Arg Cys Ala Ala Ser Ala His Arg Thr Ala Ser Glu65 70 75 80Tyr Ala Ala Ile Ala Ser Arg Asn Gly Arg Ser Ala Ser Ser Ala Ser85 90 95Ser Ala Ser Ser Ser Gly Glu Ser Gly Ser Ser Trp Ala Ala Ala Gly100 105 110Gly Arg Met Ser Ala Gly Gly Ala Ser Thr Gly Glu Val Tyr Glu Gln115 120 125Ala Pro Arg Leu Arg Leu Ala Gln Ser Val Ala Ala Arg Arg Arg Asp130 135 140Pro Thr145<210>18<211>288<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>18Val Thr Val Ser Ser Met Pro Arg Ser Trp Ser Ser Arg Val Arg Thr1 5 10 15Val Val Thr Ala Leu Gly Cys Ala Arg Arg Leu Ser Gly Ser Ile Ser20 25 30Arg Leu Arg Arg His Pro Glu Ala Gly Arg Ala Pro Arg Ser Arg Leu35 40 45Arg Ala Trp Arg Arg Leu Pro Gln His Ile Ser Ser Pro Trp Arg His50 55 60Leu Pro Pro Gly Ala Arg Val Gly Thr Ser Cys Pro Ala Asp Arg Arg65 70 75 80Ile Leu Pro Ser His Arg Thr Ala Asp Leu Gly Thr Ser Gly Gly Thr85 90 95Leu Val Ala Arg Met Ser Gly His Val Ala Arg Asn Pro His Ala Ala100 105 110Val Leu Val Gly Asp Gly Ser Ala Arg Gly Arg Arg Arg Leu Ser Asn115 120 125Arg Arg Ala Glu Arg Arg Val Ser Asp Val Thr Cys Arg Glu Gly Gly130 135 140Glu Ala Met Gln Lys Ile Ala Gly Lys Leu Val Val Gly Leu Ile Ser145 150 155 160Val Ser Gly Met Ser Leu Leu Ala Ala Cys Gly Gly Glu Lys Arg Ser165 170 175
Gly Gly Glu Ala Gln Thr Pro Gly Gly Ala Gln Gly Glu Ala Pro Val180 185 190Pro Val Gly Ser Ala Val Asp Ser Ile Val Ala Ala Arg Cys Asp Arg195 200 205Glu Ala Arg Cys Asn Asn Ile Gly Gln Asp Arg Glu Tyr Ser Ser Lys210 215 220Asp Ala Cys Ser Asn Lys Ile Arg Ser Glu Trp Arg Asp Glu Leu Thr225 230 235 240Phe Gly Glu Cys Pro Gly Gly Ile Asp Ala Lys Gln Leu Asn Glu Cys245 250 255Leu Glu Gly Ile Arg Asn Glu Gly Cys Gly Asn Pro Phe Asp Thr Leu260 265 270Gly Arg Val Val Ala Cys Arg Ser Ser Asp Leu Cys Arg Asp Ala Arg275 280 285<210>19<211>288<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>19Val Thr Val Ser Ser Met Pro Arg Ser Trp Ser Ser Arg Val Arg Thr1 5 10 15Val Val Thr Ala Leu Gly Cys Ala Arg Arg Leu Ser Gly Ser Ile Ser20 25 30Arg Leu Arg Arg His Pro Glu Ala Gly Arg Ala Pro Arg Ser Arg Leu35 40 45Arg Ala Trp Arg Arg Leu Pro Gln His Ile Ser Ser Pro Trp Arg His50 55 60Leu Pro Pro Gly Ala Arg Val Gly Thr Ser Cys Pro Ala Asp Arg Arg65 70 75 80Ile Leu Pro Ser His Arg Thr Ala Asp Leu Gly Thr Ser Gly Gly Thr85 90 95Leu Val Ala Arg Met Ser Gly His Val Ala Arg Asn Pro His Ala Ala100 105 110Val Leu Val Gly Asp Gly Ser Ala Arg Gly Arg Arg Arg Leu Ser Asn115 120 125Arg Arg Ala Glu Arg Arg Val Ser Asp Val Thr Cys Arg Glu Gly Gly130 135 140Glu Ala Met Gln Lys Ile Ala Gly Lys Leu Val Val Gly Leu Ile Ser145 150 155 160Val Ser Gly Met Ser Leu Leu Ala Ala Cys Gly Gly Glu Lys Arg Ser165 170 175Gly Gly Glu Ala Gln Thr Pro Gly Gly Ala Gln Gly Glu Ala Pro Val
180 185 190Pro Val Gly Ser Ala Val Asp Ser Ile Val Ala Ala Arg Cys Asp Arg195 200 205Glu Ala Arg Cys Asn Asn Ile Gly Gln Asp Arg Glu Tyr Ser Ser Lys210 215 220Asp Ala Cys Ser Asn Lys Ile Arg Ser Glu Trp Arg Asp Glu Leu Thr225 230 235 240Phe Gly Glu Cys Pro Gly Gly Ile Asp Ala Lys Gln Leu Asn Glu Cys245 250 255Leu Glu Gly Ile Arg Asn Glu Gly Cys Gly Asn Pro Phe Asp Thr Leu260 265 270Gly Arg Val Val Ala Cys Arg Ser Ser Asp Leu Cys Arg Asp Ala Arg275 280 285<210>20<211>155<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>20Met Asp Pro Arg Ala Arg Arg Glu Lys Arg Pro Ser Leu Leu Asp Ser1 5 10 15Arg Gly Arg Gln Pro Lys Arg Ser Gln Gln Cly Gly His Met Glu Lys20 25 30Pro Ile Gly Arg Thr Arg Trp Ala Ile Ala Glu Gly Tyr Ile Pro Gly35 40 45Arg Ser Asn Gly Pro Glu Pro Gln Met Thr Ser His Glu Thr Ala Cys50 55 60Leu Leu Asn Ala Ser Asp Arg Asp Ala Gln Val Ala Ile Thr Val Tyr65 70 75 80Phe Ser Asp Arg Asp Pro Ala Gly Pro Tyr Arg Val Thr Val Pro Ala85 90 95Arg Arg Thr Arg His Val Arg Phe Asn Asp Leu Thr Glu Pro Glu Pro100 105 110Ile Pro Arg Asp Thr Asp Tyr Ala Ser Val Ile Glu Ser Asp Val Pro115 120 125Ile Val Val Gln His Thr Arg Leu Asp Ser Arg Gln Ala Glu Asn Ala130 135 140Leu Ile Ser Thr Ile Ala Tyr Thr Asp Arg Glu145 150 155<210>21<211>156<212>PRT<213>纤维堆囊菌
<400>21Val Arg Arg Ser Arg Trp Gln Met Lys His Val Asp Thr Gly Arg Arg1 5 10 15Val Gly Arg Arg Ile Gly Leu Thr Leu Gly Leu Leu Ala Ser Met Ala20 25 30Leu Ala Gly Cys Gly Gly Pro Ser Glu Lys Ile Val Gln Gly Thr Arg35 40 45Leu Ala Pro Gly Ala Asp Ala His Val Ala Ala Asp Val Asp Pro Asp50 55 60Ala Ala Thr Thr Arg Leu Ala Val Asp Val Val His Leu Ser Pro Pro65 70 75 80Glu Arg Ile Glu Ala Gly Ser Glu Arg Phe Val Val Trp Gln Arg Pro85 90 95Ser Ser Glu Ser Pro Trp Gln Arg Val Gly Val Leu Asp Tyr Asn Ala100 105 110Ala Ser Arg Arg Gly Lys Leu Ala Glu Thr Thr Val Pro His Ala Asn115 120 125Phe Glu Leu Leu Ile Thr Val Glu Lys Gln Ser Ser Pro Gln Ser Pro30 135 140Ser Ser Ala Ala Val Ile Gly Pro Thr Ser Val Gly145 150 155<210>22<211>305<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>22Met Glu Lys Glu Ser Arg Ile Ala Ile Tyr Gly Ala Ile Ala Ala Asn1 5 10 15Val Ala Ile Ala Ala Val Lys Phe Ile Ala Ala Ala Val Thr Gly Ser20 25 30Ser Ala Met Leu Ser Glu Gly Val His Ser Leu Val Asp Thr Ala Asp35 40 45Gly Leu Leu Leu Leu Leu Gly Lys His Arg Ser Ala Arg Pro Pro Asp50 55 60Ala Glu His Pro Phe Gly His Gly Lys Glu Leu Tyr Phe Trp Thr Leu65 70 75 80Ile Val Ala Ile Met Ile Phe Ala Ala Gly Gly Gly Val Ser Ile Tyr85 90 95Glu Gly Ile Leu His Leu Leu His Pro Arg Gln Ile Glu Asp Pro Thr100 105 110Trp Asn Tyr Val Val Leu Gly Ala Ala Ala Val Phe Glu Gly Thr Ser115 120 125Leu Ile Ile Ser Ile His Glu Phe Lys Lys Lys Asp Gly Gln Gly Tyr130 135 140
Leu Ala Ala Met Arg Ser Ser Lys Asp Pro Thr Thr Phe Thr Ile Val145 150 155 160Leu Glu Asp Ser Ala Ala Leu Ala Gly Leu Thr Ile Ala Phe Leu Gly165 170 175Val Trp Leu Gly His Arg Leu Gly Asn Pro Tyr Leu Asp Gly Ala Ala180 185 190Ser Ile Gly Ile Gly Leu Val Leu Ala Ala Val Ala Val Phe Leu Ala195 200 205Ser Gln Ser Arg Gly Leu Leu Val Gly Glu Ser Ala Asp Arg Glu Leu210 215 220Leu Ala Ala Ile Arg Ala Leu Ala Ser Ala Asp Pro Gly Val Ser Ala225 230 235 240Val Gly Arg Pro Leu Thr Met His Phe Gly Pro His Glu Val Leu Val245 250 255Val Leu Arg Ile Glu Phe Asp Ala Ala Leu Thr Ala Ser Gly Val Ala260 265 270Glu Ala Ile Glu Arg Ile Glu Thr Arg Ile Arg Ser Glu Arg Pro Asp275 280 285Val Lys His Ile Tyr Val Glu Ala Arg Ser Leu His Gln Arg Ala Arg290 295 300Ala305<210>23<211>135<212>PRT<213>纤维堆囊菌<400>23Val Gln Thr Ser Ser Phe Asp Ala Arg Tyr Ala Gly Cys Lys Ser Ser1 5 10 15Arg Arg Ile Ala Arg Ser Gly Ser Ala Gly Ala Arg Ala Gly Arg Ala20 25 30His Glu Gly Ala Ala Ser Ala Gly Phe Glu Gly Gly Asp Val Met Arg35 40 45Lys Ala Arg Ala His Gly Ala Met Leu Gly Gly Arg Asp Asp Gly Trp50 55 60Arg Arg Gly Leu Pro Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ala Ala Leu Gln Arg65 70 75 80Gly Arg Ser Arg Asp Leu Ala Arg Arg Arg Leu Ile Ala Ser Val Ser85 90 95Leu Ala Gly Gly Ala Ser Met Ala Val Val Ser Leu Phe Gln Leu Gly100 105 110Ile Ile Glu Arg Leu Pro Asp Pro Pro Leu Pro Gly Phe Asp Ser Ala115 120 125
Lys Val Thr Ser Ser Asp Ile130 135<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述通用反向引物<400>24ggaaacagct atgaccatg 19<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述通用正向引物<400>25gtaaaacgac ggccagt17<210>26<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物NH24末端”B”<400>26gtgactggcg cctggaatct gcatgagc28
<210>27<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物NH2末端”A”<400>27agcgggagct tgctagacat tctgtttc 28<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物NH2末端”B”<400>28gacgcgcctc gggcagcgcc ccaa 24<210>29<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物pEPO15-NH6末端”B”<400>29caccgaagcg tcgatctggt ccatc 25<210>30<211>25
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述PCR引物pEPO15H2.7末端”A”<400>30cggtcagatc gacgacgggc tttcc 2权利要求
1.一种分离的核酸分子，其包含编码至少一种涉及epothilone生物合成的多肽的核苷酸序列。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是由粘细菌分离的。
3.权利要求2的分离的核酸分子，其中所述粘细菌是纤维堆囊菌。
4.包含与权利要求1的核酸分子可操作连接的异源启动子序列的嵌合基因。
5.包含权利要求4的嵌合基因的重组载体。
6.包含权利要求4的嵌合基因的重组宿主细胞。
7.权利要求6的重组宿主细胞，其是细菌。
8.权利要求7的重组宿主细胞，其是放线菌。
9.权利要求8的重组宿主细胞，其是链霉菌。
10.包含权利要求1的核酸分子的Bac克隆。
11.权利要求10的Bac克隆，其是pEPO15。
12.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQ ID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO3，SEQ ID NO3的氨基酸72-81，SEQ ID NO3的氨基酸118-125，SEQ ID NO3的氨基酸199-212，SEQ ID NO3的氨基酸353-363，SEQ ID NO3的氨基酸549-565，SEQ ID NO3的氨基酸588-603，SEQ ID NO3的氨基酸669-684，SEQ ID NO3的氨基酸815-821，SEQ ID NO3的氨基酸868-892，SEQ ID NO3的氨基酸903-912，SEQ ID NO3的氨基酸918-940，SEQ ID NO3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO3的氨基酸973-1256，SEQ ID NO3的氨基酸1344-1351，SEQ ID NO4，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQ ID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ IDNO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQID NO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6，SEQ ID NO6的氨基酸35-454，SEQ ID NO6的氨基酸561-881，SEQ ID NO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946，SEQ ID NO6的氨基酸2053-2373，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551，SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745，SEQ ID NO7，SEQ ID NO7的氨基酸32-450，SEQ ID NO7的氨基酸556-877，SEQ ID NO7的氨基酸887-1051，SEQ ID NO7的氨基酸1478-1790，SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055，SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164，SEQ ID NO7的氨基酸2165-2439，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，和SEQ ID NO22。
13.权利要求12的分离的核酸分子，其中所述多肽包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2，SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO3，SEQ ID NO3的氨基酸72-81，SEQ ID NO3的氨基酸118-125，SEQ ID NO3的氨基酸199-212，SEQ ID NO3的氨基酸353-363，SEQ ID NO3的氨基酸549-565，SEQ ID NO3的氨基酸588-603，SEQ ID NO3的氨基酸669-684，SEQ ID NO3的氨基酸815-821，SEQ ID NO3的氨基酸868-892，SEQ ID NO3的氨基酸903-912，SEQ ID NO3的氨基酸918-940，SEQ ID NO3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO3的氨基酸973-1256，SEQ ID NO3的氨基酸1344-1351，SEQ ID NO4，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQ IDNO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQID NO5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6，SEQ ID NO6的氨基酸35-454，SEQ IDNO6的氨基酸561-881，SEQ ID NO6的氨基酸1143-1393，SEQ IDNO6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946，SEQID NO6的氨基酸2053-2373，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551，SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745，SEQ ID NO7，SEQ ID NO7的氨基酸32-450，SEQ ID NO7的氨基酸556-877，SEQ ID NO7的氨基酸887-1051，SEQ ID NO7的氨基酸1478-1790，SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055，SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164，SEQ IDNO7的氨基酸2165-2439，SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ IDNO11，和SEQ ID NO22。
14.权利要求12的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸1900-3171的互补序列，SEQ ID NO1的核苷酸3415-5556，SEQ ID NO1的核苷酸7610-11875，SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQID NO1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQID NO1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924，SEQ ID NO1的核苷酸16251-21749，SEQID NO1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO1的核苷酸21746-43519，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQID NO1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸35042-35902，SEQID NO1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸43524-54920，SEQID NO1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，SEQID NO1的核苷酸54540-54758，SEQ ID NO1的核苷酸54935-62254，SEQ ID NO1的核苷酸55028-56284，SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565，SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254，SEQID NO1的核苷酸62369-63628，SEQ ID NO1的核苷酸67334-68251，和SEQ ID NO1的核苷酸1-68750。
15.权利要求12的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组SEQID NO1的核苷酸1900-3171的互补序列，SEQ ID NO1的核苷酸3415-5556，SEQ ID NO1的核苷酸7610-11875，SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQID NO1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO1的核苷酸14313-14334，SEQID NO1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924，SEQ ID NO1的核苷酸16251-21749，SEQ ID NO1的核苷酸16269-17546，SEQID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO1的核苷酸21746-43519，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO1的核苷酸26045-26263，SEQID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸43524-54920，SEQ ID NO1的核苷酸43626-44885，SEQID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，SEQID NO1的核苷酸54935-62254，SEQ ID NO1的核苷酸55028-56284，SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565，SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254，SEQ ID NO1的核苷酸62369-63628，SEQID NO1的核苷酸67334-68251，和SEQ ID NO1的核苷酸1-68750。
16.包含与权利要求12的核酸分子可操作连接的异源启动子序列的嵌合基因。
17.包含权利要求16的嵌合基因的重组载体。
18.包含权利要求16的嵌合基因的重组宿主细胞。
19.权利要求18的重组宿主细胞，其是细菌。
20.权利要求19的重组宿主细胞，其是放线菌。
21.权利要求20的重组宿主细胞，其是链霉菌。
22.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中连续的20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸1900-3171的互补序列，SEQ ID NO1的核苷酸3415-5556，SEQ ID NO1的核苷酸7610-11875，SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ IDNO1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQID NO1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924，SEQ ID NO1的核苷酸16251-21749，SEQID NO1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO1的核苷酸21746-43519，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQID NO1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸35042-35902，SEQID NO1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸43524-54920，SEQID NO1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，SEQID NO1的核苷酸54540-54758，SEQ ID NO1的核苷酸54935-62254，SEQ ID NO1的核苷酸55028-56284，SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565，SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087，SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304，SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099，SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426，SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254，SEQID NO1的核苷酸62369-63628，SEQ ID NO1的核苷酸67334-68251，和SEQ ID NO1的核苷酸1-68750。
23.包含与权利要求22的核酸分子可操作连接的异源启动子序列的嵌合基因。
24.包含权利要求23的嵌合基因的重组载体。
25.包含权利要求23的嵌合基因的重组宿主细胞。
26.权利要求25的重组宿主细胞，其是细菌。
27.权利要求26的重组宿主细胞，其是放线菌。
28.权利要求27的重组宿主细胞，其是链霉菌。
29.一种分离的核酸分子，其包含编码至少一个epothilone合酶结构域的核苷酸序列。
30.权利要求29的分离的核酸分子，其中所述epothilone合酶结构域是β-酮脂酰合酶结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO6的氨基酸35-454，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946，和SEQ ID NO7的氨基酸32-450。
31.权利要求30的分离的核酸分子，其中所述β-酮脂酰合酶结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO6的氨基酸35-454，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946，和SEQ ID NO7的氨基酸32-450。
32.权利要求30的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQID NO1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，和SEQ IDNO1的核苷酸55028-56284。
33.权利要求30的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中连续20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸43626-44885，SEQ ID NO1的核苷酸48087-49361，和SEQ ID NO1的核苷酸55028-56284。
34.权利要求30的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸7643-8920，SEQ ID NO1的核苷酸16269-17546，SEQ ID NO1的核苷酸21860-23116，SEQ ID NO1的核苷酸26318-27595，SEQ ID NO1的核苷酸30815-32092，SEQ ID NO1的核苷酸37052-38320，SEQ ID NO1的核苷酸43626-44885，SEQID NO1的核苷酸48087-49361，和SEQ ID NO1的核苷酸55028-56284。
35.权利要求29的分离的核酸分子，其中所述epothilone合酶结构域是酰基转移酶结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ IDNO5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO6的氨基酸561-881，SEQ IDNO6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO7的氨基酸556-877。
36.权利要求35的分离的核酸分子，其中所述酰基转移酶结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸543-864，SEQ IDNO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO5的氨基酸563-884，SEQ IDNO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQID NO5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO6的氨基酸561-881，SEQ ID NO6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO7的氨基酸556-877。
37.权利要求35的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，和SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565。
38.权利要求35的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中连续20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸45204-46166，SEQ ID NO1的核苷酸49680-50642，和SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565。
39.权利要求35的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸9236-10201，SEQ ID NO1的核苷酸17865-18827，SEQ ID NO1的核苷酸23431-24397，SEQ ID NO1的核苷酸27911-28876，SEQ ID NO1的核苷酸32408-33373，SEQ ID NO1的核苷酸38636-39598，SEQ ID NO1的核苷酸45204-46166，SEQID NO1的核苷酸49680-50642，和SEQ ID NO1的核苷酸56600-57565。
40.权利要求29的分离的核酸分子，其中所述epothilone合酶结构域是烯酰基还原酶结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，和SEQID NO7的氨基酸1478-1790。
41.权利要求40的分离的核酸分子，其中所述烯酰基还原酶结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，和SEQ ID NO7的氨基酸1478-1790。
42.权利要求40的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，和SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304。
43.权利要求40的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中连续20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ IDNO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，和SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304。
44.权利要求40的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸10529-11428，SEQ ID NO1的核苷酸35042-35902，SEQ ID NO1的核苷酸41369-42256，和SEQ ID NO1的核苷酸59366-60304。
45.权利要求29的分离的核酸分子，其中所述epothilone合酶结构域是酰基载体蛋白结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ IDNO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQID NO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164。
46.权利要求45的分离的核酸分子，其中所述酰基载体蛋白结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ ID NO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164。
47.权利要求45的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，和SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426。
48.权利要求45的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中连续20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQ IDNO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸36773-36991，SEQ ID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，和SEQ IDNO1的核苷酸61211-61426。
49.权利要求45的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸11549-11764，SEQ ID NO1的核苷酸21414-21626，SEQ ID NO1的核苷酸26045-26263，SEQ ID NO1的核苷酸30539-30759，SEQ ID NO1的核苷酸36773-36991，SEQID NO1的核苷酸43163-43378，SEQ ID NO1的核苷酸47811-48032，SEQ ID NO1的核苷酸54540-54758，和SEQ ID NO1的核苷酸61211-61426。
50.权利要求29的分离的核酸分子，其中所述epothilone合酶结构域是脱水酶结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551，和SEQ ID NO7的氨基酸887-1051。
51.权利要求50的分离的核酸分子，其中所述脱水酶结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ IDNO6的氨基酸2383-2551，和SEQ ID NO7的氨基酸887-1051。
52.权利要求50的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，和SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087。
53.权利要求50的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中连续20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ IDNO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQID NO1的核苷酸50670-51176，和SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087。
54.权利要求50的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸18855-19361，SEQ ID NO1的核苷酸33401-33889，SEQ ID NO1的核苷酸39635-40141，SEQ ID NO1的核苷酸50670-51176，和SEQ ID NO1的核苷酸57593-58087。
55.权利要求29的分离的核酸分子，其中所述epothilone合酶结构域是β-酮还原酶结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ IDNO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，和SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055。
56.权利要求55的分离的核酸分子，其中所述β-酮还原酶结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，和SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055。
57.权利要求55的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，和SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099。
58.权利要求55的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中连续20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ IDNO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQ ID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，和SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099。
59.权利要求55的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸20565-21302，SEQ ID NO1的核苷酸25184-25942，SEQ ID NO1的核苷酸29678-30429，SEQ ID NO1的核苷酸35930-36667，SEQ ID NO1的核苷酸42314-43048，SEQID NO1的核苷酸46950-47702，SEQ ID NO1的核苷酸53697-54431，和SEQ ID NO1的核苷酸60362-61099。
60.权利要求29的分离的核酸分子，其中所述epothilone合酶结构域是甲基转移酶结构域，其包含与SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045基本相似的氨基酸序列。
61.权利要求60的分离的核酸分子，其中所述甲基转移酶结构域包含SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045。
62.权利要求60的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQID NO1的核苷酸51534-52657基本相似。
63.权利要求60的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO1的核苷酸51534-52657中连续20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分。
64.权利要求60的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是SEQID NO1的核苷酸51534-52657。
65.权利要求29的分离的核酸分子，其中所述epothilone合酶结构域是硫酯酶结构域，其包含与SEQ ID NO7的氨基酸2165-2439基本相似的氨基酸序列。
66.权利要求65的分离的核酸分子，其中所述硫酯酶结构域包含SEQ ID NO7的氨基酸2165-2439。
67.权利要求65的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与SEQID NO1的核苷酸61427-62254基本相似。
68.权利要求65的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO1的核苷酸61427-62254中连续20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分。
69.权利要求65的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是SEQID NO1的核苷酸61427-62254。
70.一种分离的核酸分子，其包含编码非核糖体肽合成酶的核苷酸序列，其中所述非核糖体肽合成酶包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO3的氨基酸72-81，SEQ ID NO3的氨基酸118-125，SEQ ID NO3的氨基酸199-212，SEQ ID NO3的氨基酸353-363，SEQ ID NO3的氨基酸549-565，SEQ ID NO3的氨基酸588-603，SEQ ID NO3的氨基酸669-684，SEQ ID NO3的氨基酸815-821，SEQ ID NO3的氨基酸868-892，SEQ ID NO3的氨基酸903-912，SEQ ID NO3的氨基酸918-940，SEQ ID NO3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO3的氨基酸973-1256，和SEQ ID NO3的氨基酸1344-1351。
71.权利要求79的分离的核酸分子，其中所述非核糖体肽合成酶包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO3的氨基酸72-81，SEQ ID NO3的氨基酸118-125，SEQ ID NO3的氨基酸199-212，SEQ ID NO3的氨基酸353-363，SEQ ID NO3的氨基酸549-565，SEQ ID NO3的氨基酸588-603，SEQ ID NO3的氨基酸669-684，SEQ ID NO3的氨基酸815-821，SEQ ID NO3的氨基酸868-892，SEQ ID NO3的氨基酸903-912，SEQ ID NO3的氨基酸918-940，SEQ ID NO3的氨基酸1268-1274，SEQ ID NO3的氨基酸1285-1297，SEQ ID NO3的氨基酸973-1256，和SEQ IDNO3的氨基酸1344-1351。
72.权利要求70的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列基本相似SEQ ID NO1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQID NO1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，和SEQ IDNO1的核苷酸15901-15924。
73.权利要求70的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含与选自下组的核苷酸序列中连续20个碱基对的部分序列相同的连续20个碱基对核苷酸部分SEQ ID NO1的核苷酸11872-16104，SEQ IDNO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQ ID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO1的核苷酸14473-14547，SEQID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQ ID NO1的核苷酸14788-15639，和SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924。
74.权利要求70的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自下组SEQ ID NO1的核苷酸11872-16104，SEQ ID NO1的核苷酸12085-12114，SEQ ID NO1的核苷酸12223-12246，SEQ ID NO1的核苷酸12466-12507，SEQ ID NO1的核苷酸12928-12960，SEQID NO1的核苷酸13516-13566，SEQ ID NO1的核苷酸13633-13680，SEQ ID NO1的核苷酸13876-13923，SEQ ID NO1的核苷酸14313-14334，SEQ ID NO1的核苷酸14473-14547，SEQ ID NO1的核苷酸14578-14607，SEQ ID NO1的核苷酸14623-14692，SEQ ID NO1的核苷酸15673-15693，SEQ ID NO1的核苷酸15724-15762，SEQID NO1的核苷酸14788-15639，和SEQ ID NO1的核苷酸15901-15924。
75.在重组宿主中异源表达epothilone的方法，包括a)将权利要求4的嵌合基因导入宿主；和b)在适合宿主生物合成epothilone的条件下培养宿主。
76.生产epothilone的方法，包括c)用权利要求75的方法在重组宿主中表达epothilone；和d)从重组宿主中提取epothilone。
77.一种分离的多肽，其包含由epothilone合酶结构域组成的氨基酸序列。
78.权利要求77的分离的多肽，其中所述epothilone合酶结构域是β-酮脂酰合酶结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQ ID NO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ ID NO5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO6的氨基酸35-454，SEQ ID NO6的氨基酸1522-1946，和SEQ ID NO7的氨基酸32-450。
79.权利要求78的分离的多肽，其中所述β-酮脂酰合酶结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸11-437，SEQ IDNO4的氨基酸7-432，SEQ ID NO5的氨基酸39-457，SEQ ID NO5的氨基酸1524-1950，SEQ ID NO5的氨基酸3024-3449，SEQ IDNO5的氨基酸5103-5525，SEQ ID NO6的氨基酸35-454，SEQ IDNO6的氨基酸1522-1946，和SEQ ID NO7的氨基酸32-450。
80.权利要求77的分离的多肽，其中所述epothilone合酶结构域是酰基转移酶结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ ID NO5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO6的氨基酸561-881，SEQ ID NO6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO7的氨基酸556-877。
81.权利要求80的分离的多肽，其中所述酰基转移酶结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸543-864，SEQ ID NO4的氨基酸539-859，SEQ ID NO5的氨基酸563-884，SEQ ID NO5的氨基酸2056-2377，SEQ ID NO5的氨基酸3555-3876，SEQ IDNO5的氨基酸5631-5951，SEQ ID NO6的氨基酸561-881，SEQ IDNO6的氨基酸2053-2373，和SEQ ID NO7的氨基酸556-877。
82.权利要求77的分离的多肽，其中所述epothilone合酶结构域是烯酰还原酶结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，和SEQ ID NO7的氨基酸1478-1790。
83.权利要求82的分离的多肽，其中所述烯酰还原酶结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸974-1273，SEQ ID NO5的氨基酸4433-4719，SEQ ID NO5的氨基酸6542-6837，和SEQID NO7的氨基酸1478-1790。
84.权利要求77的分离的多肽，其中所述epothilone合酶结构域是酰基载体蛋白结构域，所述多肽包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ ID NO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQ IDNO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQID NO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164。
85.权利要求84的分离的多肽，其中所述酰基载体蛋白结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO2的氨基酸1314-1385，SEQ IDNO4的氨基酸1722-1792，SEQ ID NO5的氨基酸1434-1506，SEQID NO5的氨基酸2932-3005，SEQ ID NO5的氨基酸5010-5082，SEQ ID NO5的氨基酸7140-7211，SEQ ID NO6的氨基酸1430-1503，SEQ ID NO6的氨基酸3673-3745，和SEQ ID NO7的氨基酸2093-2164。
86.权利要求77的分离的多肽，其中所述epothilone合酶结构域是脱水酶结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ ID NO6的氨基酸2383-2551，和SEQ ID NO7的氨基酸887-1051。
87.权利要求86的分离的多肽，其中所述脱水酶结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸869-1037，SEQ ID NO5的氨基酸3886-4048，SEQ ID NO5的氨基酸5964-6132，SEQ IDNO6的氨基酸2383-2551，和SEQ ID NO7的氨基酸887-1051。
88.权利要求77的分离的多肽，其中所述epothilone合酶结构域是β-酮还原酶结构域，其包含与选自下组的氨基酸序列基本相似的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ ID NO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQ ID NO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ IDNO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，和SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055。
89.权利要求88的分离的多肽，其中所述β-酮还原酶结构域包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO4的氨基酸1439-1684，SEQ IDNO5的氨基酸1147-1399，SEQ ID NO5的氨基酸2645-2895，SEQID NO5的氨基酸4729-4974，SEQ ID NO5的氨基酸6857-7101，SEQ ID NO6的氨基酸1143-1393，SEQ ID NO6的氨基酸3392-3636，和SEQ ID NO7的氨基酸1810-2055。
90.权利要求77的分离的多肽，其中所述epothilone合酶结构域是甲基转移酶结构域，其包含与SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045基本相似的氨基酸序列。
91.权利要求90的分离的多肽，其中所述甲基转移酶结构域包含SEQ ID NO6的氨基酸2671-3045。
92.权利要求77的分离的多肽，其中所述epothilone合酶结构域是硫酯酶结构域，其包含与SEQ ID NO7的氨基酸2165-2439基本相似的氨基酸序列。
93.权利要求77的分离的多肽，其中所述硫酯酶结构域包含SEQ IDNO7的氨基酸2165-2439。
全文摘要
由纤维堆囊菌分离得到编码epothilone生物合成必需的多肽的核酸分子。还公开了用经本发明的基因转化的重组宿主生产epothilone的方法。用这种方法生产的epothilone，足够用于它们的纯化和在药用制剂(诸如治疗癌症)中的使用。
文档编号C12N15/74GK1715414SQ20041006379
公开日2006年1月4日 申请日期1999年6月16日 优先权日1998年6月18日
发明者T·斯彻普, J·M·利根, I·莫尔纳, R·泽克尔, J·戈拉彻, D·西尔 申请人:诺瓦提斯公司