专利名称：一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因及其制备方法
技术领域：
本发明属于食品工业生物技术领域。
背景技术：
谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase.E.C.2.3.2.13)，是一种催化蛋白质分子间或分子内形成ε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸共价键的酶，通过催化反应，可引起各种蛋白质分子内的交联、分子间的交联、蛋白质与氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解，被誉为生物体内‘天然的粘合剂’，在化妆品、皮革制品、纺织品工业，尤其是在食品加工领域有着广泛的用途。目前已从多种生物材料(包括动植物及微生物)中获得了谷氨酰胺转胺酶，微生物来源的谷氨酰胺转胺酶，因其生产不受季节和原料限制，是谷氨酰胺转胺酶家族中最有可能进行大规模生产应用的一种，尽管有多种微生物自然状态下能产谷氨酰胺转胺酶，但大多数的产酶量不高；而通过常规诱变育种技术进行育种，耗时费力，又很难筛选到产谷氨酰胺转胺酶高产菌株，这就造成了实际生产成本较高，限制了该酶的大规模工业化生产。
发明内容
本发明需要解决的问题是运用分子生物学技术和基因工程技术，将微生物谷氨酰胺转氨酶基因克隆至大肠杆菌，然后通过诱导基因高效率表达谷氨酰胺转氨酶，从而提高该酶的产量和降低该酶的生产成本。本发明的技术方案为1.本发明首先提供一种获得微生物谷氨酰胺转氨酶基因克隆的方法提取链霉菌属茂原链霉菌基因组DNA后，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出谷氨酰胺转氨酶全长基因。2.提供一种生产谷氨酰胺转氨酶原核表达系统构建的方法主要是利用含6-His标签的原核表达载体pQE30-xa和大肠杆菌JM109进行谷氨酰胺转氨酶基因的融合表达。3.提供重组谷氨酰胺转氨酶分离纯化的方法，主要是利用Ni-NTA柱亲和层析的方法获得高纯度的谷氨酰胺转氨酶。
本发明有益效果是重组后的谷氨酰胺转氨酶酶活性达到2.2U/ml，高于原始菌株2-3倍，且利用大肠杆菌摇瓶发酵生产该酶的工艺流程少，原料简单且价格低廉。而在一些对酶纯度要求不高的行业，诸如皮革制品、纺织品工业、饲料加工等行业，也可直接使用未经纯化的粗酶，这将大大降低这些行业的生产成本。譬如若利用未经纯化的重组谷胺酰胺转胺酶对酪蛋白进行改性研究发现，粗酶也可很好的交联酪蛋白，使之溶液粘度增加，乳化能力提高，发泡性下降另外，通过重组的谷胺酰胺转胺酶粘和小体型虾，获得了体积增大且经煎煮后也不易分离的重叠虾，大辐度提高了小体型虾的商品价值。总之，通过这一方法生产的重组谷胺酰胺转胺酶同非重组谷胺酰胺转胺酶一样可以广泛应用于化妆品行业、食品加工业等领域中。
四
图1 谷氨酰胺转氨酶基因的PCR扩增图2 用于生产重组谷氨酰胺转氨酶的表达载体pQE30xa-TGase图3 不同诱导培养时间下谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达A标准蛋白质分子量；B诱导培养12h；C诱导培养10h；D诱导培养8h；E诱导培养6h；F诱导培养4h；G诱导培养2h；H pQE30xa空白载体。
图4 亲和层析纯化后的重组谷胺酰胺转胺酶五具体实施方式
1.微生物谷氨酰胺转氨酶基因的分离克隆从茂原链霉菌(Streptomycesmobaraensis)提取基因组DNA为模板，具体DNA提取方法参照Promega说明书，根据相关谷氨酰胺转氨酶基因序列合成引物，用上下游引物TGP1(5’CGGGATCCATG CGC ATA CGC CGG AGA 3’)，TGP2(5’CG AAGCTT GCC AGC CCT GCT TTA CCTTG 3’)并在其5’端分别加入BamHI和HindIII酶切位点和相应的保护碱基，进行谷氨酰胺转氨酶基因全长的扩增，PCR扩增条件95℃预变性5min，94℃1min，55℃45s，72℃90s，35个循环，最后72℃延伸7min。制备1.2％TBE琼脂糖凝胶，取PCR扩增产物5uL与6×凝胶电泳上样缓冲液1uL混匀后电泳，电压5V/cm，电泳完毕后，在凝胶成像分析系统中观察结果并拍照，结果见附图1。利用DNA凝胶纯化试剂盒纯化回收1.2Kb的PCR产物，与克隆pUC-mT载体(上海博亚生物科技有限公司)进行连接。10ul连接反应体系为pUC-mT载体50ng，PCR产物50ng，1x连接缓冲液2μl，T4DNA连接酶3weiss，4℃连接过夜。连接产物转化感受态JM109细胞，并在在含有x-gal、IPTG及Amp的LB平板上进行重组子的筛选。挑选白色菌落，抽提质粒DNA后，一部分进行酶切和PCR鉴定，将重组质粒命名为pUC-mT-TGase；另外一部分送博亚公司进行目的片段序列的双向测定，测序最终结果如下序列atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga 40gtgcggtgtt atgcaccgcc ggattcatgc cgtcggccag 80gcgaggccgc cgccgacaat ggcgcggggg aaagagacga 120agtcctacgc cgaaacctac cgcctcacgg cggatgacgt 160cgcgaacatc aacgcgctca acgaaagcgc tccggccgct 200tcgagcgccg gcccgtcgtt ccgggccccc gactccgacg 240acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc 280cgacccgtac cgtccctcgt acggcagggc cgagacggtc 320gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc 360accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg 400ggagtggctg tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc 440aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt 480ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg 520caggccccgg tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc 560
cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag aagggcttcc 600agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct 640ggagaacgcc cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc 680aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc ctgcgcaacg 720aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac 760gccgtccttc aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg 800tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag cacttctgga 840gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta 880cggcgacccg gacgccttcc gctccgcccc gggcaccggt 920ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt ccgcgcagcc 960ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg 1000ctggttcggc gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc 1040gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg cccaatggca 1080gcctggggtg ccatgcatgt ctcacgagag caagttccgc 1120aactgggtcc gagggttact cggacttcga ccgcggggag 1160ccctatgtgg tatcaccctc tccatcccca agaatgctgg 1200aacaccgccc ccgacaaggt aaagcagggc tggcgtgatg 1240tgagcg 1246并将所获得的基因序列同已知微生物来源的谷氨酰胺转氨酶基因序列进行序列相似性比较后发现本试验获得的谷氨酰胺转氨酶基因与已知基因存在较高的同源性。
2.原核表达系统pQE30xa-TGase构建首先用BamHI和HindIII分别消化重组质粒(pUC-mT-TGase)和表达载体pQE30xa(Qiagen公司)，分别纯化回收后，T4DNA连接酶连接得到重组表达载体pQE30xa-TGase，见图2。转化受体菌JM109后，挑白色菌落，按照常规方法小量制备质粒DNA，利用酶切方法鉴定出阳性克隆。
3.重组谷氨酰胺转氨酶的提取将重组工程菌接种到LB液体培养基(含Amp，100mg/L)中，37℃培养过夜，按照1∶1000转接到新鲜LB液体培养基中(含Amp 100mg/L)，37℃振荡培养3-6h后，加1mol/L异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1mmol/L，诱导培养10h～12h后，见附图3，离心收集菌体，将获得菌体用5mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH6.5)洗一次，再溶于1/10体积的PBS中，加1mmol/L蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1mmol/L，超声波破碎(40％功率，破碎10min)。然后，10000r/min，4℃离心10min，上清液CM-纤维素层析后，进一步应用6xHis标签和Ni-NTA树脂纯化后，其纯度达90％以上。经过SDS-PAGE结果证明电泳的条带为一条，分子量45KD左右，且表达量较高，见附图4。谷氨酰胺转氨酶的酶活测定方法参照Folk提出的hydroxylamine比色法进行，即1个谷氨酰胺转氨酶酶活单位定义为pH6.0，37℃时，每分钟催化底物生成1mol CBZ-Glu(Gly)γ-单氧肟酸产物所需的酶量。重组后的谷氨酰胺转氨酶酶活性达到2.2U/ml，高于原始菌株2-3倍，且利用大肠杆菌摇瓶发酵生产该酶的工艺流程少，原料简单且价格低廉。而在一些对酶纯度要求不高的行业，诸如皮革制品、纺织品工业、饲料加工等行业，也可直接使用未经纯化的粗酶，这将大大降低这些行业的生产成本。譬如若利用未经纯化的重组谷胺酰胺转胺酶对酪蛋白进行改性研究发现，粗酶也可很好的交联酪蛋白，使之溶液粘度增加，乳化能力提高，发泡性下降；另外，通过重组的谷胺酰胺转胺酶粘和小体型虾，获得了体积增大且经煎煮后也不易分离的重叠虾，大辐度提高了小体型虾的商品价值。总之，通过这一方法生产的重组谷胺酰胺转胺酶同非重组谷胺酰胺转胺酶一样可以广泛应用于化妆品行业、食品加工业等领域中。
重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因序列表重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因序列表<110>南京大学<120>重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因<160>1<210>1<211>1246bp<212>DNA<213>人工序列<400>1atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga gtgcggtgtt atgcaccgcc 60ggattcatgc cgtcggccag gcgaggccgc cgccgacaat ggcgcggggg aaagagacga 120agtcctacgc cgaaacctac cgcctcacgg cggatgacgt cgcgaacatc aacgcgctca 180acgaaagcgc tccggccgct tcgagcgccg gcccgtcgtt ccgggccccc gactccgacg 240acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc cgacccgtac cgtccctcgt 300acggcagggc cgagacggtc gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc 360accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg ggagtggctg tcctacggct 420gcgtcggtgt cacctgggtc aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt 480ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg caggccccgg tccggcgaga 540cgcgggcgga gttcgagggc cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag aagggcttcc 600agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct ggagaacgcc cacgacgaga 660gcgcttacct cgacaacctc aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc ctgcgcaacg 720aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac gccgtccttc aaggagcgga 780acggaggcaa tcacgacccg tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag cacttctgga 840gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta cggcgacccg gacgccttcc 900gctccgcccc gggcaccggt ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt ccgcgcagcc 960ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg ctggttcggc gcccagacgg 1020aagcggacgc cgacaagacc gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg cccaatggca 1080gcctggggtg ccatgcatgt ctcacgagag caagttccgc aactgggtcc gagggttact 1140cggacttcga ccgcggggag ccctatgtgg tatcaccctc tccatcccca agaatgctgg 1200aacaccgccc ccgacaaggt aaagcagggc tggcgtgatg tgagcg 124权利要求
1.一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶基因，长度1246，其特征是1-180位的核苷酸为编码谷氨酰胺转氨酶基因前导肽的序列，该段序列与酶的跨膜运输和正确折叠有密切关系；420-422位的核苷酸为编码酶活性中心cys的序列；谷氨酰胺转氨酶全长基因序列为atgcgcatac gccggagagc tctcgtcttc gccactatga 40gtgcggtgtt atgcaccgcc ggattcatgc cgtcggccag 80gcgaggccgc cgccgacaat ggcgcggggg aaagagacga 120agtcctacgc cgaaacctac cgcctcacgg cggatgacgt 160cgcgaacatc aacgcgctca acgaaagcgc tccggccgct 200tcgagcgccg gcccgtcgtt ccgggccccc gactccgacg 240acagggtcac ccctcccgcc gagccgctcg acaggatgcc 280cgacccgtac cgtccctcgt acggcagggc cgagacggtc 320gtcaacaact acatacgcaa gtggcagcag gtctacagcc 360accgcgacgg caggaagcag cagatgaccg aggagcagcg 400ggagtggctg tcctacggct gcgtcggtgt cacctgggtc 440aattcgggtc agtacccgac gaacagactg gccttcgcgt 480ccttcgacga ggacaggttc aagaacgagc tgaagaacgg 520caggccccgg tccggcgaga cgcgggcgga gttcgagggc 560cgcgtcgcga aggagagctt cgacgaggag aagggcttcc 600agcgggcgcg tgaggtggcg tccgtcatga acagggccct 640ggagaacgcc cacgacgaga gcgcttacct cgacaacctc 680aagaaggaac tggcgaacgg caacgacgcc ctgcgcaacg 720aggacgcccg ttccccgttc tactcggcgc tgcggaacac 760gccgtccttc aaggagcgga acggaggcaa tcacgacccg 800tccaggatga aggccgtcat ctactcgaag cacttctgga 840gcggccagga ccggtcgagt tcggccgaca agaggaagta 880cggcgacccg gacgccttcc gctccgcccc gggcaccggt 920ctggtcgaca tgtcgaggga caggaacatt ccgcgcagcc 960ccaccagccc cggtgaggga ttcgtcaatt tcgactacgg 1000ctggttcggc gcccagacgg aagcggacgc cgacaagacc 1040gtctggaccc acggaaatca ctatcacgcg cccaatggca 1080gcctggggtg ccatgcatgt ctcacgagag caagttccgc 1120aactgggtcc gagggttact cggacttcga ccgcggggag 1160ccctatgtgg tatcaccctc tccatcccca agaatgctgg 1200aacaccgccc ccgacaaggt aaagcagggc tggcgtgatg 1240tgagcg 1246
2.根据权利要求1所述一种重组微生物谷氨酰胺转氨酶的制备方法，其特征是由以下步骤完成A微生物谷氨酰胺转氨酶的分离和克隆；B谷氨酰胺转氨酶基因原核表达载体构建；C谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达。
3.根据权利要求2所述的生产重组微生物谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征是获取谷氨酰胺转氨酶基因的具体步骤为(1)提取茂原链霉菌基因组DNA；(2)谷氨酰胺转氨酶基因的PCR扩增；(3)PCR产物的回收纯化；(4)谷氨酰胺转氨酶基因的T/A克隆；(5)谷氨酰胺转氨酶基因双脱氧终止法双向测序。
4.根据权利要求2所述的生产重组微生物谷氨酰胺转氨酶的方法，其特征是进行微生物谷氨酰胺转氨酶基因在大肠杆菌中表达的具体步骤为(1)原核表达载体构建(2)重组谷氨酰胺转氨酶的亲和层析分离纯化。
5.根据权利要求4所述的生产基因工程重组微生物谷氨酰胺转氨酶表达载体构建方法，其特征是将谷氨酰胺转氨酶基因正向插入表达载体pQE30-xa标签序列6-His之后，这样便于后期融合蛋白的鉴定和分离纯化。
6.根据权利要求4所述的生产重组微生物谷氨酰胺转氨酶的纯化方法，其特征是异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导标的的终浓度为0.1mmol/L，诱导的时间为10h～12h小时后，收集菌体超声破碎后，上清液先用CM-纤维素层析，再进一步利用6xHis标签和Ni-NTA树脂的特点，进行亲和层析分离纯化。
全文摘要
本发明属于食品工业生物技术领域，主要是利用分子生物学和基因工程技术，将来自茂原链霉菌的谷氨酰胺转氨酶基因克隆分离后，构建了含有该基因的重组原核表达载体pQE30xa－TGase，并在大肠杆菌JM109菌株中获得了表达，表达产物经过亲和层析分离纯化后，可以得到纯度为90％左右的重组谷氨酰胺转氨酶，重组后的谷氨酰胺转氨酶酶活性达到2.2U/ml，高于原始菌株2－3倍。利用该酶进行酪蛋白改性和重叠虾的制作均取得良好效果。由于本发明利用大肠杆菌生产谷氨酰胺转氨酶，操作简单，产酶活性较高，生产成本低，表达的酶易于分离纯化，可为今后谷氨酰胺转氨酶的生产提供一条切实可行的途径。
文档编号C12N15/09GK1796561SQ20041006580
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月20日 优先权日2004年12月20日
发明者田兴军, 张智俊, 李亚玲 申请人:南京大学