甘蓝型油菜抗厌氧烯醇酶蛋白编码序列的制作方法

专利名称：甘蓝型油菜抗厌氧烯醇酶蛋白编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种用于生物及基因工程技术领域的编码序列。特别涉及一种甘蓝型油菜抗厌氧烯醇酶蛋白编码序列。
背景技术：
糖酵解(glycolysis)是细胞能力代谢的一个组成部分，它几乎存在于所有类型的细胞中，无论是原核细胞还是真核细胞。在厌氧胁迫条件下，许多植物的碳水化合物代谢途径从氧化模式转为糖酵解途径，以满足植物缺氧条件下的能量代谢。胁迫条件诱导了几个蛋白的合成参与到糖酵解途径中，如烯醇酶、醛羧酶、丙酮酸脱羧酶等。烯醇酶是糖酵解过程中唯一的一个脱水步骤，主要催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇式丙酮酸，随后在丙酮酸激酶的催化作用下形成烯醇式丙酮酸，丙酮酸进入线粒体开始三羧酸循环。
经对现有技术文献检索中发现杂志《Plant Science(植物科学)》在1999，14641-51发表了文章“Transcript levels of genes encoding variousglycolytic and fermentation enzymes change in response to abiotic stresses(编码糖酵解酶基因在厌氧胁迫条件下的转录水平变化)”，该文献虽然对糖酵解途径中的关键酶烯醇酶基因Enolase在耐盐、干旱、高温胁迫处理下的表达做了充分肯定，但截止目前的报道显示该基因的转基因烟草植株的耐盐、抗旱和温度胁迫方面的效果没有明显提高，此外至今尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种甘蓝型油菜抗厌氧烯醇酶蛋白编码序列，使其在植物细胞抗厌氧胁迫上具有明显的作用，能够明显提高植物细胞在缺氧条件下的抗性，降低厌氧胁迫对植物的损害。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明分离出的DNA分子，该分子包括编码具有甘蓝型油菜烯醇酶蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第20-1354位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第20-1354位的核苷酸序列杂交。
所述的编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
所述的编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第20-1354位的核苷酸序列。
本发明分离出的甘蓝型油菜抗厌氧胁迫类相关蛋白质多肽Enolase，它包括具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽，较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，该多肽能够在盐、低温、水淹和脱落酸(ABA)处理下均能发挥作用，而这些逆境胁迫均可引起植物体氧化代谢途径的转换。
本发明提供的载体，它包含上述的DNA分子。一种核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
本发明用上述DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。
在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗厌氧胁迫蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有甘蓝型油菜Enolase蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第20-1354位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第20-1354位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第20-1354位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下(70％-85％一致性)，更佳的在高度严紧条件下(85％以上一致性)与SEQ ID NO.3中从核苷酸第20-1354位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第20-1354位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的甘蓝型油菜Enolase相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“甘蓝型油菜抗厌氧胁迫蛋白或多肽”指具有甘蓝型油菜Enolase蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然甘蓝型油菜Enolase相关相同功能的、SEQ ID NO.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括甘蓝型油菜Enolase蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的甘蓝型油菜Enolase多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与甘蓝型油菜Enolase相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用甘蓝型油菜Enolase多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“甘蓝型油菜Enolase保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1


表291％identity in 1334nt overlapQuery1tctagatctactcgaaaccatggccactatcaccgtcgttaaggctaggcagatcttcga 60|||||||||||||| | ||||| ||||||||||| ||||||||||| ||||||||||Sbjct65 tctagatctactcg---ctatggctactatcaccgttgttaaggctagacagatcttcga 121Query61 cagtcgtggcaatcccacggttgaggttgatgtccacacatcaagtggtgtcaaggtcac 120||||||||| ||||||| ||||||||| ||||||| |||| |||| | ||||| ||Sbjct122 cagtcgtggtaatcccaccgttgaggttgatatccacacgtcaaatggtattaaggttac 181Query121 tgctgctgttccgagtggagcttccactggtatctacgaggctcttgggcttagggatgg 180|| |||||||| ||||||||||||||||||||||| |||||||||| ||| ||||||||Sbjct182 agcagctgttccaagtggagcttccactggtatctatgaggctcttgagctgagggatgg 241Query181 tggatctgattatctcggaaagggtgcttctaaggctgttggtaatgtgaacaacatcat 240|||||||| || || |||||||||| ||||||||||||| ||||||||||||||||||Sbjct242 aggatctgactaccttggaaagggtgtatctaaggctgttggcaatgtgaacaacatcat 301Query241 cggcccagcgttgattggaaaggacccgactcagcagactgctattgacaacttcatggt 300||| ||||| | |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct302 cgggccagcacttattggaaaggacccaactcagcagactgctattgacaacttcatggt 361Query301 ccatgaacttgatggaacccagaacgagtggggttggtgcaagcaaaagcttggagccaa 360|||||||||||| |||||||| ||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||Sbjct362 ccatgaacttgacggaacccaaaacgagtgggggtggtgcaagcaaaagcttggagccaa 421Query361 tgccatccttgctgtgtcccttgctgtttgcaaagctggggccgttgtcagtggcattcc 420
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Sbjct1202 gggagtgatgaccagccacagaagtggtgaaaccgaggacacattcattgctgacttagc 1261Query1201 cgttggcttgtctactggacaaatcaagactggagctccttgcagatccgagcgtcttgc 1260|||||||||||| |||||||||||||| || || ||||||||||||||||||||||||||Sbjct1262 cgttggcttgtccactggacaaatcaaaaccggtgctccttgcagatccgagcgtcttgc 1321Query1261 caagtacaaccagcttttgcgtattgaagaggagttgggatcagaggcagtttacgctgg 1320||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| ||||||||||Sbjct1322 caagtacaaccagcttttgcgtattgaggaggagttgggatcagaggcaatttacgctgg 1381Query1321 agctaacttccgcaagcctgtggagccgtacta 1353|| ||||||||||| |||||||| || |||||Sbjct1382 agtcaacttccgcaaacctgtggaaccctacta 1414Query甘蓝型油菜Enolase的核酸序列Sbjct拟南芥Enolase的核酸序列(NM_129209)表2为本发明的甘蓝型油菜Enolase蛋白与拟南芥Enolase蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。
表395％identity in 444aa overlap，97％similarity in 444aa overlapQuery20 MATITAVKARQIFDSRGNPTVEVDVHTSSGVKVTAAVPSGASTGIYEALELRDGGSDYLG 199MATIT VKARQIFDSRGNPTVEVD+HTS+G+KVTAAVPSGASTGIYEALELRDGGSDYLGSbjct1MATITVVKARQIFDSRGNPTVEVDIHTSNGIKVTAAVPSGASTGIYEALELRDGGSDYLG 60Query200 KGVSKAVGNVNSIIGPASIGKDPTQQTAIDNFMVHELDGTQNEWGWCKQKLGANAILAVS 379KGVSKAVGNVN+IIGPA IGKDPTQQTAIDNFMVHELDGTQNEWGWCKQKLGANAILAVSSbjct61 KGVSKAVGNVNNIIGPALIGKDPTQQTAIDNFMVHELDGTQNEWGWCKQKLGANAILAVS 120Query380 LAVCKAGAVVSGIPLYKHIANLAGNPKIVLPVPAFNVINGGSHAGNKLAMQEFMILPVGA 559LAVCKAGAVVSGIPLYKHIANLAGNPKIVLPVPAFNVINGGSHAGNKLAMQEFMILPVGASbjct121 LAVCKAGAVVSGIPLYKHIANLAGNPKIVLPVPAFNVINGGSHAGNKLAMQEFMILPVGA 180Query560 SSFKEAMKMGVEVYHNLKSVIKKKYGQDATNVGDEGGFAPNIQENKEGLELLKTAIEKAG 739+SFKEAMKMGVEVYH+LKSVIKKKYGQDATNVGDEGGFAPNIQENKEGLELLKTAIEKAGSbjct181 ASFKEAMKMGVEVYHHLKSVIKKKYGQDATNVGDEGGFAPNIQENKEGLELLKTAIEKAG 240Query740 YTGKVVIGMDVAASEFYSSDKTYDLNFKEENNNGSQKISGDALKDLYKSFVAEYPIVSIE 919YTGKVVIGMDVAASEFYS DKTYDLNFKEENNNGSQKISGDALKDLYKSFVAEYPIVSIESbjct241 YTGKVVIGMDVAASEFYSEDKTYDLNFKEENNNGSQKISGDALKDLYKSFVAEYPIVSIE 300Query920 DPFDQDDWEHYAKMTAECGDNVQIVGDDLLVTNPKGVAKAIAEKSCNALLLKVNQIGSVT 1099DPFDQDDWEHYAKMT ECG VQIVGDDLLVTNPK VAKAIAEKSCNALLLKVNQIGSVTSbjct301 DPFDQDDWEHYAKMTTECGTEVQIVGDDLLVTNPKRVAKAIAEKSCNALLLKVNQIGSVT 360Query1100 ESIEAVKMSKRAGWGVMASHRSGETEDTFIADLSVGLSTGQIKTGAPCRSERLAKYNQLL 1279ESIEAVKMSK+AGWGVM SHRSGETEDTFIADL+VGLSTGQIKTGAPCRSERLAKYNQLLSbjct361 ESIEAVKMSKKAGWGVMTSHRSGETEDTFIADLAVGLSTGQIKTGAPCRSERLAKYNQLL 420
Query1280 RIEEELGSEAVYAGANFRKPVEPY 1351RIEEELGSEA+YAG NFRKPVEPYSbjct421 RIEEELGSEAIYAGVNFRKPVEPY 444Query甘蓝型油菜Enolase的氨基酸序列Sbjct拟南芥Enolase的氨基酸序列(NP_181192)表3为本发明的甘蓝型油菜Enolase蛋白与拟南芥Enolase蛋白的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
发明甘蓝型油菜Enolase蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然甘蓝型油菜Enolase相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的甘蓝型油菜Enolase多肽时，可以将甘蓝型油菜Enolase编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成甘蓝型油菜Enolase蛋白表达载体。
如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法技术分析甘蓝型油菜Enolase基因产物的表达，即分析甘蓝型油菜Enolase的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明提供的可用作探针的核酸分子，该分子通常具有甘蓝型油菜Enolase核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码甘蓝型油菜Enolase相关的核酸分子。
本发明的检测样品中是否存在甘蓝型油菜Enolase相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于甘蓝型油菜Enolase相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的甘蓝型油菜Enolase核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选甘蓝型油菜Enolase相关同源基因或同源蛋白。
为了得到与甘蓝型油菜Enolase相关基因相关的甘蓝型油菜cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选甘蓝型油菜cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用32P对甘蓝型油菜Enolase相关的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自甘蓝型油菜的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与甘蓝型油菜Enolase相关相关的基因家族的核苷酸序列。
本发明的甘蓝型油菜Enolase相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的甘蓝型油菜Enolase蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与甘蓝型油菜Enolase相关发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种甘蓝型油菜烯醇酶(Enolase)蛋白编码序列，使其在植物细胞抗厌氧胁迫上具有明显的作用，本发明具有实质性特点和显著进步，本发明在植物细胞抗厌氧胁迫上具有明显的作用，能够明显提高植物细胞缺氧条件下的抗性，降低厌氧胁迫对植物的损害。因此，本发明具有很大的应用价值。
具体实施例方式
下面结合实验室试验具体数据，以具体实施例来进一步阐述本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1甘蓝型油菜Enolase基因的克隆1.组织分离(isolation)将甘蓝型油菜(品种为“沪油15”)种子置于28℃发芽24小时，然后播种于温室中，待甘蓝型油菜叶片为3-5片时，准备抽取DNA或RNA。
2.RNA的分离(RNA isolation)取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(CTAB法)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)根据拟南芥Enolase基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1)RT-PCRPCR[MA001(SEQ ID NO.1)+MA002(SEQ ID NO.2)]得到630bp的片段，回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(GeneBank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis assulta)Enolase基因的同源性很高，故初步认为它是一个Enolase基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+MA301(5’-GACCCATTTGACCAAGATGA-3’)]得到MA3’(705bp)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(GeneBank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知十字花科植物如拟南芥(Arabidopsis assulta)Enolase基因的同源性很高，故初步认为它是一个与烯醇酶Enolase相关的基因。
(3)5’-RACE第一轮PCR[AAP+MA501(5’-TGTGCTTGTAGAGAGGAATG-3’)]第二轮PCR[(AUAP+MA502(5’-GACAACGGCCCCAGCTTTGC-3’))得到MA5’(约354bp)(过程同(1))将测序结果的重叠区拼接，发现过程(1)得到的片段既是该基因的完整编码区。
BLAST的结果证明从甘蓝型甘蓝型油菜中新得到的基因确为一个与拟南芥Enolase相关的基因。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的甘蓝型油菜Enolase蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。
实施例2甘蓝型油菜Enolase基因的序列信息与同源性分析本发明新的甘蓝型油菜Enolase全长cDNA的长度为1624bp，详细序列见SEQID NO.3，其中开放读框位于20-1354位核苷酸(1335个核苷酸)。根据全长cDNA推导出甘蓝型油菜Enolase的氨基酸序列，共444个氨基酸残基，分子量为47380.23道尔顿，等电点(pI)为5.78。详细序列见SEQ ID NO.3。
将甘蓝型油菜Enolase的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与拟南芥基因Enolase(NM_129209)在核苷酸水平上具有91％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与拟南芥Enolase基因(NP_181192)也有95％的相同性(附表3)。由此可见，甘蓝型油菜基因Enolase与拟南芥基因Enolase无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。拟南芥基因Enolase(NM_129209)已经被证明在厌氧胁迫条件下明显增强表达，并发挥着重要的作用，可以认为甘蓝型油菜基因Enolase在抗厌氧胁迫方面也具有相似的作用。
实施例3甘蓝型油菜基因Enolase蛋白或多肽在烟草中进行真核细胞表达及转基因植株的抗厌氧性鉴定含目的基因(甘蓝型油菜基因Enolase)的表达载体的构建根据甘蓝型油菜基因Enolase的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将甘蓝型油菜基因Enolase cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。
1.发苗种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用0.1％升汞消毒10-12分钟。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干，放入MS培养基。光照培养5天，待苗长到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1厘米的下胚轴小片段放入预培养基，培养2天。
预培养基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)3.转化共培养将预培养2天的下胚轴放入事先培养好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分钟。接着取出放入预培养基暗培养2天。
4.筛选培养共培养结束后，将外植体放入筛选培养基。2周继代一次。2-4周有愈伤组织形成和芽的分化。待绿芽长到2厘米后，切下生根。
筛选培养基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)生根培养基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.转化植株培养；待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。
含甘蓝型油菜基因Enolase的转基因烟草植株的抗厌氧性鉴定鉴于编码Enolase，如拟南芥的Enolase基因已被证明在抗厌氧胁迫方面发挥作用，而甘蓝型油菜基因Enolase转录水平与拟南芥的Enolase具有较高的同源性，可进一步对含甘蓝型油菜基因Enolase的转基因烟草植株进行抗厌氧鉴定。用100mM氯化钠和4℃低温处理转基因植株和转基因植株的种子(2m、15m、30m、1小时、3小时、7小时、12小时、24小时)后研究Enolase基因在转基因植株中的表达情况以及各种处理对植株的生长情况。Northern blot分析结果证明，转基因植株Enolase转录水平在低温处理后其表达量下降，盐处理后其表达量显著增强，而对照非转基因植株虽表达量也有变化，但明显低于转基因植株。此外非转基因植株生长缓慢，最后在盐和低温处理下枯萎而死，转基因植物依然能正常生长，只是比未经处理的植株生长稍慢。这证明甘蓝型甘蓝型油菜基因Enolase比拟南芥的Enolase基因具有更有效的和更广泛的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良植物抗厌氧的研究和产业化生产中。
实施例4甘蓝型油菜基因Enolase在甘蓝型油菜中的拷贝数分析采用常规方法从甘蓝型油菜叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用BamH、XhoI和KpnI酶切DNA[20μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我们将Enolase基因编码区标记为探针，然后进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。结果(Southern blot)发现在杂交膜上出现一至五条不同的杂交条带，说明Enolase基因在甘蓝型油菜中是低拷贝基因。
实施例5甘蓝型油菜基因Enolase在低温和盐胁迫条件下的不同时间处理的表达谱分析1.RNA的提取将生长了3-5片叶的甘蓝型油菜幼苗经100mM NaCl和低温处理30m、1小时、3小时、7小时、12小时、24小时和48小时，然后用TRIzol试剂盒(GIBCOBRL，USA)提取并参考《分子克隆》有关RNA的制备章节(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD260；RNA含量计算1 OD260＝40μg/ml。
3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离1)取6ml 25*(倍)电泳缓冲液，加入117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(20μg)溶解于RNA变性溶液中，在65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2ul 10*上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳5小时左右。
4.RNA尼龙膜上转移1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤2小时。
5.膜上杂交信号的检出1)将膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA]，65℃下预杂交2小时。2)将用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module标记的探针在沸水中变性5分钟，直接加入1)的杂交液中，于65℃杂交16-24小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分钟。4)用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIGlabeled试剂盒说明书)。Northern杂交表明随着盐和低温处理时间的延长，Enolase的表达分别逐步增强和减弱，说明Enolase是逆境信号如低温和盐诱导表达的，在甘蓝型油菜抗厌氧胁迫中扮演重要的角色。
本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1TGG TGC AAG CAA AAG CTT GG(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度20bp
(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2GGT CAT CTT AGC ATA GTG CT(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度1624bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.3<110>上海交通大学<120>甘蓝型油菜烯醇酶蛋白编码序列<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1624<212>DNA<213>甘蓝型油菜(Brassica napus L.)<220>
<221>CDS<222>(20)..(1354)<223>
<400>1tctagatcta ctcgaaacc atg gcc act atc acc gtc gtt aag gct agg cag52Met Ala Thr Ile Thr Val Val Lys Ala Arg Gln1 5 10atc ttc gac agt cgt ggc aat ccc acg gtt gag gtt gat gtc cac aca100Ile Phe Asp Ser Arg Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Val His Thr15 20 25tca agt ggt gtc aag gtc act gct gct gtt ccg agt gga gct tcc act148Ser Ser Gly Val Lys Val Thr Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr30 35 40ggt atc tac gag gct ctt ggg ctt agg gat ggt gga tct gat tat ctc196Gly Ile Tyr Glu Ala Leu Gly Leu Arg Asp Gly Gly Ser Asp Tyr Leu45 50 55gga aag ggt gct tct aag gct gtt ggt aat gtg aac aac atc atc ggc244Gly Lys Gly Ala Ser Lys Ala Val Gly Asn Val Asn Asn Ile Ile Gly60 65 70 75cca gcg ttg att gga aag gac ccg act cag cag act gct att gac aac292Pro Ala Leu Ile Gly Lys Asp Pro Thr Gln Gln Thr Ala Ile Asp Asn80 85 90
ttc atg gtc cat gaa ctt gat gga acc cag aac gag tgg ggt tgg tgc340Phe Met Val His Glu Leu Asp Gly Thr Gln Asn Glu Trp Gly Trp Cys95 100 105aag caa aag ctt gga gcc aat gcc atc ctt gct gtg tcc ctt gct gtt388Lys Gln Lys Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu Ala Val Ser Leu Ala Val110 115 120tgc aaa gct ggg gcc gtt gtc agt ggc att cct ctc tac aag cac att436Cys Lys Ala Gly Ala Val Val Ser Gly Ile Pro Leu Tyr Lys His Ile125 130 135gcc aac ctt gct ggt aac cct aaa att gtg cta cca gtt ccc gct ttc484Ala Asn Leu Ala Gly Asn Pro Lys Ile Val Leu Pro Val Pro Ala Phe140 145 150 155aac gtc atc aat ggt gga tta cat gca gga aac aag ctc gct atg cag532Asn Val Ile Asn Gly Gly Leu His Ala Gly Asn Lys Leu Ala Met Gln160 165 170gag ttt atg att ctc cct gtt gga gct tca tct ttc aaa gaa gcc atg580Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly Ala Ser Ser Phe Lys Glu Ala Met175 180 185aaa atg ggt gtt gaa gtt tac cac aac ttg aag tct gtg atc aag aag628Lys Met Gly Val Glu Val Tyr His Asn Leu Lys Ser Val Ile Lys Lys190 195 200
aag tat ggc cag gat gct acc aac gtt ggt gat gaa ggt ggc ttt gca676Lys Tyr Gly Gln Asp Ala Thr Asn Val Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala205 210 215cca aac att cag gag aac aag gaa ggt ctt gaa ttg ctt aag act gcc724Pro Asn Ile Gln Glu Asn Lys Glu Gly Leu Glu Leu Leu Lys Thr Ala220 225 230 235att gaa aag gct ggc tac act ggc aag gtt gtc att gga atg gat gtt772Ile Glu Lys Ala Gly Tyr Thr Gly Lys Val Val Ile Gly Met Asp Val240 245 250gcc gct tca gag ttc tac tca tca gac aag acc tac gac ttg aac tcc820Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Ser Ser Asp Lys Thr Tyr Asp Leu Asn Ser255 260 265aaa gaa gag aac aac aat ggc tct cag aag att tct ggt gat gca cta868Lys Glu Glu Asn Asn Asn Gly Ser Gln Lys Ile Ser Gly Asp Ala Leu270 275 280aag ggc ctc tac aag tcc ttt gtc tct gag tac cca att gtg tcc att916Lys Gly Leu Tyr Lys Ser Phe Val Ser Glu Tyr Pro Ile Val Ser Ile285 290 295gag gac cca ttt gac caa gat gac tgg gag cac tat gct aag atg acc964Glu Asp Pro Phe Asp Gln Asp Asp Trp Glu His Tyr Ala Lys Met Thr300 305 310 315gcc gag tgt gga gac aat gtt cag att gtc ggt gat gat ttg ttg gtc 1012
Ala Glu Cys Gly Asp Asn Val Gln Ile Val Gly Asp Asp Leu Leu Val320 325 330acc aac ccc aag aga gtt gcc aag gca atc gca gaa aag tct tgc aat1060Thr Asn Pro Lys Arg Val Ala Lys Ala Ile Ala Glu Lys Ser Cys Asn335 340 345gct ctt ctc ttg aag gtt aat caa atc ggg tca gta aca gag agt att1108Ala Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser Val Thr Glu Ser Ile350 355 360gag gca gtg aag atg tca aag aga gca gga tgg gga gtg atg gct agc1156Glu Ala Val Lys Met Ser Lys Arg Ala Gly Trp Gly Val Met Ala Ser365 370 375cac cga agt ggt gaa acc gag gac acc ttc atc gct gac tta tcc gtt1204His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala Asp Leu Ser Val380 385 390 395ggc ttg tct act gga caa atc aag act gga gct cct tgc aga tcc gag1252Gly Leu Ser Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro Cys Arg Ser Glu400 405 410cgt ctt gcc aag tac aac cag ctt ttg cgt att gaa gag gag ttg gga1300Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu Glu Glu Leu Gly415 420 425tca gag gca gtt tac gct gga gct aac ttc cgc aag cct gtg gag ccg1348Ser Glu Ala Val Tyr Ala Gly Ala Asn Phe Arg Lys Pro Val Glu Pro
430 435 440tac tag acaagtgctg ctcgtagaag cgaagtgctc tcctttgtta cgagaaaaag 1404Tyraagatctgag ttgtgcttgg tcattttgct ttaaataaaa cattacgttt gctttttttt1464tctccctttg ttggtttatt ttccaaacca ctcttgttgg gattaagttg cttatttttg1524taagaaaaaa acctgagata gctctgcctt taaagaggac agcagctctt cttttataat1584ctaatttcgg cttcttttaa tttcaaaaaa aaaaaaaaaa 1624<210>2<211>444<212>PRT<213>甘蓝型油菜(Brassica napus L.)<400>2Met Ala Thr Ile Thr Val Val Lys Ala Arg Gln Ile Phe Asp Ser Arg1 5 10 15Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Val His Thr Ser Ser Gly Val Lys20 25 30Val Thr Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu Ala35 40 45
Leu Gly Leu Arg Asp Gly Gly Ser Asp Tyr Leu Gly Lys Gly Ala Ser50 55 60Lys Ala Val Gly Asn Val Asn Asn Ile Ile Gly Pro Ala Leu Ile Gly65 70 75 80Lys Asp Pro Thr Gln Gln Thr Ala Ile Asp Asn Phe Met Val His Glu85 90 95Leu Asp Gly Thr Gln Asn Glu Trp Gly Trp Cys Lys Gln Lys Leu Gly100 105 110Ala Asn Ala Ile Leu Ala Val Ser Leu Ala Val Cys Lys Ala Gly Ala115 120 125Val Val Ser Gly Ile Pro Leu Tyr Lys His Ile Ala Asn Leu Ala Gly130 135 140Asn Pro Lys Ile Val Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly145 150 155 160Gly Leu His Ala Gly Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu165 170 175Pro Val Gly Ala Ser Ser Phe Lys Glu Ala Met Lys Met Gly Val Glu180 185 190Val Tyr His Asn Leu Lys Ser Val Ile Lys Lys Lys Tyr Gly Gln Asp195 200 205
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权利要求
1.一种甘蓝型油菜抗厌氧烯醇酶蛋白编码序列，其特征在于，分离出的DNA分子，该分子包括编码具有甘蓝型油菜烯醇酶蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第20-1354位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第20-1354位的核苷酸序列杂交。
2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜抗厌氧烯醇酶蛋白编码序列，其特征是，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的甘蓝型油菜抗厌氧烯醇酶蛋白编码序列，其特征是，所述的编码序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第20-1354位的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜抗厌氧烯醇酶蛋白编码序列，其特征是，包含DNA分子中8-100个连续核苷酸。
5.根据权利要求1或者4所述的甘蓝型油菜抗厌氧烯醇酶蛋白编码序列，其特征是，用所述的DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
全文摘要
一种甘蓝型油菜抗厌氧烯醇酶蛋白编码序列，属于基因工程领域。包括编码具有甘蓝型油菜Enolase蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第20－1354位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO.3中从核苷酸第20－1354位的核苷酸序列杂交。本发明在植物抗厌氧方面具有明显的作用，具有很大的应用价值，能够明显减少农作物在干旱、盐碱、低温和病菌感染等环境胁迫条件下生物产量的损失。
文档编号C12N9/00GK1597959SQ20041006643
公开日2005年3月23日 申请日期2004年9月16日 优先权日2004年9月16日
发明者赵静雅, 左开井, 唐克轩 申请人:上海交通大学