利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法

专利名称：利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法
技术领域：
本发明涉及利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法。属于植物细胞工程领域。
背景技术：
藏医药是中华民族藏文化的传统瑰宝，具有几千年的研究历史，一些青藏高原上特有的藏药植物因其药效显著而倍受国内外重视。
生物技术是一门应用生物研究成果以工程手段增加数量和质量，从而满足人类日益增长的对生物制品需求的技术。30年来，已在许多领域取得了巨大的进展，但在传统药材中的应用才刚刚起步，迄今为止，我国主要开展了以下方面的研究1、体外培养和试管繁殖 目前已有100多种药用植物经离体培养获得试管植株，其中苦丁菜、芦荟、怀地黄、枸杞、金线莲等已用于栽培种植。
2、液体培养和大规模生产 我国已经建立了三七、人参、西洋参、三尖杉、紫草、洋地黄、长春花、丹参、红豆杉等十几种药用植物的液体培养系统，经过对培养基和培养条件的操作已使有效成分达到或超过原植株，例如，红豆杉的培养细胞加倍时间能达到3.5-5.6天，紫杉醇产量达到细胞干重的0.2％和0.3％，分别比树皮紫杉醇含增加11.8倍和17.6倍；日本红豆杉(Taxus cuspidata)21升规模培养，在培养27天后分别获得3mg/L的紫杉醇。在这些研究中细胞系的选择仍然是主要条件。目前，利用植物细胞培养技术生产次生代谢物实现商品性工业化生产的还为数甚少。
3、基因工程研究 近年来，次生代谢产物合成的关键酶基因的调控研究非常引人注目，因为中药有效成分的绝大多数都来源于次生代谢产物，所以进行次生代谢的基因工程，提高中药材有效成分含量，对于缓解中药材的资源压力十分有利。目前，Croteau实验室相继克隆了紫杉醇生物合成中几种酶的cDNA，如taxadiene合成酶，毛牛儿毛牛儿二磷酸合成酶和taxa-4(20)，11(12)-dien-5α-ol-0-乙酰转移酶。其中乙酰转移酶cDNA和taxadiene合成酶cDNA在酵母菌(Escherichia coii)中表达。但是编码其生物合成途径中各个反应的酶蛋白的基因还未完全克隆，利用微生物转化中间产物成最终产物紫杉醇仍存在较大的的局限性。另外，随着基因工程的发展，出现了许多新的培养技术，主要有毛状根培养，即在80年代末期将发根培养技术应用在生产次生代谢产物上，利用发根农杆菌Ri质粒转移，转化后的表现型是毛状根，以产生植物有效物质。目前，已有30多种植物的毛状根培养获得初步成功。Yochikawa等通过诱导人参的原生质体获得转化的毛状根，其生长速度为使用外源激素诱导根的2倍以上。Flores等报道，他们建立的20多个埃及天仙子毛状根无性系都比正常根生长快得多，而且其产生的托品生物碱含量达到正常根培养水平。1997年黄遵锡从短叶红豆杉诱导出毛状根，选育出的5个无性系在20天后生物量平均增加约9倍，是同等条件下愈伤组织液体悬浮培养的生物增量的2.9倍；毛状根中的紫杉醇(taxol)含量为每千克干重含0.128毫克，是愈伤组织的1.3-8.0倍。同时毛状根也能向培养液中分泌0.01-0.03mg/L的紫杉醇，但是，目前对于绝大多数次生代谢途径未知的中药材基因工程仍未开展，利用毛状根培养来实现中药材产业化生产还有较大的困难。
上述的各种方法的研究表明，一些中药材易于诱导培养可利用细胞、组织培养及毛状根培养获得有高含量次生代谢物的细胞系及毛状根，但对于那些在体外培养难以形成快速生产细胞系的中草药，尤其是藏药材，上述方法并不适用，因此，急需探索简便、快速生产药用次生代谢产物的新方法。
4、植物体细胞杂交，又称原生质体融合，可以克服远缘有性杂交不亲和性，将异源遗传物质转入受体。其优越性表现在可同时转移多个目的基因；并使双亲细胞核及胞质基因在杂种细胞中共存。已被成功地用于转移远缘不亲和种、属的有用基因。80年代兴起的不对称体细胞杂交方法，通过用χ、γ-射线处理供体，使杂种中供体染色体片段化和消减，实现微量核物质转移，结果产生了大量的不对称杂种。本实验室在国际上首先将紫外线应用于植物的不对称体细胞杂交，发现紫外线可引起供体染色体片段化和消减，使少量染色体片段或DNA片段进入受体。在我们之后，国外将紫外线用于其它植物体细胞杂交转移染色体小片段，将目标性状转入受体的例证逐渐增加。
将紫外线照射供体的不对称融合用于药用植物的体细胞杂交中，可以获得了大量转移部分供体基因组的杂种，并且可提高有效药用成分，因此，利用体细胞杂交可将决定药用植物有效成分的基因在不同科、属、种间相互转移，再生出含有高含量药效成分基因的体细胞杂种，实现在易于快繁的植物细胞中生产有效药用成分，可解决濒危紧缺中药材料的资源压力，使中药应用进入持续发展的阶段。但是，现有其它生物技术在实现这一目的上还存在诸多不足。
高寒藏药材是中华医药的瑰宝之一，有极大的开发利用价值。然而，一些重要的资源受其特殊生长环境的限制，不能满足开发和生产的需求，急需进行生物技术快繁的研究。诸如高寒藏药材川西獐牙菜(Swertia musstii Franch)系龙胆科(Gentianaceae)、獐牙菜属(Swertia)，为青藏高原特有种，分布于西藏、青海海拔3800-5000米的高寒地区，为藏族民间常用的一种草药，称“藏茵陈”。一年生草本，全草入药，专治黄胆性肝炎及病毒性肝炎，开发出的“急肝宁”、“乙肝宁”和“藏茵陈胶囊”是治疗肝中毒、肝炎的最佳药物之一。主要有效成分为齐墩果酸(Oleanolic)及其衍生物、芒果甙(Mangiferin)、獐牙菜苦甙、黄酮类化合物、当药黄素和多种口山酮化合物。
四数獐牙菜(Swertia tetraptera Maxim)系龙胆科(Gentianaceae)、獐牙菜属(Swertia)，称“藏茵陈”。在青海省生于海拔2200～3600m的高寒地区，一年生草本，全草入药，有清热解毒，舒肝利胆之功效，可用于治疗黄胆型肝炎，病毒型肝炎。
管花秦艽(Gentiana siphonantha Maxim)为龙胆科、龙胆属植物。生于海拔2500-4500米的高山、草地、滩地。多年生草本，根入药，祛风除湿，退虚热；主治风湿关节痛、结核病潮热、黄疸。其主要有效成分为秦艽碱甲、秦艽碱乙及秦艽碱丙。
白花假龙胆(Gentianella albifpra Ma)系龙胆科(Gentianaceae)植物，在青海省生于海拔2200～3600m的高寒地区，一年生草本，全草入药，有清热解毒，舒肝利胆之功效，与同科植物川西獐牙莱(Swertia mussotii Franch)及抱茎獐牙莱(Swertia franchetiana H.Smith)同等入药。可用于治疗黄胆型肝炎，病毒型肝炎。
湿生扁蕾(Gentianopsis paludosa(Hook.f.)Ma.)，生于海拔2500-4500米的灌丛中、山坡湿地。全草入药，清热解毒，可治疗急性黄疸性肝炎、结膜炎、高血压、急性肾盂肾炎、疮疖肿毒、感冒及小儿腹泻。主要有效成分为齐墩果酸(Oleanolic)及其衍生物、芒果甙(Mangiferin)、獐牙菜苦甙、黄酮类化合物。
目前，由于上述地道藏药材野生资源非常匮乏，不能满足医药生产及外贸出口的需要，主要是采用同属其它植物为代用品进行混制，不但会影响疗效，而且不利于外贸出口。对它们的组培及细胞培养研究表明，它们建立快速繁殖系很困难，因此，只能选择它们作体细胞杂交的供体，以期将有效成分转入到快速生长的受体细胞系中，实现在易于快繁的植物细胞中生产有效药用成分。
狭叶柴胡属于伞形科(Umbelliferae)、柴胡属(Bupleurum)，具退热解毒、舒肝解郁等作用，有效成分主要为柴胡皂甙a、b、d，是治疗感冒、疟疾等症的常用药材。目前，已筛选出快速生长、遗传稳定的细胞系，继代培养10年，染色体数目仍保持稳定，已经成为体细胞杂交的良好受体。
胡萝卜为伞形科(Umbelliferae)的常用蔬菜，是进行细胞培养的模式植物，实验室也已筛选出胡萝卜快速生长的细胞系，可作为体细胞杂交受体。
马铃薯，属于茄科(Solanaceae)、茄属(Solanum)，是一种常用蔬菜及工业原料，其生物产量高，适应性广泛。由于其易于组织培养，通过其再生植株的块茎无性繁殖，可以产生遗传稳定的快速繁殖体，亦可作为体细胞杂交受体。
总之，上述植物已成为离体培养及体细胞杂交的理想材料，实验室也已建立起其快速繁殖的愈伤组织及其高效再生体系，因此，选择它们作为体细胞杂交的受体，将所述药物的有效成分转入到快速生长的受体细胞系中，以期实现在易于快繁的植物细胞中生产有效药用成分的技术基础正在具备。

发明内容
针对上述现有技术方法在中药材改良中的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法。该技术可将决定药用植物有效成分的基因在不同科、属、种间相互转移，再生出含有高含量药效成分基因的体细胞杂种，实现在易于快繁的植物细胞中生产有效药用成分，可解决濒危紧缺中药材料的资源压力，使中药应用进入持续发展的阶段。
本发明的利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法，步骤由双亲材料来源；受体原生质体的游离；射线处理供体原生质体；双亲原生质体的融合与培养；杂种愈伤组织及再生植株的鉴定；体细胞杂种中目标性状的检测组成。
其中，涉及的关键步骤是①双亲材料的选择、原生质体的游离及UV处理供体；
②双亲原生质体的融合及培养。
本发明中，植物体细胞杂交是指两种不同细胞去掉细胞壁后进行原生质体融合，形成杂种细胞，继而发育成杂种植株的过程。
本发明中，双亲材料基因型的选择及诱导是指受体和供体材料，受体材料为柴胡、胡萝卜、马铃薯胚性愈伤组织。供体材料分别为川西獐牙菜、四数獐牙菜麦、管花秦艽、白花假龙胆、湿生扁蕾愈伤组织；取所述供体的幼叶及未成熟种子在MS诱导培养基上诱导愈伤组织，愈伤组织在继代培养基上继代后，选取胚性愈伤组织作为供体。
本发明中，受体原生质体的游离方法为取继代培养2～4天的上述受体悬浮培养物，放入酶液中，于25℃下游离3～4小时温育后用300～400目不锈钢网过滤，500r/min离心收集原生质体，然后用洗液洗一次后，将密度调至1×106/ml作供体，备用。供体原生质体制备的方法为取继代第6-7天的川西獐牙菜、四数獐牙菜麦、管花秦艽、白花假龙胆、湿生扁蕾的愈伤组织，游离并收集原生质体。原生质体的游离方法同受体。收集的原生质体用洗液洗一次后，调成1×106/mL的密度铺在直径3.5cm的玻璃培养皿中成薄层用UV照射；紫外线照射强度为260～380μW/cm2/30s～5min；即分别照射0、30s、1min、2min、3min、5min后作为融合供体。
本发明中，双亲原生质体的融合与培养过程是将各供体分别与上述受体以1×106/ml的密度按1∶1的体积比混合均匀，用PEG法诱导融合。融合流程如下(1)原生质体滴加在直径3.5cm的培养皿，铺成一薄层，静置15分钟～20分钟。(2)沿薄层边缘滴加PEG溶液，静置15分钟～20分钟。(3)再加二倍体积的0.225M～0.275M Ca(NO3)2液，静置10分钟～15分钟。重复一次。(4)吸掉皿中液体，洗液洗两次，每次5分钟～10分钟。(5)用P5液体培养基洗一次。(6)用Parafilm封口，25℃避光保湿培养。再生愈伤组织长至1.5mm～2mm时挑出，转至MS培养基中继代培养，每天光照12h，光强2000Lux，温度25℃。
其中，上述所用溶液配方为酶液成分15mg/ml Cellulase Onozuka RS，3mg/ml Pectolyase Y-23，5mM MES，0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH5.8；洗液成分0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH5.8；PEG溶液的配方2g葡萄糖，1.5g Ca(NO3)2，40g分子量6000的PEG，溶解在100ml无离子水中，调pH至7.0，抽滤灭菌；Ca(NO3)2溶液的配方9g无水Ca(NO3)2+200ml无离子水，调pH至7.0，抽滤灭菌；P5培养基MS培养基的大量元素+MS培养基的微量元素+B5维生素+500mg/L水解酪蛋白+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+90g/L葡萄糖+975mg/L MES，pH5.6--5.8；MS培养基MS培养基的大量元素+MS培养基的微量元素+MS维生素+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+30mg/L水解酪蛋白+30mg/L+7g/l蔗糖琼脂粉，pH5.8--6.0；MS诱导培养基MS培养基+2mg/L 2，4-D；
MS继代培养基MS培养基+2mg/L 2，4-D+0.5mg/L激动素；MS1培养基MS培养基+1mg/L 2，4-D。
在上述的利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法中，所述的受体材料优选为柴胡原生质体，供体优选为川西獐牙菜及管花秦艽原生质体，柴胡原生质体的优选UV处理条件是在照射强度280～380μW/cm2的UV下，分别照射30s、1min、2min、3min、5min；所述的双亲原生质体融合是指柴胡分别与川西獐牙菜、管花秦艽原生质体在400g/L PEG静置15分钟后，加入0.275M无水Ca(NO3)2溶液6滴，静置10分钟；重复一次；所述的原生质体培养是指原生质体融合后再在MS1培养基中培养。
本发明中，杂种愈伤组织鉴定的方法主要为(1)染色体分析取双亲以及再生克隆愈伤组织4℃低温下24小时，经甲醇∶冰乙酸(3∶1)固定4-24小时，压片法制片，检查染色体。
(2)同工酶分析对亲本及再生愈伤组织进行酯酶同工酶、过氧化物同工酶和苹果酸脱氢酶分析。制样及染色方法参考胡能书和万国贤。
(3)RAPD分析CTAB法提取亲本、再生愈伤组织的基因组总DNA。选用随机引物，按夏光敏等报道的方法进行PCR扩增并分析。
(4)5S rDNA间隔序列分析CTAB法分别提取和纯化亲本及再生愈伤组织的基因组总DNA。选用两种引物(20mer和25mer)序列为PI5’-GAGAGTAGTACATCGATGGG-3’；PII5’-GGAGTTCTG ACGGGATCCGG-3’(20mer)PIII5’-GGATGGGTGACCTCCCGGGAAGTCC-3’；PIV5’-CGCTTAACTGCGGAGTTCTGATGGG-3’(25mer)。按周爱芬等报道的方法进行杂种与亲本的核糖体5S-rDNA间隔序列分析。
(5)荧光原位杂交1.亲本及再生愈伤组织用压片法进行染色体制片。2.探针的制备采用Nick translation法，用各供体的总基因组DNA(CTAB法提取)制备探针。3.原位杂交程序参照周爱芬(2001，中国科学)的方法，略有改动。杂交前，染色体制片在70％甲酰胺中70℃处理2min，再依次用--20℃预冷的70％→95％→100％乙醇，各处理5min。每张片子加杂交液20μL，包括甲酰胺10μL，50％硫酸葡聚糖4μL，20×SSC 2μL，10％SDS0.2μL，鲑鱼精DNA(10μg/μl)1μL，探针50ng、封阻中国春DNA8.0-～10μg，混匀，短暂离心，沸水中变性10min，迅速放人冰水中5-10min。每张玻片加18μl杂交液，盖上盖玻片，将玻片移入湿盒中，88℃变性12min，然后放入37℃恒温箱中杂交过夜。室温下2×SSC洗片5min后按试剂盒Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIGDetection的要求进行。4μg/ml PI染色10min，加抗褪色剂，封片。在OLYMPUS BX60荧光显微镜下观察。激光波长450-490nm，Kodak 400胶片拍照。
本发明中，体细胞杂种中目标性状(药效成分)的检测方法为实验仪器为LC-10AD型高效液相色谱仪(日本岛津)，SPD-10A紫外-可见检测仪，Class-vp5.0计算机控制及处理系统，Phenomenex Luna C18反相柱(4.6×250mm，5μm，带保护柱)，3K30型离心机(德国Sigma公司)，超声波发生器(宁波新芝科器研究所)。
主要试剂为对照品均购自中国药品生物制品检定所，经高效液相色谱归一法计算，峰纯度均达到99.99％。甲醇为色谱纯，购自天津市四友生物医学技术有限公司；乙醚为分析纯，购自天津市广成化学试剂有限公司；冰乙酸为分析纯，购自天津市福晨化学试剂厂。
检测实验方法(1)獐牙菜苦甙、龙胆苦甙、芒果甙色谱条件流动相为甲醇—水—冰乙酸(25∶75∶0.04)，临用前经超声脱气处理；检测波长259nm；流速0.8ml/min；柱温室温；数据处理为外标法峰面积定量。
(2)齐墩果酸与熊果酸色谱条件流动相为甲醇—水—冰乙酸(85∶15∶0.04)，临用前经超声脱气处理；检测波长209nm；流速1.0ml/min；柱温室温；数据处理为外标法峰面积定量。
(3)标准溶液及样品溶液的制备精密称取獐牙菜苦甙对照品1.00mg，龙胆苦甙对照品1.20mg，芒果甙对照品0.90mg，置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度；精密称取齐墩果酸对照品1.00mg，熊果酸对照品1.00mg，置10ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度。标准溶液经0.45μm的滤膜滤过备用。分别取干燥恒重并研成粉末状的藏药材粉末约1.5g，各体细胞杂种细胞系及其双亲愈伤组织1g，将样品粉末置具塞管中，加入25ml甲醇，超声波振荡处理60min，放冷，补足重量，12000转离心10min，上清液经0.45μm的滤膜滤过备用。结果详见附图及实施例。
本实验室于1998年将紫外线照射供体的不对称融合用于药用植物的体细胞杂交中已获得多种组合的体细胞杂种(1)葡萄与柴胡、(2)柴胡与石防风、(3)柴胡与川西獐牙菜、(4)胡萝卜与柴胡、(5)柴胡与管花秦艽、(6)胡萝卜与西洋参的不对称体细胞杂种。
本实验室对含川西獐牙菜部分遗传物质的柴胡杂种细胞系进行芒果甙含量的测定发现，川西獐牙菜的主要药效成分已转入柴胡，且含量比对照高。对胡萝卜与西洋参杂种中人参皂甙的含量测定发现，杂种中人参皂甙比对照高1倍以上。表明供体(川西獐牙菜、西洋参)的少量遗传物质已经转入柴胡及胡萝卜，此技术可转移并且提高有效药用成分。目前，国内外还未见有相关的研究，因此，本发明中的高寒藏药材药效成分向快速生长的受体细胞转移的体细胞杂交技术是藏药材生物技术改良的一种新方法。
本发明的有益效果本发明是利用体细胞杂交技术获得药效成分含量高、快速生长的细胞系，以期实现大规模工业化生产。与组织、细胞培养及基因工程方法相比，本发明的优势在于体细胞杂交为资源匮乏、难以培养的名贵藏药材有效成分生产提供了直接而简便的方法，获得的药效成分含量高、生长快速、遗传稳定的杂种细胞系可用于藏药材药效成分的工业化生产，因而在藏药材资源的有效、快速利用上具有重要的作用，将会产生巨大的经济效益。本发明所采用的体细胞杂交技术的优势在于(1)可以超越常规有性杂交的局限性，使远缘不亲和的植物产生体细胞杂种，转移中药材的目标次生物；(2)可实现细胞核和胞质基因的转移，产生多种多样的，有性杂交无法实现的中药材新类型；(3)可以转移由多基因控制的次生代谢途径及同时转移多个有益性状；(4)可以使供体中药材的染色体以小片段渐渗到受体植物的染色体上，并能够稳定及遗传；(5)目标基因在植物之间转移，因此不存在潜在的安全性问题。
本发明通过利用该技术所获得的高含量药效成分的杂种细胞系的特征是(1)生长快速；(2)药效成分含量高，进一步快繁筛选，可以实现利用液体培养大规模生产有效成分的目的；(3)含有高含量药效成分单体，具有极大的开发利用价值；(4)可为鉴定、分离及克隆药用成分相关基因提供了基础材料。


图1示柴胡与川西獐牙菜原生质体融合产物；图2示柴胡与川西獐牙菜体细胞杂种愈伤组织；图3示柴胡与川西獐牙菜体细胞杂种克隆3染色体，2n＝19；图4示柴胡与川西獐牙菜体细胞杂种的RPAD结果，M分子量标准，B川西獐牙菜，S柴胡，No.3，4，6，10，11，14为杂种克隆；←柴胡特征带；→川西獐牙菜特征带；新带。
图5示柴胡与川西獐牙菜体细胞杂种克隆3 GISH结果，箭头表示川西獐牙菜染色体小片段；图6示柴胡与管花秦艽体细胞杂种愈伤组织；图7示柴胡与管花秦艽体细胞杂种愈伤组织脂酶同工酶结果，←柴胡特征带；→管花秦艽特征带；新带。QJ管花秦艽，C柴胡，No.2，3，4，6，8杂种克隆；图8示柴胡与管花秦艽体细胞杂种愈伤组织的RAPD结果，M分子量标准，C柴胡，Q秦艽，1-2，1-1，3，4，5，6，8杂种克隆，←柴胡特征带；→管花秦艽特征带；新带；具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明实例1利用不对称体细胞杂交向柴胡转移川西獐牙菜的有效成分1材料与方法1.1双亲原生质体的来源 以狭叶柴胡愈伤组织建立悬浮细胞系。取继代3天的悬浮细胞系分离制备原生质体作为受体。
用川西獐芽菜愈伤组织分离原生质体，方法同小麦。原生质体分别经260μW/cm2的紫外线照射1min、2min、3min后作融合供体。
2原生质体的融合和培养将供体与受体以1×106/ml的密度按1∶1比例混匀，用PEG法融合。
3对再生愈伤组织及再生植株进行杂种性质的鉴定包括同工酶分析；染色体分析；RAPD和GISH分析(方法及实施方案如前述)。
4川西獐牙菜药效成分的检测(方法实施如前所述)。
结果川西獐芽菜原生质体用强度为260μw/cm2紫外线分别照射0min、1min、2min、3min后，与柴胡原生质体在PEG诱导下融合。对融合再生的46个单细胞克隆进行杂种形态学(图1，2)、染色体(图3)、同功酶和RAPD(图4)分析，结果表明，它们中有32个为体细胞杂种细胞系。染色体观察表明，11个克隆再生的植株染色体数目均介于双亲之和。主要分布在12-18，同功酶及5SrDAN间隔序列分析，均具有双亲特征谱带，证实它们为科间体细胞杂种GISH分析表明，杂种含1-4个川西獐牙菜染色体小片段(图5)。对部分杂种愈伤组织药效成分(芒果甙)含量测定结果表明(表1)，有4个克隆的芒果甙含量高于原材料川西獐芽菜，最高达0.293％。
表1 柴胡与川西獐芽菜体细胞杂种细胞系芒果甙的含量(％)

实例2利用不对称体细胞杂交向柴胡转移管花秦艽的有效成分方法和步骤同实施例1。
结果管花秦艽原生质体用强度为380μw/cm2紫外线分别照射0min、1min、2min、3min后，与柴胡原生质体在PEG诱导下融合。对融合再生的20个单细胞克隆进行杂种形态学(图6)、染色体、同功酶(图7)和RAPD(图8)分析，结果表明，它们中有18个为体细胞杂种细胞系。染色体观察表明(图2)，11个克隆再生的植株染色体数目均分布范围在11-13，同功酶及RAPD分析，均具有双亲特征谱带，证实它们为科间体细胞杂种。对部分杂种愈伤组织药效成分(龙胆苦甙)含量测定结果表明(表2)，有2个克隆的龙胆苦甙含量高于亲本管花秦艽，最高达0.1792％。
表2 柴胡与管花秦艽体细胞杂种龙胆苦甙含量

权利要求
1.一种利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法，步骤由双亲材料来源；受体原生质体的游离；射线处理供体原生质体；双亲原生质体的融合与培养；杂种愈伤组织及再生植株的鉴定；体细胞杂种中目标性状的检测组成，其特征在于①双亲材料的选择、原生质体的游离及UV处理供体；②双亲原生质体的融合及培养；上述双亲材料的选择是指受体和供体材料的选择，受体材料为柴胡、胡萝卜、马铃薯，供体材料为川西獐牙菜、四数獐牙菜麦、管花秦艽、白花假龙胆、湿生扁蕾，取上述供体的幼叶及未成熟种子在MS诱导培养基上诱导愈伤组织，愈伤组织在继代培养基上继代后，选取胚性愈伤组织作为供体；受体原生质体的游离方法是指取继代培养2～4天的上述受体悬浮培养物，放入酶液中，于25℃下游离3～4小时温育后用300～400目不锈钢网过滤，500r/min离心收集原生质体，然后用洗液洗一次后，将密度调至1×106/ml作供体，备用；供体原生质体的游离方法同受体；UV照射供体是指将收集的供体原生质体用洗液洗一次后，调成1×106/mL的密度铺在直径3.5cm的玻璃培养皿中成薄层后用UV照射；紫外线照射强度为260～380μW/cm2/30s～5min；上述双亲原生质体的融合及培养是指将各供体分别与上述受体以1×106/ml的密度按1∶1的体积比混合均匀，用PEG法诱导融合；融合流程如下(1)原生质体滴加在直径3.5cm的培养皿中，铺成一薄层，静置15分钟～20分钟；(2)沿薄层边缘滴加PEG溶液，静置15～20分钟，(3)再加二倍体积的0.225M～0.275M Ca(NO3)2液，静置10分钟～15分钟；重复一次；(4)吸掉培养皿中液体，洗液洗两次，每次5分钟～10分钟；(5)用P5液体培养基洗一次；(6)用Parafilm封口，25℃避光保湿培养；再生愈伤组织长至1.5mm～2mm时挑出，转至MS1培养基中继代培养，每天光照12h，光强2000Lux，温度25℃；其中，上述所用溶液配方为酶液成分15mg/ml Cellulase Onozuka RS，3mg/ml Pectolyase Y-23，5mM MES，0.6M甘露醇，5mM CaCl2，pH 5.8；洗液成分0.6M甘露醇，5mM CaCl3，pH 5.8；PEG溶液的配方2g葡萄糖，1.5g Ca(NO3)2，40g分子量6000的PEG，溶解在100ml无离子水中，调pH至7.0，抽滤灭菌；Ca(NO3)2溶液的配方9g无水Ca(NO3)2+200ml无离子水，调pH至7.0，抽滤灭菌；P5培养基MS培养基的大量元素+MS培养基的微量元素+B5维生素+500mg/L水解酪蛋白+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+90g/L葡萄糖+975mg/L MES，pH5.6--5.8；MS培养基MS培养基的大量元素+MS培养基的微量元素+MS维生素+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+30mg/L水解酪蛋白+30mg/L+7g/l蔗糖琼脂粉，pH5.8--6.0；MS诱导培养基MS培养基+2mg/L 2，4-D；MS继代培养基MS培养基+2mg/L 2，4-D+0.5mg/L激动素；MS1培养基MS培养基+1mg/L 2，4-D。
2.如权利要求1所述的利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法，其特征在于所述的受体材料为柴胡原生质体，供体为川西獐牙菜及管花秦艽原生质体，柴胡原生质体在照射强度280～380μW/cm2的UV下，分别照射30s、1min、2min、3min、5min；所述的双亲原生质体融合是指柴胡分别与川西獐牙菜、管花秦艽原生质体在400g/L PEG静置15分钟后，加入0.275M无水Ca(NO3)2溶液6滴，静置10分钟；重复一次；所述的原生质体培养是指原生质体融合后再在MS1培养基中培养。
全文摘要
本发明公开一种利用体细胞杂交技术将藏药材药效成分转入受体细胞的方法，主要步骤包括1)、双亲材料的基因型选择；2)、受体原生质体的游离；3)、UV照射供体原生质体；4)供、受体原生质体的融合与培养；5)杂种愈伤组织及再生植株的鉴定；6)体细胞杂种中目标性状的检测。本发明是利用体细胞杂交技术获得药效成分含量高、生长快速的细胞系，其优势在于可为资源匮乏、难以培养的名贵藏药材有效成分生产提供直接而简便的方法，获得的药效成分含量高、生长快速、遗传稳定的杂种细胞系可用于藏药材药效成分的工业化生产，因而在藏药材资源的有效、快速利用上具有重要的作用，将会产生巨大的经济效益。
文档编号C12N5/14GK1648246SQ20041007577
公开日2005年8月3日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者向凤宁, 夏光敏, 蔡云飞, 李子东, 江莉 申请人:山东大学