专利名称：重组胸腺素α1的制备方法
技术领域：
本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种重组胸腺素α1的其制备方法。
背景技术：
胸腺素α1(thymosin α1，简称Tα1)是一个由28个氨基酸残基组成的多肽，具有免疫活性，临床上应用广泛，多用于治疗病毒性肝炎和作为免疫调节剂。天然Tα1的氨基酸序列为NH2-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-COOH，N端为乙酰化(GoldsteinA L，Low T L，McAdoo M，McClure J，Thurman GB，Rossio J，Lai C Y，Chang D，Wang S S，Harvey C，Ramel A H，Meienhofer.J.Thymosin alpha 1isolation and sequenceanalysis of an immunological active thymic peptide.Proc Natl Acad Sci USA，1977，74(2)725～729)。目前Tα1单体只有一种来源，即采用固相合成法全合成，成本高，易造成环境污染。至今国内临床所用均为国外进口合成Tα1制剂，由于制备工艺成本高，故售价昂贵，如美国Sciclone公司生产的Zadaxin(中文名为日达仙)国内零售价高达900元/1.6毫克。
发明内容
本发明采用基因工程技术制备重组胸腺素α1，以克服化学合成成本高且污染环境等缺点。
本发明采用原核融合表达的方法来制备重组胸腺素α1，包括(1)具有工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的合成以及融合表达载体的构建；(2)工程菌的构建及发酵；(3)重组胸腺素α1的制备与纯化。
本发明具体采用大肠杆作为工程菌，其具体步骤如下(1)具有大肠杆菌工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的合成以及融合表达载体的构建的具体方法如下按大肠杆菌密码子偏好性化学合成胸腺素α1基因，其核苷酸序列为5’-TCT GAT GCT GCG GTC GAT ACC AGC AGT GAA ATA ACT ACG AAA GACTTA AAA GAA AAG AAA GAG GTT GTG GAA GAA GCC GAG AAC-3’，以5’-GGGGTACC TCTGATGCTGCGGTCGAT-3’为上游引物、5’-GTCATGCGGCCGC GTTCTCGGCTTCTTCCACAA-3’为下游引物，扩增出目的基因片段，通过Kpn I/Not I双酶切后，将目的基因定向克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建融合表达质粒pTRX-Tα1。
(2)大肠杆菌工程菌的构建及发酵培养将上述的融合表达质粒pTRX-Tα1转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株，经测序鉴定后得到工程菌DE3/pTRX-Tα1。该工程菌采用发酵培养，以终浓度为1mmol的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导3.5小时，终止发酵，收获菌体。
(3)重组胸腺素α1的制备与纯化含表达质粒pTRX-Tα1的工程菌可表达出硫氧还蛋白—胸腺素α1融合蛋白，通过亲和层析和离子交换层析纯化融合蛋白，肠激酶酶切释放出Tα1，再通过亲和层析和HPLC纯化出Tα1。
该重组胸腺素α1与由28个氨基酸残基组成的天然Tα1的氨基酸序列完全一致，且具有与天然Tα1相当的生物活性。
本发明制备方法简单，成本低廉，且不会造成环境污染。
具体实施例方式
现结合实施例对本发明重组胸腺素α1(Tα1)的制备作详细描述实施例1融合表达质粒pTRX-Tα1的构建1.试剂与材料载体质粒pTRX由中山大学生命科学学院彭立胜博士构建，已申请国家发明专利，申请号为00124832；大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自Stratagene公司，胸腺素α1基因由上海博亚生物技术公司合成；限制性内切酶和T4DNA连接酶购自New England公司，PCR引物由上海博亚生物技术公司合成，胶回收试剂盒购自Omega生物技术公司。
2.方法(1)寡核苷酸引物上游引物5’-GGGGTACC TCTGATGCTGCGGTCGAT-3’下游引物5’-GTCATGCGGCCGC GTTCTCGGCTTCTTCCACAA-3’上游引物内含Kpn I酶切位点(单下划线)、肠激酶识别位点(双下划线)，下游引物内含Not I(单下划线)酶切位点和强终止子(双下划线)。
(2)胸腺素α1基因的合成根据大肠杆菌密码子的偏好性，合成胸腺素α1基因，其序列如下5’-TCT GAT GCTGCG GTC GAT ACC AGC AGT GAA ATA ACT ACG AAA GAC TTA AAA GAA AAGAAA GAG GTT GTG GAA GAA GCC GAG AAC-3’。
(3)PCR扩增以合成胸腺素α1基因为模板，取上游引物和下游引物然后进行PCR反应，反应条件为94℃变性5分钟，进入循环，94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，共25个循环，再在72℃延伸10分钟。
(4)重组质粒的构建将PCR扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收，经Kpn I和Not I分别双酶切后回收的DNA片段，然后与经Kpn I和Not I酶切后的质粒载体pTRX连接，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)株，通过酶切鉴定转化子。
将上述酶切鉴定的重组质粒测序，获得正确序列和读码框的重组质粒，称为融合表达质粒pTRX-Tα1。重组胸腺素α1的核苷酸序列与其相应的氨基酸序列见序列表。上述含重组质粒pTRX-Tα1的大肠杆菌BL21(DE3)为工程菌，将工程菌DE3/pTRX-Tα1用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导表达融合蛋白Trx-Tα1。
实施例2大肠杆菌工程菌DE3/pTRX-Tα1的发酵1.工程菌和质粒工程菌BL21(DE3)/pTRX-Tα1；2.培养基一级种子菌活化用LB培养基(g/L)蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g；二级种子菌活化用2YT培养基(g/L)蛋白胨16g，酵母粉10g，NaCl 5g；发酵罐发酵培养基(g/L)蛋白胨12g，酵母粉12g，NaCl 5g，KH2PO44g，MgSO4·7H2O 1g，K2HPO45g，葡萄糖2g；发酵时将上述培养基混合；补料碳源(400ml)葡萄糖40g，MgSO4·7H2O 3g；补料氮源(g/L)37g蛋白胨，37g酵母粉；3.种子菌的活化取在-70℃、20％甘油中保藏的工程菌株划板，37℃培养约16hr，挑单克隆接种于含200ml LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)的锥形瓶中，37℃、250rpm培养10hr左右，然后按2YT培养基量的1％转种1次，在相同条件下培养14.5hr即成为活化种子菌。
4.高密度发酵培养10L发酵罐中加入8L发酵用培养基，按1∶25的比例加入活化种子菌，另加入少量消泡剂(按50μl单位体积加入)，发酵温度37℃，起始转速300rpm。
发酵过程的几个重要参数1)溶氧量及转速溶解氧量制在30％-60％左右，起始转速控制在300rpm，菌体生长旺盛、溶氧不足时最大转速可达800rpm；2)pH值自动流加2N的HCL或4N的NaOH调节pH至7.0；3)补料的流加当加入种子菌后2hr开始补加碳源，10L发酵罐补充400ml，诱导前30min左右完成；当加入种子菌后3hr开始补加氮源，10L发酵罐补充2000ml，诱导完毕前1hr左右完成。
5.IPTG诱导表达接种5hr后加入IPTG进行诱导表达，诱导的终浓度为0.6mM，诱导1hr后将IPTG的浓度补充至1mM，IPTG的终浓度为1mM，37℃诱导后3.5小时结束。
6.菌体收集4℃，5000rpm离心10min收集菌体，得到湿菌体300克(10L发酵罐)。
实施例3重组Tα1多肽的制备与纯化按每克湿菌加入10ml的比例加入超声缓冲液，冰浴中超声破碎菌体，离心，取上清，进行Ni2+-Chelating Sepharose柱进行亲和层析和Q Sepharose Fast Flow离子交换层析纯化融合蛋白。按每μl肠激酶酶切4mg融合蛋白的比例加入肠激酶，20℃反应16小时。将肠激酶酶切的裂解液过Ni2+-Chelating Sepharose柱，收集穿过峰，通过HPLC纯化获得重组胸腺素α1，其分子量为3066道尔顿。具体步骤如下1.将发酵菌液离心收集菌体，按10ml溶液/g湿菌的比例，用50mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl溶液重新悬浮菌体。采用Branson 450型超声波细胞粉碎机破碎细菌，探头型号为1/2″，以70％的功率在冰浴下超声15-25min(超声8sec，间歇4sec)。4℃、10,000rpm离心30min(BECKMAN AVANTITMJ-25)，收集上清。
2.上清过Ni2+-Chelating Sepharose亲和层析柱，弃去穿过峰；用Tris-HCl(pH7.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑溶液洗脱，直至平台期；用Tris-HCl(pH7.0)，0.5M NaCl，150mM咪唑溶液洗脱，收集洗脱峰；通过Sephadex G-25柱更换成20mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM NaCl缓冲液后上Q Sepharose Fast Flow柱，用50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl进行洗脱，收集洗脱峰用于酶切。
3.将获得的融合蛋白样品用肠激酶(EK)切割，在Trx-Tα1融合蛋白溶液中加入肠激酶(EK)，在20℃切割16hr后(或20hr)，按每μl肠激酶切割4mg融和蛋白的比例酶切。
4.酶切裂解液过过Ni2+-Chelating Sepharose亲和层析柱，收集含Tα1的穿过峰，通过Sephadex G-10柱将Tα1更换成超纯水。
5.过HPLC柱(C18)，流动相A(100％乙晴)，流动相B(0.01 M KH2PO4)，按5％流动相A到30％流动相A剃度进行洗脱，洗脱时间为30分钟，收集洗脱峰4。
实施例4重组胸腺素α1的活性测定1.E玖瑰花结实验按常规方法分离健康人外周血单核细胞，小牛血清调整细胞数至2×105/ml。各取200ul细胞液入试管，分别加入样品。37℃水浴90分钟。每支试管中加入200μl绵羊红细胞(2×108/ml)，4℃放置2-3小时；涂片，染色，于高倍镜下计数200个淋巴细胞中形成玖瑰花结的细胞数(结合3个及3个以上绵羊红细胞)，计算玖瑰花形成细胞的百分数，按公式“样品活力＝供试品测定管E玫瑰花结百分率—对照管E玫瑰花结百分率”计算激活率。供试品测定管E玫瑰花结百分率与对照管E玫瑰花结百分率之差不得低于10.0％，结果见表1。
表1 重组Tα1对E-玫瑰花结形成率的影响 由表1可见Tα1可显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率，且其作用与进口的合成Tα1(日达仙)相当。
本发明具有以下优点1.采用基因工程方法制备重组胸腺素α1(Tα1)，克服了化学合成成本高，且污染环境的缺点。
2.获得的重组Tα1经E-玫瑰花结试验显示，重组Tα1可显著提高人外周血淋巴细胞E-玫瑰花结形成率，对小鼠脾细胞增殖具有显著促进作用，且重组Tα1的生物学活性与进口的合成Tα1(日达仙)相当。
权利要求
1.重组胸腺素α1的制备方法，按照以下步骤进行(1)具有工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的融合表达载体的构建；(2)工程菌的构建及发酵；(3)重组胸腺素α1的制备与纯化。
2.按权利要求1所述的重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于选用大肠杆菌作为工程菌，按照以下步骤进行(1)具有大肠杆菌工程菌密码子偏好性胸腺素α1基因的融合表达载体的构建(1.a)按大肠杆菌密码子偏好性化学合成胸腺素α1基因，其核苷酸序列为5’-TCTGAT GCT GCG GTC GAT ACC AGC AGT GAA ATA ACT ACG AAA GAC TTA AAAGAA AAG AAA GAG GTT GTG GAA GAA GCC GAG AAC-3’；(1.b)以5’-GGGGTACC TCTGATGCTGCGGTCGAT-3’为上游引物、5’-GTCATGCGGCCGC GTTCTCGGCTTCTTCCACAA-3’为下游引物，扩增出目的基因片段；(1.c)目的基因片段通过酶切后，将目的基因定向克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建融合表达质粒pTRX-Tα1。(2)工程菌的构建及发酵培养(2.a)将上述的融合表达质粒pTRX-Tα1转化大肠杆菌；(2.b)大肠杆菌工程菌发酵培养；(3)重组胸腺素α1的制备与纯化。
3.按权利要求2所述的重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于步骤(2.b)大肠杆菌工程菌发酵培养采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导后，终止发酵，收获菌体。
4.按权利要求2所述的重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于步骤(3)重组胸腺素α1的制备与纯化是将含表达质粒pTRX-Tα1的工程菌表达出的硫氧还蛋白-胸腺素α1融合蛋白通过亲和层析和离子交换层析纯化融合蛋白，肠激酶酶切释放出Tα1，再通过亲和层析和HPLC纯化出Tα1。
5.按权利要求2所述的重组胸腺素α1的制备方法，其特征在于所用的大肠杆菌工程菌为BL21-DE3/pTRX-Tα1。
全文摘要
本发明涉及一种重组胸腺素α1的制备方法按大肠杆菌密码子偏好性化学合成胸腺素α1基因，扩增出目的基因片段，将目的基因定向克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建融合表达质粒pTRX－Tα1。含表达质粒pTRX－Tα1的工程菌可表达出硫氧还蛋白—胸腺素α1融合蛋白，通过亲和层析和离子交换层析纯化融合蛋白，肠激酶酶切释放出Tα1，再通过亲和层析和HPLC纯化出Tα1。试验结果表明，Tα1的生物学活性与化学合成的胸腺素α1(日达仙)相当。
文档编号C12P21/02GK1661037SQ200410077749
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者徐安龙, 姜孝玉, 李靖, 于琳, 王妍, 陈尚武, 王磊, 董美玲 申请人:中山大学