专利名称：抗原激发得到的树突细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及可以用于疾病的预防或治疗的树突细胞。
背景技术：
(树突细胞疫苗疗法及其问题)癌症治疗等领域中，树突细胞疫苗疗法引人注目。
树突细胞是生物体内抗原呈递能力最强的抗原呈递细胞(APC)，通过将摄取的抗原表位呈递给T细胞来激活T细胞，可以提高免疫应答。
树突细胞疫苗疗法是使用从癌细胞中提取的物质或癌特异性抗原，在生物体外激发该树突细胞，提高抗原呈递能力，作为树突细胞疫苗回到生物体内的治疗方法。
从癌细胞提取的物质一般为多种物质的混合物。因此，由于认为由细胞提取物质中的多种癌抗原激发树突细胞，所以预想用从癌细胞提取的物质激发的树突细胞疫苗诱导对癌的强力免疫反应。但是，这种通过多种物质的混合物激发的场合，树突细胞呈递的抗原不能特定。因此，作为对于癌症患者的治疗疫苗已被批准使用，但是作为对于正常人群的疾病预防疫苗还没有被批准使用。
另外，用癌特异性抗原激发的树突细胞疫苗中，虽然树突细胞呈递的抗原能够特定，但是存在现在得到鉴定的癌特异性抗原数自身还不多的问题。
作为使抗原呈递于树突细胞的另一形态，例如已知将来自抗原的肽编码的基因导入树突细胞表达的方法。但是，这样调整的树突细胞疫苗虽然能够引起对特定的抗原的强力免疫应答，但是现阶段还没有批准将用基因操作的树突细胞给予正常人群以预防疾病等。
(关于肝炎)肝炎是发生在肝脏的炎症，主要由病毒、酒精、药物的原因引起。由肝炎病毒引起的肝炎最多，至今发现了7种肝炎病毒。另外，日本的病毒性肝炎中，乙型、丙型占大部分。
肝炎可大致分为急性肝炎和慢性肝炎。所谓慢性肝炎，是指肝炎持续6个月以上。甲型肝炎经口感染，为急性肝炎可治愈，不慢性化。另一方面，乙型、丙型肝炎经血液感染、母子间的垂直感染、家族及异性间的水平感染。另外，乙型、丙型肝炎由急性肝炎发展为慢性肝炎的情况多，如果慢性化，据称向肝硬化和肝癌等严重的肝脏疾病的转变率非常高。
(关于乙型肝炎)乙型肝炎患者全世界都有分布，据称世界上乙型肝炎病毒感染者有3亿5千万人。特别是，中国感染者非常多，估计有1亿2千万人。整个东南亚占全世界感染者人数的70％以上。另外，据报道世界上每年有约100万人因该疾病死亡。日本乙型肝炎病毒感染者估计有100万人以上，其中10％左右为慢性肝炎患者。
(乙型肝炎的治疗方法及其问题)乙型肝炎没有特效治疗药物。因此，治疗以减少病毒数量、抑制其活动为目的。作为代表性的治疗方法，已知有干扰素疗法和拉米夫定疗法。
干扰素疗法是距今20年前开始的乙型肝炎的最初治疗方法。干扰素起着帮助免疫系统工作、抑制病毒增殖的作用。由于干扰素疗法病毒数量越少越有效果，一般在治疗病毒数量为乙型肝炎的1000分之1的丙型肝炎中发挥显著效果，而治疗乙型肝炎，只有约20％的患者有效。另外，如果转为肝硬化，干扰素更难以起作用。而且，治疗使用的干扰素，至开发成产品要花费高成本，治疗1个疗程需200～300万日元，给患者带来沉重的经济负担等的问题也很多。
已知拉米夫定本来是作为艾滋病治疗药开发的药物，对治疗乙型肝炎也有效。拉米夫定具有直接抑制病毒DNA合成的作用，具有抑制乙型肝炎急剧恶化和重症化的效果。据报道，拉米夫定对干扰素治疗无效的乙型肝炎患者也有效，但是病毒不在增殖状态时无效。而且，由于长期给药，存在出现拉米夫定耐药病毒等问题。
另外，这些乙型肝炎治疗方法由于效果的评价方法各不相同，不能一样地比较效果。另外，认为即使使用这些治疗方法，也不可能从体内完全除掉乙型肝炎病毒。因此，为了防止上述乙型肝炎患者的增加，认为预防乙型肝炎很重要。
(乙型肝炎的预防方法及其问题)从预防乙型肝炎的观点看，一般HB疫苗有效。
为了预防乙型慢性肝炎，即使是正常人群，体内保持、维持抗HBs抗体也很重要。现在的HB疫苗基于乙型肝炎病毒的表面抗原HBs抗原制备。通常，通过接种3次该HB疫苗，HB疫苗生效的人体内可产生抗HBs抗体。认为产生抗体的人之后不会感染乙型肝炎，即使几年后抗体值下降时，如果体内产生一次抗HBs抗体，就可能避免感染。另外，也可通过追加接种，再次提高抗体值。
但是，HB疫苗也存在几个问题。
首先，正常人群中约10％为HB疫苗无应答者，即使给予HB疫苗也不能产生抗HBs抗体。认为医务工作者中不少人为HB疫苗无应答者，日本有数十万人。
另外，患有伴随免疫功能低下的疾病的人，例如，HIV患者、肝疾病患者、透析患者中，HB疫苗也不能充分发挥效果。肥胖者和吸烟者也发生免疫功能低下，这些人对HB疫苗的反应性也低。
而且，由于HB疫苗对肝移植对象等正在给予免疫抑制剂的人不起作用，所以患者不能产生抗HBs抗体。但是，乙型肝炎相关肝移植中，由于维持抗HBs抗体值对治疗成绩有很大影响，所以肝移植后，患者需要反复给予抗HBs人免疫球蛋白。给药频率需2周1次，这带来一年250万日元的沉重的经济负担。今后，由于考虑到以患者特别多的东南亚为中心，乙型肝炎相关肝移植激增，所以需要世界性地解决这个经济性问题。
发明内容
发明要解决的课题本发明的目的是提供对疾病的预防或治疗有效的树突细胞，特别是，提供可以适用于乙型肝炎的预防或治疗的树突细胞。解决课题的手段1、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞本发明是由包括用HBs抗原激发树突细胞的步骤的方法得到的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
根据本发明得到的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，通过将HBs抗原表位呈递给T细胞而激活T细胞，可以提高对HBs抗原的免疫应答。因此，根据本发明，可以提供对乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
本发明中，上述方法可以进一步包括从血液得到上述树突细胞的步骤。据此，可以从来自血液的树突细胞提供本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。另外，如果使用血液，采用现有公知的方法等，通过比较简便的操作便可以得到树突细胞。
本发明中，上述方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
本发明中，上述生物可以为人。据此，可以得到来自人的树突细胞，所以，本发明的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞可以给予人。因此，根据本发明，可以提供对人的乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
本发明中，上述HBs抗原可以是HB疫苗中含有的HBs抗原。例如，人的场合，实际上作为HB疫苗上市的是确认对包括正常人群在内的人有安全性、有效性，并获得批准的疫苗。因此，根据本发明，可以提供例如可以安全且有效地用于人的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。另外，由于HB疫苗对正常人群可以使用，所以，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞不只是对乙型肝炎患者等的乙型肝炎治疗目的，也可以以乙型肝炎的预防为目的用于正常人群。再者，不只限于人，关于其他生物，通过使用用对该生物安全且有效的HB疫苗激发的树突细胞，也可以预防或治疗该生物的乙型肝炎。
2、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的制备方法本发明为包括用HBs抗原激发树突细胞的步骤的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的制备方法。据此，可以得到对乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的制备方法可以进一步包括从血液得到上述树突细胞的步骤。据此，可以从来自血液的树突细胞得到本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。另外，如果使用血液，采用现有公知的方法等，通过比较简便的操作便可以得到树突细胞。
本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的制备方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
本发明中，上述生物可以为人。据此，可以得到对人的乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
本发明中，上述HBs抗原可以是HB疫苗中含有的HBs抗原。据此，可以提供可以安全且有效地用于生物例如包括正常人群在内的人的、对乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
3、含有具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的组合物本发明为含有本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的组合物。据此，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，例如，可以以与其他物质混合的状态、悬浮在其他物质中的状态、与其他物质组合的状态等使用。具体地说，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，例如，可以以悬浮在PBS、生理盐水、RPMI1640培养基等中的形态，以及本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞中例如添加TNF-α、IL-12、HB疫苗、GM-CSF、OK432、其他免疫赋活剂等的形态使用。因此，根据本发明，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞可以以适于使用目的的形态使用，或以提高本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的效果的形态使用。
本发明有关的组合物可以进一步含有HB疫苗添加剂。
本发明中，上述组合物可以为实验试剂或实验试剂盒。据此，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞可以以适于研究例如免疫研究的形态使用。
本发明中，上述组合物可以为医药组合物。据此，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞可以以适于医疗例如乙型肝炎的预防或治疗的形态使用。
本发明中，上述组合物可以是免疫应答激活制剂。据此，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞可以以适于激活对HBs抗原的免疫应答的给药剂型使用。
本发明中，上述组合物可以是细胞疫苗。据此，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞可以直接给予生物体内，能够激活对HBs抗原的免疫应答。
本发明中，上述细胞疫苗可以是乙型肝炎的预防或治疗疫苗。据此，上述细胞疫苗中含有的本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，通过在生物体内激活对HBs抗原的免疫应答，可以预防或治疗乙型肝炎。
4、使用具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的乙型肝炎的预防或治疗方法本发明为使用本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的乙型肝炎的预防或治疗方法。据此，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，通过激活对HBs抗原的免疫应答，可以预防或治疗乙型肝炎。例如，人的场合，目前的HB疫苗无应答的正常人群或患有伴随免疫功能低下的疾病的人、正在给予免疫抑制剂的人等目前的HB疫苗不能发挥效果的人，通过本发明有关的乙型肝炎的预防或治疗方法，变得能够产生抗HBs抗体，可以预防或治疗乙型肝炎。
本发明中，可以包括将本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞给予生物的步骤。据此，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，通过在生物体内激活对HBs抗原的免疫应答，可以预防或治疗乙型肝炎。另外，本发明有关的乙型肝炎的预防或治疗方法，与将HB疫苗直接给予生物体内的目前的乙型肝炎的预防或治疗方法相比，可以发挥高效果。
本发明中，上述生物可以为人。据此，可以预防或治疗人的乙型肝炎。
5、疫苗激发树突细胞本发明为由包括用疫苗激发树突细胞的步骤的方法得到的疫苗激发树突细胞。
本发明中，“疫苗激发树突细胞”指由包括用疫苗激发的步骤的方法得到的具有抗原呈递能力的树突细胞。
根据本发明得到的疫苗激发树突细胞，通过将疫苗中含有的抗原表位呈递给T细胞而激活T细胞，可以提高对上述抗原的免疫应答。因此，根据本发明，可以提供对疾病的预防或治疗有效的疫苗激发树突细胞。
另外，例如人的场合，实际上作为疫苗上市的是确认对人有安全性、有效性，并获得批准的疫苗。因此，根据本发明，可以提供例如可以安全且有效地用于人的疫苗激发树突细胞。再者，不只限于人，关于其他生物，通过使用用对该生物安全且有效的疫苗激发的疫苗激发树突细胞，可以预防或治疗该生物的疾病。
本发明中，上述方法可以进一步包括从血液得到上述树突细胞的步骤。据此，可以从来自血液的树突细胞提供本发明有关的疫苗激发树突细胞。另外，如果使用血液，采用现有公知的方法等，通过比较简便的操作便可以得到树突细胞。
本发明中，上述方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
本发明中，上述生物可以为人。据此，可以得到来自人的树突细胞，所以，可以将本发明的疫苗激发树突细胞给予人。因此，根据本发明，可以提供对人的疾病的预防或治疗有效的疫苗激发树突细胞。
本发明中，上述疫苗可以是疾病的预防或治疗疫苗。据此，可以提供这些疫苗中含有的、呈递上述疾病有关的抗原的疫苗激发树突细胞。因此，可以预防或治疗上述疾病。
本发明中，上述疫苗可以是肝炎疫苗。作为肝炎疫苗，例如，已知有甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗等。例如人的场合，实际上作为肝炎疫苗上市的是确认对包括正常人群在内的人有安全性、有效性，并获得批准的疫苗。因此，根据本发明，可以提供例如可以安全且有效地用于人的、具有肝炎病毒抗原呈递能力的肝炎疫苗激发树突细胞。另外，由于肝炎疫苗可以用于正常人群，所以，本发明有关的肝炎疫苗激发树突细胞，例如，不只是对肝炎患者等的肝炎的治疗目的，也可以以肝炎的预防为目的用于正常人群。再者，不只限于人，关于其他生物，通过使用用对该生物安全且有效的肝炎疫苗激发的树突细胞，可以预防或治疗该生物的肝炎。
本发明中，上述肝炎疫苗可以优选是含有HBs抗原的HB疫苗。据此，可以提供可以安全且有效地用于生物例如包括正常人群在内的人的、对乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的疫苗激发树突细胞。
6、疫苗激发树突细胞的制备方法本发明是包括用疫苗激发树突细胞的步骤的疫苗激发树突细胞的制备方法。据此，可以得到对疾病的预防或治疗有效的疫苗激发树突细胞。
本发明有关的疫苗激发树突细胞的制备方法可以进一步包括从血液得到上述树突细胞的步骤。据此，可以从来自血液的树突细胞得到本发明有关的疫苗激发树突细胞。另外，如果使用血液，采用现有公知的方法等，通过比较简便的操作便可以得到树突细胞。
本发明有关的疫苗激发树突细胞的制备方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
本发明中，上述生物可以为人。据此，可以得到对人的疾病的预防或治疗有效的疫苗激发树突细胞。
本发明中，上述疫苗可以是疾病的预防或治疗疫苗。据此，可以提供对上述疾病的预防或治疗有效的疫苗激发树突细胞。
本发明中，上述疫苗可以是肝炎疫苗。据此，可以提供可以安全且有效地用于生物例如包括正常人群在内的人的、对肝炎的预防或治疗有效的、具有肝炎病毒抗原呈递能力的肝炎疫苗激发树突细胞。
本发明中，上述肝炎疫苗可以优选是含有HBs抗原的HB疫苗。据此，可以提供可以安全且有效地用于生物例如包括正常人群在内的人的、对乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的疫苗激发树突细胞。
7、含有疫苗激发树突细胞的组合物本发明为含有本发明有关的疫苗激发树突细胞的组合物。据此，本发明有关的疫苗激发树突细胞可以以例如与其他物质混合的状态、悬浮在其他物质中的状态、与其他物质组合的状态等使用。具体地说，本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞可以以例如悬浮在PBS、生理盐水、RPMI 1640培养基等中的形态，以及本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞中例如添加TNF-α、IL-12、HB疫苗、GM-CSF、OK432、其他免疫赋活剂等的形态使用。因此，根据本发明，本发明有关的疫苗激发树突细胞可以以适于使用目的的形态使用，或以提高本发明有关的疫苗激发树突细胞的效果的形态使用。
本发明有关的组合物可以进一步含有疫苗添加剂。
本发明中，上述组合物可以为实验试剂或实验试剂盒。据此，本发明有关的疫苗激发树突细胞可以以适于研究例如免疫研究的形态使用。
本发明中，上述组合物可以为医药组合物。据此，本发明有关的疫苗激发树突细胞可以以适于医疗例如疾病的预防或治疗的形态使用。
本发明中，上述组合物可以是免疫应答激活制剂。据此，本发明有关的疫苗激发树突细胞可以以适于激活对疫苗中含有的抗原的免疫应答的给药剂型使用。
本发明中，上述组合物可以是细胞疫苗。据此，本发明有关的疫苗激发树突细胞可以直接给予生物体内，能够激活对疫苗中含有的抗原的免疫应答。
本发明中，上述细胞疫苗可以是疾病的预防或治疗疫苗。据此，上述细胞疫苗中含有的本发明有关的疫苗激发树突细胞，通过在生物体内激活对疫苗中含有的抗原的免疫应答，可以预防或治疗上述疾病。
8、使用疫苗激发树突细胞的疾病的预防或治疗方法本发明为使用本发明有关的疫苗激发树突细胞的疾病的预防或治疗方法。据此，本发明有关的疫苗激发树突细胞，通过激活对疫苗中含有的抗原的免疫应答，可以预防或治疗上述疾病。例如，人的场合，目前使用预防或治疗上述疾病的疫苗无应答的正常人群，或患有伴随免疫功能低下的疾病的人、正在给予免疫抑制剂的人等疫苗不能充分发挥效果的人，通过本发明有关的疾病的预防或治疗方法，变得能够产生抗体，可以预防或治疗上述疾病。
本发明中，可以包括将本发明有关的疫苗激发树突细胞给予生物的步骤。据此，本发明有关的疫苗激发树突细胞，通过在生物体内激活对疫苗中含有的抗原的免疫应答，可以预防或治疗上述疾病。另外，本发明有关的疾病的预防或治疗方法，与目前的将疫苗直接给予生物体内的疾病的预防或治疗方法相比，可以发挥高效果。
本发明中，上述生物可以为人。据此，可以预防或治疗人的疾病。
图1表示给予HB疫苗激发树突细胞前的抗HBs抗体值。
图2是表示HB疫苗激发引起的树突细胞的HLA-DR及CD86的变化的图。
图3是表示HB疫苗激发引起的树突细胞的T细胞幼稚化辅助能力的变化的图。
图4是表示使用HBs记忆-T细胞的HB疫苗激发树突细胞对HBs记忆-T细胞的增殖能力带来的效果的图。
图5表示使用HBs记忆-T细胞的HB疫苗激发树突细胞对HBs抗体产生能力带来的效果的图。
图6表示采用血液生化检查的HB疫苗激发树突细胞的安全性试验的检查项目。
图7是表示ALT检查结果的图。
图8是表示CRP检查结果的图。
图9是表示PT检查结果的图。
图10是表示肌酸酐检查结果的图。
图11表示采用血清生化检查的关于自体免疫反应的安全性试验的结果。
图12是表示给予HB疫苗激发树突细胞引起的抗HBs抗体值的变化的图。
图13表示给予HB疫苗激发树突细胞引起的抗HBs抗体值的变化。
图14是表示给予HB疫苗激发树突细胞引起的HB疫苗无应答者的抗HBs抗体值的变化的图。
具体实施例方式
下面说明本发明的最佳实施方式。本发明并不只限于以下实施方式，可以在不超出本发明的要点的范围内做各种变更。
1、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞由包括用HBs抗原激发树突细胞的步骤的方法得到。根据本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，可以提供对乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
本实施方式中，“用抗原激发树突细胞”指使树突细胞摄取抗原，在上述树突细胞内分解，上述分解的抗原可以作为肽呈递的状态。
本实施方式中，作为用抗原激发树突细胞的具体方法，例如，在适当的细胞因子等存在下，使抗原和树突细胞共存进行培养的方法。
得到树突细胞的方法，只要摄取抗原、最终能得到呈递该抗原的树突细胞，没有特别限制，可以采用各种方法。
例如，可以从血液中得到树突细胞。具体地说，例如，利用本领域技术人员公知的方法，从含有树突细胞的前体细胞的血液中分化诱导树突细胞的方法，或可以使用从血液中直接分离树突细胞的方法。更具体地说，例如，根据下述方法可以得到树突细胞从骨髓细胞、脐带血或末梢血的CD34阳性前体细胞中主要使用GM-CSF和TNF-α诱导的方法、从脐带血单核细胞或末梢血单核细胞中主要使用GM-CSF和IL-4诱导的方法、从末梢血单核细胞中主要使用GM-CSF和IFN-α诱导的方法、从末梢血单核细胞中直接分离的方法等。
另外，这些得到树突细胞的方法，根据需要，也可以进一步包括从生物采集血液的步骤。上述生物，根据有无感染乙型肝炎的可能性，并没有特别限定，例如，可以是能够感染乙型肝炎的生物。上述能够感染乙型肝炎的生物中，可以包括能够自然感染乙型肝炎的生物和能够人工感染乙型肝炎的生物。具体地说，作为上述能够自然感染乙型肝炎的生物，例如有人、黑猩猩等灵长类、土拨鼠、北京鸭等鸭类等；作为上述能够人工感染乙型肝炎的生物，例如有松鼠、大鼠、野鸭、鹅、鹭、鹤、小鼠等。特别是，从世界上乙型肝炎引起的死亡人数在增加的观点看，可以将本发明用于上述生物为人时的效果大。
另外，作为不利用血液得到树突细胞的方法，例如，将ES细胞分化诱导得到树突细胞的方法。具体地说，例如，通过将由胚盘胞内部存在的内部细胞块制成的ES细胞与适当的饲养细胞和细胞因子一起培养，可以分化诱导为树突细胞。
本实施方式中，关于培养树突细胞的培养基，只要不阻碍由树突细胞的前体细胞向树突细胞的分化诱导、树突细胞的生存、抗原对树突细胞的激发等，没有特别限定，例如，可以使用RPMI 1640培养基等。另外，优选RPMI 1640培养基。
本实施方式中，树突细胞的诱导可以使用细胞因子。作为树突细胞的诱导使用的细胞因子，只要不阻碍向树突细胞的分化诱导、树突细胞的生存、抗原对树突细胞的激发等，没有特别限定，例如，可以使用GM-CSF、TNF-α、IL-4、IFN-α等。
本实施方式中，HBs抗原的形态，只要最终能通过树突细胞呈递，没有特别限制，可以是完全蛋白质抗原，也可以是肽抗原。
另外，本实施方式有关的HBs抗原，例如，可以以与各种物质和液体组合的形态使用。具体地说，例如，可以将HBs抗原用核糖体等磷脂双层膜导入树突细胞内，以及将HBs抗原悬浮在缓冲液例如PBS、培养基例如RPMI 1640培养基中而导入树突细胞内。
另外，HBs抗原的添加时期，只要结果上HBs抗原能通过树突细胞呈递，没有特别限定，例如，可以在分化诱导树突细胞后添加。另外，也可以在分化诱导时添加HBs抗原，一起培养。另外，HBs抗原的激发时间，只要结果上HBs抗原能通过树突细胞呈递，没有特别限定，例如可以为8小时～24小时。
另外，HBs抗原可以是HB疫苗中含有的HBs抗原。
疫苗中，例如，存在活性疫苗、非活性疫苗和类毒素等几个种类。活性疫苗，例如，指将病原性减弱的活的病毒或细菌直接接种的疫苗。非活性疫苗，例如，是将病毒的微粒或细菌的菌体等精制、加热和用福尔马林等药剂处理，使病原性消失或无毒化而制成的疫苗。类毒素，例如，指只取出细菌的毒素进行精制，加入福尔马林无毒化处理而不失去免疫原性。
本实施方式的HB疫苗，只要含有HBs抗原，其种类并没有限定，现在日本批准用于人而上市的HB疫苗属于非活性疫苗。本实施方式中，使用非活性疫苗HB疫苗时，例如，可以使用重组沉降乙型肝炎疫苗或沉降乙型肝炎疫苗。
作为重组沉降乙型肝炎疫苗，例如，可以使用将相当于乙型肝炎病毒DNA的HBs抗原的部分插入到酵母菌或动物细胞等的DNA中表达，制成疫苗的有效成分HBs抗原，加入免疫增强剂铝胶调整的疫苗。作为动物细胞，例如，可以使用用CHO细胞调整的疫苗。
作为沉降乙型肝炎疫苗，例如，可以使用将由动物细胞等生产的HBs抗原精制后，加入铝胶调整的疫苗。作为动物细胞，例如，可以使用用huGK-14细胞调整的疫苗。
2、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的制备方法本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的制备方法包括用HBs抗原激发树突细胞的步骤。据此，可以得到对乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
上述制备方法可以进一步包括从血液得到上述树突细胞的步骤。据此，可以从来自血液的树突细胞得到本发明有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。另外，如果使用血液，采用现有公知的方法等，通过比较简便的操作便可以得到树突细胞。
另外，上述制备方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
上述生物可以为人。据此，可以得到对人的乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
另外，上述HBs抗原可以是HB疫苗中含有的HBs抗原。据此，可以提供可以安全且有效地用于生物例如包括正常人群在内的人的、对乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
3、含有具有HB8抗原呈递能力的树突细胞的组合物本实施方式有关的组合物可以含有本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
另外，本实施方式有关的组合物可以进一步含有HB疫苗添加剂。
本实施方式中，“本实施方式有关的组合物可以进一步含有HB疫苗添加剂”指HB疫苗添加剂包含在本实施方式有关的组合物全体中的某处的状态。即，含有HB疫苗添加剂的场所没有特别限定，可以是本实施方式有关的组合物中的树突细胞之外、之中、细胞膜上等任一场所。可以判定，本实施方式有关的组合物通过含有疫苗添加剂，作为HBs抗原使用HB疫苗中含有的HBs抗原，可得到本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞。
作为HB疫苗添加剂，例如，可列举保存剂、抗生素、稳定剂、防腐剂、免疫增强剂、缓冲剂、等渗透剂等。作为具体实例，例如有乙基汞硫代水杨酸钠、硫酸铝钾、氢氧化钠、氯化铝、醋酸、乙酸钠、氯化钠等。再者，HB疫苗添加剂并不局限于这些。
作为HB疫苗添加剂的检测方法，例如，可以使用公知的分析方法。具体地说，例如，可列举通过使用各种色谱的分离分析、定量分析、红外分光分析、核磁共振分析、质量分析、元素分析等的结构分析等。
本实施方式有关的组合物可以为实验试剂或实验试剂盒。据此，本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞可以以适于各种研究的方式使用。作为可以使用的研究领域，例如，有关免疫应答、免疫耐受性、细胞因子产生的信号传递机制的研究、关于使用树突细胞的免疫疗法的研究。另外，例如，也可以用于关于乙型肝炎的预防或治疗研究，例如基因、RNA、肽、蛋白质、化合物、医药、细胞因子等的筛选等目的。
另外，本实施方式有关的组合物可以为医药组合物。本实施方式有关的医药组合物，例如，可以以直接给予生物体内的形态、在生物体外与其他物质和细胞混合的形态使用。
另外，本实施方式有关的组合物可以是免疫应答激活制剂。本实施方式有关的免疫应答激活制剂，例如，可以以直接给予生物体内的形态、在生物体外与其他物质和细胞混合的形态使用。
作为在生物体外使用本实施方式有关的组合物的方式，例如，本实施方式有关的免疫应答激活制剂与T细胞混合，通过将HBs抗原表位呈递给T细胞而激活T细胞的使用方法。另外，该T细胞可以给予生物体内使用。
另外，作为将本实施方式有关的组合物直接给予生物体内的形态，例如有作为细胞疫苗的注射和滴注。作为细胞疫苗，优选乙型肝炎的预防或治疗疫苗。另外，作为将本实施方式有关的组合物直接给予生物体内的部位，例如有静脉内给药、动脉内给药、胸腔内给药、腹腔内给药、皮下给药、肌肉内给药、组织内(例如肝脏内)给药、淋巴结给药等。从给药的简便性的观点看，优选皮下注射。
4、使用具有HBs抗原呈递能力的树突细胞预防或治疗乙型肝炎本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，例如，可以用于乙型肝炎的预防或治疗。
使用具有HBs抗原呈递能力的树突细胞预防或治疗乙型肝炎，例如，可以与现有的乙型肝炎的预防或治疗方法组合使用。
另外，使用本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞预防或治疗乙型肝炎，可以包括将具有HBs抗原呈递能力的树突细胞给予生物的步骤。作为上述生物，例如，可以是能够感染上述乙型肝炎的生物。另外，如果能抑制排斥反应，产生树突细胞的生物和成为给药对象的生物可以是同种生物，也可以是异种生物。同种生物的场合，可以将本实施方式有关的树突细胞给予取出树突细胞的自体内，也可以给予组织适合性抗原一致到可以给药的程度的异体内。
例如，上述生物可以为人。这种场合，希望HLA配型尽可能一致。因此，树突细胞的由来优选有血缘关系的提供者由来的树突细胞。如果使用自家细胞，则不需考虑HLA配型适合性，所以更加优选来自给药对象本人的树突细胞。
本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，如上所述，可以以直接给予生物体内的形态使用，以及在生物体外与T细胞混合而激活T细胞，该T细胞可以以给予生物体内的形态使用。但是，由于T细胞为效应细胞，起一次作用后，短时间内便死亡、消失。因此，为了预防、治疗乙型肝炎，需要高频率反复给予T细胞。而树突细胞也作用于原初T细胞、HBs记忆-T细胞、B细胞，由于反复给与刺激，因此具有长时间且强力的效果。由此，认为本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞更加优选以直接给予生物体内的形态使用。
5、本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的使用例及其效果下面示出本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞的使用例及其效果。本使用例中，可以包括将本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞给予人的步骤。本使用例可以适用于乙型肝炎的预防或治疗。再者，本使用例不只限于以下的场合，本使用例有关的树突细胞的使用形态，可以在不超出本发明的要点的范围内做各种变更。
5-1、适用于乙型肝炎的预防已知正常人群中约10％为对HB疫苗无应答者，即使给予HB疫苗也不能产生抗HBs抗体。由于乙型肝炎通过血液感染，所以认为医务工作者等抗HBs抗体的必要性特别高，这些人中也有不少是HB疫苗无应答者。
因此，通过将本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞给予这些HB疫苗无应答者，这些人可产生抗HBs抗体。据称，为了预防乙型肝炎的感染，抗HBs抗体值至少需维持在10mIU/ml。根据后述实验例11的结果可知，给予1次本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，HB疫苗无应答者的抗HBs抗体值平均上升到30mIU/ml，10mIU/ml以上的值可以维持约3～6个月。因此，通过本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，可以使现在的HB疫苗无应答者变得能够产生抗HBs抗体，能够预防感染乙型肝炎。
另外，现在预防乙型肝炎使用的HB疫苗，通常需间隔一定时间接种3次。根据后述实验例11的结果可知，通过给予1次本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，不只是HB疫苗无应答者，HB疫苗起作用的正常人群(应答者)的抗HBs抗体值也能够提高。因此，本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，不只是HB疫苗无应答者，对于HB疫苗应答者，也可以作为新的乙型肝炎的预防手段使用，能够减少接种次数、减轻经济负担。
另外，已知对于HIV患者、肝疾病患者、透析患者、肥胖者和吸烟者等免疫功能低下的人，现有的HB疫苗不能充分发挥效果。认为这些人通过使用本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，也可以产生抗HBs抗体。
5-2、适用于乙型肝炎的治疗治疗乙型肝炎，目前主要使用抗病毒剂。但是，已知由于长期给予抗病毒剂，抗病毒剂不起作用的变异病毒高频率出现。结果，乙型肝炎病毒量再度上升，有导致肝炎恶化的危险性。
因此，如果使用本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，预想可以降低这种变异病毒的出现频率，认为这是乙型肝炎的治疗中的一大优点。
另外，肝移植对象等正在给予免疫抑制剂的人，由于处于免疫抑制状态，通常的HB疫苗不起作用，不能产生抗HBs抗体。但是，已知乙型肝炎相关肝移植中，维持抗HBs抗体值对治疗成绩有很大的好的影响，所以患者移植后，需要以2周1次的频率给予抗HBs人免疫球蛋白。这给患者带来一年约250万日元的负担，需要世界性地来解决这个经济性问题。
因此，认为通过将本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞给予患者，患者变得能够产生抗HBs抗体。而且，根据后述实验例11的结果，预想将本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，例如以3～6个月1次的频率给药，可以维持10mIU/ml以上的抗HBs抗体值。由此认为，如果使用本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，与使用抗HBs人免疫球蛋白相比，可以大幅降低给药频率，结果可以大幅度减轻患者的经济负担。
另外，现有的HB疫苗为乙型肝炎的预防疫苗，乙型肝炎的治疗疫苗始终只是用于试验。
相反，如上所述，根据本实施方式，使用HB疫苗制备的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，使现有的HB疫苗不仅能用于乙型肝炎的预防，还能用于治疗。这可以说，扩大了现在实际中使用的、确认了安全性、有效性的HB疫苗的使用用途，可以进一步说，发现了提高现有的HB疫苗的效果的新的使用形态。
由此断定，本实施方式有关的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞具有广泛的使用用途和很大的优点。
6、疫苗激发树突细胞本实施方式有关的疫苗激发树突细胞由包括用疫苗激发树突细胞的步骤的方法得到。据此，可以提供对疾病的预防或治疗有效的疫苗激发树突细胞。
上述方法可以进一步包括从血液得到树突细胞的步骤。
另外，上述方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。上述生物可以为人。
另外，疫苗的添加时期，只要结果上疫苗中含有的抗原能通过树突细胞呈递，没有特别限定，例如，可以在分化诱导树突细胞后添加。另外，也可以在分化诱导时添加疫苗，一起培养。另外，疫苗的激发时间，只要结果上疫苗中含有的抗原能通过树突细胞呈递，没有特别限定，例如可以为8小时～24小时。
作为疫苗，只要结果上上述疫苗中含有的抗原能通过树突细胞呈递，没有特别限定，例如，可以使用活性疫苗、非活性疫苗、类毒素、抗毒素等。另外，疫苗的形态，只要结果上上述疫苗中含有的抗原能通过树突细胞呈递，没有特别限定，例如，可以使用液状疫苗、沉降型疫苗、冻干疫苗等。
作为本实施方式可以使用的疫苗的例子，例如有百日咳疫苗、白喉类毒素、破伤风类毒素、脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、日本脑炎疫苗、流感疫苗、BCG疫苗等结核疫苗、流行性腮腺炎疫苗、水痘疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、肺炎球菌疫苗、黄热疫苗、狂犬病疫苗、霍乱疫苗、秋令热钩端螺旋体病混合疫苗、饭匙倩抗毒素、蝮蛇抗毒素、鼠疫疫苗、MMR疫苗、肠伤寒疫苗、流感b菌结合型疫苗、髓膜炎菌疫苗、痢疾疫苗、疟疾疫苗等。再者，本实施方式可以使用的疫苗并不只限于这里例示的。
上述疫苗可以是疾病的预防或治疗疫苗。例如，上述疫苗可以是肝炎疫苗。上述肝炎疫苗，例如，可以是含有HBs抗原的HB疫苗。
7、疫苗激发树突细胞的制备方法本实施方式有关的疫苗激发树突细胞的制备方法包括用疫苗激发树突细胞的步骤。据此，可以得到对疾病的预防或治疗有效的疫苗激发树突细胞。
上述制备方法可以进一步包括从血液得到上述树突细胞的步骤。据此，可以从来自血液的树突细胞得到本发明有关的疫苗激发树突细胞。另外，如果使用血液，采用现有公知的方法等，通过比较简便的操作便可以得到树突细胞。
另外，上述制备方法可以进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
上述生物可以为人。据此，可以得到对人的疾病的预防或治疗有效的疫苗激发树突细胞。
另外，上述疫苗可以是疾病的预防或治疗疫苗。据此，可以提供对上述疾病的预防或治疗有效的疫苗激发树突细胞。
上述疫苗可以是肝炎疫苗。据此，可以提供能够安全且有效地用于生物例如包括正常人群在内的人的、对肝炎的预防或治疗有效的、具有肝炎病毒抗原呈递能力的肝炎疫苗激发树突细胞。
上述肝炎疫苗，例如，可以是含有HBs抗原的HB疫苗。据此，可以提供能够安全且有效地用于生物例如包括正常人群在内的人的、对乙型肝炎的预防或治疗有效的、具有HBs抗原呈递能力的肝炎疫苗激发树突细胞。
8、含有疫苗激发树突细胞的组合物本实施方式有关的组合物可以含有本实施方式有关的疫苗激发树突细胞。
另外，本实施方式有关的组合物可以进一步含有疫苗添加剂。
本实施方式中，“本实施方式有关的组合物进一步含有疫苗添加剂”指疫苗添加剂包含在本实施方式有关的组合物全体中的某处的状态。即，含有疫苗添加剂的场所没有特别限定，可以是本实施方式有关的组合物中的树突细胞之外、之中、细胞膜上等任一处。可以判定，本实施方式有关的组合物通过含有疫苗添加剂，作为抗原使用疫苗中含有的抗原，可得到本实施方式有关的疫苗激发树突细胞。
作为疫苗添加剂，例如可列举保存剂、抗生素、稳定剂、防腐剂、免疫增强剂、缓冲剂、等渗透剂、着色剂等。作为具体实例，作为保存剂，例如有乙基汞硫代水杨酸钠、福尔马林等；作为抗生素，例如有红霉素、红霉素乳糖酸盐、硫酸卡那霉素等及其他添加剂。作为其他添加剂，例如有精制白糖、L-谷氨酸一钠、明胶、乳糖、谷氨酸钾、D-山梨糖醇、人血清白蛋白、聚山梨酸酯80、甘氨酸、葡萄糖、氢氧化钠、硫酸铝钾、氯化铝、醋酸、乙酸钠、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢钠、氯化钠、酚红、L-盐酸精氨酸、磷酸氢二钠、磷酸一钾、L-精氨酸、盐酸赖氨酸等。这些其他添加剂，可以作为稳定剂、防腐剂、免疫增强剂、缓冲剂、等渗透剂、着色剂添加。再者，疫苗添加剂并不局限于这些。
本实施方式有关的组合物可以为实验试剂或实验试剂盒。据此，本实施方式有关的疫苗激发树突细胞可以以适于各种研究的形态使用。作为可以使用的研究领域，例如，有关该疾病的信号传递机制的研究、关于使用树突细胞的免疫疗法的研究。另外，例如，也可以用于关于该疾病的预防或治疗研究，例如基因、RNA、肽、蛋白质、化合物、医药、细胞因子等的筛选等目的。
另外，本实施方式有关的组合物可以为医药组合物。本实施方式有关的医药组合物，例如，可以以直接给予生物体内的形态使用，以及在生物体外与其他物质和细胞混合的形态使用。
另外，本实施方式有关的组合物可以是免疫应答激活制剂。本实施方式有关的免疫应答激活制剂，例如可以以直接给予生物体内的形态使用，以及在生物体外与其他物质和细胞混合的形态使用。
作为本实施方式有关的组合物在生物体外使用的形态，例如，本实施方式有关的免疫应答激活制剂与T细胞混合，通过将疫苗中含有的抗原表位呈递给T细胞而激活T细胞的使用方法。另外，该T细胞可以给予生物体内使用。
另外，作为将本实施方式有关的组合物直接给予生物体内的形态，例如，作为细胞疫苗的注射和滴注。作为细胞疫苗，优选疾病的预防或治疗疫苗。另外，作为将本实施方式有关的组合物直接给予生物体内的部位，例如有静脉内给药、动脉内给药、胸腔内给药、腹腔内给药、皮下给药、肌肉内给药、组织内(例如肝脏等)给药、淋巴结给药等。从给药的简便性的观点看，优选皮下注射。
9、使用疫苗激发树突细胞预防或治疗疾病本实施方式有关的疫苗激发树突细胞可以用于疾病的预防或治疗。
本实施方式有关的疫苗激发树突细胞，例如，可以与现有的该疾病的预防或治疗方法组合使用。
另外，本实施方式有关的疾病的预防或治疗可以包括将疫苗激发树突细胞给予生物的步骤。作为上述生物，例如可以是能够感染上述疾病的生物。另外，如果能抑制排斥反应，产生树突细胞的生物和成为给药对象的生物可以是同种生物，也可以是异种生物。同种生物的场合，可以将本实施方式有关的树突细胞给予取出树突细胞的自体内，也可以给予组织适合性抗原一致到可以给药的程度的异体内。
例如上述生物可以为人。这种场合，希望HLA配型尽可能一致。因此，树突细胞的由来优选来自于有血缘关系的提供者的树突细胞。如果使用自家细胞，不需考虑HLA配型适合性，所以更加优选来自给药对象本人的树突细胞。
本实施方式有关的疫苗激发树突细胞，如上所述，可以以直接给予生物体内的形态使用，以及在生物体外与T细胞混合而激活T细胞，该T细胞可以以给予生物体内的形态使用。但是，由于T细胞为效应细胞，起一次作用后，短时间内便死亡、消失。因此，为了预防、治疗疾病，需要高频率反复给予T细胞。而树突细胞也作用于原初T细胞、记忆T细胞、B细胞，由于反复给与刺激，具有长时间且强力的效果。由此，认为本实施方式有关的疫苗激发树突细胞更加优选以直接给予生物体内的形态使用。
10、本实施方式有关的疫苗激发树突细胞的使用例及其效果下面示出本实施方式有关的疫苗激发树突细胞的使用例及其效果。本使用例中，可以包括将本实施方式有关的疫苗激发树突细胞给予人的步骤。本使用例可以适用于疾病的预防或治疗。再者，本使用例不只限于以下的场合，本使用例有关的树突细胞的使用形态，可以在不超出本发明的要点的范围内做各种变更。
目前，癌症治疗等中进行的树突细胞疫苗疗法中，使用从癌细胞提取的物质激发树突细胞。如背景技术项中所述，从细胞提取的物质一般为多种物质的混合物。因此，认为使用细胞提取物质激发的树突细胞通过细胞提取物质中的多种抗原被激发。认为这样处理的树突细胞是包括呈递不能特定的抗原以及与疾病无关的抗原的树突细胞的、具有抗原呈递能力的多种树突细胞的集团。这样制成的树突细胞疫苗在癌症治疗等领域已经批准用于治疗患病患者，但没有批准给予正常人群。因此，还不能作为正常人群为了预防疾病用的树突细胞疫苗。
对此，本实施方式的疫苗激发树突细胞可以通过使用疫苗激发树突细胞而制备。实际上作为疫苗上市的是确认对包括正常人群在内的人有安全性、有效性，并获得批准的疫苗。因此，本实施方式的用疫苗激发的树突细胞，作为用于疾病的治疗树突细胞疫苗，不仅可以用于患者，作为用于疾病的预防树突细胞疫苗，也可以用于正常人群。
另外，例如关于结核，日本战后患者数虽然顺利减少，但是，从1980年前后起，减少率变慢，1997年起患者数连续3年增加。另外，治疗结核必需长期给予抗结核剂，由此产生耐药菌的可能性非常高，为了防止耐药菌的产生，2种以上多剂并用是铁的规则。
本实施方式有关的疫苗激发树突细胞可以用于治疗结核。这里，作为本实施方式有关的疫苗激发树突细胞，可以使用由用包括BCG疫苗等结核疫苗激发的步骤的方法得到的疫苗激发树突细胞。据此，预想可以降低如上所述的耐药菌的出现频率，认为这是结核的治疗中的一大优点。另外，关于其他疾病，通过用疫苗激发树突细胞治疗可以期待同样的效果，预想治疗该疾病也有很大优点。
另外，作为使树突细胞呈递抗原的另一方法，已知通过将抗原编码基因插入质粒载体等中转染，或插入病毒载体等中使感染，在树突细胞内使目的抗原表达的方法。但是，现在，虽然已经批准了将进行这种基因操作的树突细胞用于治疗患病患者，但是还没有批准用于正常人群预防疾病。
对此，本实施方式的疫苗激发树突细胞，如上所述，不仅可以作为对患者疾病的治疗疫苗使用，还可以作为对正常人群疾病的预防疫苗使用。
另外，疫苗无效的患者，认为原因之一是树突细胞功能低下。即，认为目前的只给予生物体的疫苗，为不能充分激活树突细胞的状态。
因此，本实施方式有关的疫苗激发树突细胞，例如，通过以直接给予生物体内的形态使用，以及在生物体外与T细胞混合而激活T细胞，将该T细胞给予生物体内的形态使用，对于目前疫苗无效、不能产生抗体的正常人群，也能使产生对目的抗原的抗体。
由此认为，本实施方式有关的疫苗激发树突细胞具有广泛的使用用途和很大的优点。另外，认为使用本实施方式有关的疫苗激发树突细胞预防或治疗疾病，与以往的树突细胞疫苗疗法完全区分开。
再者，具体实施方式
项中的6～10中的激发的定义、激发的具体方法、得到树突细胞的方法、培养树突细胞的培养基和细胞因子、疫苗添加剂的检测方法等，只要没有特别记载，可以使用与该项的1～5中记载的相同的解释、方法、物质。
实施例1下面根据实验例具体说明本发明，可是本发明并不只限于本实施例。
(实验例1)树突细胞的配制(1)使用用肝素(Novo-heparin注1000Aventis公司生产)润湿内腔的注射器(Terumo Syringe SS-50ESZTerumo公司生产)，从每个受试者(以已经有反复给予HB疫苗经验的健康志愿者5人为对象)采血40～60ml。将得到的血液与和血液同量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)在专用洁净工作台内充分混合。然后，根据使用Ficoll-Conray液(比重1.077)的比重离心法，分离单核细胞。于室温、1800rpm～3000rpm下离心30分钟，将离心后的中间层作为单核细胞取出。
(2)同时，按以下步骤，从各受试者得到自身血清。首先，使用不用肝素的另一注射器(Terumo Syringe SS-10ESZTerumo公司生产)，从每个受试者采血约10ml。然后，将得到的血液用灭菌过的Vacutainer真空采血管(Becton Dickinson公司生产)，于3000rpm下离心，分离血清。
(3)在(1)得到的单核细胞中加入PBS，充分混合。然后，将该样品于4℃、1800rpm～2700rpm下离心10分钟，按与(1)同样的步骤，再度回收单核细胞。将该操作最低重复2次，充分洗涤单核细胞。
(4)计数由(3)得到的单核细胞，以2×106～2×107/ml的细胞密度，每个35mm培养皿中加入2ml。培养基使用以1～5％浓度加入(2)得到的各受试者的自身血清的RPMI 1640培养基(Nipro公司生产、)。在专用培养室内，于37℃、5％CO2浓度、75％空气的条件下进行培养。
(5)将(4)的单核细胞培养90分钟后，按以下步骤，分离附着细胞。首先，从培养室取出培养皿，在洁净工作台内静置5分钟。然后，使培养皿倾斜，培养液慢慢撒到附着细胞全体，洗涤，去除淋巴细胞。
(6)将(5)得到的附着细胞(单核细胞)，关于每个培养皿，用加入GM-CSF(PeproTech EC公司生产)800U/ml、IL-4(PeproTech EC公司生产)500U/ml、自身血清1～5％的RPMI 1640培养基2ml，培养4天。
(7)培养第4天，弃去1ml培养上清，新加入(6)记载的组成的培养基1ml，再培养4天。
(8)培养第8天，从培养皿回收树突细胞，测定树突细胞数。
(实验例2)用HB疫苗激发树突细胞(1)将实验例1得到的树突细胞分成2份。1份树突细胞中添加HB疫苗(r-HB疫苗“Mitsubishi”三菱welpharm公司生产)，使最终浓度达到2.5～5μg/ml，培养8～24小时，制备用HBs抗原激发的树突细胞(以下，将该细胞记为“HB疫苗激发树突细胞”)。在专用培养室内，于37℃、5％CO2浓度、75％空气的条件下进行培养。另一份树突细胞，不添加HB疫苗，培养，作为阴性对照。
(2)培养后，从培养皿回收HB疫苗激发树突细胞。将回收的细胞与PBS混合，于4℃、1500rpm下离心5分钟后，弃去上清。通过重复5次该操作，将树突细胞充分洗涤。将得到的树突细胞加到500μlPBS中。另外，关于阴性对照的树突细胞也进行同样的操作。
(实验例3)给予HB疫苗激发树突细胞(1)测定给予HB疫苗激发树突细胞前的抗HBs抗体。首先，从5名受试者(已经有反复给予HB疫苗经验的健康志愿者)采血，用与实验例1(2)同样的方法，从各受试者得到血清。使用该血清，根据CLIA法测定抗HBs抗体值。结果如图1所示。由图1可知，受试者5人中，2人能够产生抗HBs抗体(抗HBs抗体阳性，应答者)，3人不能产生抗HBs抗体(抗HBs抗体阴性，无应答者)。
(2)给予受试者HB疫苗激发树突细胞。首先，使用实验例2得到的HB疫苗激发树突细胞500μl中的50μl，对各受试者进行对于各自树突细胞的刺皮试验。结果，全部受试者中刺皮试验均为阴性。然后，各受试者皮下给予各自的HB疫苗激发树突细胞450μl。再者，实验例1～实验例3所示的HB疫苗激发树突细胞的制备、给予过程中，作业者应穿戴灭菌工作服、灭菌口罩、灭菌帽子进行作业，操作尽可能在洁净工作台内进行。使用试剂为购入的灭菌过的试剂(PBSInvitrogen公司生产，RPMI 1640Nipro公司生产等)。使用时，用肉眼及显微镜确认试剂不混浊。另外，通过测定培养上清中的内毒素，确认培养过程中没有微生物引起的污染。
(实验例4)HB疫苗激发树突细胞的表面抗原解析使用流式细胞仪进行细胞表面抗原的解析。
(1)将实验例2得到的HB疫苗激发树突细胞以及没有激发的树突细胞于5℃、1500rpm下离心5分钟，回收。回收的细胞用FCM PBS(pH7.22Kibco公司生产)洗涤，再于5℃、1500rpm下离心5分钟，回收。
(2)将(1)得到的各树突细胞分到4个Spitz管中，加入(a)FITC标记小鼠IgG(Cat.No.349041Becton Dickinson公司生产)10μl、(b)PE标记小鼠IgG(Cat.No.349043Becton Dickinson公司生产)2μl、(c)FITC标记小鼠抗人HLA-DR单克隆抗体(PM-32414XBectonDickinson公司生产)10μl、(d)PE标记抗人CD86(B70/B7-2)(Mat.No.555658Pharmingen公司生产)10μl，制备样品。将其在冰中放置30分钟，加入溶胞溶液(lysing solution)(Becton Dickinson公司生产)2ml，混合，于5℃、2000rpm下离心5分钟。
(3)将回收的树突细胞用FCM PBS(PH7.22)反复充分洗涤后，使用FACScalibur(Becton Dickinson公司生产)解析表面抗原。
(4)解析的结果如图2所示。图2的横坐标轴表示解析的表面抗原，纵坐标轴表示表面抗原的相对浓度。由该结果可知，HB疫苗激发树突细胞与没有激发的树突细胞相比，HLA-DR的表达上升1.2倍，CD86的表达上升1.6倍。由这些结果可知，HB疫苗激发树突细胞成熟。
(实验例5)HB疫苗激发树突细胞的功能解析-1(1)从没有注射疫苗的他人的末梢血中，与实验例1(1)同样地采集单核细胞。
(2)使用autoMACS(Miltenyi Biotec公司生产)、PanT细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec公司生产)，进行从单核细胞分离T细胞的操作。首先，每1×107的单核细胞中加入MACS-Buffer，达80μl，再加入20μl半抗原标记抗体混合物(CD11b、CD16、CD19、CD36、CD56、)，于6～12℃下混合10分钟。然后，加入MACS-Buffer洗涤，进行2次除去上清的操作。接着，每1×107的单核细胞中加入MACS-Buffer，达80μl，再加入20μl MACS抗半抗原抗体标记玻璃细珠，于6～12℃下混合15分钟。然后，加入MACS-Buffer洗涤，除去上清。接着，每1×107的单核细胞中加入500μl MACS-Buffer，用autoMACS分选程序进行分选，采集T细胞。
(3)在(a)没有激发的树突细胞1×104细胞、(b)HB疫苗激发树突细胞1×104细胞中，分别加入(2)得到的T细胞2×105细胞，培养108小时。培养基使用加入了10％FCS(Filtron公司生产)的RPMI 1640培养基。
(4)分别添加用3H标记的胸苷，再培养12小时后，从培养皿回收细胞。
(5)使用γ线计数器(LS6500Beckman公司生产)，评价摄取能力，结果如图3所示。图3的纵坐标轴表示胸苷的摄取能力、横坐标轴从左边起表示(3)中所示的(a)、(b)的场合。由该结果可知，对于HLA不一致的T细胞，HB疫苗激发树突细胞与没有激发的树突细胞相比，T细胞幼稚化辅助能力上升1.5～2倍。
(实验例6)HB疫苗激发树突细胞的功能解析-2(1)从受试者(已经有反复给予HB疫苗经验的健康志愿者，且是HB疫苗应答者)每人采血60ml，用实验例1(1)、实验例5(2)的方法采集T细胞(以下，将该T细胞记为“HBs记忆-T细胞”)。
(2)用实验例1的方法从相同受试者采集树突细胞，分成2份。1份树突细胞用实验例2的方法，作为HB疫苗激发树突细胞，另一份树突细胞，不用HB疫苗激发，作为阴性对照。
(3)将(a)HBs记忆-T细胞1×105细胞和HB疫苗10μg、(b)HBs记忆-T细胞1×105细胞和没有激发的树突细胞1×104细胞、(c)HBs记忆-T细胞1×105细胞和HB疫苗激发树突细胞1×104细胞，分别混合培养。
(4)7天后，在测定的12小时前，给予用3H标记的胸苷，与实验例5(5)同样地，使用γ线计数器测定胸苷摄取能力。
(5)结果如图4所示。图4的纵坐标轴表示相对cpm比，横坐标轴从左边起表示(3)中记载的(a)、(b)、(c)的场合。由该结果可知，与(b)的与没有激发的树突细胞混合培养的场合相比，(c)的与HB疫苗激发树突细胞混合培养的cpm达到7倍，HBs记忆-T细胞增殖。
(实验例7)HB疫苗激发树突细胞的功能解析-3(1)从受试者(已经有反复给予HB疫苗经验的健康志愿者，且是HB疫苗应答者)每人采血60ml，用实验例1(1)的方法采集单核细胞。
(2)将单核细胞6×107细胞与(a)什么也不混合、(b)HB疫苗10μg、(c)没有激发的树突细胞1×105细胞、(d)HB疫苗激发树突细胞1×105细胞，分别混合培养。培养条件与实验例1(4)相同。
(3)5天后，回收培养上清，根据CLIA法测定抗HBs抗体值。
(4)结果如图5所示。图5的纵坐标轴表示抗HBs抗体值，横坐标轴从左边起表示(2)中记载的(a)、(b)、(c)、(d)的场合。由该结果可知，HB疫苗和没有激发的树突细胞混合的场合，不能产生抗HBs抗体，HB疫苗激发树突细胞混合的场合，能够产生15～56mIU/ml抗HBs抗体。
(实验例8)给予HB疫苗激发树突细胞伴随的过敏反应试验(0～24小时)(1)实验例3中，各受试者皮下给予HB疫苗激发树突细胞后，于0～24小时确认有无给予疫苗伴随的炎症等过敏反应。
(2)其结果，给予HB疫苗激发树突细胞的受试者5人，均没有出现发热、发红、休克等急性期过敏反应。因此，确认HB疫苗激发树突细胞安全。
(实验例9)通过血液生化检查的安全性试验(第0、1、3、14天)(1)为了进一步确认实验例3中给予受试者HB疫苗激发树突细胞的安全性，对于各受试者，进行关于CBC、肝功能、肾功能等的50个项目以上的检查。代表性检查项目如图6所示。
(2)ALT、CRP、PT、肌酸酐检查结果如图7～10所示。各图的横坐标轴表示自给予起的天数，纵坐标轴表示检查项目及其值。结果，给予HB疫苗激发树突细胞的受试者5人，血液生化检查均未见异常。由此可知HB疫苗激发树突细胞安全。
(实验例10)关于使用血清生化检查的自体免疫反应的安全性试验(第0、14天)(1)为了研究实验例3中给予受试者的HB疫苗激发树突细胞有无引起自体免疫反应，进行了IgG量、IgM量的测定、甲状腺试验、微粒体试验、抗核抗体等自身抗体检查。
(2)结果如图11所示。结果，给予HB疫苗激发树突细胞的受试者5人，均没有发现自体免疫反应。由此可知，HB疫苗激发树突细胞安全。
(实验例11)体内HB疫苗激发树突细胞的抗HBs抗体诱导能力的评价(第0天、第2、3、4、12周)(1)用实验例1(2)的方法，从实验例3中给予HB疫苗激发树突细胞的各受试者采集血清，根据CLIA法测定抗HBs抗体值。
(2)结果如图12、13、14所示。图12、14的横坐标轴表示自给予起的周数、纵坐标轴表示抗HBs抗体值。另外，图13是将图12的图表的值数值化。图14是表示HB疫苗无应答者的受试者的抗HBs抗体值的变化的图。图12、13的结果，通过给予1次HB疫苗激发树突细胞，关于HB疫苗无应答的受试者3人，有2人变得可以产生抗HBs抗体。另外，关于HB疫苗应答者的受试者2人，抗HBs抗体值也上升。由于这4例受试者抗HBs抗体值为10mIU/ml以上，所以认为通过给予1次HB疫苗激发树突细胞，便可产生预防或治疗乙型肝炎的充足量的抗体。另外，由图14的结果可知，该HB疫苗应答者的受试者，10mIU/ml以上的抗HBs抗体值至少可以维持3个月。
权利要求
1.具有HB s抗原呈递能力的树突细胞，其由包括用HB s抗原激发树突细胞的步骤的方法得到。
2.权利要求1所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞，其中，上述方法进一步包括从血液得到上述树突细胞的步骤。
3.权利要求2所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞，其中，上述方法进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
4.权利要求3所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞，其中，上述生物为人。
5.权利要求1所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞，其中，上述HB s抗原是HB疫苗中含有的HB s抗原。
6.具有HB s抗原呈递能力的树突细胞的制备方法，所述方法包括用HB s抗原激发树突细胞的步骤。
7.权利要求6所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞的制备方法，所述方法进一步包括从血液得到上述树突细胞的步骤。
8.权利要求7所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞的制备方法，所述方法进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
9.权利要求8所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞的制备方法，其中，上述生物为人。
10.权利要求6所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞的制备方法，其中，上述HB s抗原为HB疫苗中含有的HB s抗原。
11.含有权利要求1～5之任一项所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞的组合物。
12.权利要求11所述的组合物，其进一步含有HB疫苗添加剂。
13.权利要求11或12所述的组合物，其中，上述组合物为实验试剂或实验试剂盒。
14.权利要求11或12所述的组合物，其中，上述组合物为医药组合物。
15.权利要求11或12所述的组合物，其中，上述组合物为免疫应答激活制剂。
16.权利要求11或12所述的组合物，其中，上述组合物为细胞疫苗。
17.权利要求16所述的组合物，其中，上述细胞疫苗为乙型肝炎的预防或治疗疫苗。
18.乙型肝炎的预防或治疗方法，所述方法使用权利要求1～5之任一项所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞。
19.乙型肝炎的预防或治疗方法，所述方法包括将权利要求1～5之任一项所述的具有HB s抗原呈递能力的树突细胞给予生物的步骤。
20.权利要求19所述的乙型肝炎的预防或治疗方法，其中，上述生物为人。
21.疫苗激发树突细胞，其由包括用疫苗激发树突细胞的步骤的方法得到。
22.权利要求21所述的疫苗激发树突细胞，其中，上述方法进一步包括从血液得到上述树突细胞的步骤。
23.权利要求22所述的疫苗激发树突细胞，其中，上述方法进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
24.权利要求23所述的疫苗激发树突细胞，其中，上述生物为人。
25.权利要求21所述的疫苗激发树突细胞，其中，上述疫苗为疾病的预防或治疗疫苗。
26.权利要求21所述的疫苗激发树突细胞，其中，上述疫苗为肝炎疫苗。
27.权利要求26所述的疫苗激发树突细胞，其中，上述肝炎疫苗为含有HB s抗原的HB疫苗。
28.疫苗激发树突细胞的制备方法，所述方法包括用疫苗激发树突细胞的步骤。
29.权利要求28所述的疫苗激发树突细胞的制备方法，其进一步包括从血液得到上述树突细胞的步骤。
30.权利要求29所述的疫苗激发树突细胞的制备方法，其进一步包括从生物采集上述血液的步骤。
31.权利要求30所述的疫苗激发树突细胞的制备方法，其中，上述生物为人。
32.权利要求28所述的疫苗激发树突细胞的制备方法，其中，上述疫苗为疾病的预防或治疗疫苗。
33.权利要求28所述的疫苗激发树突细胞的制备方法，其中，上述疫苗为肝炎疫苗。
34.权利要求33所述的疫苗激发树突细胞的制备方法，其中，上述肝炎疫苗为含有HB s抗原的HB疫苗。
35.含有权利要求21～27之任一项所述的疫苗激发树突细胞的组合物。
36.权利要求35所述的组合物，其进一步含有疫苗添加剂。
37.权利要求35或36所述的组合物，其中，上述组合物为实验试剂或实验试剂盒。
38.权利要求35或36所述的组合物，其中，上述组合物为医药组合物。
39.权利要求35或36所述的组合物，其中，上述组合物为免疫应答激活制剂。
40.权利要求35或36所述的组合物，其中，上述组合物为细胞疫苗。
41.权利要求40所述的组合物，其中，上述细胞疫苗为疾病的预防或治疗疫苗。
42.疾病的预防或治疗方法，所述方法使用权利要求21～27之任一项所述的疫苗激发树突细胞。
43.疾病的预防或治疗方法，所述方法包括将权利要求21～27之任一项所述的疫苗激发树突细胞给予生物的步骤。
44.权利要求43所述的疾病的预防或治疗方法，其中，上述生物为人。
全文摘要
本发明提供对疾病，主要是乙型肝炎的预防、治疗有效的树突细胞。由包括用HBs抗原激发树突细胞的步骤的方法得到的具有HBs抗原呈递能力的树突细胞，作为树突细胞疫苗，对乙型肝炎的预防、治疗有效。作为HBs抗原，可以使用HB疫苗中含有的HBs抗原。由包括用疫苗激发树突细胞的步骤的方法得到的疫苗激发树突细胞，作为树突细胞疫苗，不仅可以用于患者，也可以用于正常人群。作为激发中使用的疫苗，可以使用各种疫苗。
文档编号C12N5/08GK1680549SQ20041007862
公开日2005年10月12日 申请日期2004年9月14日 优先权日2004年4月6日
发明者Sk.·Md.·法兹勒·阿克巴尔, 恩地森一 申请人:四国技术网络株式会社