分离核酸的方法

专利名称：分离核酸的方法
技术领域：
本发明涉及核酸的纯化。特别地，本发明涉及将存在于含水吸附液中的核酸吸附到固体基材上的方法。
背景技术：
许多生物物质，特别是核酸，目前特有的问题是将它们与它们所在的自然环境相分离。一方面，它们通常以非常小的浓度存在，另一方面，通常发现它们存在于许多其它固体和溶解物质中，如存在于胞溶之后的物质中。这使它们难以分离或测量，特别是在检测特定核酸或检测核酸的特定性质的生物特异性试验中。这种生物特异性试验在诊断学和生物分析领域的研发中起重要作用。生物特异性试验的例子为杂交试验、免疫试验、和受体-配体试验。杂交试验使用特定的碱基对用于核酸分析物如RNA和DNA的分子检测。因此，长度为18到20个核苷酸的寡聚核苷酸探针能够特异性识别所选择的如人类基因组中的互补序列。另一个需要两种寡聚核苷酸引物选择性结合的试验是US4,683,195中描述的聚合酶链式反应(PCR)。该方法通过在若干循环中在脱氧核苷酸三磷酸的存在下，通过热稳定的聚合酶将特定的核酸区域选择性扩增到可检测的水平。
如上所述，核酸在上述试验之一中进行分析或用于其它方法之前，需要将它们从包含不同组分如蛋白质和非蛋白质组分的复合混合物的生物样品中分离或纯化。通常，对于第一步，使用使在研组分即核酸富集的方法。经常地，这些组分包含于细菌细胞、真菌细胞、病毒粒子、或更复杂生物体的细胞如人血细胞或植物细胞中。核酸作为在研组分也可以称为“靶组分”。
为释放所述细胞或粒子的内容物，它们可用酶或化学品处理，使这些生物体的细胞壁和细胞膜溶解、降解或变性。该方法通常称为胞溶。得到的包含这种胞溶物质的溶液称为胞溶产物。在胞溶过程中经常遇到的问题是降解靶组分的其它酶如脱氧核糖核酸酶或核糖核酸酶在胞溶过程中与靶组分接触。这些降解酶也可在胞溶之前存在于细胞外部或在不同的细胞隔室内在空间上被分开，而现在接触到靶组分。该方法期间释放的其它组分可为如属于脂多糖类的内毒素，其对细胞有毒性并能够使人类或动物治疗用产品出现问题。
在样品制备的胞溶步骤之后的下一步中，进一步使核酸富集。通常在用于基于探针的试验之前将核酸从复杂的胞溶混合物中提取出来。核酸的提取有几种方法。序列依赖性或生物特异性的方法包括例如亲和色谱法或与固定探针的杂交。序列非依赖性或物化方法包括例如使用苯酚-氯仿的液-液提取法、用纯乙醇或异丙醇沉淀、用滤纸提取、用胶束形成试剂如十六烷基三甲基溴化铵提取、与固定的嵌入染料如吖啶衍生物结合、吸附于基材如硅胶或硅藻土上、在离液序列高的条件下吸附于可磁吸引的玻璃粒子(MGP)或有机硅烷粒子。优选核酸与具有二氧化硅表面的基材直接结合，原因之一为核酸无需修饰，并且甚至天然的核酸也可以结合。
虽然可使用其它的表面，但用于提取目的的特别兴趣在于将核酸吸附到玻璃表面上。
近年来已经提出通过使用核酸与基材如玻璃表面的结合行为将核酸与它们的自然环境分离的许多过程。当想要使核酸游离时，经常使用离液剂如硫氰酸胍或阴离子的、阳离子的、两性离子的或非离子的洗涤剂。还可以有利地使用迅速降解这些酶或多余蛋白质的蛋白酶类。在例如细胞胞溶和/或细胞器如线粒体、质体、细胞核或其它含核酸的细胞器胞溶之后游离的核酸，可通过如下方式纯化核酸使其结合于基材如无机物载体，洗涤结合有核酸的所述无机物载体，并使所述核酸从所述无机物载体释放，即解吸。对于洗涤步骤的条件，由本领域的技术人员进行选择，在所选的洗涤条件下，使核酸保持吸附于无机物载体上。优选地，大于40％，更优选大于50％，更优选大于70％，更优选大于80％，更优选大于90％，更优选大于95％，更优选大于99％的核酸保持吸附于无机物载体上。对于解吸步骤条件，由本领域的技术人员进行选择，在所选条件下，使核酸从无机物载体释放。优选地，大于40％，更优选大于50％，更优选大于70％，更优选大于80％，更优选大于90％，更优选大于95％，更优选大于99％的核酸被从无机物载体释放。
在离液盐的存在下将核酸吸附于玻璃粒子或二氧化硅粒子在本领域是已知的(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)第615-619页)并且为核酸的色谱纯化和分离过程奠定了基础。本领域还已知使用高浓度的离液盐如碘化钠、高氯酸钠、和硫氰酸胍从胞溶产物中分离和纯化RNA和DNA的方法(Boom，R.等人，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503；Yamada，O.等人，J.Virol.Methods 27(1990)203-209)。得自细菌的质粒DNA在高氯酸钠的存在下在玻璃粉上的纯化在Marko，M.A.等人，Anal.Biochem.121(1982)382-387中有所描述。在DE 3724442中，描述了通过用乙酸使噬菌体粒子沉淀并用高氯酸盐使噬菌体粒子胞溶而分离单链的M13噬菌体DNA。洗涤与玻璃纤维过滤器结合的核酸，然后用含甲醇的Tris/EDTA缓冲溶液洗脱。从λ噬菌体纯化DNA的类似过程在Jakobi，R.等人，Anal.Biochem.175(1988)196-201中有所描述。该过程要求核酸在离液盐溶液中选择性地与玻璃表面结合，并从污染物如琼脂糖、蛋白质或细胞残余物中分离核酸。为从污染物中分离玻璃粒子，可通过离心分离粒子或吸引液体使其通过玻璃纤维过滤器。然而，这是一个限制性步骤，防止使用该过程来处理大量的样品。
在通过加入盐和乙醇沉淀之后，使用磁性粒子固定核酸是更有利的，其在例如Alderton，R.P.等人，Anal.Biochem.201(1992)166-169和WO 91/00212中有所描述。在这个过程中，核酸与磁性粒子一起粘合。通过施加磁场使粘合物从原溶剂中分离并进行洗涤步骤。一次洗涤步骤之后，将核酸溶解于Tris缓冲溶液中。然而，这个过程有一个缺点，在于沉淀对于核酸不是选择性的。而是还粘合有多种固体和溶解物质。结果是，这个过程不能用于除去可能存在的显著量的特定酶促反应的任何抑制剂。磁性的多孔玻璃也是有市售的，其在多孔的特别是玻璃基质中包含磁性粒子，并由包含链亲和素的层覆盖。如果生物材料在复杂的制备步骤中经过修饰使得它们与生物素共价结合，则上述产物可用于分离这些生物材料，如蛋白质或核酸。可磁化的特定吸附剂被证明是非常有效的，并适用于自动样品制备。亚铁磁的和铁磁的以及超顺磁性颜料被用于这一目的。最优选的MGP为在WO01/37291中描述的那些。
通过在高浓度盐的存在下将核酸吸附于基材上如无机物基材来纯化核酸也适用于其它的复杂混合物。其例子是分子生物学领域的技术人员已知的，包括例如在核酸的体外合成如PCR、限制性内切酶消化、连接反应等之后得到的反应混合物。例如在Vogelstein，B.和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619中，提出了使琼脂糖凝胶中的核酸在碘化钠的存在下结合于研磨的燧石玻璃的过程。通过在高浓度盐的存在下将核酸吸附于基材上如无机物基材来纯化核酸的另一个应用是除去可能已经与核酸共同纯化的热原(pyrogenic)污染物。
还不完全清楚核酸在离液剂的存在下与无机物载体结合的机理。据假设，核酸和溶剂之间的相互作用受到影响而使核酸吸附于无机物载体并变性。在高浓度离液剂的存在下，反应几乎是定量的。被吸附的核酸可通过对无机物载体施用低离子强度的缓冲溶液洗脱。
EP 0 658 164描述了色谱纯化核酸的方法。核酸从具有高的盐浓度的、优选包含离液剂的含水吸附液中吸附于基材即无机物载体上。所述含水吸附液包括链长度为1％-50％的C1-C5脂族醇和/或聚乙二醇和/或疏水的无机聚合物和/或有机聚合物和/或有机酸如三氯乙酸。
本领域中目前的分离/纯化核酸的方法有某些缺点。这种缺点涉及如纯度、选择性、回收率、实验室安全性和方便性，以及涉及分离/纯化方法的速度。
例如，在使用苯酚/氯仿提取的方案中，残余的苯酚对于某些后分离过程，特别对于酶促反应如用限制性内切酶消化、聚合酶链式反应(PCR)、或连接酶介导的反应通常是一个问题。通常，纯化/分离方法的残余试剂的浓度升高可带来问题。因此，希望在纯化的核酸中保持尽可能低的在纯化过程中所用试剂的残余量。与纯度有关的另一个潜在问题是某些物质从吸附基质中共萃取(浸出)。因此，希望在纯化的核酸中保持尽可能低的在纯化过程中由浸出释放出的化合物的残余量。
本领域目前的在吸附液中使用乙醇或异丙醇的方案的另一个缺点为这种醇的高挥发性和易燃性。一方面，这些易燃的醇在实验室实践中是潜在危险。同时，根据国家法规的规定，易燃的醇可造成与可允许的储存和运输有关的后勤问题。另外，挥发性醇由于它们的蒸气压难以精确定量。因此，希望由危险较小或/和较少造成后勤问题的物质代替易燃醇。
用于制备核酸样品的市售示例性试剂盒为“High Pure”产品线(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)。将吸附液转移到“High Pure”柱并通过包含玻璃纤维材料的羊毛状物(fleece)。在这个方法过程中，核酸吸附于玻璃物质上。当使用Roche的“HighPure”试剂盒和在吸附液中使用乙醇从血清分离/纯化核酸的方案时，人们注意到血清中高的甘油三酯浓度导致吸附液通过玻璃纤维羊毛状物所需的时间延长(也参见实施例6)。因此，考虑到从具有高的甘油三酯浓度的血清制备样品时，希望找到乙醇的代替物，以减少吸附液通过玻璃纤维羊毛状物所需的时间。

发明内容
因此，本发明要解决的问题是提供可供选择的纯化核酸的方法，该方法在含水吸附液中使用可供选择的物质，以促进核酸与基材如无机物载体的结合。
令人惊讶地，已经发现如果高离子强度的吸附液包括含有式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物时，核酸可与基材结合， (式I)其中W为碳原子或硫原子，和Z为氧原子或氮原子。
因此，在本发明的第一个实施方案中提供纯化核酸的方法，其包括以下步骤a)将核酸从组合物吸附于基材上，所述组合物含有(i)缓冲水溶液、(ii)高浓度盐、和(iii)包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物、和(iv)核酸， (式I)其中W为碳原子或硫原子，和Z为氧原子或氮原子；b)任选地用洗涤液洗涤吸附有核酸的基材，然后，c)将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤(a)的组合物中盐的浓度，和d)将含有解吸核酸的溶液与基材分离，从而纯化核酸，和任选地(e)使解吸核酸从步骤(d)的溶液中沉淀并分离沉淀的核酸，从而进一步纯化核酸。
本发明的另一个实施方案是将核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步骤(a)提供核酸的水溶液，所述水溶液包含高浓度的盐和与水混溶的非酸性有机化合物，该有机化合物包含式I的官能团，其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子；然后(b)将步骤(a)的水溶液加入到基材上。
另外，本发明的另一个实施方案为将核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步骤(a)提供包含高浓度盐的核酸水溶液；(b)提供粉状材料形式的基材；(c)提供包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物，其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子；然后(d)将步骤(b)的基材分散在步骤(c)的与水混溶的非酸性有机化合物中，形成所述基材的悬浮液；和(e)将步骤(a)的水溶液与步骤(d)的悬浮液混合。
另外，本发明的另一个实施方案为含有粉状材料形式的基材的悬浮液，所述基材分散在与水混溶的非酸性有机化合物中，该有机化合物包含式I的官能团，其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子。
另外，本发明的另一个实施方案为与水混溶的非酸性有机化合物在实施本文所述的本发明的方法中的应用，所述与水混溶的非酸性有机化合物包含式I的官能团，其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子。另外，本发明的另一个实施方案为使用与水混溶的非酸性有机化合物用于制备悬浮液，通过将基材分散在所述与水混溶的非酸性有机化合物中形成所述基材的悬浮液，所述与水混溶的非酸性有机化合物包含式I的官能团，其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子。另外，本发明的另一个实施方案为本发明的悬浮液在实施本发明的方法中的应用。
本发明的其它实施方案为各组件的试剂盒(kit of parts)，包含与水混溶的非酸性有机化合物，该有机化合物包括式I的官能团，其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子。
还发现如果高离子强度的吸附液包含与水混溶的环状二醚时，核酸可与基材结合。
因此，本发明的另一个实施方案为纯化核酸的方法，其包括以下步骤a)将核酸从组合物吸附于基材上，所述组合物包含(i)缓冲水溶液、(ii)高浓度盐、(iii)与水混溶的环状二醚、和(iv)核酸；b)任选地用洗涤液洗涤吸附有核酸的基材；然后，c)将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤(a)的组合物中盐的浓度，和(d)将含有解吸核酸的溶液与基材分离，从而纯化核酸，和任选地(e)使解吸核酸从步骤(d)的溶液中沉淀并分离沉淀的核酸，从而进一步纯化核酸。
另外，本发明的另一个实施方案为将核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步骤(a)提供包含高浓度盐和与水混溶的环状二醚的核酸水溶液；和(b)将步骤(a)的水溶液加到基材上。
另外，本发明的另一个实施方案为将核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步骤(a)提供包含高浓度盐的核酸水溶液；(b)提供粉状材料形式的基材；(c)提供与水混溶的环状二醚；(d)将步骤(b)的基材分散在步骤(c)的与水混溶的环状二醚中形成所述基材的悬浮液；和(e)将步骤(a)的水溶液与步骤(d)的悬浮液混合。
另外，本发明的另一个实施方案为包含粉状材料形式的基材的悬浮液，所述基材分散在与水混溶的环状二醚中。
另外，本发明的另一个实施方案为与水混溶的环状二醚在实施本文所述的本发明的方法中的应用。另外，本发明的另一个实施方案为使用与水混溶的环状二醚，通过将所述基材分散在所述与水混溶的非酸性有机化合物中制备悬浮液，从而形成所述基材的悬浮液。另外，本发明的另一个实施方案为本发明的悬浮液在实施本发明的方法中的应用。
本发明的其它实施方案为包含与水混溶的环状二醚的各组件的试剂盒。
本发明的另一个实施方案为测定生物样品中核酸存在的方法，其包括以下步骤(a)使生物样品胞溶；(b)形成组合物，该组合物含有(i)步骤(a)的胞溶生物样品、(ii)缓冲水溶液、(iii)高浓度盐、(iv)包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物 (式I)
其中W为碳原子或硫原子，和Z为氧原子或氮原子；(c)将步骤(b)的组合物与基材接触，从而将核酸吸附于基材上；(d)任选地用洗涤液洗涤吸附有核酸的基材；然后，(e)将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤(a)的组合物中盐的浓度，和(f)将含有解吸核酸的溶液与基材分离，和(g)检测步骤(f)的溶液中核酸的存在，从而测定核酸的存在。优选地，通过核酸的扩增测定核酸，通过使用特异引物、特异性检测探针、和扩增混合物的聚合酶链式反应的方式进行扩增，从而实时监测扩增。
本发明的另一个实施方案为测定生物样品中核酸的存在的方法，其包括以下步骤(a)使生物样品胞溶；(b)形成组合物，该组合物含有(i)步骤(a)的胞溶生物样品、(ii)缓冲水溶液、(iii)高浓度盐、(iv)与水混溶的环状二醚，其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子；(c)将步骤(b)的组合物与基材接触，从而将核酸吸附于基材上；(d)任选地用洗涤液洗涤吸附有核酸的基材；然后，(e)将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤(a)的组合物中盐的浓度，和(f)将含有解吸核酸的溶液与基材分离，和(g)检测步骤(f)的溶液中核酸的存在，从而测定核酸的存在。
在本文中，可以理解，术语“核酸”表示至少一种核酸。另外，术语“核酸”还可能表示核酸的混合物。术语“核酸”包括RNA、DNA、或两者都包括。术语“基材”表示在水溶液中基本上不溶的物质，并且当加入高离子强度的核酸水溶液时，所述基材上可吸附核酸。因此，基材的例子为多孔或无孔无机物粒子，如二氧化硅、玻璃、石英、沸石、或其混合物。同时，术语“基材”包括涂有二氧化硅、玻璃、石英、或沸石的可被磁吸引的粒子。另外，可以理解，“粉末”或“粉状”材料形式的基材指精细粉碎的材料，当分散在液相如液体有机化合物或水溶液中时，其生成悬浮液。术语“粉末”或“粉状”材料包括其中粉状材料已经聚集的片，但是当与液体有机化合物或水溶液混和时，仍然得到悬浮液。另外，可以理解，术语“高离子强度”和“高浓度”指溶解的盐的浓度等于或大于约1M所生成的水溶液的离子强度或浓度。优选水溶液中存在的盐的浓度为1-10M。更优选离液盐的浓度为1到8M。另外，术语“与水混溶的”是指在室温和标准大气压力下非含水有机化合物可以以等于或大于1％(体积百分数)的比例溶解于水中，形成均相液相。术语“非酸性的”有机化合物表示没有羧基官能团的有机化合物。
详细而言，将(至少一种)核酸(也称为靶核酸)结合于基材如玻璃粒子上的过程可描述如下。优选在浓度为1到8mol/l，优选在2到6mol/l的离液盐的存在下进行，该离液盐可为碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍或盐酸胍。也可使用其它物质如氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物。
纯化效果得自在这些条件下，即在一定浓度的离液剂以及优选的与水混溶的非酸性有机化合物的存在下，将DNA或RNA结合于具有玻璃表面的材料上。为使样品与基材即与核酸有亲和力的材料接触，将样品与材料混和并培养一段足以发生结合的时间。技术人员通常熟知进行非磁性粒子处理过程的培养持续时间。这个步骤可通过在不同的时间点测定固定在表面上的生物材料的量而进行优化。对于核酸，适合的培养时间为10秒到30分钟。培养之后，结合的(至少一种)靶组分即核酸与液体分离。这通常可通过重力来实现、或在核酸结合于磁性玻璃粒子上的情况中通过施加磁场使与磁性粒子结合的材料分离而实现。例如，磁性粒子可被拉到其中进行培养的容器的壁上。从而除去包含未与磁性粒子结合的样品的液体。使用的除去过程取决于其中进行培养的容器的种类。适当的步骤包括通过移液或抽取除去液体。
另一个例子是将吸附液中的核酸结合于玻璃羊毛状物上。市售的试剂盒经常在柱的底部提供这种羊毛状物。包含核酸的吸附液被转移到柱上，并通过施加力使吸附液通过羊毛状物。术语“力”包括重力，和优选的离心力。非常优选的是“自旋柱”过程，其中由于通过离心施加的力使吸附液通过过滤器。使吸附液通过羊毛状物的其它方法包括施用压力或吸力。
然后，结合有DNA或RNA的材料可至少洗涤一次。优选地，洗涤液包含高于1和低于100体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。同样优选地，洗涤液包含1到100体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。更优选地，洗涤液为1到50体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物与水的混合物。另一个非常优选的洗涤液为40到80体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物与水的混合物。另一个非常优选的洗涤液为50到99体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物与水的混合物。更优选的洗涤液是约70体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物与水的混合物。同样优选的洗涤液为与水混溶的非酸性有机化合物，也就是说得自供应商的纯液体化合物也理解是被包括在术语“洗涤液”中。
使用的洗涤液不会引起所述(至少一种)靶核酸从材料表面释放，但尽可能彻底地洗掉不需要的污染物。这一洗涤步骤优选通过将结合有靶核酸的材料与洗涤液培养进行。在这一步骤中，材料优选是悬浮的。同样优选地，在材料为玻璃羊毛状物或柱中的填塞物的情况中，洗涤步骤通过用洗涤液淋洗柱子而进行。优选地，通过施加压力、吸力、离心力或重力使洗涤液通过柱。当与水混溶的非酸性有机化合物以纯的形式使用时，以上所述同样适用。
被污染的洗涤液优选正如在上述将核酸与基材材料结合的步骤中那样被除去。最后的洗涤步骤之后，材料可在真空中简单地干燥，或使液体蒸发。也可实施使用丙酮的预处理步骤。
然后，条件可能逆转，例如，离液剂或与水混溶的非酸性有机化合物的浓度可被降低，以洗脱与材料结合的DNA或RNA。优选地，使基材如磁性玻璃粒子与其余样品分离的方法通过使固定的生物材料粒化，例如通过重力或在磁性玻璃粒子的情况中使用磁铁，并除去上清液进行。然后，将固定有生物材料的磁性玻璃粒子再悬浮在没有或只有少量离液剂和/或与水混溶的非酸性有机化合物的水溶液中。或者，可使用没有或只有少量离液剂和/或与水混溶的非酸性有机化合物的溶液稀释该悬浮液。具有这一性质的缓冲溶液在DE 372442和Jakobi，R.，等人的Anal.Biochem.，175(1988)196-201中已知。低含盐量的洗脱缓冲溶液特别为含量低于0.2mol/l的缓冲溶液。优选地，洗脱缓冲溶液包含缓冲用的物质Tris。同样优选地，洗脱缓冲溶液为软化水。目前包含纯化DNA或RNA的溶液可用于其它反应。任选地，可使用例如乙醇或异丙醇使核酸从溶液中沉淀。沉淀物还可以进行另外的洗涤步骤。这类的方法是本领域技术人员公知的，并在Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press，2001中有所描述。
对于本发明方法中的吸附和洗涤步骤，优选使用适合于分子生物学方法特别是脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)纯化方法中的液体，所述方法利用了这些物质在一定条件下与玻璃粒子的结合。优选的液体包括含有式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物 (式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子。优选地，官能团选自氧代基团、硫氧代(sulfoxo)基团、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基。更优选地，与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。本发明同样包括包含作为与水混溶的非酸性有机化合物的环状二醚的液体。优选地，环状二醚为二氧杂环己烷。
本发明中使用的磁性玻璃粒子可以以不同制剂提供。可能以片剂的形式提供、作为粉末或作为悬浮液提供。非常优选地，磁性玻璃粒子悬浮在与水混溶的非酸性有机化合物中。优选地，这些悬浮液包含5到60mg/ml的磁性玻璃粒子(MGP)。同样优选地，将含二氧化硅的材料悬浮在缓冲水溶液中，所述缓冲水溶液任选地包含浓度为2到8mol/l，优选4到6mol/l的离液剂。离液盐为碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍或盐酸胍。也可使用本领域技术人员已知的其它化合物。本发明的离液剂为干扰液态水有序结构的任何化学物质，并且如果这些试剂存在于包含DNA或RNA的溶液中，其具有使DNA或RNA与磁性玻璃粒子结合的效果。生产适当的缓冲水溶液对于本领域技术人员而言是显而易见的。适用于分子生物学目的的缓冲系统可在例如Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第三版，CSHL Press，2001中发现。优选的缓冲材料为三(羟甲基)-氨基甲烷(TRIS)、磷酸盐、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)及其盐或其它适当的材料。另外，可存在那些改进溶液的离子强度的物质如NaCl、KCl、或CaCl2；或金属阳离子络合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)或其盐。也可存在本领域已知的其它生物材料。
本发明的方法适合于从包含核酸的其它生物材料的复杂混合物纯化核酸，即RNA或DNA。因此可以纯化多种核酸的混合物，甚至是包含低丰度在研核酸的混合物。因此，本发明还包括纯化其中靶核酸在浓度上可能是微量组分(或可能以低丰度存在)的特定核酸的混合物。
本文所述的过程可用于分离天然或修饰的核酸。天然核酸被认为是如下核酸，其结构与天然存在的核酸相比不是不可逆改变的。然而，这不意味着样品的其它组分不能被修饰。修饰的核酸包括非天然存在的核酸，如通过将其连接于反应性的、可检测的、或能够固定的基团上而修饰的核酸。其例子为生物素化的核酸。
在上述步骤之后，现在可根据需要进一步使用通过本发明的方法分离的核酸。例如它们可用作多种酶促反应的基材。当涉及核酸时，它们可用于测序、放射性或非放射性标记、它们所含的一个或多个序列的扩增、转录、与标记探针核酸杂交、翻译或连接。因此，本发明也包括如下方法该方法包含使结合的靶核酸从与其有亲合力的材料中释放的步骤。如果期望，如此纯化的靶核酸可与如上所述的材料分离。
因此，本发明的第一个实施方案是纯化核酸的方法，其包括以下步骤a)将包含(i)缓冲水溶液、(ii)高浓度盐、(iii)包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物、和(iv)核酸的组合物中的核酸吸附于基材上 (式I)其中W为碳原子或硫原子，和Z为氧原子或氮原子；b)任选地用洗涤液洗涤吸附有核酸的基材；然后，c)将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤(a)的组合物中盐的浓度；和d)将含有解吸核酸的溶液与基材分离，从而纯化核酸，和任选地(e)使解吸核酸从步骤(d)的溶液中沉淀并分离沉淀的核酸，从而进一步纯化核酸。优选官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基。更优选与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。还考虑了步骤(a)的组合物在纯化(至少一种)核酸的自动化方法中的应用。能够实施本发明的方法的自动化处理装置，如具有移液装置的自动机，经常具有包含溶液如储备溶液的开口容器。在这个方面，溶液的液相包含在标准大气压力和室温下具有低蒸发倾向的溶剂是有利的。因此，非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为二甲亚砜。还非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为N-甲基-2-吡咯烷酮。
优选地，步骤(a)的组合物包含1到50体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。更优选地，步骤(a)的组合物包含2到35体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。更优选地，步骤(a)的组合物包含3到30体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，步骤(a)的组合物包含约4体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，步骤(a)的组合物包含约15体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，步骤(a)的组合物包含约25体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
优选地，步骤(a)的组合物中的盐为离液盐，其浓度为1到8M。更优选地，所述离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠。
同样优选地，步骤(a)的组合物中盐的浓度为1到10M，并且所述盐选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物。
优选地，洗涤液包含与水混溶的非酸性有机化合物。更优选地，洗涤液包含1到50体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。更优选地，洗涤液包含2到35体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。更优选地，洗涤液包含3到30体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，洗涤液包含约4体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，洗涤液包含约15体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，洗涤液包含约25体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
优选地，基材包括多孔或无孔无机物基材，其选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维、和沸石。同样优选地，基材包括多孔或无孔无机物基材，其选自金属氧化物，和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、和主要由玻璃组成的材料。同样优选粒度为0.1μm到1,000μm的无机物基材。同样优选当使用时，多孔的无机物载体材料的孔径大小为2到1,000nm。更优选地，多孔或无孔载体材料，特别是沸石，为疏松填充的形式。更优选地，无机物基材由玻璃形式的滤板、石英或陶瓷滤板、和/或包含硅胶的膜、和/或无机物载体的粒子或纤维和石英或玻璃棉的织物组成。同样优选地，基材包括可被磁吸引的粒子。更优选地，可被磁吸引的粒子涂有选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的无机物基材。更优选地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。靶核酸可进行检测和测定。优选上述纯化方法，然后进行测定或检测步骤或纯化方法，然后进行扩增和测定或检测步骤。靶核酸或在研核酸可包含在非靶核酸的基质中，甚至可在特定核酸的所述混合物中为微量组分。适当的DNA检测方法为本领域技术人员已知的并在标准教科书如Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第三版，CSHL Press，2001；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley and Sons，NY，1987中有所描述。在DNA检测步骤之前同样可能进行另外的纯化步骤如沉淀步骤。检测方法可包括但不限于特定染料如溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的结合或嵌入，所述染料嵌入双链DNA并由此改变其荧光。纯化的DNA同样可通过电泳法分离，任选地在限制性内切酶酶切消化之后进行所述分离，然后显象。还有基于探针的试验，其采用将寡聚核苷酸杂交到特异序列上并随后进行杂交检测。同样在本领域技术人员已知的另外的步骤之后对DNA测序。其它方法将多种DNA序列施加到结合有特异探针的硅片上，并当结合有互补序列时产生信号。
本发明同样涉及包含核酸的非蛋白质和蛋白质组分的混合物，其中核酸包括DNA或RNA或两者。
本发明同样涉及从其中纯化核酸的生物样品，其包括病毒或细菌细胞以及多细胞机体的分离细胞如人和动物细胞如白细胞，和免疫活性的低和高分子化合物如半抗原、抗原、抗体和核酸、血浆、脑液、唾液、粪便、活检标本、骨髓、漱口液、血清、组织、尿或其混合物。本发明同样涉及生物样品如得自人或动物体的液体；优选生物样品为血液、血浆、血清或尿。血浆优选为EDTA、肝素或柠檬酸盐血浆。在本发明的一个实施方案中，生物样品包括细菌细胞、真核细胞、病毒或其混合物。以上所述的生物样品，优选为经过处理的形式如胞溶产物，可为(靶)核酸由其吸附到基材上的组合物的部分。
同样优选核酸和蛋白质材料的混合物包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或两者，优选DNA或RNA或两者源自于病毒或(至少一种)微生物。病毒可为甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类乳头状瘤病毒(HPV)或细小病毒B19。
同样优选靶核酸组分和其它核酸的纯化基本上如上所述。然后对靶核酸组分进行另外的操作并检测，即，通过特异性扩增靶序列到可检测的量的聚合酶链式反应进行扩增。其它可能的扩增反应为连接酶链式反应(LCR，Wu，D.Y.和Wallace R.B.，Genomics 4(1989)560-569；和Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)；聚合酶连接酶链式反应(Barany，F.，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)；Gap-LCR(WO 90/01069)；修复链式反应(EP 0 439 182A2)，3SR(Kwoh，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；WO 92/08800)，和NASBA(US 5,130,238)。另外，有链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)、和Q-β-扩增(综述参见例如Whelen，A.C.和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.D.和Myers，T.W.，Curr.Opin.Biotechnol.4(1993)41-47)。
特别优选的是在WO 92/02638和相应的美国专利US 5,210,015；US 5,804,375；US 5,487,972中公开的TaqMan检测方法。该方法采用聚合酶的核酸外切酶活性生成信号。详细而言，检测靶核酸组分的方法包括使样品与含有与靶核酸组分区域序列互补的寡聚核苷酸和含有与相同靶核酸组分序列链的第二区域序列互补但不包括第一寡聚核苷酸定义的核酸序列的标记寡聚核苷酸接触，以在杂交条件期间生成双链体混合物，其中双链体包括退火为第一寡聚核苷酸和标记寡聚核苷酸的靶核酸，使得第一寡聚核苷酸的3′-末端连接于标记寡聚核苷酸的5′-末端。然后，用具有5′到3′核酸酶活性的模板依赖性核酸聚合酶在足够使得聚合酶的5′到3′核酸酶活性能使退火的标记寡聚核苷酸裂开并释放标记片段的条件下处理混合物。检测和/或测量标记寡聚核苷酸水解生成的信号。TaqMan技术消除了对形成固相结合反应复合物的需要，并使其可检测。更概括地，公开了纯化靶核酸组分然后进行检测步骤的过程，其中扩增和/或检测反应为均相溶液相。
本发明的另一个实施方案是将核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步骤(a)提供核酸的水溶液，该水溶液包含高浓度的盐和具有式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物 (式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子；和(b)将步骤(a)的水溶液加到基材上。优选地，官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基。更优选地，与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。同样考虑了在自动化方法中使用步骤(a)的水溶液来纯化(至少一种)核酸。能够实施本发明的方法的自动化处理装置，如具有移液装置的自动机，经常具有包含溶液如储备溶液的开口容器。在这个方面，溶液/或悬浮液的液相包含在标准大气压力和室温下具有低蒸发倾向的溶剂是有利的。因此，非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为二甲亚砜。还非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为N-甲基-2-吡咯烷酮。
优选地，步骤(a)的水溶液包含1到50体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。更优选地，步骤(a)的水溶液包含2到35体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。更优选地，步骤(a)的水溶液包含3到30体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，步骤(a)的水溶液包含约4体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，步骤(a)的水溶液包含约15体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，步骤(a)的水溶液包含约25体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
优选地，步骤(a)的水溶液中的盐为浓度为1到8M的离液盐。更优选地，所述离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠。
同样优选地，步骤(a)的水溶液中的盐的浓度为1到10M，并且所述盐选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物。
优选地，基材包括多孔或无孔无机物基材，其选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维、和沸石。同样优选地，基材包括多孔或无孔无机物基材，其选自金属氧化物，和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、和主要由玻璃组成的材料。同样优选粒度为0.1μm到1,000μm的多孔无机物基材。同样优选当使用时，多孔的无机物载体材料的孔径大小为2到1,000nm。更优选地，多孔或无孔载体材料，特别是沸石，为疏松填充的形式。更优选地，无机物基材由玻璃形式的滤板、石英或陶瓷滤板、和/或包含硅胶的膜、和/或无机物载体的粒子或纤维和石英或玻璃棉的织物组成。同样优选地，基材包括可被磁吸引的粒子。更优选地，可被磁吸引的粒子涂有选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的无机物基材。更优选地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本发明的另一个实施方案中提供将核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步骤a)提供包含高浓度盐的核酸水溶液；(b)提供粉状材料形式的基材；(c)提供包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物 (式I)其中W为碳原子或硫原子，和Z为氧原子或氮原子；(d)将步骤(b)的基材分散在步骤(c)的与水混溶的非酸性有机化合物中，以形成所述基材的悬浮液；和(e)将步骤(a)的水溶液与步骤(d)的悬浮液混合。优选地，官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基。更优选与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。还考虑了步骤(d)的悬浮液在纯化(至少一种)核酸的自动化方法中的应用。能够实施本发明的方法的自动化处理装置，如具有移液装置的自动机，经常具有包含溶液如储备溶液和悬浮液如步骤(d)的悬浮液的开口容器。在这个方面，溶液和/或悬浮液的液相包含在标准大气压力和室温下具有低蒸发倾向的溶剂是有利的。因此，非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为二甲亚砜。还非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为N-甲基-2-吡咯烷酮。
优选地，步骤(e)的组合物包含1到50体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。更优选地，步骤(e)的组合物包含2到35体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。更优选地，步骤(e)的组合物包含3到30体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，步骤(e)的组合物包含约4体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，步骤(e)的组合物包含约15体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。非常优选地，步骤(e)的组合物包含约25体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
优选地，步骤(e)的组合物中的盐为离液盐，其浓度为1到8M。更优选地，所述离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠。
同样优选地，步骤(e)的组合物中盐浓度为1到10M，并且所述盐选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物。
优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自硅胶、玻璃、石英、和沸石。同样优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自金属氧化物，和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、和主要由玻璃组成的材料。同样优选基材包括可被磁吸引的粒子。更优选地，可被磁吸引的粒子涂有选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的无机物基材。更优选地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本发明的另一个实施方案为包含粉状材料形式的基材的悬浮液，该基材分散在包括式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物中 (式I)其中W为碳原子或硫原子，和Z为氧原子或氮原子。优选地，官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基。更优选与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。还考虑了本发明的悬浮液在纯化(至少一种)核酸的自动化方法中的应用。能够实施本发明的方法的自动化处理装置，如具有移液装置的自动机，经常具有包含溶液如储备溶液和悬浮液如上述悬浮液的开口容器。在这个方面，溶液和/或悬浮液的液相包含在标准大气压力和室温下具有低蒸发倾向的溶剂是有利的。因此，非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为二甲亚砜。还非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为N-甲基-2-吡咯烷酮。
优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自硅胶、玻璃、石英、和沸石。同样优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自金属氧化物，和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、和主要由玻璃组成的材料。同样优选基材包括可被磁吸引的粒子。更优选地，可被磁吸引的粒子涂有选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的无机物基材。更优选地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本发明的另一个实施方案为使用包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物用于实施本文所述的方法 (式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子。
优选地，官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基。更优选与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。还考虑了本发明的悬浮液在纯化(至少一种)核酸的自动化方法中的应用。能够实施本发明的方法的自动化处理装置，如具有移液装置的自动机，经常具有包含溶液如储备溶液和悬浮液如上述悬浮液的开口容器。在这个方面，溶液和/或悬浮液的液相包含在标准大气压力和室温下具有低蒸发倾向的溶剂是有利的。因此，非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为二甲亚砜。还非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为N-甲基-2-吡咯烷酮。
本发明的另一个实施方案为使用包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物用于制备悬浮液，其通过将基材分散于所述与水混溶的非酸性有机化合物中制备 (式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子。
优选地，官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基。更优选与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。还考虑了本发明的悬浮液在纯化(至少一种)核酸的自动化方法中的应用。能够实施本发明的方法的自动化处理装置，如具有移液装置的自动机，经常具有包含溶液如储备溶液和悬浮液如上述悬浮液的开口容器。在这个方面，溶液和/或悬浮液的液相包含在标准大气压力和室温下具有低蒸发倾向的溶剂是有利的。因此，非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为二甲亚砜。还非常优选地，与水混溶的非酸性有机化合物为N-甲基-2-吡咯烷酮。
优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自硅胶、玻璃、石英、和沸石。同样优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自金属氧化物，和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、和主要由玻璃组成的材料。同样优选基材包括可被磁吸引的粒子。更优选地，可被磁吸引的粒子涂有选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的无机物基材。更优选地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本发明的另一个实施方案为使用本发明悬浮液用于实施本文所述的本发明的方法。
本发明同样考虑了试剂盒。这种试剂盒在本领域中已知，其另外包括能够在样品制备过程中使用的塑料制品，如由德国汉堡的Eppendorf生产的96或384孔格式的微量滴定板或仅仅是普通的反应管、和所有其它的用于实施本发明方法的试剂。因此，试剂盒可另外包含与核酸(和(至少一种)靶核酸组分)有亲合力的材料，与核酸(和(至少一种)靶核酸组分)有亲合力的材料优选包括具有二氧化硅表面的材料。优选地，具有二氧化硅表面的材料为玻璃。最优选地，与核酸有亲合力的材料包括磁性玻璃粒子，即涂有玻璃的可被磁吸引的粒子的组合物。另一个优选的与核酸有亲合力的材料为阴离子交换剂。试剂盒可进一步或另外包括胞溶缓冲溶液，其包含例如离液剂、洗涤剂、或其混合物，其能够使细胞溶解。本发明的试剂盒的这些组分可分别在试管中或储存容器中提供。根据组分的性质，这些甚至可在一个试管或储存容器中提供。试剂盒可进一步或另外包括适合于磁性玻璃粒子在结合有DNA或RNA时的洗涤步骤的洗涤液。这些洗涤液可包含本发明的与水混溶的非酸性有机化合物和/或在一种或多种不含本发明与水混溶的非酸性有机化合物的酸性pH的缓冲溶液中的离液剂；和/或如上所述的离液剂。通常洗涤液或其它溶液作为储备溶液提供，其在使用之前必需经过稀释。试剂盒可进一步或另外包括洗脱剂或洗脱缓冲溶液，即溶液或缓冲溶液(如10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0)或纯水，以洗脱结合于磁性玻璃粒子上的DNA或RNA。另外，可存在有其它的试剂或缓冲溶液，用于核酸即DNA或RNA的纯化方法。
本发明的另一个实施方案为各组件的试剂盒，其包含(a)缓冲盐和离液盐的浓储备液，离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠；(b)包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物 (式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子，与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；(c)缓冲溶液；和(d)色谱材料和过滤材料。
本发明的另一个实施方案为各组件的试剂盒，其包含(a)缓冲盐和选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物的盐的浓储备液；(b)包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物
(式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子，与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；(c)缓冲溶液；和(d)色谱材料和过滤材料。
本发明的另一个实施方案为各组件的试剂盒，其包含(a)缓冲盐和离液盐的浓储备液，离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠；(b)如上所述的本发明的悬浮液；(c)缓冲溶液。
本发明的另一个实施方案为各组件的试剂盒，其包含(a)缓冲盐和选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物的盐的浓储备液；(b)如上所述的本发明的悬浮液；(c)缓冲溶液。
本发明的优选实施方案为本发明的方法或试剂盒在如WO 99/16781中描述的可自动化的方法中的应用。可自动化的方法是指该方法的步骤适合于使用在很少或没有通过人类外部控制或影响下能够进行操作的装置或机器进行。自动化方法是指可自动化的方法的步骤使用在很少或没有通过人类外部控制或影响下能够进行操作的装置或机器进行。只有方法的准备步骤需要手工完成，如储存容器必需被填充并放在位置上，样品的选择必需由人类完成，其它步骤为本领域技术人员已知的，例如控制计算机的操作。装置或机器可例如自动添加液体、混合样品、或在特定温度下进行培养步骤。典型地，这种机器或装置通过执行其中规定了单个步骤和命令的程序的计算机进行自动控制。优选的自动化方法为在高通量格式中实施的那些方法，所述高通量格式是指方法和所用机器或装置被优化用于在短时间内处理高通量样品。在本发明的另一个实施方案中，本发明的方法或试剂盒用于半自动化方法中，其是指某些反应步骤必需通过手动完成。在本发明的优选实施方案中，包含本发明的MGP(磁性玻璃粒子)的悬浮液被从储存容器中取出并将部分加入到不同的反应容器中。反应容器可能是由塑料制成最终为包含96或384孔或更多孔的微量滴定板格式的反应管，在孔中可进行反应。然而，这些容器可由其它材料制成，例如钢。
对于本领域技术人员清楚地是，本发明考虑的某些有机化合物能够溶解某些塑料材料。因此，当确定适当的储存容器或反应容器的性质时，本领域技术人员可在有限的显而易见的试验中确定最适合进行本发明的方法或生产本发明的试剂盒的材料。
在本发明的优选实施方案中，本发明的试剂盒被用于在研核酸的纯化、生物分析或诊断。在本发明的优选实施方案中，本发明的试剂盒或本发明的方法被用于高通量格式中，即，用于允许在非常短的时间分析大量不同样品的自动化方法中。
本发明的另一个实施方案为测定生物样品中的核酸存在的方法，其包括以下步骤(a)使生物样品胞溶；(b)形成组合物，该组合物包含(i)步骤(a)胞溶生物样品、(ii)缓冲水溶液、(iii)高浓度盐、(iv)包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物 (式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子；(c)将步骤(b)的组合物与基材接触，从而将核酸吸附于基材上；(d)任选地用洗涤液洗具有吸附的核酸的基材；然后，(e)将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤(a)的组合物中盐的浓度；和(f)将从基材解吸的核酸与溶液分离；和(g)检测步骤(f)的溶液中核酸的存在，从而测定核酸的存在。优选地，通过核酸的扩增测定核酸，其通过使用特异引物、特异性检测探针、和扩增混合物的聚合酶链式反应的方式扩增，从而实时监测扩增。同样优选的是通过使核酸杂交于杂交探针并检测和/或对杂交体定量化而测定核酸。本领域技术人员知道不仅核酸可作为杂交探针，而且可以使用包含一种或多种核苷类似物的核酸。另外，本领域已知核酸类似物如PNA能够与核酸形成可检测的杂交体。可以理解，要被检测的核酸为DNA或RNA。非常优选的是上述方法，其中核酸为RNA以及步骤(g)包括(i)使RNA逆转录形成cDNA，(ii)随后通过聚合酶链式反应的方式扩增cDNA，(iii)检测cDNA的存在，从而测定核酸的存在。
本发明的发明人同样发现，与水混溶的环状二醚是适合于实施本发明的方法的非酸性有机化合物。
因此，本发明的另一个实施方案为纯化核酸的方法，其包括以下步骤a)将核酸从组合物吸附于基材上，所述组合物包含(i)缓冲水溶液、(ii)高浓度盐、(iii)与水混溶的环状二醚、和(iv)核酸；b)任选地用洗涤液洗具有吸附的核酸的基材；然后，c)将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤(a)的组合物中盐的浓度，和d)将从基材解吸的核酸与溶液分离，从而纯化核酸；和任选地(e)使解吸核酸从步骤(d)的溶液中沉淀并分离沉淀的核酸，从而进一步纯化核酸。优选地，与水混溶的环状二醚是二氧杂环己烷。
优选地，步骤(a)的组合物包含1到50体积百分数的与水混溶的环状二醚。更优选地，步骤(a)的组合物包含2到35体积百分数的与水混溶的环状二醚。更优选地，步骤(a)的组合物包含3到30体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，步骤(a)的组合物包含约4体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，步骤(a)的组合物包含约15体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，步骤(a)的组合物包含约25体积百分数的与水混溶的环状二醚。
优选地，步骤(a)的组合物中的盐为离液盐，其浓度为1到8M。更优选地，所述离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠。
同样优选地，步骤(a)的组合物中盐浓度为1到10M，并且所述盐选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物。
优选地，洗涤液包含与水混溶的环状二醚。更优选地，洗涤液包含1到50体积百分数的与水混溶的环状二醚。更优选地，洗涤液包含2到35体积百分数的与水混溶的环状二醚。更优选地，洗涤液包含3到30体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，洗涤液包含约4体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，洗涤液包含约15体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，洗涤液包含约25体积百分数的与水混溶的环状二醚。
优选地，基材包括多孔或无孔无机物基材，其选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维、和沸石。同样优选地，基材包括多孔或无孔无机物基材，其选自金属氧化物，和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、和主要由玻璃组成的材料。同样优选粒度为0.1μm到1,000μm的无机物基材。同样优选当使用时，多孔的无机物载体材料的孔径大小为2到1,000nm。更优选地，多孔或无孔载体材料，特别是沸石，为疏松填充的形式。更优选地，无机物基材由玻璃形式的滤板、石英或陶瓷滤板、和/或包含硅胶的膜、和/或无机物载体的粒子或纤维和石英或玻璃棉的织物组成。同样优选地，基材包括可被磁吸引的粒子。更优选地，可被磁吸引的粒子涂有选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的无机物基材。更优选地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本发明的另一个实施方案为将核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步骤a)提供包含高浓度盐和与水混溶的环状二醚的核酸水溶液；和b)将步骤(a)的水溶液加入基材。优选地，与水混溶的环状二醚是二氧杂环己烷。
优选地，步骤(a)的水溶液包含1到50体积百分数的与水混溶的环状二醚。更优选地，步骤(a)的水溶液包含2到35体积百分数的与水混溶的环状二醚。更优选地，步骤(a)的水溶液包含3到30体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，步骤(a)的水溶液包含约4体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，步骤(a)的水溶液包含约15体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，步骤(a)的水溶液包含约25体积百分数的与水混溶的环状二醚。
优选地，步骤(a)的水溶液中的盐为离液盐，其浓度为1到8M。更优选地，所述离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠。
同样优选地，步骤(a)的水溶液中的盐浓度为1到10M，并且所述盐选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物。
优选地，基材包括多孔或无孔无机物基材，其选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维、和沸石。同样优选地，基材包括多孔或无孔无机物基材，其选自金属氧化物，和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、和主要由玻璃组成的材料。同样优选粒度为0.1μm到1,000μm的无机物基材。同样优选当使用时，多孔的无机物载体材料的孔径大小为2到1,000nm。更优选地，多孔或无孔载体材料，特别是沸石，为疏松填充的形式。更优选地，无机物基材由玻璃形式的滤板、石英或陶瓷滤板、和/或包含硅胶的膜、和/或无机物载体的粒子或纤维和石英或玻璃棉的织物组成。同样优选地，基材包括可被磁吸引的粒子。更优选地，可被磁吸引的粒子涂有选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的无机物基材。更优选地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本发明的另一个实施方案为将核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步骤(a)提供包含高浓度盐的核酸水溶液；(b)提供粉状材料形式的基材；(c)提供与水混溶的环状二醚；(d)将步骤(b)的基材分散在步骤(c)的与水混溶的环状二醚中形成所述基材的悬浮液；和(e)将步骤(a)的水溶液与步骤(d)的悬浮液混合。优选地，与水混溶的环状二醚为二氧杂环己烷。
优选地，步骤(e)的组合物包含1到50体积百分数的与水混溶的环状二醚。更优选地，步骤(e)的组合物包含2到35体积百分数的与水混溶的环状二醚。更优选地，步骤(e)的组合物包含3到30体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，步骤(e)的组合物包含约4体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，步骤(e)的组合物包含约15体积百分数的与水混溶的环状二醚。非常优选地，步骤(e)的组合物包含约25体积百分数的与水混溶的环状二醚。
优选地，步骤(e)的组合物中的盐为离液盐，其浓度为1到8M。更优选地，所述离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠。
同样优选地，步骤(e)的组合物中盐浓度为1到10M，并且所述盐选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物。
优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自硅胶、玻璃、石英、和沸石。同样优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自金属氧化物，和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、和主要由玻璃组成的材料。同样优选基材包括可被磁吸引的粒子。更优选地，可被磁吸引的粒子涂有选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的无机物基材。更优选地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本发明的另一个实施方案为包含粉状材料形式的基材的悬浮液，该基材分散在与水混溶的环状二醚中。优选地，与水混溶的环状二醚为二氧杂环己烷。
优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自硅胶、玻璃、石英、和沸石。同样优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自金属氧化物，和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、和主要由玻璃组成的材料。同样优选基材包括可被磁吸引的粒子。更优选地，可被磁吸引的粒子涂有选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的无机物基材。更优选地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本发明的另一个实施方案为与水混溶的环状二醚在实施本文所述的本发明的方法中的应用。优选地，环状二醚为二氧杂环己烷。
本发明的另一个实施方案为使用与水混溶的环状二醚用于制备悬浮液，其通过将基材分散在所述与水混溶的环状二醚中形成所述基材的悬浮液。优选地，环状二醚为二氧杂环己烷。
优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自硅胶、玻璃、石英、和沸石。同样优选地，基材包括粉状多孔或无孔无机物基材，其选自金属氧化物，和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆、和主要由玻璃组成的材料。同样优选基材包括可被磁吸引的粒子。更优选地，可被磁吸引的粒子涂有选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的无机物基材。更优选地，基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
本发明的另一个实施方案为使用上述本发明的悬浮液用于实施本文所述的本发明的方法。
本发明的另一个实施方案为各组件的试剂盒，其包含(a)缓冲盐和离液盐的浓储备液，离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠；(b)二氧杂环己烷；(c)缓冲溶液；和(d)色谱材料和过滤材料。
本发明的另一个实施方案为各组件的试剂盒，其包括(a)缓冲盐和选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物的盐的浓储备液；(b)二氧杂环己烷；(c)缓冲溶液；和(d)色谱材料和过滤材料。
本发明的另一个实施方案为各组件的试剂盒，其包括(a)缓冲盐和离液盐的浓储备液，离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠；(b)上述本发明的在二氧杂环己烷中的悬浮液；(c)缓冲溶液。
本发明的另一个实施方案为各组件的试剂盒，其包括(a)缓冲盐和选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物的盐的浓储备液；(b)上述本发明的在二氧杂环己烷中的悬浮液；(c)缓冲溶液。
提供以下实施例、参考文献、和附图以帮助理解本发明，本发明的真正保护范围在附加的权利要求书中阐述。可以理解可对所述过程中进行修饰，而不脱离本发明的精神实质。


图1a使用MagNA Pure System(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的各方案和试剂盒从8倍复制的106海拉细胞分离RNA。对于这些分离，将MGP(磁性玻璃粒子)再悬浮于水中或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。然后在琼脂糖凝胶上分析具有纯化RNA的洗脱液。道次1-8，即使用再悬浮于水中的MGP的RNA制剂，其带非常弱，并几乎不能重现。M表示尺寸标记。道次9-16表示使用再悬浮于NMP中的MGP的制剂得到的RNA带。
图1b使用MagNA Pure System(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim；目录号码3186229)的各方案和试剂盒从4倍复制的106海拉细胞分离RNA。对于这些分离，将MGP(磁性玻璃粒子)再悬浮于异丙醇中或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中。然后在琼脂糖凝胶上分析具有纯化RNA的洗脱液。
图2使用MagNA Pure System(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim；目录号码3186229)的各方案和试剂盒从8倍复制的1ml血液中分离DNA。对于这些分离，将MGP(磁性玻璃粒子)再悬浮于异丙醇中或N-甲基-2-吡咯烷酮或水中。然后在琼脂糖凝胶上分析具有纯化DNA的洗脱液。
图3a、3bTaqMan PCR过程中的荧光信号。X轴表示PCR周期的数目，Y轴为检测器测得的以[mV]为单位的荧光信号。“R300”曲线反映了由净化水中10,000拷贝阳性对照靶RNA得到的信号。“R30”曲线反映了由净化水中1,000拷贝阳性对照靶RNA得到的信号。另外的曲线为“NMP”(1-甲基-2-吡咯烷酮)、“PC”(异丙二醇碳酸酯)、“yBL”(γ-丁内酯)、和“noBC”(没有加入结合调节剂)的曲线。
具体实施例方式
实施例1使用玻璃纤维分离DNA用100μl的蛋白酶K溶液(Roche Id.No.745723，90mg溶解于4.5毫升水中)和1,200μl离液结合缓冲溶液(6M盐酸胍，10mMTrisHCl，20％ Triton X 100 pH4.4)在70℃培养得自健康供体的1,000μl全血10分钟。
加入500μl的(a)异丙醇、(b)乙腈、(c)二甲亚砜或(d)甲基乙基酮之后，将胞溶产物转移到玻璃纤维滤管(滤管取自Macherey undNagel Cat.No.740 954.20的试剂盒)中。以1,900xg离心3分钟之后，弃去流通液(flowthrough)并将滤管放在接收管上。将2,000μl高离子抑制剂清除缓冲溶液(5M盐酸胍，20mMTris，60％乙醇，pH6.6)移液于玻璃纤维过滤器上并以3,000xg离心1分钟。然后用2,000μl洗涤缓冲溶液(20mMNaCl，2mMTrisHCl，80％乙醇，pH 7.5)的两个洗涤步骤并以3,000xg离心5分钟。弃去流通液。使用新的接收管。DNA的洗脱使用300μl 70℃的热Tris缓冲溶液(10mM，pH8.5)完成。培养5分钟之后，试管以3,000xg离心5分钟。
分离的DNA的分析由使用标准光度计从OD260nm测量结果计算DNA收率。通过计算OD260/280nm的比例评价纯度。结果(n＝2)如表1中所示。
表1从1,000μl全血分离DNA

实施例2在MagNA Pure LC仪器上分离RNA将106海拉细胞(体积200μl)直接转移到MagNA Pure LC仪器(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim)的样品筒。从软件选择各个方案，将必要的塑料一次用品和试剂盒试剂安装在工作站上，并开始自动化的RNA分离。然后MagNA Pure LC仪器自动地进行所有的分离和纯化步骤，如用特定的胞溶/结合缓冲溶液使细胞胞溶、用蛋白酶K的酶促蛋白质消化、用脱氧核糖核酸酶I的酶促DNA消化、RNA与磁性玻璃粒子(MGP)的结合、几个洗涤步骤以除去未结合物质和杂质、纯RNA在特定洗脱缓冲溶液中的洗脱和最后将洗脱液转移到冷却的储存筒中。
当分析非酸性有机化合物如N-甲基-2-吡咯烷酮在核酸分离过程中的性能时，将干燥的MGP悬浮在适当体积的各个非酸性有机化合物中，并将悬浮液与MagNA Pure试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的所有其它试剂一起用于MagNA Pure LC仪器。
与水相比，发现当使用N-甲基-2-吡咯烷酮制备磁性玻璃粒子的悬浮液时，RNA收率更高。与异丙醇相比，发现当使用N-甲基-2-吡咯烷酮制备磁性玻璃粒子的悬浮液时，RNA收率相等或更高。
表2从106海拉细胞分离RNA(也参见图1a、图1b)

结果也在图1a(i、ii)和1b(iii、iv)表示。
实施例3在MagNA Pure LC仪器上分离DNA将人血(1ml)直接转移到MagNA Pure LC仪器(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim)的样品筒。从软件选择各个方案，将必要的塑料一次用品和试剂盒试剂安装在工作站上，并开始DNA的自动化分离。然后MagNA Pure LC仪器自动地进行所有的分离和纯化步骤，如用特定的胞溶/结合缓冲溶液使细胞胞溶、用蛋白酶K的酶促蛋白质消化、DNA与磁性玻璃粒子(MGP)的结合、几个洗涤步骤以除去未结合的物质和杂质、纯DNA在特定洗脱缓冲溶液中的洗脱和最后将洗脱液转移到冷却的储存筒中。
当分析非酸性有机化合物如N-甲基-2-吡咯烷酮在核酸分离过程中的性能时，将干燥的MGP悬浮在适当体积的各个非酸性有机化合物中，并将悬浮液与MagNA Pure试剂盒(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim)的所有其它试剂一起用于MagNA Pure LC仪器。
对分离的DNA的分析在1％琼脂糖凝胶上检查分离的DNA的完整性，用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓与分子量标记物III(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim)一起染色。使用标准光度计从OD260hm的测量结果计算DNA收率。通过计算OD260/280nm的比例评价纯度。为保证使用MagNA Pure方案和N-甲基-2-吡咯烷酮或其它非酸性有机化合物分离的DNA可被扩增，使用如LightCycler Factor V Mutation DetectionKit或LightCycler Her2neu DNA Quantification Kit(都来自RocheDiagnostics GmbH，Mannheim)对所有样品在LightCycler仪器上进行PCR。在所有情况中扩增都获得成功。
表3从1,000μl全血分离DNA(也参见图2)

使用N-甲基-2-吡咯烷酮得到的DNA收率与异丙醇相同，使用水得到的收率低得多。图2说明了这些结果。
实施例4
从血清样品分离RNA胞溶和调节得自健康患者的200μl体积的血清与20μl的蛋白酶K溶液(酶活性6,000 U/ml，没有脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶活性)混和并在37℃培养5分钟。随后，将600μl的胞溶缓冲溶液与经过蛋白酶K处理的样品混和，得到胞溶溶液。胞溶缓冲溶液包含溶解于水中的以下化合物表4

随后，向胞溶溶液加入380μl结合调节剂，并混和，得到吸附液。使用100％的γ-丁内酯(CAS 96-48-0)、100％的异丙二醇碳酸酯(CAS108-32-7)或100％的1-甲基-2-吡咯烷酮(CAS 872-50-4)作为结合调节剂。
吸附于固相将第一个600μl试样量的经过调节的胞溶溶液转移到具有玻璃羊毛状物作为固相的市售自旋柱中。优选地，使用得自High Pure PCRTemplate Preparation Kit(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，目录编号1796828)的High Pure Spin Filter管作为自旋柱。具有第一个600μl试样量的自旋柱以4,300xg离心1分钟。然后将第二个试样量转移到相同的自旋柱并在相同条件下重复离心步骤。
洗涤洗涤柱三次，每次使用150μl的洗涤缓冲溶液。洗涤缓冲溶液包含溶解于水中的以下化合物
表5

对于前两个洗涤步骤，将洗涤缓冲溶液转移到自旋柱并以4,300xg离心1分钟。第三个洗涤步骤有所改变，柱以13,200xg离心3分钟。
代替通过离心(第三个洗涤步骤，参见上面)的方式除去洗涤缓冲溶液，固相可选地在65℃下干燥10分钟。
洗脱对于这个步骤，使用包含溶解于水中的以下化合物的洗脱缓冲溶液表6

将150μl的洗脱缓冲溶液转移到自旋柱，并以4,300xg自旋柱1分钟。收集洗脱液用于进一步分析。
实施例5RNA分析如实施例4所述处理搀入10,000拷贝的阳性对照靶RNA(纯化的丙型肝炎病毒RNA)的血清样品。洗脱液中靶RNA的含量通过TaqManPCR使用Roche HCV检测试剂盒测定。
对于回收率(＝处理之后的量/处理之前的量)的计算，使用标准样品运行检测过程。图3a和3b表示相当于10,000拷贝的“R300”曲线(即300％回收率)，和相当于1,000拷贝的“R30”曲线(即30％回收率)。
图3a和3b表示典型实验的结果。而没有结合调节剂(“noBC”)的对照实验得到非常低的回收率(没有发现靶)，加入结合调节剂(“NMP”N-甲基-2-吡咯烷酮、“PC”异丙二醇碳酸酯、或“gBL”γ-丁内酯)得到针对对照RNA高于50％的回收率。
将杂质留在洗脱液中的样品制备过程可损害TaqMan PCR方法过程中形成的信号。因此，监测信号形成以评价RNA制备的质量/纯度。上个PCR周期之后的荧光信号值作为测量值。作为参考，使用洁净阳性对照RNA(与搀入血清的RNA相同)在纯水中的已知量。图3a和3b说明典型实验的结果。而在没有结合调节剂(主要由于没有回收)的制备中荧光信号的形成是可忽略不计的，加入结合调节剂导致信号形成的改善，其可与用纯靶发现的信号形成相当。
实施例6样品处理时间来自医院并且其中样品具有升高的甘油三酯值的样品根据以下方案处理750μl体积的血清与75μl蛋白酶K溶液(酶活性6,000U/ml，没有脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶活性)在37℃培养5分钟。然后，加入1,405μl体积的胞溶缓冲溶液(根据表4)并混合。随后，加入880μlγ-丁内酯或880μl96％乙醇并混合，得到两种不同类型吸附液。
在+1巴的恒压下使每个吸附液通过包含直径为5mm和厚度为1mm的玻璃纤维羊毛状物(得自Roche“High Pure”试剂盒)的柱装置处理。测量全部体积通过装置所需的时间(也称为“结合时间”)。结果总结在表7中。
表7

*认为是正常的，**升高的甘油三酯值参考文献Abramson，R.D.，和Myers，T.W.，Curr.Opin.Biotechnol.4(1993)41-47Alderton，R.P.等人，Anal.Biochem.201(1992)166-169Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，J.Wiley and Sons，NY，1987Barany，F.，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193Boom，R.等人，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503DE 3724442EP 0439182A2EP 0658164Guatelli，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878Jakobi，R.等人，Anal.Biochem.175(1988)196-201Kwoh，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 86(1989)1173-1177Marko，M.A等人，Anal.Biochem.121(1982)382-387Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第3版，CSHLPress，2001US 4,683,195US 5,130,238US 5,210,015US 5,487,972US 5,804,375Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619Whelen，A.C.，和Persing，D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996WO 01/37291WO 90/01069WO 91/00212WO 92/02638WO 92/08800WO 99/16781Wu，D.Y.，和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569Yamada，O.等人，J.Virol.Methods 27(1990)203-209
权利要求
1.纯化核酸的方法，其包括以下步骤(a)将核酸从组合物吸附于基材上，所述组合物含有(i)缓冲水溶液，(ii)高浓度盐，(iii)包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物 (式I)其中W为碳原子或硫原子，和Z为氧原子或氮原子，和(iv)核酸；(b)任选地用洗涤液洗涤吸附有核酸的基材，然后，(c)将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤(a)的组合物中盐的浓度，和(d)将含有解吸核酸的溶液与基材分离，从而纯化核酸，和任选地(e)使解吸核酸从步骤(d)的溶液中沉淀并分离沉淀的核酸，从而进一步纯化核酸。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基。
3.权利要求2的方法，其特征在于与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。
4.权利要求1到3中任一项的方法，其特征在于步骤(a)的组合物包含1到50体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
5.权利要求4的方法，其特征在于步骤(a)的组合物包含3到30体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
6.权利要求1到5中任一项的方法，其特征在于步骤(a)的组合物中的盐为离液盐，其浓度为1到8M，并且所述离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠。
7.权利要求1到5中任一项的方法，其特征在于步骤(a)的组合物中盐浓度为1到10M，并且所述盐选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物。
8.权利要求1到7中任一项的方法，其特征在于步骤(b)的洗涤液包含与水混溶的非酸性有机化合物。
9.权利要求8的方法，其特征在于步骤(b)的洗涤液包含1到100体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
10.权利要求1到9中任一项的方法，其特征在于基材包括选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维和沸石的多孔或无孔无机物基材。
11.权利要求1到9中任一项的方法，其特征在于基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
12.将核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步骤(a)提供核酸的水溶液，该水溶液包含高浓度的盐和与水混溶的非酸性有机化合物，该有机化合物包含式I官能团 (式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子，和所述官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基，和与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；然后(b)将步骤(a)的水溶液加到基材上。
13.权利要求12的方法，其特征在于步骤(a)的水溶液包含1到50体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
14.权利要求13的方法，其特征在于步骤(a)的水溶液包含3到30体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
15.权利要求12到14中任一项的方法，其特征在于步骤(a)的水溶液中的盐为离液盐，其浓度为1到8M，并且所述离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠。
16.权利要求12到14中任一项的方法，其特征在于步骤(a)的水溶液中的盐浓度为1到10M，并且所述盐选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物。
17.权利要求12到16中任一项的方法，其特征在于基材包括选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维、和沸石的多孔或无孔无机物基材。
18.权利要求12到16中任一项的方法，其特征在于基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
19.将核酸吸附于基材上的方法，其包括以下步骤(a)提供包含高浓度盐的核酸水溶液；(b)提供粉状材料形式的基材；(c)提供包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物， (式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子，和步骤(c)的与水混溶的非酸性有机化合物的所述官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基，和步骤(c)的与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮；然后(d)将步骤(b)的基材分散在步骤(c)的与水混溶的非酸性有机化合物中形成所述基材的悬浮液；和(e)将步骤(a)的水溶液与步骤(d)的悬浮液混合。
20.权利要求19的方法，其特征在于步骤(e)的组合物包含1到50体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
21.权利要求20的方法，其特征在于步骤(e)的组合物包含3到30体积百分数的与水混溶的非酸性有机化合物。
22.权利要求19到21中任一项的方法，其特征在于步骤(a)的水溶液中的盐为离液盐，其浓度为1到8M，并且所述离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠。
23.权利要求19到21中任一项的方法，其特征在于步骤(e)的组合物中的盐浓度为1到10M，并且所述盐选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物。
24.权利要求19到23中任一项的方法，其特征在于基材包括选自硅胶、玻璃、石英、和沸石的粉状多孔或无孔无机物基材。
25.权利要求19到24中任一项的方法，其特征在于基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
26.包含粉状材料形式的基材的悬浮液，所述基材分散在包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物中 (式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子，和所述官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基，和与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。
27.权利要求26的悬浮液，其特征在于基材包括选自硅胶、玻璃、石英和沸石的粉状多孔或无孔无机物基材。
28.权利要求26到27中任一项的悬浮液，其特征在于基材包括涂有玻璃的可被磁吸引的粒子。
29.包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物在实施权利要求1到25中任一项的方法中的应用， (式I)其中W为碳原子或硫原子，Z为氧原子或氮原子，和所述官能团选自氧代基、硫氧代基、氰基、和氨基甲酰基官能或酰胺中的但不属于羧基官能的羰基，和与水混溶的非酸性有机化合物选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮。
30.权利要求26到28中任一项的悬浮液在实施权利要求19到25中任一项的方法中的应用。
31.各组件的试剂盒，其包括(a)缓冲盐和离液盐的浓储备液，离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠；(b)选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮的与水混溶的非酸性有机化合物；(c)缓冲溶液；和(d)色谱材料和过滤材料。
32.各组件的试剂盒，其包括(a)缓冲盐和选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物的盐的浓储备液；(b)选自丙酮、乙酰丙酮、乙腈、二甲亚砜、二乙酮、甲基乙基酮、甲基丙基酮、异丁基甲基酮、γ-丁内酯、γ-戊内酯、异丙二醇碳酸酯、和N-甲基-2-吡咯烷酮的与水混溶的非酸性有机化合物；(c)缓冲溶液；和(d)色谱材料和过滤材料。
33.各组件的试剂盒，其包括(a)缓冲盐和离液盐的浓储备液，离液盐选自高氯酸钠、盐酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、和碘化钠；(b)权利要求26到28中任一项的悬浮液；(c)缓冲溶液。
34.各组件的试剂盒，其包括(a)缓冲盐和选自氯化锂、氯化钠、氯化钾、醋酸钠、脲、及其混合物的盐的浓储备液；(b)权利要求26到28中任一项的悬浮液；(c)缓冲溶液。
35.测定生物样品中核酸的存在的方法，其包括以下步骤(a)使生物样品胞溶；(b)形成组合物，该组合物包含(i)步骤(a)的胞溶生物样品，(ii)缓冲水溶液，(iii)高浓度盐，(iv)包含式I官能团的与水混溶的非酸性有机化合物， (式I)其中W为碳原子或硫原子，和Z为氧原子或氮原子；(c)将步骤(b)的组合物与基材接触，从而将核酸吸附于基材上；(d)任选地用洗涤液洗涤吸附有核酸的基材；然后(e)将吸附有核酸的基材与舍有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤(a)的组合物中盐的浓度；和(f)将含有解吸核酸的溶液与基材分离，和(g)检测步骤(f)的溶液中核酸的存在，从而测定核酸的存在。
36.权利要求35的方法，其特征在于核酸为RNA或DNA。
37.权利要求35和36中任一项的方法，其特征在于核酸为RNA，步骤(g)包括(i)使RNA逆转录形成cDNA，(ii)随后通过聚合酶链式反应扩增cDNA，(iii)检测cDNA的存在，从而测定核酸的存在。
全文摘要
本发明要解决的问题是提供可供选择的使用在含水吸附液中的可供选择的物质用于核酸的色谱纯化的方法，目的在于促进核酸与基材如无机物载体结合。本发明提供了纯化核酸的方法，其包括以下步骤(a)将核酸从组合物吸附于基材上，所述组合物包含(i)缓冲水溶液、(ii)高浓度盐、(iii)与水混溶的非酸性有机化合物、和(iv)核酸；(b)任选地用洗涤液洗涤吸附有核酸的基材；然后，(c)将吸附有核酸的基材与含有盐的溶液接触，从而使核酸从基材解吸，该含有盐的溶液中盐的浓度低于步骤(a)的组合物中盐的浓度；和(d)将含有解吸核酸的溶液与基材分离，从而纯化核酸；和任选地(e)使解吸核酸从步骤(d)的溶液中沉淀并分离沉淀的核酸，从而进一步纯化核酸。
文档编号C12Q1/68GK1616477SQ20041008358
公开日2005年5月18日 申请日期2004年10月13日 优先权日2003年10月13日
发明者F·贝格曼, M·柯西格泽, T·瓦尔特, K·魏因德尔, R·齐伦斯基, E·萨洛芬 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司