专利名称：C型凝集素样受体l1的单克隆抗体及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及人NK细胞C型凝集素样受体L1(KLRL1)单克隆抗体及其制备和应用。本发明的该单克隆抗体可提高NK细胞的杀伤活性。
背景技术：
自然杀伤细胞(natural killer，NK)无需抗原预先作用就可直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，因为具备此功能特点，NK细胞在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。NK细胞表面分布杀伤活化受体和杀伤抑制受体，通过两种受体的相互作用确保NK细胞既能杀伤病毒感染的细胞和突变肿瘤细胞，又能保护宿主自身正常细胞免遭破坏。NK细胞表面杀伤抑制受体与靶细胞表面组织相容性复合体I类分子(MHC I类分子)结合，可产生杀伤抑制信号，能阻断杀伤信号的传递。对于宿主自身组织细胞，因MHC I类分子表达正常使杀伤抑制受体介导的抑制作用占主导地位，表现为NK细胞失活；对于病毒感染的细胞和肿瘤细胞，由于MHC I类分子表达减少或缺失而影响杀伤抑制受体与相应配体的结合，从而使杀伤活化受体的作用占主导地位，表现为NK细胞活化并产生杀伤作用。
NK细胞是机体天然免疫系统的重要组成部分，在机体抗病毒感染和抗肿瘤免疫中，NK细胞和CTL细胞作为最主要的效应细胞担负重要的作用。因此，对如何提高NK细胞杀伤靶细胞的效应和精确调控其靶向性的探索一直是研究抗病毒感染和抗肿瘤免疫治疗的热点，NK细胞作为免疫杀伤效应的第一道防线在机体肿瘤发生的早期承担最主要的抗肿瘤任务，也就是说，机体NK细胞的杀伤活性直接影响肿瘤的早期治疗和预后。
随着一系列NK细胞表面抑制性受体和活化性受体的发现，通过精确调节NK细胞表面受体提高NK细胞杀伤效应和成为抗肿瘤免疫治疗的新策略。因此，NK细胞抑制性受体的结构与功能的深入研究必然为抗肿瘤免疫治疗研究开辟新的途径，同时，也为抗病毒感染的免疫治疗提供新的思路。
近年来研究表明，人类NK细胞表面抑制性受体可以分为三个家族第一个家族为杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer Ig-like Receptors KIR)，在结构上为胞外段有二到三个免疫球蛋白样结构域的一型膜蛋白受体，配体为人类白细胞抗原I类分子(HLA I类分子)；第二个家族为免疫球蛋白样转录产物(ILT)；第三个家族为杀伤细胞凝集素样受体(Killer cell Lectin-likeReceptors KLR)，所有成员定位于12号染色体的NK复合体(NKC)。免疫抑制性受体的结构特点为胞内段含有一个或多个免疫受体酪氨酸相关的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs ITIM)，ITIM是由6个氨基酸组成的保守序列(I/L/VXYXXL/V，X代表任一氨基酸)。当免疫抑制性受体与相应配体偶联时，ITIM发生酪氨酸磷酸化，然后与SHP1蛋白酪氨酸磷酸酶或/和SPIP肌醇磷酸酶的结合，产生细胞活化的负调节效应。
C型凝集素家族基因定位于人12号染色体，小鼠6号染色体和大鼠4号染色体，此区域基因编码蛋白多与NK细胞功能相关，又称NK复合体(NKC)。人NK复合体长度约为2.5Mb，含有28个基因，目前已知与免疫功能相关的基因有18个，明确表达于NK细胞的有13个分别编码以下分子MAFA-L，NKRP1A，LLT1，CD69，AICL，KLRF1，CLEC-2，CD94，NKG2A/B，NKG2C，NKG2D，NKG2E/H和NKG2F。NK复合体所编码的大部分受体分子因尚不清楚相应配体及生理功能，仍为孤儿受体；已明确为NK细胞抑制性受体的分子是MAFA-L，CD94-NKG2A，Ly49a，Ly49c，Ly49e和Ly49g。
由于每一种抗原决定簇只能被一个B细胞克隆所识别，并产生一种特异性抗体，根据杂交瘤技术原理经过选择培养的杂交瘤细胞就只分泌一种抗体，即为单克隆抗体(mAb，简称单抗)。自从1975年德国Khler和英国Milstein采用杂交瘤技术首次成功的制备出针对一种抗原决定簇的mAb，单抗在诊断、治疗、预防和蛋白质纯化等方面日益显示出重要的作用和广阔的前景。由于此种抗体的纯度高和特异性强，可用于对各种免疫细胞及其他组织细胞表面分子的检测，这对免疫细胞的分离、鉴定、分类以及研究各种细胞膜表面分子的结构和功能等具有重要意义。
综上所述，本领域迫切需要开发对NK细胞的杀伤能力有调控作用(如激活作用)的单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的提供一种提高NK细胞杀伤能力的单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供含有该单克隆抗体的制法和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种免疫球蛋白，其特征在于，它特异性地结合于C型凝集素样受体L1，并且提高天然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞是肺癌细胞、乳腺癌细胞或宫颈癌细胞。
在另一优选例中，所述的免疫球蛋白是单克隆抗体。
在另一优选例中，所述的免疫球蛋白由杂交瘤细胞SP2/0-hKLRL1HK-13，CCTCC No.C200417所产生。
在本发明的第二方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有本发明上述的免疫球蛋白和选自下组的偶联部分药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。
在本发明的第三方面，提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它是杂交瘤细胞SP2/0-hKLRL1HK-13，CCTCC No.C200417。
在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，它含有0.001-99.9wt％(更佳地0.1-9wt0％)本发明上述的免疫球蛋白，以及药学上可接受的载体。
在本发明的第五方面，提供了一种产生单克隆抗体的方法，包括步骤(a)培养上述的杂交瘤细胞，从而表达单克隆抗体；和(b)从培养物中分离出单克隆抗体。
在本发明的第五方面，提供了本发明上述免疫球蛋白的用途，它们被用于制备提高天然杀伤细胞的杀伤活性的药物。
在另一优选例中，所述的杀伤活性针对肿瘤细胞(如肺癌、乳腺癌或宫颈癌的细胞)。
图1是本发明的单克隆抗体HK-13特异性识别NK细胞C型凝集素样受体L1(KLRL1)及本发明的单克隆抗体HK-13可用于证实人KLRL1对磷酸酶SHP-1和SHP-2的募集作用。
A为HK-13特异性识别NK细胞C型凝集素样受体L1(KLRL1)B为人KLRL1对磷酸酶SHP-1和SHP-2的募集作用图2是本发明的单克隆抗体HK-13可以检测NK-92细胞表面C型凝集素样受体L1(KLRL1)的表达。
图3显示了本发明的单克隆抗体HK-13特异性结合NK-92细胞C型凝集素样受体L1(KLRL1)，提高效应的杀伤活性具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究，制备和筛选了抗不同蛋白的各种单克隆抗体，意外发现抗C型凝集素样受体L1的单克隆抗体HK-13具有提高NK细胞杀伤能力的优异效果。在此基础上完成了本发明。
人NK细胞C型凝集素样受体L1(KLRL1)一种免疫抑制性受体，蛋白分子全长265个氨基酸，分子量约75kDa；该分子是杀伤细胞凝集素样受体家族中的II型跨膜糖蛋白，胞内区段含有一个ITIM特征结构，具有结合SHP-1和SHP-2的潜在能力；其基因定位于人12号染色体短臂NK复合体编码区，与hCLEC1、hCLEC2、CD94有较高的同源性；KLRL1主要表达于淋巴组织和免疫细胞。
如本文所用，“单克隆抗体HK-13”、“HK-13单克隆抗体”、“单抗HK-13”、“HK-13单抗”可互换使用，指由杂交瘤细胞SP2/0-hKLRL1HK-13，CCTCC No.C200417产生的单克隆抗体。
本发明包括具有HK-13单抗的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有HK-13单抗可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括药物、毒素、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与HK-13单抗或其片段结合的而形成的偶联物。
如本文所用，“免疫毒素”指对靶细胞有特异性亲和力和杀伤力的物质，例如免疫偶联物及融合表达产物包括药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素或其他治疗分子与HK-13单抗或其片段结合的而形成的偶联物。具体的例子有例如131I-HK-13偶联物等。
对于本发明HK-13单抗重链和轻链序列，可以用常规方法测定。HK-13单抗V链的超变区或互补决定区(complementarity determining region，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与HK-13单抗CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab′)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术(如PCR扩增法)，利用小鼠杂交瘤细胞系HK-13(CCTCC No.C200417)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的HK-13单抗的DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达单抗蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌等细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的HK-13单抗。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
此外，本发明还提供了一种检测KLRL1的试剂盒，它含有容器以及装于容器中的上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白(或免疫偶联物)，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于促进NK-13的杀伤活性，因此在某些癌症(如肝癌、肺癌、结肠癌、乳房癌、前列腺癌等)的治疗。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的免疫球蛋白(或上述的免疫偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明单克隆抗体施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于抗人NK细胞C型凝集素样受体L1(KLRL1)单克隆抗体可提高NK细胞对某些肿瘤细胞的杀伤活性，因此在提高或辅助提高免疫力方面有潜在的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗原制备人KLRL1单克隆抗体的制备用Trizol试剂提取处于人外周血单核细胞来源的树突状细胞总RNA，取5μg细胞总RNA与1μg Oligo-dT12-18混合，进行反转录。反转录体系为20μl，反应结束后加80μl ddH2O进行稀释。PCR扩增人KLRL1全长开放阅读框的引物如下有义引物5’-AAAGAATTCATGTCTGAAGAAGTTACTT-3’(SEQ ID NO1)，该引物含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是翻译起始子和人KLRL1的部分编码序列；反义引物5’-AAAGGATCCTCATGCCTCCCATTT-3’(SEQ ID NO2)，该引物含有BamH I限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人KLRL1的部分编码序列。
PCR反应体积为50μl，其中含反转录模板10μl、0.5mM引物、0.2mM dNTP和1U rTaq DNA聚合酶(Takara)，扩增参数为95℃15秒、57℃30秒、72℃90秒，32个循环后PCR产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳初步确认。DNA序列分析结果表明该PCR产物(约800bp)的编码DNA序列与人KLRL1的ORF序列完全相同。
将获得的PCR产物纯化后经EcoR I-BamH I酶切再与质粒pcDNA3.1/myc-his(-)B(Invitrogen公司)按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌BL21，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。经测序证实，已插入了所设计的CLSPa编码序列。正确序列的克隆形成载体pcDNA-KLRL1。
利用LipofectAMINE试剂(Invitrogen)进行真核细胞的基因转染，按照说明书操作。主要步骤为待转染的质粒pcDNA-KLRL1与脂质体LipofectAMINE按一定比例混合，室温作用45分钟；处60-80％汇合(confluent)生长6孔细胞培养板或10mm培养皿的待转染细胞，用OPTI-MEM无血清培养基(Invitrogen)洗两遍后，加入DNA-脂质体混合物，置37℃5％CO2培养6-8小时，加等体积含20％血清的正常培养基，继续培养6小时后更换新鲜培养基。瞬时表达于转染后48-72小时收集细胞进行检测，并收集细胞。经裂解后将裂解液作为抗原备用。
实施例2动物免疫以实施例1中制备的瞬时转染pcDNA-KLRL1的NIH3T3细胞小鼠成纤维细胞为抗原经腹腔注射免疫BALB/c小鼠，初次免疫3-4周后加强免疫3次，每次间隔2周。经四次免疫后，尾静脉取血，用免疫双扩法测得小鼠血清中有1∶4以上的免疫应答后，取等量细胞经尾静脉加强免疫。
实施例3细胞融合末次免疫3天后，取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0做细胞融合。取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在室温下融合30秒内加入预热的1ml 45％PEG(Merek，分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌；作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟；加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml；离心，800rpm，6分钟；弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬。根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl/孔，然后将培养板置于37℃、5％CO2的孵箱内培养。
实施例4筛选和制备抗体应用HAT选择培养液筛选融合细胞，ELISA及免疫印迹法检测阳性克隆，采用有限稀释法反复克隆化3-4次，得到有稳定分泌抗体能力的杂交瘤细胞株HK-13。离心收集至少5×106个生长良好的杂交瘤细胞，弃上清，加入1ml的冻存液，置于-196℃液氮中保存。另腹腔注射0.5ml液体石腊于BaLb/c小鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可收集腹水，经Affi-Gel protein A-agarose亲和柱(Bio-Rad Laboratories)纯化得到单克隆抗体。结果得到了多种单克隆抗体。
用标准抗Ig类与亚类血清系统作夹心ELISA来分析所得到各个单克隆抗体的表型。
结果显示获得一种小鼠抗人KLRL1单克隆抗体HK-13的表型为IgGl，kappa。(一些其他单克隆抗体因为没有明显的提高NK细胞杀伤活性，故没有进一步分析其表型。)产生单克隆抗体HK-13的细胞是杂交瘤细胞SP2/0-hKLRL1HK-13，该杂交瘤细胞系于2004年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)No.C200417。
实施例5免疫共沉淀和Western印迹检测收集培养细胞SP2/0-hKLRL1HK-13(CCTCC NoC200417)，在含1mM PMSF的PBS中洗两次后，重悬于T-PER组织蛋白抽提试剂(Pierce公司)中，混匀，放冰上20min，以10,000g 4℃离心10分钟，收集上清。蛋白样品定量采用BCA法。
收集用于免疫共沉淀的细胞，在含1mM PMSF的PBS中洗两次后，加入0.5mlPBS置于37℃预处理5分钟；加入终浓度为100μM的Na3VO4和0.03％H2O2置于37℃孵育5分钟；随后在冰上加入2×1％毛地黄皂苷(digitonin)裂解液(25mMTris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5，1％毛地黄皂苷，1mM NaF，1mM PMSF，1mM Na3VO4，10μg/ml leupeptin，and 10μg/ml aprotinin)裂解30分钟，16,000g4℃离心15分钟，收集细胞裂解上清，加入正常BALB/c小鼠血清和蛋白A beads4℃震荡孵育预封闭1小时，2,300g 4℃离心2分钟收集上清，加入单克隆抗体HK-13和蛋白A beads 4℃震荡孵育8小时。2,300g 4℃离心2分钟收集anti-FlagM2-琼脂糖珠，用0.5％毛地黄皂苷裂解液洗3次，即为免疫沉淀物。
将蛋白样品或免疫沉淀物行SDS-PAGE，随后以100V恒电压于4℃转至硝酸纤维素膜上，丽春红染色并标记大小和方向。室温阻断2小时(5％脱脂奶粉的TBST溶液)，以阻断液稀释一抗，室温孵育1小时。TBST(0.05％Tween 20的TBS溶液)洗15分钟、3次，以阻断液稀释二抗，室温孵育2小时。TBST洗15分钟、3次，TBS(10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl)洗15分钟，然后加入化学发光底物作用1min，并迅速封膜和自显影。
用于Western印迹检测KLRL1蛋白表达的—抗为小鼠抗KLRL1单克隆抗体HK-13，二抗为HRP标记抗鼠IgG(Santa Cruz公司)；用于免疫共沉淀后Western印迹检测SHP-1、SHP-2和SHIP1的—抗分别为兔抗SH-PTP1(SHP-1)多抗、兔抗SH-PTP2多抗和兔抗SHIP1多抗(Santa Cruz公司)，二抗为HRP标记抗兔IgG(Santa Cruz公司)。
结果提示，在NK细胞系NK-92以及髓系/单核细胞系U937中，用单克隆抗体HK-13能够特异性识别并结合人KLRL1，并证实KLRL1在酪氨酸磷酸化的情况下可以通过募集酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2(图1)。
实施例6用单克隆抗体HK-13检测NK-92细胞表面KLRL1的表达收集指数生长期的常规的天然杀伤细胞NK-92细胞(购自ATCC，CRL-2407)，用PBS悬浮为1×106细胞/ml，加入离心管，100μl/管，以单克隆抗体HK-13为间标第一抗体，同型Ig为对照抗体。4℃标记45分钟，PBS洗2遍；然后，加入FITC标记的抗鼠IgG；终浓度5ug/ml，置暗处，4℃标记45分钟，PBS洗2遍，用流式细胞仪(FACS calibur，BD公司)检测细胞表面KLRL1表达，CellQuest软件分析。
结果如图2所示，表明HK-13单抗可以检测NK-92细胞表面C型凝集素样受体L1(KLRL1)的表达。
实施例7NK细胞杀伤活性检测和单克隆抗体HK-13功能检测运用LDH释放法检测NK细胞杀伤活性检测，基本原理如下乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是胞浆中的酶，细胞死亡后释放到上清中；在硫辛酰胺脱氢酶和氧化型辅酶I的共同作用下，乳酸脱氢酶可以将2-p-碘苯酯-3-p-氯化硝基苯四唑(INT)转化为红色formazan；通过吸光检测可以间接检测细胞死亡率。检测试剂盒是CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promego)，基本方法如下收集对数生长期的靶细胞，计数；在96孔圆底板中加入靶细胞，每孔50μl，细胞数为1×103；收集对数生长期的效应细胞，计数倍比稀释；向每孔加入效应细胞50μl，效应细胞和靶细胞(各种癌细胞)分别为50∶1、25∶1和12.5∶1，250g离心5分钟后置37℃5％CO2孵育4小时；250g离心5分钟，每孔吸出50μl上清对应加入另一96孔酶联检测板，依次加入50μl反应液，室温避光放置30分钟，在酶联检测仪上检各孔吸光度(OD值)，检测波长490nm。
单克隆抗体HK-13中和实验收集对数生长期的效应细胞，与纯化的单克隆抗体HK-13在37℃5％CO2的孵箱内共孵育30分钟，HK-13的终浓度为20μg/ml，对照组用与之浓度相同的IgG，然后用RPMI 1640无血清培养基洗两遍，记数铺板，以下步骤与上述相同。
杀伤活性(％)＝[(OD实验组-OD总自然释放)/(OD最大释放组-OD总自然释放)]×100结果显示，经HK-13预处理的NK-92细胞作用于肺癌细胞A549(购自ATCC，CCL-185)、乳腺癌细胞MCF-7(购自ATCC)和宫颈癌HeLa细胞(购自ATCC)的杀伤效率明显提高。其中对A549细胞的杀伤效果如图3所示。当效应细胞∶靶细胞＝25∶1时，对乳腺癌细胞MCF-7和宫颈癌HeLa细胞的裂解率为48-50％，高于对照IgG的裂解率(约30％)。
上述结果证明HK-13抗体作为一种hKLRL1的单克隆抗体可以提高NK-92细胞对于某些肿瘤细胞的杀伤活性。
实施例8药物组合物将纯化的HK-13单克隆抗体与生理盐水配制成溶液，浓度为10μg/ml，装于灭菌小瓶中，10ml/瓶。
菌种保藏杂交瘤细胞SP2/0-hKLRL1HK-13于2004年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)No.C200417。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国人民解放军第二军医大学<120>C型凝集素样受体L1的单克隆抗体及其制备和应用<130>048324<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1aaagaattca tgtctgaaga agttactt 28<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2aaaggatcct catgcctccc attt 2权利要求
1.一种免疫球蛋白，其特征在于，它特异性地结合于C型凝集素样受体L1，并且提高天然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
2.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的肿瘤细胞是肺癌细胞、乳腺癌细胞或宫颈癌细胞。
3.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是单克隆抗体。
4.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它由杂交瘤细胞SP2/0-hKLRL1 HK-13，CCTCC No.C200417所产生。
5.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有权利要求1所述的免疫球蛋白和选自下组的偶联部分药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。
6.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它是杂交瘤细胞SP2/0-hKLRL1 HK-13，CCTCC No.C200417。
7.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的免疫球蛋白，以及药学上可接受的载体。
8.一种产生单克隆抗体的方法，其特征在于，包括步骤(a)培养权利要求6所述的杂交瘤细胞，从而表达单克隆抗体；和(b)从培养物中分离出单克隆抗体。
9.如权利要求1所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，用于制备提高天然杀伤细胞的杀伤活性的药物。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的杀伤活性针对肺癌、乳腺癌或宫颈癌。
全文摘要
本发明公开了一种人NK细胞C型凝集素样受体L1(KLRL1)单克隆抗体及其制备和应用。本发明的该单克隆抗体可提高NK细胞对于某些肿瘤细胞的杀伤活性。
文档编号C12N5/00GK1778822SQ20041008449
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月24日 优先权日2004年11月24日
发明者韩岩梅, 李楠, 万涛, 曹雪涛 申请人:中国人民解放军第二军医大学