专利名称：能催化吲哚生成靛蓝的P450BM－3Glu 435Asp变体基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化工中的基因工程菌生产靛蓝染料的技术领域，尤其涉及一种能催化吲哚生成靛蓝的P450BM-3Glu435 Asp变体基因及其用途。
背景技术：
酶分子的定向进化技术就是人为的创造特殊的进化条件，模拟天然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个人工突变酶库通过一定筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。与自然进化相比。酶分子的定向进化过程完全是在人为控制下进化的，使酶分子朝向人们期望的特定目标进行。近年来随着诸如易错PCR，DNA改组等技术的应用，在对目的基因表达有高效检测筛选体统的条件下，尽管尚不清楚酶分子的结构等特性，采用酶分子的定向策略能获得具有预期特性的新酶，实现酶分子的人为的快速进化。诸多的研究表明，在目前对酶分子认识还不成熟的情况下通过DNA水平上适当修饰来改变酶的氨基酸顺序，进而改变酶的性能是可能在重组生物中产生新的酶类，并获得比天然酶活力更高，稳定性和催化性能更好的进化酶，以满足研究和应用的需要。
P450酶系是广泛分布于动物，植物和微生物等不同的生物体内的一类代谢酶系.因其主要成分中P450蛋白与CO结合后，在450nm处有特征光吸收峰而得名。研究表明。它可以催化成千上万的化学反应，参与的主要反应有烷基的羟基化，烷基的环氧化，羟基的氧化。氨，氧，硫部位上脱烷基化，氨部位上羟基化和氧化，硫部位上的氧化，氧化性脱氨，脱氢和脱卤素，氧化性的C-C键断裂以及其它一些还原催化反应。有专著甚至指出它可能是自然界中最具有催化多样性的生物催化剂。由于该酶系的性质和功能以及在生命活动过程中的作用。P450酶系受到广大研究者的极度重视。P450酶系的作用的重要性已经成为当代生物学研究中一个值得注意的领域。国外的研究工作主要分布在该酶系在生物体系中的作用以及利用该酶系的催化作用大规模生产手性药物等方面。而在国内。虽然有大量关于该酶系的综述性和研究性的报道。但研究工作却只限于该酶系在生物机体中的作用。目前尚未见有该酶系的催化作用制备手性药物的报道。有学者指出，主要原因是国内目前尚未能获得适量的酶。
在P450酶系中，P450 BM-3是从巨大芽孢杆菌中发现的具有脂肪酸羟基化活性的酶，现在已作为哺乳动物微粒体P450单加氧酶重要的模型。P450BM-3是一种可溶解的单加氧酶，分子量117,641Da，不像其它P450酶催化需要额外的蛋白，P450BM-3在NADPH和O2的存在下，它具有快速催化链长为C12-C18的饱和脂肪酸的加单氧酶活性。在国外，德国的斯图加特大学技术生化研究所R.D.Schmid领导的科研小组在1999年利用定点突变定向进化技术获得具有三个突变位点的P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)，他们意外的发现这一突变酶竟然能够催化吲哚生成靛蓝。因此，本发明就在R.D.Schmid领导的科研小组用易错PCR技术进一步定向进化获得的具有三个突变位点的P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)变体基因的基础上，通过易错PCR技术进一步定向进化P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)变体基因，获得了一个高于P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)催化吲哚活性的P450BM-3变体酶P450BM-3(Glu435→Asp)，从而提高靛蓝的产量，使生物转化合成靛蓝更加接近实用化。
靛蓝(indigo)是一种颜色鲜艳而又耐久的蓝色染料，是最早发现的天然染料之一，全球对染料的总体需求是800,000t，靛蓝就占据了80,000t。远古时代主要是从含有靛蓝的植物中提取。1897年西德BASF生产的合成靛蓝问世，它以生产简便、原料充足、纯度高、易贮运、使用方便等优点后来居上，迅速普及，从而使得具有几千年历史的植物靛蓝黯然失色。本世纪60年代之后，天然靛蓝终于销声匿迹，退出了历史舞台。进入80年代之后，随着社会现代化程度的日益提高，环境保护和劳动保护意识逐渐普及，人们开始认识到了合成化学工业的一系列有损健康、污染环境的弊病。如合成靛蓝中使用的苯胺和邻苯二甲酸酐能导致人体急性和慢性中毒，对呼吸道和中枢神经及肝脏均有一定损害。而生物转化合成天然靛蓝产生的有害废物比化学方法少，既节能又廉价，保护自然环境，维持生态平衡等方面，无疑都是具有重要意义的。因此很多研究者认为发展生物法生产生物靛蓝染料是极具有前途的。
发明内容
本发明的目的是提供一种能催化吲哚生成靛蓝的P450BM-3 Glu435Asp变体基因及其用途。
它通过易错PCR技术介导的随机突变，筛选获得的P450BM-3变体基因，该P450BM-3基因中的第435位的谷氨酸(Glu)的密码子GAA突变为天冬氨酸(Asp)的密码子GAT，所得到的P450BM-3变体基因(Glu435→Asp)P450BM-3该变体基因序列为SEQ ID No.1核苷酸序列，并且编码细胞色素P450BM-3的单加氧酶。
能催化吲哚生成靛蓝的P450BM-3Glu435 Asp变体基因，表达所得到P450BM-3变体蛋白酶能催化吲哚生成染料靛蓝。
本发明创造了一种对吲哚具有更高催化活力的P450BM-3变体基因，其突变位点为Glu435→Asp，该变体基因表达的突变酶能构催化吲哚生成染料靛蓝，与R.D.Schmid领导的科研小组获得的具有三个突变位点的P450BM-3(Phe87Val，Leu188Gln，Ala74Gly)变体酶相比较，在测定的一例中活性提高了1.5-1.7倍，为生物转化生产染料靛蓝提供了广阔的应用前景。
图1质粒pET28α(+)P450BM-3的基因图谱；图2靛蓝的TLC定性鉴定，图中1-标准靛蓝 2-催化产生靛蓝 3-催化产生靛玉红；图3突变位点Glu435→Asp在蛋白质三级结构中的位置；图4定点突变原理示意图。
具体实施例通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，或使用低保真度TaqDNA聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错误引入获得P450BM-3突变基因文库，并通过一定的筛选方法获得P450BM-3变体基因，即Glu435→Asp，并实现在大肠杆菌中的高效表达，经分离纯化，创造出对吲哚有较高催化的P450BM-3变体酶，该P450BM-3变体酶能催化吲哚生成靛蓝染料。本发明得到的突变酶生产出靛蓝染料可能成为一种替代化学染料的环保型技术。
本发明的技术内容包括通过改变传统PCR反应体系中某些组分的浓度，或使用低保真度TaqDNA聚合酶等，使碱基在一定程度上随机错误引入获得突变基因文库，并通过一定的筛选方法获得一种变体基因，即，本发明按照上述的设计思想，通过降低传统PCR中一种或者两种dATP dGTP dCTP dTTP的浓度并且加入一定量的MnCl2，同时采用低保真度的TaqDNA聚合酶，使基因在扩增时能随机的创造突变，然后将易错PCR扩增产物经NheI-BamHI双酶切后插入到用同样的酶双酶切后的线性质粒pET28α(+)，然后转化到转化到E.ColiBL21中，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养。从平板上挑取蓝色的克隆，并接种到200μl含有30μg/ml卡那霉素LB液体培养基的96微孔板中，37℃过夜培养，取20μl该过夜培养液加入到一个新的200μl含有30μg/ml卡那霉素LB液体培养基的96微孔板中，在37℃培养至OD6000.5-0.7时加入IPTG(终浓度0.5μM)诱导并在30℃继续培养48小时，得到蓝色的细胞，用THF提取该蓝色物质，在630nm处测定其吸收值，将吸收值高于亲本的菌株挑选出来并进行100ml规模的培养，离心收集菌体，超声破菌，保留上清液，该上清液含有P450BM-3变体酶，通过测定测定其酶反应动力学曲线，筛选出活力高于原酶的菌株挑选出来并提取质粒进行全自动DNA测序，发现突变位点为Glu435→Asp。
序列表(1)SEQ ID NO.1.信息(a)序列特征长度3150个碱基类型核酸链型单链拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)最初来源巨大芽孢杆菌(d)序列描述SEQ ID NO.1ATGACAATTAAAGAAATGCCTCAGCCAAAAACGTTTGGAGAGCTTAAAAATTTACCGTTATTAAACACAGATAAACCGGTTCAAGCTTTGATGAAAATTGCGGATGAATTAGGAGAAATCTTTAAATTCGAGGCGCCTGGTCGTGTAACGCGCTACTTATCAAGTCAGCGTCTAATTAAAGAAGCATGCGATGAATCACGCTTTGATAAAAACTTAAGTCAAGCGCTTAAATTTGTACGTGATTTTGCAGGAGACGGGTTATTTACAAGCTGGACGCATGAAAAAAATTGGAAAAAAGCGCATAATATCTTACTTCCAAGCTTCAGTCAGCAGGCAATGAAAGGCTATCATGCGATGATGGTCGATATCGCCGTGCAGCTTGTTCAAAAGTGGGAGCGTCTAAATGCAGATGAGCATATTGAAGTACCGGAAGACATGACACGTTTAACGCTTGATACAATTGGTCTTTGCGGCTTTAACTATCGCTTTAACAGCTTTTACCGAGATCAGCCTCATCCATTTATTACAAGTATGGTCCGTGCACTGGATGAAGCAATGAACAAGCTGCAGCGAGCAAATCCAGACGACCCAGCTTATGATGAAAACAAGCGCCAGTTTCAAGAAGATATCAAGGTGATGAACGACCTAGTAGATAAAATTATTGCAGATCGCAAAGCAAGCGGTGAACAAAGCGATGATTTATTAACGCATATGCTAAACGGAAAAGATCCAGAAACGGGTGAGCCGCTTGATGACGAGAACATTCGCTATCAAATTATTACATTCTTAATTGCGGGACACGAAACAACAAGTGGTCTTTTATCATTTGCGCTGTATTTCTTAGTGAAAAATCCACATGTATTACAAAAAGCAGCAGAAGAAGCAGCACGAGTTCTAGTAGATCCTGTTCCAAGCTACAAACAAGTCAAACAGCTTAAATATGTCGGCATGGTCTTAAAC
GAAGCGCTGCGCTTATGGCCAACTGCTCCTGCGTTTTCCCTATATGCAAAAGAAGATACGGTGCTTGGAGGAGAATATCCTTTAGAAAAAGGCGACGAACTAATGGTTCTGATTCCTCAGCTTCACCGTGATAAAACAATTTGGGGAGACGATGTGGAAGAGTTCCGTCCAGAGCGTTTTGAAAATCCAAGTGCGATTCCGCAGCATGCGTTTAAACCGTTTGGAAACGGTCAGCGTGCGTGTATCGGTCAGCAGTTCGCTCTTCATGAAGCAACGCTGGTACTTGGTATGATGCTAAAACACTTTGACTTTGAAGATCATACAAACTACGAGCTGGATATTAAAGATACTTTAACGTTAAAACCTGAAGGCTTTGTGGTAAAAGCAAAATCGAAAAAAATTCCGCTTGGCGGTATTCCTTCACCTAGCACTGAACAGTCTGCTAAAAAAGTACGCAAAAAGGCAGAAAACGCTCATAATACGCCGCTGCTTGTGCTATACGGTTCAAATATGGGAACAGCTGAAGGAACGGCGCGTGATTTAGCAGATATTGCAATGAGCAAAGGATTTGCACCGCAGGTCGCAACGCTTGATTCACACGCCGGAAATCTTCCGCGCGAAGGAGCTGTATTAATTGTAACGGCGTCTTATAACGGTCATCCGCCTGATAACGCAAAGCAATTTGTCGACTGGTTAGACCAAGCGTCTGCTGATGAAGTAAAAGGCGTTCGCTACTCCGTATTTGGATGCGGCGATAAAAACTGGGCTACTACGTATCAAAAAGTGCCTGCTTTTATCGATGAAACGCTTGCCGCTAAAGGGGCAGAAAACATCGCTGACCGCGGTGAAGCAGATGCAAGCGACGACTTTGAAGGCACATATGAAGAATGGCGTGAACATATGTGGAGTGACGTAGCAGCCTACTTTAACCTCGACATTGAAAACAGTGAAGATAATAAATCTACTCTTTCACTTCAATTTGTCGACAGCGCCGCGGATATGCCGCTTGCGAAAATGCACGGTGCGTTTTCAACGAACGTCGTAGCAAGCAAAGAACTTCAACAGCCAGGCAGTGCACGAAGCACGCGACATCTTGAAATTGAACTTCCAAAAGAAGCTTCTTATCAAGAAGGAGATCATTTAGGTGTTATTCCTCGCAACTATGAAGGAATAGTAAACCGTGTAACAGCAAGGTTCGGCCTAGATGCATCACAGCAAATCCGTCTGGAAGCAGAAGAAGAAAAATTAGCTCATTTGCCACTCGCTAAAACAGTATCCGTAGAAGAGCTTCTGCAATACGTGGAGCTTCAAGATCCTGTTACGCGCACGCAGCTTCGCGCAATGGCTGCTAAAACGGTCTGCCCGCCGCATAAAGTAGAGCTTGAAGCCTTGCTTGAAAAGCAAGCCTACAAAGAACAAGTGCTGGCAAAACGTTTAACAATGCTTGAACTGCTTGAAAAATACCCGGCGTGTGAAATGAAATTCAGCGAATTTATCGCCCTTCTGCCAAGCATACGCCCGCGCTATTACTCGATTTCTTCATCACCTCGTGTCGATGAAAAACAAGCAAGCATCACGGTCAGCGTTGTCTCAGGAGAAGCGTGGAGCGGATATGGAGAATATAAAGGAATTGCGTCGAACTATCTTGCCGAGCTGCAAGAAGGAGATACGATTACGTGCTTTATTTCCACACCGCAGTCAGAATTTACGCTGCCAAAAGACCCTGAAACGCCGCTTATCATGGTCGGACCGGGAACAGGCGTCGCGCCGTTTAGAGGCTTTGTGCAGGCGCGCAAACAGCTAAAAGAACAAGGACAGTCACTTGGAGAAGCACATTTATACTTCGGCTGCCGTTCACCTCATGAAGACTATCTGTATCAAGAAGAGCTTGAAAACGCCCAAAGCGAAGGCATCATTACG
CTTCATACCGCTTTTTCTCGCATGCCAAATCAGCCGAAAACATACGTTCAGCACGTAATGGAACAAGACGGCAAGAAATTGATTGAACTTCTTGATCAAGGAGCGCACTTCTATATTTGCGGAGACGGAAGCCAAATGGCACCTGCCGTTGAAGCAACGCTTATGAAAAGCTATGCTGACGTTCACCAAGTGAGTGAAGCAGACGCTCGCTTATGGCTGCAGCAGCTAGAAGAAAAAGGCCGATACGCAAAAGACGTGTGGGCTGGGTAA下面是
具体实施例方式1.定点突变突变在基因序列第1460-1475位点获得BamHI酶切位点a)定点突变引物的设计和PCR扩增产物的获得上游引物B1 5`-TGTGCTATACGGATCCGAATATGGGAACAGC-3′↑BamHI酶切位点↓下游引物B2 5′-TGTTCCATATTGGATCCGTATAGCACCAAGC-3′选择P450BM3基因第1469位的A替换为C和1472位的T替换为A，这一替换属于沉默突变，设计一对突变引物B1和B2，以pET28α(+)P450BM-3为模板，用QuikChangTM定点突变扩增的方法向P450BM-3基因引入点突变，如附图4所示。
向500μl的eppendorf管中加入25pmol的dNTPs，上游引物，下游引物各10pmol，大约1ng质粒pET28α(+)BM3作为模板DNA，2.5u pfuDNA聚合酶，5μl的含有MgCl2(25mM)的PCR缓冲液，然后加无菌的蒸馏水至总体积50μl。PCR反应参数是通过95℃变性1分钟后，在95℃ 30s，55℃ 1min，每一循环温度上升0.7℃，72℃ 16min，总共14个循环，然后72℃延伸30s。
b)具有BamHI酶切位点的变体基因的获得上述PCR扩增产物用1μl DpnI(10u/μl)消化2小时后转化到E.coli DH5α中并涂布到含有30μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养。大约挑选12个克隆接种到5ml的含有30μg/ml卡那霉素LB液体培养基中，37℃过夜培养以扩增质粒。提取质粒并用BamHI和EcoRI在37℃酶解后，利用DNA电泳和全自动DNA测序检测期望的突变位点是否引入。
2.易错PCR引物的设计和PCR扩增产物的获得根据P450BM-3的cDNA的单加氧酶的编码区设计的，为了方便以后的操作，在引物的5′端分别引入BamHI和NheI位点。
上游引物5′-CTAGCTAGCATGACAATTAAAG-3′↑NheI酶切位点BamHI酶切位点↓下游引物5′-CATATTGGATCCGTATAGCACAAC-3′向500μl的eppendorf管中加入100pmol的dNTPs，上游引物，下游引物各20pmol，大约1ng pET28α(+)P450BM-3(由定点突变突变在基因序列第1460-1475位点具有BamHI酶切位点的pET28α(+)P450BM-3)作为模板DNA，以及最终浓度范围为0到0.20mM MnCl2，2.5uTaqDNA聚合酶，5μl的的PCR缓冲液，12.5μl 25mM的MgCl2，然后加无菌的蒸馏水至总体积50μl。反应参数是通过95℃变性3分钟后，在95℃ 1min，47℃ 2min，72℃ 2min，经过25个循环，然后72℃延伸2min。
3.突变文库的构建易错PCR扩增产物经NheI-BamHI双酶切后插入到用同样的酶双酶切后的线性质粒pET28α(+)，然后转化E.ColiBL21中，涂布到到含有30μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养。
酶切时质粒pET28α(+)P450BM-3以及限制酶的用量比质粒pET28α(+)P450BM-3 5μlNheI(10u/μl) 1μlBamHI(10u/μl) 1μlBuffer(10X) 5μl无菌水 8μl总体积 20μl质粒pET28α(+)-P450BM-3连接时连接酶和质粒的配比质粒DNA pET28α(+)片断 2μl基因P450BM-3片断4μlT4DNA连接酶 1μlT4DNA连接酶Buffer(10X) 2μl无菌水 11μl总体积 20μl4.一种对吲哚具有高催化活性的变体基因的的筛选从平板上挑取蓝色的克隆，并接种到200μl含有30μg/ml卡那霉素LB液体培养基的96微孔板中，37℃过夜培养，取20μl该过夜培养液加入到一个新的200μl含有30μg/ml卡那霉素LB液体培养基的96微孔板中，在37℃培养至OD6000.5-0.7时加入IPTG(终浓度0.5μM)诱导并在30℃继续培养48小时，得到蓝色的细胞，用THF提取该蓝色物质，在630nm处测定其吸收值，将吸收值高于亲本的菌株挑选出来并接种到100毫升LB液体培养基中种子液为试管培养液，接种量1％-3％，培养基的体积为100毫升，pH7.0-7.5，摇床转速为150-200转\分钟，在37℃培养至OD0.5-0.7时加入IPTG(O.5-1.0um)诱导，然后将温度转为30℃继续培养5-8小时，培养液以80000转\分钟离心10-20分钟，去除上清液，收获离心后的细胞，悬浮于5毫升的pH7.5 50mM含有0.5MNaCl和微量PMSF的磷酸盐缓冲液中，在冰浴的条件下超声破菌10分钟(超声60秒，间隙60秒)，再8000rpm离心4℃离心15分钟，得到含有P450BM-3变体酶的上清液，并用以下方法测定其酶活在1ml缓冲液为pH8.2的磷酸缓冲液反应液中加入10mM-100mM吲哚为底物，加入1.2nmol-2.4nmol P450BM-3变体酶，室温下培育9分钟，加入20μl NADPH 5mg/ml启动反应(ϵ=6.2mM-1cml),]]>测定其酶反应动力学曲线，筛选出活力高于原酶的菌株挑选出来并提取质粒进行全自动DNA测序，发现突变位点为Glu435→Asp。用蛋白质模拟技术确定该突变位点接近活性位点，猜想该突变使其允许底物更加接近催化中心，这种突变都发生在活性位点的空穴内通过酶动力学曲线的测定，与R.D.Schmid领导的科研小组获得的具有三个突变位点的P450BM-3(Phe87Val，Leul88Gln，Ala74Gly)变体酶相比较，在测定的一例中活性提高了1.5-1.7倍。
5.全细胞生产染料靛蓝a)挑取含有该P450BM-3变体基因G1u435→Asp的阳性克隆接种到LB液体培养基中种子液为试管培养液，接种量1％-2％，培养基的体积为100毫升，pH7.0-7.5，摇床转速为150-200转\分钟，在37℃培养至OD0.5-0.7时加入IPTG(0.5-1.0um)诱导，然后将温度转为30℃继续培养48小时。
b)将培养液以4000-80000转\分钟离心10-20分钟，放弃上清液，收获离心后的细胞。离心后的细胞用适量的水冲洗2-3次，，加入适量的四氢呋喃(THF)提取蓝色物质，1000-2000转\分钟离心保留上清液，用旋转蒸发仪干燥，然后在干燥好的蓝色沉淀中加入无水乙醇提取数次，直到最后一次提取液没有红色为止，将剩下的蓝色物质再用THF溶解。
c)TLC薄层色谱定性分析产生的靛蓝色谱条件预涂硅胶TLC板西德E.MERCK公司生产的硅胶60F25TLC板10cm×10cm×2cm，使用前在120℃活化1小时溶剂系统四氢呋喃∶汽油醚＝1∶2，无水乙醇均为分析纯展开方法上行法展开前饱和5分钟展距7.5cm温度室温试验方法用毛细血管吸取适量的提取液距TLC板底边1.5cm处点样，待溶剂挥发后立即放入存有展开剂的层析缸中分别进行展开，待至前沿7.5cm时取出凉干，并立即扫描，如附图2所示。
扫描条件扫描条件228nm单波长反射矩齿扫描，狭缝04mm×04从图2中看出从发酵液中提取的蓝色物质和商业出售的标准靛蓝有相同的RF值都为0.78，因此我们获得的这一变体基因产生的蓝色物质是靛蓝。
权利要求
1.一种能催化吲哚生成靛蓝的P450BM-3Glu435 Asp变体基因，其特征在于通过易错PCR技术介导的随机突变，筛选获得的P450BM-3变体基因，该P450BM-3基因中的第435位的谷氨酸(Glu)的密码子GAA突变为天冬氨酸(Asp)的密码子GAT，所得到的P450BM-3变体基因(Glu435→Asp)P450BM-3该变体基因序列为SEQID No.1核苷酸序列，并且编码细胞色素P450BM-3的单加氧酶。
2.一种如权利要求1所述能催化吲哚生成靛蓝的P450BM-3Glu435 Asp变体基因的用途，其特征在于，表达所得到P450BM-3变体蛋白酶能催化吲哚生成染料靛蓝。
全文摘要
本发明公开了一种能催化吲哚生成靛蓝的P450BM－3Glu435Asp变体基因及其用途。它通过易错PCR技术介导的随机突变，筛选获得的P450BM－3变体基因，该P450BM－3基因中的第435位的谷氨酸的密码子GAA突变为天冬氨酸的密码子GAT，所得到的P450BM－3变体基因(Glu
文档编号C12N9/02GK1637144SQ20041008917
公开日2005年7月13日 申请日期2004年11月29日 优先权日2004年11月29日
发明者梅乐和, 李红梅, 姚善泾 申请人:浙江大学