专利名称：诱导干细胞向胰岛样细胞分化的方法及胰岛样细胞的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种体外诱导干细胞向胰岛样细胞定向分化的方法及胰岛样细胞的用途。
背景技术：
糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体作缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。临床上，I型及部分II型糖尿病多采用皮下注射胰岛素来治疗。细胞治疗是糖尿病尤其是I型糖尿病的理想治疗策略，对于已经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说，植入能分泌胰岛素的β细胞或其替代物是最理想的治疗方法。近几年，胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难却极大的限制了这种疗法的应用。
干细胞具有极强自我更新能力及多向分化潜能，是基因治疗的理想靶细胞。干细胞分为全能干细胞(如胚胎干细胞，可以分化为机体所有组织细胞)、多能干细胞(具有多向分化潜能，可以分化为多种组织细胞，如间充质干细胞等)和专能干细胞(维持某一特定组织细胞的单一方向自我更新，如肠上皮干细胞等)。干细胞技术的不断突破及干细胞本身所具有的特性使人类有可能在体外培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织工程以供临床所需，以此为目的的干细胞工程涉及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的大多数医学难题，如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于人脐带血、外周血和骨髓中的多能干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的作用。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种肠促胰岛素激素，它是一种由小肠L细胞分泌的多肽激素，具有促进胰岛素分泌，抑制胰升糖素释放，抑制胃排空，增加β细胞增殖等作用。它还具有对葡萄糖依赖的降血糖作用，不会产生低血糖。能使2型糖尿病病人的基础和葡萄糖刺激后β细胞功能恢复到非糖尿病水平，改善血脂水平。GLP-1受体是一个与G蛋白偶联的7个跨膜结构，主要第二信使为cAMP，当细胞外液葡萄糖浓度增加时，葡萄糖进入β细胞被氧化使细胞内ATP含量增加，ATP与ATP敏感K+通道结合，导致K+通道关闭，细胞膜去极化，于是Ca2+通道开放，Ca2+内流，刺激胰岛素从β细胞排出，从而促进了胰岛素的分泌。GLP-1与β细胞膜上的GLP-1受体结合，通过增加细胞内cAMP，使K+ATP酶磷酸化进而促进胰岛素的分泌，同时竞争胰高血糖素受体，降低胰高血糖素浓度。
对干细胞进行适当的基因修饰，使之成为能分泌胰岛素的细胞，是治疗I型糖尿病的理想策略之一，而引入胰高血糖素样肽-1受体基因(glp-1r基因)，有可能使我们获得能分泌胰岛素的细胞。因此，分离不同组织来源的成体干细胞，将其在体外诱导分化为胰岛样细胞作为种子细胞用于胰岛细胞移植、微囊化干细胞制剂等的制备，同时诱导分化的胰岛样细胞可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。此方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立一种体外诱导干细胞分化为胰岛样细胞的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是利用干细胞具有多向分化的潜能，诱导其向胰岛样细胞分化，诱导分化的细胞可分泌胰岛素，为胰岛细胞移植、微囊化干细胞制剂的制备提供种子细胞，同时诱导分化的细胞可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。
本发明中所用的诱导方法，其特征在于利用含有GLP-1受体基因的载体转染干细胞，并同时添加细胞因子GLP-1，在GLP-1的作用下诱导干细胞向胰岛样细胞分化。
本发明中的干细胞包括人和哺乳动物胚胎、骨髓、动员的外周血、脐带血以及其它组织来源的间充质干细胞、胰腺干细胞、肝干细胞、造血干细胞及神经干细胞。
本发明中所用的载体包括腺病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒载体，逆转录病毒载体，通过这些载体介导GLP-1R基因在干细胞中表达。
本发明所用的体外诱导方法是将GLP-1直接加入转染了GLP-1R基因的干细胞的培养液中，在GLP-1的作用下诱导干细胞向胰岛样细胞分化。
本发明用于基因转染的载体中腺病毒载体是转染GLP-1R基因的首选病毒载体。
本发明选用的培养液为无血清诱导培养液，其中添加了营养素或细胞因子，包括GLP-1、尼克酰胺、葡萄糖，可以诱导转染GLP-1R基因的干细胞向胰岛样细胞分化。
本发明中所获得的胰岛样细胞团能表达胰岛相关基因及蛋白，包括葡萄糖转运子、葡萄糖激酶、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素。
本发明中体外诱导干细胞向胰岛样细胞分化后的胰岛样细胞能分泌胰岛素，可作为种子细胞用于胰岛细胞移植、微囊化干细胞制剂的制备及作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。
具体实施方案如下1.分离不同组织来源的成体干细胞，制备方法是(1)骨髓间充质干细胞的分离无菌条件下，经双侧髂后上棘穿刺，采集骨髓，经Percoll(美国，Sigma公司产品，相对密度1.073g/ml)密度梯度离心后收集人骨髓单个核细胞，贴壁培养72h，去除悬浮细胞后贴壁生长的即为骨髓间充质干细胞。
(2)大鼠肝干细胞分离无菌条件下，沿正中线切开大鼠腹腔并暴露门静脉，输注无钙镁Hanks液至肝脏变成肉色后，保留门静脉，离断肝脏并将肝脏移入无菌平皿中，再输注含IV型胶原酶的Hanks液，回收平皿内的胶原酶液，去除肝包膜及血管，钝性撕裂肝组织，以培养基溶解，多层纱布过滤，反复离心洗涤，再以培养基制备成单个肝细胞悬液。
(3)脐带血单个核细胞的分离无菌及ACD抗凝液抗凝条件下经脐静脉穿刺取血，采集健康足月顺产新生儿脐带血，依次经过0.5％甲基纤维素(美国，Sigma公司产品)沉降及Ficoll(美国，Sigma公司产品，相对密度1.077g/ml)密度梯度离心后收集人脐带血单个核细胞，洗涤后重悬于PBS中。
2.构建了含glp-1r基因的腺病毒载体，步骤如下用电穿孔法使穿梭质粒pAdtrack-CMV-glp-1r与病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组。利用脂质体介导重组腺病毒载体转染293细胞，包装并扩增腺病毒。
3.构建重组逆转录病毒质粒pMSCV-GLP-1R，步骤如下设计含有Sal I、Ecor V位点的GLP-1R基因上、下游引物，从携带GLP-1R基因的质粒中获得目的基因GLP-1R，将反应产物克隆至pGEM-T eassy载体(Promega公司，美国)，获得克隆质粒T-GLP-1R，用限制性内切酶SalI和Ecor V双酶切后，回收目的片段插入到pMSCVneo载体，获得携带目的基因的逆转录病毒载体pMSCV-GLP-1R。
4.用携带目的基因的载体转染干细胞。
5.在转染的干细胞培养液中直接添加GLP-1细胞因子，诱导干细胞分化为胰岛样细胞。
6.利用RT-PCR鉴定体外诱导分化的细胞。
本发明的有益效果是1.按照本发明提供的技术方法，可以将人和哺乳动物胚胎、骨髓、外周血、脐带血以及其它组织来源的间充质干细胞、胰腺于细胞、肝干细胞、造血干细胞及神经干细胞等在体外定向诱导分化为能分泌胰岛素的胰岛样细胞；2.按照本发明技术方法得到的体外诱导分化的胰岛样细胞，可作为种子细胞应用于胰岛细胞移植及微囊化干细胞制剂的制备；3.按照本发明技术方法得到的体外诱导分化的胰岛样细胞，可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。
4.本发明中诱导分化方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
图1 PCR产物电泳图MDL2000 -阴性对照 1非特异性条带 21300bp左右的目的基因GLP-1R。
图2 T载体连接产物酶切、PCR鉴定图MDL15000Marker1、目的基因与Teasy载体连接产物2、PCR鉴定图3、酶切鉴定图(I3.0kb；II1.3kb)图3带目的基因的腺病毒穿梭质粒酶切鉴定图MDL15000Marker
1酶切鉴定图(I9.7kb；II1392bp)图4重组质粒的鉴定4aMDL15000Marker1未重组的质粒大小9kb左右2重组成功的质粒大小40kb左右4bMDL15000Marker1PacI性酶切鉴定图(I38.6kb II4.5kb)图5lGLP-1R基因的表达1.未转染的MSC；2.转染glp-1r于MSC 3天；3.转染glp-1r于MSC 7天；4.转染glp-1r于MSC 14天；+.阳性对照IIPDX-1基因的表达1.未转染的MSC；2.转染glp-1r于MSC 3天；3.转染glp-1r于MSC 7天；4.转染glp-1r于MSC 14天III胰岛素基因的表达1 未转染的MSC；2 转染glp-1r于MSC3天；3.转染glp-1r于MSC 7天；4.转染glp-1r于MSC 14天图6免疫组织化学检测结果具体实施方式
实施例1、GLP-1R基因的获得携带GLP-1R基因的质粒由德国Lankette教授馈赠。设计含有Sal I、Ecor V位点的GLP-1R基因全长上、下游引物，引物序列及其多聚酶链式反应(PCR)的条件如下上游引物5′-gtc gac tcc tga act ccc cgc catg-3′下游引物5′-gat atc gct gga gtc tca gct gca cgga-3′
20μl反应体系包括1μl cDNA(100ng/μl)，primer1和2各0.5μl(20μM)，1.5μl dNTP(2.5mM)，0.25μl La Taq DNA聚合酶(TakaRa公司，5u/μl)，2μl 5×GC Buffer I，14.75μl灭菌水。反应条件为94℃变性3min；94℃45s，56℃45s，72℃2min，28个循环；72℃7min。电泳后1300bp左右为目的基因GLP-1R(见图1)。反应产物克隆至pGEM-T eassy载体(Promega公司，美国)，获得克隆质粒T-GLP-1R(见图2)。
实施例2、pAdv-GLP-1R腺病毒载体的构建用Sal I、Ecor V双酶切连入pGEM-T easy载体的GLP-1R基因后，回收目的片断插入腺病毒穿梭质粒pAdtrack-cmv的Sal I、Ecor V位点，获得带有GLP-1R基因的腺病毒穿梭质粒，经Sal I及Ecor V双酶切鉴定，切出了1392bp的小片段及9.7kb的大片段(见图3)。
选用PmeI酶切1μg穿梭质粒pAdtrack-cmv-GLP-1R，70％乙醇沉淀质粒，加5μl H2O。线性化的穿梭质粒与100ng超螺旋质粒pAdEasy-1电穿孔共转化至BJ5183感受态菌中，菌液涂卡那霉素抗性平板筛选。选择20个小克隆，分别接种于含卡那霉素的LB培养液，37℃摇菌过夜。提取质粒，重组质粒均大于40kb，所以经0.7％琼脂糖电泳可初步鉴定。根据电泳结果，选取质粒作PacI限制性酶切鉴定。重组质粒可被酶切出4.5kb的小片段及38.6kb的大片段(见图4)。
取鉴定好的重组病毒质粒5μg行PacI限制性酶切。用Lipofectine 2000包裹线性化质粒转染293细胞，转染12h后去掉转染液，加含5％胎牛血清的DMEM培养液继续培养7～10天，当细胞出现CPE时，收集细胞，-70℃和37℃反复冻融三次，离心取上清。用病毒上清再次感染293细胞，收集上清。用TCID50法测定病毒滴度(参考AdEasy Vector Systerm操作方法)，滴度为2.0×108PFU/mL。
实施例3、重组逆转录病毒质粒pMSCV-GLP-1R的构建。
克隆质粒T-GLP-1R用限制性内切酶Sal I和Ecor V双酶切后，回收目的片段插入到pMSCVneo载体的Sal I和Ecor V位点上，获得携带目的基因的逆转录病毒载体pMSCV-GLP-1R，重组质粒分别经Sal I.Ecor V双酶切后，TAE琼脂糖凝胶电泳分别得到5.15KB、1300bp的条带，与预期结果符合；对其进行正、反向测序及分析表明，其开放阅读框正确，没有发生移码改变。表明我们克隆的目的基因序列正确，重组逆转录病毒载体pMSCV-GLP-1R构建成功。
实施例4、逆转录病毒产生细胞株的建立和筛选。
PT67细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液(完全培养液)培养至95％汇合。将pMSCV-GLP-1R 5μg加入250μl无血清培养液，取LF2000 10μl加入250μl上述培养液，两者混匀室温放置20min。将PT67细胞用培养液洗2次，缓慢滴入用1ml培养液稀释的DNA-LF2000混合液。培养6h后，加入1ml含20％胎牛血清的培养液，继续培养24h后更换完全培养液。细胞转染48h后按1∶15传代，加入含600μg/ml G418筛选14d，直至抗性细胞集落形成。挑选大的健康的细胞集落，用完全培养液扩大培养，以制备含病毒的包装细胞上清、测定病毒滴度并冻存细胞。
实施例5、重组逆转录病毒pMSCV-GLP-1R病毒滴度的测定和PT-GLP-1R细胞株的建立。
生长状态良好的NIH3T3细胞常规培养24h至60％汇合，将制备的病毒液相应作10-2、10-4、10-6倍稀释，加入polybrene至终浓度为8μg/ml。倒去细胞培养液，分别吸取1ml稀释的病毒液加入培养皿中，常规培养5h，补加2ml含胎牛血清的培养基常规培养24h，更换新鲜含500μg/mlG418的培养基，每3d换液一次，培养14d待长出肉眼可见的集落后，倾去培养液，以纯甲醛固定后用姬母萨染色，用克隆计数仪自动计数，再乘以稀释倍数后得病毒滴度(CFU)。我们共挑选出病毒滴度＞106CFU的包装细胞6个，筛选出具有最高滴度(1.5×108PFU/mL)的包装细胞，扩大培养后建立高滴度表达GLP-1R的包装细胞株PT-GLP-1R。
实施例6、重组逆转录病毒液中野生型病毒的检测。
将以上病毒滴度测定所得NIH3T3多克隆用完全培养液扩大培养48h，收集所得细胞上清再次感染NIH3T3细胞，加500μg/ml G418筛选，5d后细胞全部死亡。提示PT67细胞不产生可检测出的辅助病毒，用它制备的逆转录病毒可以感染人和其他哺乳动物细胞可以广泛使用而且较为安全。
实施例7、骨髓间充质干细胞的分离培养和扩增由非血液系统疾病胸外科手术后获得肋骨，无菌条件下挤出肋骨中的骨髓；或由非血液系统疾病或正常人髂后上棘抽取骨髓。向骨髓液中加入含10％胎牛血清的α-MEM(Gibco公司)充分混合，1500r/min离心5min，弃上清，再加入5ml完全培养液混匀后轻轻叠加到密度为1.073的Percoll分离液上，1500r/min离心20min，取白细胞膜层以上的部分，加入完全培养液洗两遍。按1×106/ml密度接种于完全培养基中，置37℃，5％CO2饱和湿度的孵箱中培养。培养72h后更换培养液，以后每4d换液一次。细胞达80％融合后用25％胰酶消化，按1∶3传代继续扩增培养。
实施例8、大鼠肝干细胞的分离雄性Wister大鼠，体重300～350g，3％苯巴比妥钠麻醉，常规消毒铺巾，沿正中线切开腹腔并暴露门静脉，将硅胶管针头端插入门静脉继以细线固定，硅胶管输液端与一次性输血器连接，后者连接输液瓶，先输注无钙镁Hanks液(含EDTA 1mmol/L)200ml，速度为30ml/min，肝脏变成肉色后，除保留门静脉外离断肝脏血管、韧带及系膜，将肝脏移入无菌平皿中，再输注含0.05％IV型胶原酶Hanks液100ml，输注速度为15ml/min，可回收平皿内的胶原酶液，视消化程度决定是否继续输注。液体温度为39℃。去除肝包膜及血管，钝性撕裂肝组织，以培养基溶解，多层纱布过滤，以50g×3min反复离心洗涤3次，再以培养基制备成单个肝细胞悬液。
实施例9、GLP-1诱导干细胞向胰岛样细胞分化以骨髓间充质干细胞为例，选择病毒感染MSC合适的MOI(Multiplicity of Infection)值(MOI＝300Virus/Cell)，根据细胞数计算所需病毒量，运用收集的病毒上清液感染MSC，孵育2h后，补加含有10％胎牛血清的α-MEM培养液，同时在培养液中直接添加GLP-1细胞因子，继续培养1周，诱导MSC在体外分化为胰岛样细胞。
实施例10、胰岛样细胞团的鉴定1)利用RT-PCR鉴定不同时间PDX-1、胰岛素，胰高血糖素基因的表达。利用primer 3软件设计基因引物，序列如下
结果表明转染GLP-1R基因的细胞(1周)高表达GLP-1R、PDX-1、胰岛素基因。(见图5)2)将转染3天后的MSC接种在96孔板中(5×103/孔)，进行胰岛素的免疫细胞染色，结果显示细胞表达胰岛素蛋白阳性，同时我们可以观察到细胞逐渐变圆并聚集成胰岛样细胞团(见图6)。未转染的细胞无相应蛋白质表达。
权利要求
1.一种诱导干细胞向胰岛样细胞分化的方法，其特征在于利用干细胞具有多向分化的潜能，诱导其向胰岛样细胞分化，诱导分化的细胞可分泌胰岛素，为胰岛细胞移植、微囊化干细胞制剂的制备提供种子细胞，同时诱导分化的细胞可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。
2.按照权利要求1所述的诱导方法，其特征在于利用含有GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体基因的载体转染干细胞，并同时添加细胞因子GLP-1，在GLP-1的作用下诱导干细胞向胰岛样细胞分化。
3.按照权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的干细胞具有多向分化潜能，包括人和哺乳动物胚胎、骨髓、动员的外周血、脐带血以及其它组织来源的间充质干细胞、胰腺干细胞、肝干细胞、造血干细胞及神经干细胞。
4.按照权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的载体包括腺病毒载体，腺相关病毒载体，慢病毒载体，逆转录病毒载体，通过这些载体介导GLP-1R基因在干细胞中表达。
5.按照权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，将GLP-1直接加入转染了GLP-1R基因的干细胞的培养液中，在GLP-1的作用下诱导干细胞向胰岛样细胞分化。
6.按照权利要求1或4所述的诱导方法，其特征在于，所述的载体中腺病毒载体是转染GLP-1R基因的首选病毒载体。
7.按照权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，选用的培养液为无血清诱导培养液，其中添加了营养素或细胞因子，包括GLP-1、尼克酰胺、葡萄糖，可以诱导转染GLP-1R基因的干细胞向胰岛样细胞分化。
8.按照权利要求1所述的诱导方法，其特征在于获得的胰岛样细胞团能表达胰岛相关基因及蛋白，包括葡萄糖转运子、葡萄糖激酶、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素。
9.体外诱导干细胞向胰岛样细胞分化后的胰岛样细胞的用途，其特征在于诱导分化后的细胞可分泌胰岛素，可作为种子细胞用于胰岛细胞移植、微囊化干细胞制剂的制备。
10.按照权利要求9所述的用途，其特征在于诱导分化后的细胞可作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种体外诱导干细胞向胰岛样细胞定向分化的方法及胰岛样细胞的用途。本发明的目的是提供一种体外获得大量胰岛样细胞的方法，并将诱导分化的胰岛样细胞作为种子细胞用于胰岛细胞移植、微囊化干细胞制剂的制备以及作为体外的药代动力学模型用于细胞药物筛选。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案1)获得GLP－1R基因；2)构建含有GLP－1R基因的病毒载体；3)分离、培养及扩增干细胞；4)向培养液中添加细胞因子GLP－1，诱导干细胞向胰岛样细胞分化；5)获得的胰岛样细胞鉴定。此方法的建立将在以基因工程、细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
文档编号C12N15/85GK1772885SQ20041009078
公开日2006年5月17日 申请日期2004年11月11日 优先权日2004年11月11日
发明者裴雪涛, 张锐, 李艳华, 王韫芳, 闫舫 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所