专利名称：发酵生产α－熊果苷的方法
技术领域：
本发明涉及α-熊果苷的制备方法。
背景技术：
目前，国内对于生物法合成α-熊果苷的文献尚未见报道；国外α-熊果苷的制备方法主要是通过以α糖苷酶为催化剂，催化合成对苯二酚与葡萄糖为α-熊果苷，由于α糖苷酶价格昂贵，所以生产的α-熊果苷成本很高，且采用上述方法制备α-熊果苷产率不高，给实际推广应用带来了很大困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种α-熊果苷的制备方法，该制备方法通过对野油菜黄单胞菌进行筛选、诱变获得一株α-熊果苷产率很高、抗对苯二酚能力强的菌株野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243，选用合适的培养基在最适培养条件下培养一定时间，加入反应物对苯二酚与蔗糖，在最佳反应条件下发酵生产α-熊果苷，发酵液通过大孔吸附树脂柱的分离、纯化后，可得到高纯度的α-熊果苷。该方法具有工艺操作简单、生产成本低、操作安全等优点。
本发明的整体技术构思是发酵法生产α-熊果苷，该方法由下列工艺步骤组成(1)将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；(2)将斜面菌株扩大培养作为种子液；(3)将种子液接入发酵罐中进行发酵；(4)加入反应物对苯二酚和蔗糖；(5)α-熊果苷的分离纯化。
本发明的具体工艺步骤及工艺条件是步骤(1)中斜面培养基由下列重量份组分组成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、酵母粉2.0-3.5份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾2.0份、氯化钠2.0份、琼脂15-20份和水1000份；制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.0-8.0、温度25-35℃、培养时间为24-48小时。
步骤(2)中种子液和步骤(3)中发酵液由下列重量份组分组成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、硫酸镁0.5-1.0份、碳酸钙2份和水1000份；发酵的工艺条件为发酵液接种量为10-15％，pH值为7.0-7.5，培养温度为25-35℃，通风量为0.4-0.6vvm，搅拌转速为120-160转/分钟，发酵时间为24-36小时。步骤(4)中反应条件为反应物对苯二酚物质量浓度为30-48mmol/l，蔗糖物质量浓度为100-200mmol/l，反应温度为30-55℃，反应时间为36-72小时，搅拌转速为160-200转/分钟。在此反应条件下，对苯二酚转化为α-熊果苷的转化率达87-92％，每升发酵液中含α-熊果苷8-11g。
步骤(5)中α-熊果苷的分离纯化包括以下四个步骤；a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b、把经过a步骤后的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行脱色，弱极性大孔吸附树脂柱为大孔吸附树脂AB-8柱，经过a步骤后的发酵液经过AB-8柱吸附后，发酵液变成无色透明液体；c、把经过b步骤的发酵液通过极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化，极性大孔吸附树脂柱为大孔吸附树脂S-8柱；d、把经过c步骤的发酵液真空干燥，即可得到纯度为98％以上的α-熊果苷，真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为65度，干燥后的成品为白色粉末状。
本发明所用的野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为野油菜黄单胞菌CGMCCNO.1243。
野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243的筛选，由下列工艺步骤组成(1)将安培管野油菜黄单胞菌菌种接种斜面制得斜面菌种；(2)将复壮后菌种涂布平板；(3)将平板菌落接种摇瓶发酵培养，进行初筛和复筛；(4)将复筛后的菌株进行复合诱变；步骤(1)中斜面培养基和步骤(2)中的平板培养基由下列重量份组分组成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、酵母粉2.0-3.5份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾2.0份、氯化钠2.0份、琼脂15-20份和水1000份；制备斜面菌种和平板的工艺条件为pH值为7.0-8.0、温度25-35℃、培养时间为24-48小时。
步骤(3)中发酵液由下列重量份组分组成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、硫酸镁0.5-1.0份、碳酸钙2份和水1000份；发酵的工艺条件为pH值为7.0-7.5，培养温度为25-35℃，搅拌转速为120-160转/分钟，发酵时间为24-36小时。
步骤(4)中诱变依次包括种子菌悬液的制备，诱变剂的加入量，紫外照射时间。
将斜面菌种接种到含5ml生理盐水试管中，往试管中加入体积百分比为0.5％-2.0％的硫酸二乙酯诱变剂，在漩涡振荡器上振荡1-2min，取0.5ml该菌悬液涂布平板，把平板放在紫外灯照射20-60s，然后把平板暗培养。培养条件为培养温度25-35℃、培养时间为48-72小时。
最后，得到野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243。
本发明所取得的技术进步在于本发明是通过野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243发酵生产α-熊果苷，降低了生产成本，且生产过程中不使用有机溶剂，发酵过程中不产生有害物质，工艺步骤简单，提高了生产操作安全性。采用本发明生产的α-熊果苷产量高，每升发酵液中含8-11gα-熊果苷，通过大孔吸附树脂分离纯化，纯度可达到98％以上，具有重大工业化意义。
实施例以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1(1)菌种斜面培养将野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成蔗糖55份、蛋白胨15份、酵母粉3份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾2.0份、氯化钠2.0份、琼脂15份和水1000份制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.0、温度30℃、培养时间为36小时。
(2)接种发酵将斜面菌株扩大培养作为种子液；
将种子液按10％的接种量接入发酵罐中进行发酵；其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成蔗糖55份、蛋白胨15份、硫酸镁1.0份、碳酸钙2份和水1000份发酵的工艺条件为发酵液接种量为10％，pH值为7.0，培养温度为30℃，通风量为0.6vvm，搅拌转速为130转/分钟，培养时间为36小时。
(3)生产α-熊果苷加入反应物对苯二酚物质量浓度为35mmol/l及蔗糖物质量浓度为150mmol/l；其中反应条件为反应温度为35℃，反应时间为48小时，搅拌转速为200转/分钟。在此反应条件下，对苯二酚转化为α-熊果苷的转化率达91.5％，每升发酵液中含α-熊果苷8.5g。
(4)α-熊果苷的分离纯化，包括以下四个步骤a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟b、步骤中的弱极性大孔吸附树脂柱为大孔吸附树脂AB-8柱，经过a步骤后的发酵液经过AB-8柱吸附后，发酵液变成无色透明液体。
c、步骤中的极性大孔吸附树脂柱为大孔吸附树脂S-8柱。
d、步骤中的真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为65℃，干燥后的成品为白色粉末状，纯度达99％。
实施例2(1)菌种斜面培养将野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；其中斜面培养基由下列重量份组分组成蔗糖45份、蛋白胨10份、酵母粉2.5份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾2.0份、氯化钠2.0份、琼脂15份和水1000份制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.5、温度30℃、培养时间为24小时。
(2)接种发酵将斜面菌株扩大培养作为种子液；将种子液按15％的接种量接入发酵罐中进行发酵；其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成蔗糖45份、蛋白胨10份、硫酸镁1.0份、碳酸钙2份和水1000份发酵的工艺条件为发酵液接种量为15％，pH值为7.5，培养温度为30℃，通风量为0.5vvm，搅拌转速为140转/分钟，培养时间为24小时。
(3)生产α-熊果苷加入反应物对苯二酚物质量浓度为40mmol/l及蔗糖物质量浓度为200mmol/l；其中反应条件为反应温度为40℃，反应时间为48小时，搅拌转速为200转/分钟。在此反应条件下，对苯二酚转化为α-熊果苷的转化率达90.2％，每升发酵液中含α-熊果苷9.6g。
(4)α-熊果苷的分离纯化，包括以下四个步骤a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b、步骤中的弱极性大孔吸附树脂为大孔吸附树脂AB-8柱，经过a步骤后的发酵液经过AB-8柱吸附后，发酵液变成无色透明液体。
c、步骤中的极性大孔吸附树脂为大孔吸附树脂S-8柱。
d、步骤中的真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为65℃，干燥后的成品为白色粉末状，纯度达98.3％。
实施例3(1)菌种斜面培养将野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；其中斜面培养基由下列重量份组分组成蔗糖55份、蛋白胨10份、酵母粉2.0份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾2.0份、氯化钠2.0份、琼脂15份和水1000份制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.5、温度30℃、培养时间为36小时。
(2)接种发酵将斜面菌株扩大培养作为种子液；将种子液按12.5％的接种量接入发酵罐中进行发酵；其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成蔗糖55份、蛋白胨10份、硫酸镁1.0份、碳酸钙2份和1000份发酵的工艺条件为发酵液接种量为12.5％，pH值为7.5，培养温度为30℃，通风量为0.4vvm，搅拌转速为160转/分钟，培养时间为36小时。
(3)生产α-熊果苷加入反应物对苯二酚物质量浓度为45mmol/l及蔗糖物质量浓度为200mmol/l；反应条件为反应温度为50℃，反应时间为48小时，搅拌转速为200转/分钟。在此反应条件下，对苯二酚转化为α-熊果苷的转化率达87.0％，每升发酵液中含α-熊果苷10g。
(4)α-熊果苷的分离纯化，包括以下四个步骤a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b、步骤中的弱极性大孔吸附树脂为大孔吸附树脂AB-8柱，经过a步骤后的发酵液经过AB-8柱吸附后，发酵液变成无色透明液体。
c、步骤中的极性大孔吸附树脂为大孔吸附树脂S-8柱。
d、步骤中的真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为65℃，干燥后的成品为白色粉末状，纯度达98.0％。
权利要求
1.发酵生产α-熊果苷的方法，其特征在于用野油菜黄单胞菌发酵生产α-熊果苷，生产过程由下列工艺步骤组成(1)将野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；(2)将斜面菌种扩大培养作为种子液；(3)将种子液接入发酵罐中进行发酵；(4)加入反应物对苯二酚和蔗糖；(5)α-熊果苷的分离纯化。
2.根据权利要求1所述的发酵生产α-熊果苷的方法，其特征在于所述的(1)步骤中的斜面培养基由下列重量份组分组成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、酵母粉2.0-3.5份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾2.0份、氯化钠2.0份、琼脂15-20份和水1000份。
3.根据权利要求1或2所述的发酵生产α-熊果苷的方法，其特征在于制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.0-8.0、温度25-35℃、培养时间为24-48小时。
4.根据权利要求1所述的发酵生产α-熊果苷的方法，其特征在于所述的(2)步骤中的种子液和(3)步骤中发酵液由下列重量份组分组成蔗糖40-60份、蛋白胨10-20份、硫酸镁0.5-1.0份、碳酸钙2份和水1000份。
5.根据权利要求1或4所述的发酵生产α-熊果苷的方法，其特征在于发酵的工艺条件为发酵液接种量为10-15％，pH值为7.0-7.5，培养温度为25-35℃，通风量为0.4-0.6vvm，搅拌转速为120-160转/分钟，培养时间为24-36小时，。
6.根据权利要求1所述的发酵生产α-熊果苷的方法，其特征在于所述的(4)步骤中的反应条件为反应物对苯二酚物质量浓度为30-48mmol/l，蔗糖物质量浓度为100-200mmol/l，反应温度为30-55℃，反应时间为36-72小时，搅拌转速为160-200转/分钟。
7.根据权利要求1所述的发酵生产α-熊果苷的方法，其特征在于所述的(5)步骤中的α-熊果苷的分离纯化包括以下四个步骤a、将发酵完成后的发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b、把经过a步骤后的发酵液通过弱极性大孔吸附树脂柱进行脱色；c、把经过b步骤的发酵液通过极性大孔吸附树脂柱进行分离纯化；d、把经过c步骤的发酵液真空干燥，即可得到纯度为98％以上的α-熊果苷。
8.根据权利要求7所述的发酵生产α-熊果苷的方法，其特征在于所述的a步骤发酵液在4000转/分钟条件下离心20分钟；b步骤中的弱极性大孔吸附树脂柱为AB-8柱；c步骤中的极性大孔吸附树脂柱为S-8柱；d步骤中的真空干燥真空度为0.1Mpa，温度为65度，干燥后的成品纯度达98％以上。
9.野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)CGMCC NO.1243。
全文摘要
本发明涉及α－熊果苷的制备方法，它包括斜面种子的制备，培养基的选择，反应条件的优化和产物的提取等工艺步骤。本发明通过野油菜黄单胞菌发酵生产α－熊果苷，具有生产成本低，生产过程中不使用有机溶剂，发酵过程中不产生有害物质，工艺步骤简单，生产操作安全等优点。采用本发明生产α－熊果苷产量高，每升发酵液中含有8－11g α－熊果苷，对苯二酚转化率可达91％。α－熊果苷具有显著的抑制酪氨酸酶活性，减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变和祛斑的功效。
文档编号C12P33/00GK1635139SQ200410090980
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月15日 优先权日2004年11月15日
发明者刘春巧 申请人:刘春巧