专利名称：缺失型α－地中海贫血基因诊断芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种可用于医学检测人α-珠蛋白基因缺失的DNA芯片。
本发明还涉及该芯片的制备方法。
本发明还涉及目标DNA片断的扩增方法。
背景技术：
α-地中海贫血是由于α-珠蛋白基因缺失导致其合成速率改变而致，在遗传学上具有高度的异质性，我国南方有较高的发病率(Lau YL，1997；XM Xu，2004)。α-地贫分子缺陷主要为基因的大片段缺失。导致α-地贫的缺失突变有多种类型，在中国人中共有7种缺失型突变，即--SEA、-α3.7、-α4.2、-α2.7、--THAI、--FIL和--HW，其中以东南亚(--SEA)、左缺(-α3.7)和右缺(-α4.2)最常见。临床上常用测定红细胞有关参数的方法对α-地贫进行筛查性诊断(Lau YL，1997；XM Xu，2004)。但最后的确诊诊断和类型判断仍需要用基因诊断。鉴于东南亚、左缺和右缺占中国人缺失型α-地贫的96％以上(XM Xu，2004)。因此α-地贫基因诊断的主要任务就在于快速检出这三种缺失。传统的Southern杂交法是缺失型α-地贫最可靠的诊断方法，但其缺点显而易见(Waye，1993)。PCR技术已应用于α-地贫的基因诊断(Chong SS，2000)。
DNA芯片技术自上世纪九十年代出现以来(Schena M，1995)，因其具有高通量、并行性、快速、灵敏等特点，获得了巨大发展。已在遗传性疾病、致病微生物检测等方面获得了广泛应用。
发明内容
针对中国人中最常见的三种缺失型α-地中海贫血(--SEA、-α3.7、-α4.2)的检测问题，本发明提供了一种快速、稳定、灵敏度高、重复性好的DNA芯片检测方法。
本发明的技术方案包括对人基因组DNA待测样品的PCR扩增，其特征在于采用7条(4对)引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7组成四重PCR，分别扩增正常等位基因和缺失等位基因。而其中的四条引物(P2，P4，P6，P7)的5’端为荧光(Cy-3或Cy5)或生物素标记。
P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’
P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3’本发明的技术方案包括检测正常等位基因和缺失等位基因的特异性探针，其特征在于检测正常α2基因的特异性探针为5’-CCCCCGCCCCGCGTGCACCCCCAGGGGAGGCCGAGCCCGCCGCCCGGCCCCGCGCAGGCCCCGCCCGGGA-3’检测东南亚缺失型(--SEA)的特异性探针为5’-TGACGCTGTCTGCTTAAGGCCCAGGGAAACCCAGGTGCAAACTCACACTCATCACCCAGGCAGCCACAGC-3’检测右侧缺失型(-α3.7)的特异性探针为5’-GCAGCTGGATAGGGTAGGAAAAGGCAGGGGCGGGAGGAGGGGATGGAGGAGGGAAAGTGGAGCCACCGCG-3’检测左侧缺失型(-α4.2)的特异性探针为5’-GCCCATGCCTGTAAACCCACCTACTCCGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCATTTTAACCAAGGAGGCAGAGG-3’本发明的技术方案包括DNA芯片的制备方法，其特征在于用于芯片制备的基质包括玻片、硅片和膜等。玻片可为经醛基、氨基或多聚赖氨酸等修饰。探针经点样液稀释后用点样仪打印到基质表面，构成微阵列芯片。
本发明的技术方案包括PCR扩增产物与芯片进行杂交，对杂交信号进行检测以及分析，进一步判断是否有缺失基因存在。
具体实施例方式
实施实例一PCR扩增在灭菌的0.2或0.5mlEppendoef管中，在25μl的反应体系中，分别加入等浓度的7条PCR引物的混合贮存液5μl，等浓度的四种脱氧核苷酸dATP，dUTP，dCTP和dGTP的混合贮存液8μl，反应缓冲液为10μl，其组分为20mmol/L Tris-HCl pH8.9，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2。石蜡30μl。加入人基因组DNA1μl，PCR反应用酶1μl，短暂离心后进行PCR循环。PCR循环参数为95℃5min；97℃45s，61℃75s，72℃150s，35个循环；72℃5min。
芯片制备探针经点样液稀释到0.1μg/μl-1.51μg/μl，用点样仪打印到基质表面，构成微阵列芯片(见附
图1)。
芯片杂交将PCR产物与杂交液按一定比例稀释混匀后，加入5-20μl混合液到杂交孔，在42℃杂交30-180min后，用洗液将玻片洗二次，晾干。
杂交信号检测用荧光扫描仪检测DNA芯片杂交信号。结果如图1。
权利要求
1.一种诊断缺失型α-地中海贫血的DNA芯片，通过固定在玻片、硅片等基质上的特异性探针，与特异性的PCR产物杂交从而对中国人常见的缺失等位基因(--SEA、-α3.7、-α4.2)进行检测。
2.根据权利要求1所述DNA芯片的基质包括玻片、硅片和膜等。
3.根据权利要求1所述DNA芯片的探针为检测正常α2基因的特异性探针为5’-CCCCCGCCCCGCGTGCACCCCCAGGGGAGGCCGAGCCCGCCGCCCGGCCCCGCGCAGGCCCCGCCCGGGA-3’检测东南亚缺失型(--SEA)的特异性探针为5’-TGACGCTGTCTGCTTAAGGCCCAGGGAAACCCAGGTGCAAACTCACACTCATCACCCAGGCAGCCACAGC-3’检测右侧缺失型(-α3.7)的特异性探针为5’-GCAGCTGGATAGGGTAGGAAAAGGCAGGGGCGGGAGGAGGGGATGGAGGAGGGAAAGTGGAGCCACCGCG-3’检测左侧缺失型(-α4.2)的特异性探针为5’-GCCCATGCCTGTAAACCCACCTACTCCGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCATTTTAACCAAGGAGGCAGAGG-3’
4.根据权利要求1所述PCR为单管多重PCR，其特征在于待测样品中DNA的特异性片段通过PCR进行扩增，PCR产物含有与特异性探针杂交的DNA序列；其所采用的7条优选引物序列为P15’-CCCTCGCCAAGTCCACCCC-3’P25’-CAAAGCACTCTAGGGTCCAGC-3’P35’-TTTACCCATGTGGTGCCTCC-3’P45’-CCGTTGGATCTTCTCATTTCCCC-3’P55’-AGCGATCTGGGCTCTGTGTTC-3’P65’-CCCACGTTGTGTTCATGGCTG-3’P75’-GACCAGGAAGGGCCGGTGC-3’
5.根据权利要求5所述PCR引物其特征在于其5’端为荧光(Cy-3或Cy-5)或生物素标记。
全文摘要
本发明公开了一种缺失型α－地中海贫血基因检测的DNA芯片，其特征在于通过固定在玻片、硅片等基质上的特异性探针，与特异性的PCR产物杂交从而对中国人常见的缺失等位基因(－－
文档编号C12Q1/68GK1661098SQ20041009190
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者李泽松, 张文 申请人:深圳益生堂生物企业有限公司