专利名称：香菇菌株鉴别的特征引物和方法
技术领域：
本发明属于利用分子生物学方法检测鉴别食用菌菌株的技术领域。具体地说，是涉及一种用于鉴别香菇菌株的技术方法及其引物的设计和引物序列。
背景技术：
香菇是我国人工驯化栽培最早的大型真菌，2002年我国香菇产量占世界总产的80％，但是我国香菇菌种检测技术滞后，菌种管理混乱，给育种者和生产者都带来极大危害，制约着我国香菇出口。目前，我国香菇菌株鉴定常用的方法，主要是采用拮抗反应、酯酶同工酶技术和RAPD技术(随机扩增多态性DNA分析)。这3种方法都曾发挥过重要的作用，但也有其缺点和缺陷性。
发明内容
本发明的目的是提供一种香菇菌株鉴别的技术。具体包括1.提供利用特征引物进行菌株鉴定的方法；2.提供用于香菇ISSR扩增的5`锚定的特征引物。
本发明的发明人在对香菇菌株鉴定的研究中发现，自行设计的特征引物能够快速准确的对香菇菌株进行鉴别。
本发明的用于香菇菌株鉴别的特征引物序列为Primer 15`gtg acg act ctc tct ctct 3`。Primer 25`gga tgc aac aca cac aca c 3`。
本发明的特征引物能够快速有效的鉴别香菇菌株。
本发明所提供的香菇菌株鉴别的方法采用下面所述的本发明的操作步骤、引物、反应体系及扩增程序，对香菇菌株进行鉴定。其他具体步骤和过程，按照常规的分子生物学方法进行。
本发明具有以下有益效果1.所提供的引物可以快速方便地将香菇菌株进行鉴别。
2.所提供的香菇菌株鉴定方法，采用ISSR技术，鉴别更加简单化，通常只须少量样品，不需大量提取DNA。
图1Primer 1对香菇菌株的ISSR指纹图谱1～17菌株编号，C阴性对照，M为λDNA/HindIII+EcoR I。
图2Primer2对香菇菌株的ISSR指纹图谱1～17菌株编号，C阴性对照，M为λDNA/HindIII+EcoR I。
具体实施例方式
以下通过实例对本发明作进一步说明实施例1 Primer 1和Primer 2的制备根据Primer 1和Primer 2的核苷酸序列，在商业化的DNA自动合成仪上进行化学合成，即可获得Primer 15`gtg acg act ctc tct ctc t 3`。Primer 25`gga tgc aac acacac aca c 3`的核苷酸序列实施例2 香菇菌株的鉴别(1)DNA提取的具体步骤●液氮研磨0.2g菌丝，转移到含有机溶剂的1.5ml的离心管中。
●加入预热的0.6ml裂解液(100mM Tris-HCl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0；1.4M NaCl；2％CTAB；2％PVP；2％(V/V)的2-巯基乙醇)，充分混合，65℃温浴60min，不时混匀。
●12,000r/min离心10min，取上清液。
●用等体积的1∶1苯酚/氯仿抽提，4℃，10,000r/min离心10min，回收上(水)相。
●用等体积的24∶1氯仿/异戊醇抽提，4℃，10,000r/min离心10min回收上(水)相。
●如果界面有明显沉淀，则重复5～6，否则继续下面步骤。
●加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，-20℃沉淀10min，4℃条件下8,000r/min离心10min收集沉淀。
●沉淀用70％的乙醇洗涤2-3次，倒置沥干●加入100μl TE缓冲液溶解沉淀。
(2)PCR反应体系的总体积为25μl，组分见表2-9。阴性对照中用ddH2O代替模板。
ISSR的PCR扩增反应体系
(3)PCR程序预变性92℃，5min；变性92℃，30S；复性49℃，1min；延伸72℃，5min；30个循环。补平72℃，7min。
(4)取5ul产物于1.4％的琼酯糖凝胶电泳，以λDNA/EcoTI+HindIII Marker为分子量标记。溴化乙锭染色，用凝胶成像仪记录试验结果。
从图1和图2的结果中可以清楚的看出采用Primer 1和Primer 2对香菇菌株进行ISSR，各引物均可以对香菇菌株进行鉴别。
权利要求
1.用于香菇ISSR扩增的5`锚定的引物，其特征是其核苷酸序列为Primer 15`gtg acgact ctc tct ctc t 3`或Primer 25`gga tgc aac aca cac aca c 3`。
2.一种香菇菌株鉴别的方法，其特征是采用权利要求1所述的引物，通过ISSR方法进行检验鉴定，具体步骤和过程按常规的分子生物学方法进行。
全文摘要
本发明属于利用分子生物学方法检测食用菌菌株的技术领域。本发明提供了香菇菌株鉴定的引物，以及利用该引物进行菌株鉴定的方法。利用本发明可方便、快速、准确地鉴别香菇菌株。
文档编号C12Q1/68GK1772918SQ20041009276
公开日2006年5月17日 申请日期2004年11月8日 优先权日2004年11月8日
发明者张瑞颖, 张金霞, 黄晨阳 申请人:中国农业科学院土壤肥料研究所