专利名称：棒状链霉菌lat基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物工程，涉及一种用基因工程技术实现棒状链霉菌编码赖氨酸ε转氨酶lat基因的PCR体外扩增引物及lat基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法。
背景技术：
自青霉素问世以来，β-内酰胺类抗生素至今已被广泛应用，许多具有新特点的β-内酰胺类品种不断问世。但是，随着β-内酰胺类抗生素的广泛应用，各种细菌对这一类抗生素的耐药性也日趋增多。细菌耐药机制有多种，其中产生β-内酰胺酶是最主要的耐药机制，因此开发β-内酰胺酶抑制剂对于解决细菌的耐药性问题具有重要意义。这类酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素联合应用，通过β-内酰胺酶抑制剂灭活β-内酰胺酶，而使β-内酰胺类抗生素发挥原有的抗菌作用。克拉维酸是第一个被发现并应用于临床的β-内酰胺酶抑制剂，因其由棒状链霉菌代谢合成，故又名棒酸。棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)是一种广为人知的克拉维酸产生菌。它的抗菌作用微弱，但是具有较好的抑酶作用。克拉维酸对金黄色葡萄球菌产生的β-内酰胺酶，革兰阴性菌产生的质粒介导酶(TEM和SHV等)以及克雷伯杆菌属，普通变形杆菌、脆弱拟杆菌产生的染色体酶均有抑制作用。阿莫西林与克拉维酸合用的体外抗菌研究发现，克拉维酸提高阿莫西林对克雷伯杆菌属、普通变形杆菌等少数肠道产酶杆菌等的抗菌作用4-32倍，对嗜血流感杆菌的抗菌活性提高32倍。克拉维酸这种非常功效，决定了其需求量很大，因此有关提高棒状链霉菌克拉维酸产量的方法是国内外研究的热点领域。
国内提高克拉维酸产量的途径主要是优化发酵条件，但其所能提高的产量有限。对棒状链霉菌进行原生质体再生以及传统的紫外诱变法筛选高产菌株虽然仍是菌种改良的主要手段，但是存在选育周期长、效率低以及盲目性、随机性等问题尚有待解决。由于克拉维酸发酵产量低，生产工艺复杂，化学合成法尚未实现工业化，我国的克拉维酸制剂一直以来主要依赖进口，因此大幅度提高其生产菌株产酸量是当前克拉维酸开发中的一项重要任务。目前利用基因工程的方法提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究在国内尚属空白。
国外对棒状链霉菌克拉维酸合成基因簇的研究较多，棒状链霉菌克拉维酸合成的途径已基本明确，为利用基因工程的方法提高克拉维酸的产量提供了可能。由于克拉维酸的生物合成通常受基因的调控，因此棒状链霉菌该基因的突变对克拉维酸产率的影响就显得十分重要。从影响棒状链霉菌克拉维酸代谢的lat基因入手，将与克拉维酸代谢支路平行的另一条代谢支路中编码某种酶的基因突变，从而阻断该代谢支路进而可提高克拉维酸产量。棒状链霉菌合成头孢霉素C的代谢途径是以L-赖氨酸、L-半胱氨酸和缬氨酸为前体物质的(见图5)，编码头孢霉素C合成途径的酶的基因簇现已经明确，棒状链霉菌的lat基因编码赖氨酸ε-转氨酶，是头孢霉素C合成的第一个基因，尽管头孢霉素C和克拉维酸的合成途径不受相同的酶催化，但编码与克拉维酸合成相关酶的基因簇紧挨编码与头孢霉素C合成相关酶的基因簇，且两条代谢途径受相同的调节蛋白CcaR和ClaR的调控，因此，头孢霉素C合成的停止将有效提高克拉维酸的产量，也是进行调控的首选基因，该酶的失活将导致头孢霉素C合成的停止，因此，目的性的对lat基因进行突变将使头孢霉素C合成途径受阻，进而可以有效提高克拉维酸的产量。
Paradkar等人曾采用基因置换的方法对棒状链霉菌的lat基因进行了插入突变，使克拉维酸产量得到提高。其实验的主要思路是，首先将棒状链霉菌的lat基因插入大肠杆菌质粒pUC119的多克隆位点，然后对插入的lat基因进行单酶切，与末端经过修饰的阿泊拉霉素抗性基因连接，使lat基因中插入一段阿泊拉霉素抗性基因，经双酶切将插入抗性基因的lat基因(lat∷apr)片段，末端修饰后与大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体pIJ486相连接，得到lat基因插入突变的重组质粒。用在大肠杆菌中构建好的该质粒转化原始克拉维酸产生菌后，质粒与链霉菌的染色体通过双交换发生同源重组，从而实现对棒状链霉菌的lat基因进行突变。但是，由于其采用的插入突变方法步骤相对较繁琐，且所用的穿梭质粒载体pIJ486，不具有单交换整合到染色体的能力，而双交换整合势必具有一定难度。
但是，对棒状链霉菌的lat基因进行缺失突变，并选用具有单交换整合能力的穿梭质粒载体构建lat基因突变的质粒目前未见报道。
发明内容
要解决的问题针对上述情况，本发明的目的在于采用基因工程的技术，设计了两条用于PCR扩增棒状链霉菌编码赖氨酸ε-转氨酶lat基因的上下游引物，实现了lat基因的体外大量扩增，并对影响克拉维酸产量的棒状链霉菌的lat基因进行缺失突变，构建了用于转化棒状链霉菌进而实现对棒状链霉菌lat基因阻断的具有单交换整合能力的两种缺失质粒pKCLES、pKCLHS和衍生物，并完成在大肠杆菌中的构建工作。
技术方案本发明首先对棒状链霉菌的lat基因进行了PCR体外扩增，并将扩增后的lat基因末端经修饰后克隆到大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体pKC1139的多克隆位点(MCS)，经双酶切去除lat基因中一段EcoRI-ScaI片段或HindIII-ScaI片段后分别自连构建成重组质粒pKCLES和pKCLHS，两种重组质粒均为松弛型质粒。
本发明构建的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒及其衍生物，包含棒状链霉菌中编码赖氨酸ε-转氨酶基因的一部分，质粒上还包含了大肠杆菌源质粒和链霉菌源质粒的复制起始点、带有在大肠杆菌和链霉菌中都可表达的阿泊拉霉素抗性选择标记，并具有pSW344E温敏型复制子基因。上述棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)来自于中国抗生素微生物菌种保藏中心保藏号为CACC NO.SIIA 2.111。
需要说明的是所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒，pKCLHS大小约为7.8kb，并且由图1的限制图谱表示；质粒pKCLES大小约为7.0kb，并且由图2的限制图谱表示。
所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒pKCLHS和pKCLES的衍生物大小为除7.0kb、7.8kb之外的6.5kb-8.3kb。
棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒pKCLHS、pKCLES及其衍生物的构建方法质粒pKCLHS和pKCLES的构建方法首先构建含有目的基因lat的重组质粒pUCm-T-lat，通过设计引物并进行PCR体外扩增，得到大小约为1.8kb的lat基因片段，选用具有多克隆位点的pUCm-T载体与纯化后的lat基因片段以T4DNA连接酶进行连接得到重组质粒pUCm-T-lat；用EcoRI-HindIII双酶切pUCm-T-lat，得到的lat基因片段经纯化后与经EcoRI-HindIII双酶切并纯化后的载体pKC1139以T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pKC1139-lat；pKC1139-lat分别经HindIII-ScaI或EcoRI-ScaI双酶切回收约7.8kb或7.0kb的DNA片段，两种纯化后的回收产物首先均以T4DNA聚合酶补平末端，再以T4DNA连接酶进行自连，分别得到lat基因缺失一段HindIII-ScaI及EcoRI-ScaI片段的重组质粒pKCLHS和pKCLES，构建过程由图4表示，整个质粒构建过程是在大肠杆菌Escherichia coli(DH5α)中完成的，该菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.0428.1。
该衍生物的构建方法采用的限制性内切酶为lat基因上的除构建质粒pKCLHS和pKCLES所用的HindIII-ScaI和EcoRI-ScaI以外的其余酶切位点(见图3)中的任意两种酶，对质粒pKC1139-lat中的lat基因进行切割并回收lat基因缺失后剩余的DNA片段，其余方法同质粒pKCLHS和pKCLES的构建。
上述的PCR体外扩增编码赖氨酸ε-转氨酶的lat基因所用引物具有SEQ NO ID1或2中所示的DNA序列，或具有与SEQ NO ID1或2中所示的DNA序列90％或更高同源性的DNA序列。
引物15’-CCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTTCTCACCCATG-3’ (SEQ NO ID1)；引物25’-ATCGCGGGCCGGCCGGCCCACGGGGTCGCCCCGGGCCGG-3’ (SEQ NO ID2)。
有益效果本发明利用了基因工程的方法，与传统的诱变法相比具有目的性强、工作强度小、周期短、效率高的优点。该方法对影响克拉维酸产量的lat基因进行缺失突变，设计了棒状链霉菌lat基因缺失突变的质粒，并完成在大肠杆菌中的构建工作。本发明的棒状链霉菌lat基因缺失质粒的构建过程，与插入突变质粒的构建方法相比，本发明的构建方法更简便易行，且由于本发明采用的穿梭质粒载体pKC1139具有pSW344E温敏型复制子基因，因此构建好的棒状链霉菌lat基因缺失的质粒为温敏型穿梭质粒。该质粒转化棒状链霉菌可发生同源性单交换，比同源性双交换更易整合到棒状链霉菌的染色体上。本发明为进一步转化棒状链霉菌，提高其克拉维酸产量，为获得克拉维酸高产菌株奠定了基础，对我国克拉维酸产业的更新换代具有重要意义。
图1为本发明质粒pKCLHS的限制图；图2为本发明质粒pKCLES的限制图；图3为lat基因片段的限制图；图4为本发明质粒pKCLHS及pKCLES的构建过程图；图5为头孢霉素C的合成途径；图6为棒状链霉菌染色体DNA电泳图；图7为本发明PCR扩增lat基因片段电泳图；图8为木发明重组质粒pUCm-T-lat的酶切电泳图；图9为本发明重组质粒pKC1139-lat的酶切电泳图；图10为本发明重组质粒pKCLHS及pKCLES的酶切电泳图。
具体实施例方式
实施例1重组质粒pKCLHS的构建①棒状链霉菌总DNA的提取挑取固体ISP(ISP(Difco)0.8％，琼脂粉2％，pH＝7.3)平板上28℃培养3天的棒状链霉菌接种于液体ISP培养基中，28℃摇床培养2d，离心收获菌体，用10mM pH＝8.0的EDTA洗涤一次或用水洗涤两次菌体。加入SET(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0))溶液至1mL，并加入20μL 50mg/mL(或相当量的其他浓度的溶菌酶)，37℃水浴30-60min。加入20mg/mL的蛋白酶K 28μL混匀，加入120μL 10％SDS，翻转混匀，55℃温浴2h。将混合物分装到两个干净的离心管中(0.8mL/管)，分别加入500μL酚/氯仿，激烈震荡充分混匀，离心后小心吸取上清液于另一离心管内。若蛋白沉淀不完全，可重复以上两步。加入600μL冰的无水乙醇，翻转充分混匀，静置3min，高速离心沉淀DNA(若染色体较多可用加样枪挑入另一离心管中)。用冰的无水乙醇洗一次，所得DNA在室温放置10min，使之干燥。将干燥后的DNA溶于20μL TE缓冲液中，存于-20℃。棒状链霉菌总DNA的电泳图见图6，其中a.棒状链霉菌染色体DNA；b.10kb Marker(在图中从上到下依次为10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb和1.5kb的标准大小DNA片段，以下同此)。
②根据棒状链霉菌lat基因的DNA序列设计引物，并以棒状链霉菌总DNA为模板PCR体外扩增lat基因，并对PCR产物进行纯化根据棒状链霉菌编码赖氨酸ε-转氨酶的lat基因序列(SEQ NO ID3)的分析设计PCR扩增lat基因的两引物，分别如下引物15’-CCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTTCTCACCCATG-3’；引物25’-ATCGCGGGCCGGCCGGCCCACGGGGTCGCCCCGGGCCGG-3’；利用PCR反应体系合成编码赖氨酸ε-转氨酶的lat基因进行PCR反应，反应体系如下棒状链霉菌模板DNA 3μL(100ng/μL)，10×PCR buffer 5μL，2mM dNTP 5μL，引物12μL(100ng/μL)，引物22μL(100ng/μL)，Taq酶(5u/μL)1μL，DMSO 2.5μL，MgCl23μL(25mM)，ddH2O 26.5μL，反应体系共50μL。循环条件将上述体系于94℃恒温5分钟，94℃恒温2分钟，61℃恒温1分钟，72℃恒温2分钟，第二步到第四步共40个循环，72℃恒温15分钟，保存于4℃。以上PCR反应各试剂均为Sangon SK2491试剂盒中的试剂，PCR反应两引物的合成由Sangon公司完成，PCR产物的纯化采用Sangon公司UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒，纯化方法参见UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒说明书。PCR扩增得到大小约为1.8kb的lat基因片段，纯化后的lat基因片段电泳图见图7，其中a.10kb Marker；b.lat基因片段。
③纯化后的lat基因与pUCm-T载体进行连接得到重组质粒pUCm-T-lat首先将纯化后的PCR产物lat基因片段与pUCm-T载体进行连接，连接反应体系如下10×连接缓冲液(Ligation buffer)1μL，PEG40001μL，PUCm-T载体1μL，纯化PCR产物lat基因片段4μL，灭菌双蒸水(Sterile ddH2O)2μL，T4DNA连接酶1μL；整个连接反应体系共10μL，将上述连接体系于16℃恒温过夜，连接产物用于转化E.coliDH5α。以上连接体系所用试剂均采用Sangon SK2211 PCR产克隆试剂盒。电击转化E.coliDH5α制备E.coliDH5α电击法感受态细胞并将上述连接产物采用电击转化法转化E.coliDH5α。将转化后的细胞于1mL SOC培养基(SOB培养基胰蛋白胨；20％，酵母提取物0.5％，NaCl 0.05％，KCl0.25mM，MgCl22mM，121℃灭菌20min。使用前每升SOB培养基中加入20mL 1mol/L葡萄糖溶液(终浓度20mmol/L)，即为SOC培养基)中37℃，摇床培养1小时后，取培养好的菌体，涂于含有X-gal和IPTG及100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，将上述平板于37℃恒温培养，挑选白色克隆子(载体pUCm-T含有可用于大肠杆菌中蓝白筛选的lacZ基因的多克隆位点区)转接于含有50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床培养12h，离心收集菌体并提取质粒，lat基因片段大小为1.8kb，pUCm-T载体大小为2.8kb，连接后所得正确重组质粒pUCm-T-lat大小应为4.6kb。将所提质粒分别用EcoRI进行单酶切及EcoRI-HindIII进行双酶切，酶切电泳图见图8，其中a.EcoRI-HindIII双酶切pUCm-T-lat；b.KpnI单酶切pUCm-T-lat；c.线性pUCm-T载体；d.lat gene；e.10kb Marker。单酶切后大小为一条4.6kb的DNA片段，双酶切后为两条大小分别为2.8kb及1.8kb的DNA片段的质粒可确定为正确的pUCm-T-lat重组质粒。上述所用T4DNA连接酶及限制性内切酶均为Sangon公司产品，酶切反应体系参考限制性内切酶说明书，大肠杆菌电击法转化感受态细胞的制备及电击转化方法，含有X-gal和IPTG的LB平板的制备方法，以及碱法提取大肠杆菌质粒DNA的方法均参见文献[Sambrook J.，Fritsch E.F.，Maniatis T.(金冬雁等译)，分子克隆分子克隆实验指南，第二版，北京科学出版社，1999]④对重组质粒pUCm-T-lat进行双酶切，与经同样双酶切获得的线性质粒载体pKC1139进行连接得到重组质粒pKC1139-lat将所得重组质粒pUCm-T-lat用EcoRI-HindIII双酶切，回收1.8kb的lat基因片段(Takara公司DV 805A胶回收试剂盒)，使lat基因两端分别具有EcoRI和HindIII酶切位点，与经同样双酶切的大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体pKC1139(由北京医药生物技术研究所提供)用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系如下lat基因片段3μL，质粒pKC11393μL，连接缓冲液(10×)1μL，T4 DNA连接酶1μL，灭菌双蒸水2μL，连接反应总体系10μL；将上述连接体系于16℃恒温连接12h，所得的连接产物用于转化E.coliDH5α感受态细胞。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法参见本实施例中的步骤③，只是电击转化的菌体培养1小时后，涂于含有X-gal和IPTG及25μg/mL阿泊拉霉素的LB固体平板上，37℃恒温培养后挑选白色克隆子(载体pKC1139含有可用于大肠杆菌中蓝白筛选的lacZ基因的多克隆位点区)转接于含有12.5μg/mL阿泊拉霉素的液体LB培养基中，37℃摇床培养12h，离心收集菌体并提取质粒，lat基因片段大小为1.8kb，大肠杆菌—链霉菌穿梭质粒载体pKC1139大小为6.5kb，连接后所得正确重组质粒pKC1139-lat大小应为8.3kb。将所提质粒分别用EcoRI进行单酶切，酶切电泳图见图9，其中a.10kbMarker；b、c.EcoRI单酶切pKC1139-lat；d.lat基因片段；e.EcoRI单酶切pKC1139载体。单酶切pKC1139-lat后大小为一条8.3kbDNA片段的质粒可确定为正确的pKC1139-lat重组质粒。上述所用T4 DNA连接酶及限制性内切酶均为Sangon公司产品，酶切反应体系参考限制性内切酶说明书，大肠杆菌电击法转化感受态细胞的制备及电击转化方法，含有X-gal和IPTG的LB平板的制备方法，碱法提取大肠杆菌质粒DNA的方法均参见文献[Sambrook J.，Fritsch E.F.，Maniatis T.(金冬雁等译)，分子克隆分子克隆实验指南，第二版，北京科学出版社，1999]⑤对pKC1139-lat内的棒状链霉菌lat基因部分缺失后自连得到重组质粒pKCLHS将所得重组质粒pKC1139-lat进行HindIII-ScaI双酶切，切去lat基因的一段大小约为0.4kb的HindIII-ScaI基因片段，回收约7.8kb线性pKCLHS片段(Takara公司DV 805A胶回收试剂盒)，对其两粘性末端用T4 DNA聚合酶(Takara公司产品)补平，补平体系如下灭菌双蒸水3.5μL，T4 DNA聚合酶缓冲液(10×)1μL，0.1％BSA1μL，回收pKCLHS2.5μL，dNTP(2mM)1μL，补平反应总体系9μL；将该体系首先于70℃保温5min然后转移入37℃并加入0.5μL 4U/μL的T4 DNA聚合酶，轻轻混匀将混合物于37℃保温5min后，经振荡器剧烈震荡后置于冰中，所得的补平产物立即用于连接反应。
将补平后的pKCLHS用T4DNA连接酶(Takara公司产品)进行自连，连接体系如下T4 DNA连接酶缓冲液(10×)2μL，补平pKCLHS9.5μL，T4 DNA连接酶(10U/μL)1.5μL，灭菌双蒸水7μL，连接反应总体系20μL；将该体系于16℃恒温连接12h，连接产物用于转化E.coliDH5α。
E.coliDH5α电击法感受态细胞的制备及电击转化E.coliDH5α的方法参见本实施例中的步骤③。将所得转化子提取质粒并进行酶切验证，连接前的线性质粒pKCLHS的大小约为7.8kb，连接后所得正确重组质粒pKCLHS大小也应为7.8kb。将所提质粒用EcoRI进行单酶切，酶切电泳图见图10，其中a.HindIII单酶切pKCLES；b.HindIII/KpnI双酶切pKCLES；c.EcoRI单酶切pKC1139-lat；d.10kb Markere.EcoRI单酶切pKCLHS；e.KpnI单酶切pKCLHS。单酶切后大小为一条7.8kb的DNA片段的质粒可确定为正确的pKCLHS自连所得重组质粒。上述所用限制性内切酶均为Sangon公司产品，酶切反应体系参考限制性内切酶说明书，大肠杆菌电击法转化感受态细胞的制备及电击转化方法，以及碱法提取大肠杆菌质粒DNA的方法均参见文献[Sambrook J.，Fritsch E.F.，Maniatis T.(金冬雁等译)，分子克隆分子克隆实验指南，第二版，北京科学出版社，1999]实施例2重组质粒pKCLES的构建具体方法参见实施例1中的①②③④四个步骤，第⑤步与实施例1中的第⑤步所用的限制性内切酶不同，具体如下将所得重组质粒pKC1139-lat进行EcoRI-ScaI双酶切，切去lat基因的一段大小约为1.4kb的EcoRI-ScaI基因片段，回收约7.0kb线性pKCLES片段(Takara公司DV805A胶回收试剂盒)，对其两粘性末端用T4DNA聚合酶(Takara公司产品)补平，补805A胶回收试剂盒)，对其两粘性末端用T4DNA聚合酶(Takara公司产品)补平，补平体系如下灭菌双蒸水3.5μL，T4 DNA聚合酶缓冲液(10×)1μL，0.1％BSA1μL，回收pKCLES2.5μL，dNTP(2mM)1μL，补平反应总体系9μL；将该体系首先于70℃保温5min然后转移入37℃并加入0.5μL 4U/μL的T4DNA聚合酶，轻轻混匀将混合物于37℃保温5min后，经振荡器剧烈震荡后置于冰中，所的补平产物立即用于连接反应。
将补平后的pKCLES用T4DNA连接酶(Takara公司产品)进行自连，连接体系如下T4DNA连接酶缓冲液(10×)2μL，补平pKCLES9.5μL，T4 DNA连接酶(10U/μL)1.5μL，灭菌双蒸水7μL，连接反应总体系20μL；将该体系于16℃恒温连接12h，连接产物用于转化E.coliDH5α。
E.coliDH5α电击法感受态细胞的制备及电击转化E.coliDH5α的方法参见实施例1中步骤③。将所得转化子提取质粒并进行酶切验证，连接前的线性质粒pKCLES的大小约为7.0kb，连接后所得正确重组质粒pKCLES大小也应为7.0kb。将所提质粒用HindIII进行单酶切，酶切电泳图见图10。单酶切后大小为一条7.0kb的DNA片段的质粒可确定为正确的pKCLES自连所得重组质粒。上述所用限制性内切酶均为Sangon公司产品，酶切反应体系参考限制性内切酶说明书，大肠杆菌电击法转化感受态细胞的制备及电击转化方法，以及碱法提取大肠杆菌质粒DNA的方法均参见文献[Sambrook J.，Fritsch E.F.，Maniatis T.(金冬雁等译)，分子克隆分子克隆实验指南，第二版，北京科学出版社，1999]实施例3含有棒状链霉菌lat基因部分缺失的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的衍生物1及其构建方法具体方法参见实施例1中的①②③④四个步骤，第⑤步与实施例1中的第⑤步所用的限制性内切酶不同，具体步骤如下采用lat基因上的除构建质粒pKCLHS和pKCLES所用的HindIII-ScaI和EcoRI-ScaI以外的其余酶切位点(见图3)中的任意两种酶，如采用EcoNI-HindIII对质粒pKC1139-lat中的lat基因进行切割，切去lat基因的一段大小约为0.7kb的EcoNI-HindIII基因片段，回收约7.6kb线性片段，对其两粘性末端用T4 DNA聚合酶(Takara公司产品)补平，补平体系如下灭菌双蒸水3.5μL，T4 DNA聚合酶缓冲液(10×)1μL，0.1％BSA1μL，回收DNA片段2.5μL，dNTP(2mM)1μL，补平反应总体系9μL；将该体系首先于70℃保温5min然后转移入37℃并加入0.5μL 4U/μL的T4 DNA聚合酶，轻轻混匀将混合物于37℃保温5min后，经振荡器剧烈震荡后置于冰中，所的补平产物立即用于连接反应。
将末端补平后的DNA片段用T4DNA连接酶(Takara公司产品)进行自连，连接体系如下T4 DNA连接酶缓冲液(10×)2μL，补平DNA片段9.5μL，T4DNA连接酶(10U/μL)1.5μL，灭菌双蒸水7μL，连接反应总体系20μL；将该体系于16℃恒温连接12h，连接产物用于转化E.coliDH5α。
E.coliDH5α电击法感受态细胞的制备及电击转化E.coliDH5α的方法参见实施例1中步骤③。将所得转化子提取质粒并进行酶切验证。上述所用限制性内切酶均为Sangon公司产品，酶切反应体系参考限制性内切酶说明书，大肠杆菌电击法转化感受态细胞的制备及电击转化方法，以及碱法提取大肠杆菌质粒DNA的方法均参见文献[Sambrook J.，Fritsch E.F.，Maniatis T.(金冬雁等译)，分子克隆分子克隆实验指南，第二版，北京科学出版社，1999]实施例4含有棒状链霉菌lat基因部分缺失的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒的衍生物2及其构建方法采用lat基因上的除构建质粒pKCLHS和pKCLES所用的HindIII-ScaI和EcoRI-ScaI以外的其余酶切位点(见图3)中的任意两种酶，如采用SplI-EcoNI对质粒pKC1139-lat中的lat基因进行切割，切去lat基因的一段大小约为0.6kb的SplI-EcoNI基因片段，回收约7.7kb线性片段，其余方法同实施例3。
序列表SEQUENCE LISTING<110>天津科技大学<120>棒状链霉菌lat基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法<130>041012<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>1ccataattca gcctgatccc ccaggagttc tcacccatg39<210>2<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>2atcgcgggcc ggccggccca cggggtcgcc ccgggccgg39<210>3
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<221>gene<222>(1)..(1779)<223>
<400>
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权利要求
1.棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒、衍生物，其特征在于该质粒或其衍生物包含棒状链霉菌中的编码赖氨酸ε-转氨酶基因的一部分，质粒上包含大肠杆菌源质粒和链霉菌源质粒的复制起始点，为带有在大肠杆菌和链霉菌中都可表达的阿泊拉霉素抗性选择标记的穿梭质粒，并具有pSW344E温敏型复制子基因。
2.按照权利要求1所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒，其特征在于该质粒pKCLHS大小约为7.8kb，并且由图1的限制图谱表示。
3.按照权利要求1所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒，其特征在于该质粒pKCLES大小约为7.0kb，并且由图2的限制图谱表示。
4.按照权利要求1所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒pKCLHS和pKCLES的衍生物，其特征在于该衍生物大小为除7.0kb、7.8kb之外的6.5kb-8.3kb。
5.棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因缺失的质粒pKCLHS、pKCLES及其衍生物的构建方法，其特征在于质粒pKCLHS和pKCLES的构建方法是，首先构建含有目的基因lat的重组质粒pUCm-T-lat，通过设计引物并进行PCR体外扩增，得到大小约为1.8kb的lat基因片段，选用具有多克隆位点的pUCm-T载体与纯化后的lat基因片段以T4DNA连接酶进行连接得到重组质粒pUCm-T-lat；用EcoRI-HindIII双酶切pUCm-T-lat，得到的lat基因片段经纯化后与经EcoRI-HindIII双酶切并纯化后的载体pKC1139以T4DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pKC1139-lat；pKC1139-lat分别经HindIII-ScaI或EcoRI-ScaI双酶切回收约7.8kb或7.0kb的DNA片段，两种纯化后的回收产物首先均以T4DNA聚合酶补平末端，再以T4DNA连接酶进行自连，分别得到lat基因缺失一段HindIII-ScaI及EcoRI-ScaI片段的重组质粒pKCLHS和pKCLES，构建过程由图4表示，整个质粒构建过程是在大肠杆菌(Escherichia coli DH5α)中完成的；该衍生物的构建方法是，其采用的限制性内切酶为lat基因上的除构建质粒pKCLHS和pKCLES所用的HindIII-ScaI和EcoRI-ScaI以外的其余酶切位点(见图3)中的任意两种酶，对质粒pKC1139-lat中的lat基因进行切割并回收lat基因缺失后剩余的DNA片段，其余方法同质粒pKCLHS和pKCLES的构建。
6.按照权利要求5所述的棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)lat基因突变的质粒及其衍生物的构建方法，其特征在于PCR体外扩增编码赖氨酸ε-转氨酶的lat基因所用引物具有SEQ NO ID1或2中所示的DNA序列，或具有与SEQ NO ID1或2中所示的DNA序列90％或更高同源性的DNA序列；引物15’-CCATAATTCAGCCTGATCCCCCAGGAGTTCTCACCCATG-3’(SEQ NO ID1)；引物25’-ATCGCGGGCCGGCCGGCCCACGGGGTCGCCCCGGGCCGG-3’(SEQ NO ID2)。
全文摘要
棒状链霉菌lat基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法，属于生物工程，涉及棒状链霉菌编码赖氨酸ε－转氨酶lat基因的PCR体外扩增引物及lat基因缺失的质粒、衍生物及其构建方法。本发明设计了上下游引物，实现lat基因的体外大量扩增，构建了具有单交换整合能力的质粒和衍生物，对影响克拉维酸产量的棒状链霉菌的lat基因进行缺失突变，并完成在大肠杆菌中的构建工作。该质粒大小约为7.8kb或7.0kb，它包含来自棒状链霉菌中的编码赖氨酸ε－转氨酶基因的一部分及大肠杆菌源质粒和链霉菌源质粒的复制起始点、带有在大肠杆菌和链霉菌中都可表达的阿泊拉霉素抗性选择标记，并具有pSW344E温敏型复制子基因。
文档编号C12N15/66GK1644700SQ20041009395
公开日2005年7月27日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年12月17日
发明者王艳萍, 左志晗, 金守光 申请人:天津科技大学