专利名称：重组生产和纯化蛋白激酶的改进方法
技术领域：
本发明涉及在原核生物中通过内含体重组生产和纯化蛋白激酶的改进方法。
背景技术：
蛋白激酶通过向蛋白质添加磷酸基团来调控许多不同的细胞增殖、分化、和信号过程(Hunter，T.，Cell，50(1987)823-829)。蛋白激酶常常以它们的底物、它们的调控分子、或突变表型的一些方面命名。就底物而言，蛋白激酶可以分成两组；将酪氨酸残基磷酸化的称为蛋白质酪氨酸激酶即PTK，和将丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化的称为丝氨酸/苏氨酸激酶即STK。几乎所有的激酶都包含类似250-300个氨基酸的催化结构域。N端结构域结合并定向ATP(或GTP)供体分子。较大的C端部分结合蛋白质底物，并执行将磷酸由ATP转移至丝氨酸、苏氨酸、或酪氨酸残基的羟基。
可以根据位于激酶结构域的环的某一端或插入其环中的不同氨基酸序列(通常在5和100个残基之间)将激酶分类成家族。这些外加氨基酸序列能够调控各自激酶，因为它识别其靶蛋白并与其相互作用。激酶结构域的一级结构是保守的，而且可以进一步细分成11个亚结构域。这11个亚结构域的每一个都包含特定残基和基序或氨基酸样式，它们是亚结构域的特征，而且这些亚结构域是高度保守的(Hardie，G.和Hanks，S.，TheProtein Kinase Facts Books I，Academic Press，San Diego，Calif，1995，第7-20页)。
第二信使依赖性蛋白激酶主要介导第二信使诸如环AMP(cAMP)、环GMP、肌醇三磷酸、磷脂酰肌醇、3，4，5-三磷酸、环ADP核糖、花生四烯酸和二酰甘油的作用。例如，环AMP依赖性蛋白激酶(PKA)和促分裂原活化蛋白激酶(MAP)是STK家族的成员。在已经研究过的所有原核和动物细胞中，环AMP是激素作用的胞内介导物。这些由激素诱导的细胞应答包括甲状腺激素分泌、皮质醇分泌、孕酮分泌、糖原分解、骨吸收、以及心率和心肌收缩力度的调控。PKA发现于所有动物细胞中，而且认为它负责环AMP在大多数这些细胞中的作用。PKA表达的改变涉及多种疾病和病症，包括癌症、甲状腺疾病、糖尿病、动脉粥样硬化、和心血管疾病。
MAP激酶像p38还调控胞内信号途径。它们通过磷酸化级联反应介导由细胞表面至细胞核的信号转导。已经鉴定了几个亚类，它们各自显示不同的底物特异性并应答不同的胞外刺激(Egan，S.E.和Weinberg，R.A.，Nature，365(1993)781-783)。
蛋白激酶B(PKB/Akt)是具有基础重要性的胞内信号途径的成员，功能是发挥生长和存活因子的作用，并介导对胰岛素和炎性信号的应答(Datta，S.R.等人，Genes Dev.，13(1999)2905-2927；Brazil，D.P.和Hemmings，B.A.，Trends Biochem.Sci.，11(2001)657-664)。WO2003/016516描述了使用苯基TSK疏水相互作用层析的PKB的重组生产和纯化。将PKB吸附到柱上，并在清洗PKB后使用线性梯度洗脱。
SRC激酶涉及癌症、免疫系统机能失调和骨重建疾病。一般综述可参阅Thomas，S.M.和Brugge，J.S.，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，13(1997)513-609。Src家族的成员有例如Src、Fyn、Yes、Fgr、Lyn、Hck、Lck、和Blk。这些是非受体蛋白激酶，分子量范围为52-62kD。它们的特征是共同结构组织，即包含六个不同功能结构域Src同源结构域4(SH4)、一个独特结构域、SH3结构域、SH2结构域、一个催化结构域(SH1)、和C端15调控区。
在原核生物体中，蛋白质合成(也称为翻译)是在细胞质的核糖体上进行的。在原核宿主生物体诸如大肠杆菌中表达重组DNA时，由此生成的重组基因产物/蛋白质常常以不溶性内含体的形式在细胞质中沉淀。在完成发酵并裂解细胞后，分离并任选纯化内含体，通过添加变性剂诸如尿素或盐酸胍溶解其中包含的重组蛋白，并通过还原变性条件实现所述蛋白质的复性。这些方法是众所周知的，并且已经长时间成功用于重组蛋白的工业生产(参阅如Lee，S.Y.，Trends Biotechnol.，14(1996)98-105；Panda，A.K.等人，J.Biotechnol.，75(1999)161-172；Mattes，R.，Semin.Thromb.Hemost.，27(2001)325-336；Clark，E.D.，Curr.Opin.Biotechnol.，12(2001)202-207；Misawa，S.和Kumagai，I.，Biopolymers，51(1999)297-307；和Lilie，H.，Current Opinion Biotechnol.，9(1998)497-501)。
由于溶解性差、折叠不正确、缺乏稳定性和其它问题，哺乳动物蛋白质在微生物宿主细胞如大肠杆菌中的表达常常是具有挑战性的任务。发明人在微生物宿主细胞中通过重组表达生产蛋白激酶的尝试通常导致只有少量的有活性的可溶性激酶，但是产生大量的不需要的且无活性的二聚体和更高聚集体。
发明内容
发明概述现在，令人惊讶的发现，使用本发明的方法可以在微生物宿主细胞中的重组生成后大量回收正确折叠的激酶。
因此，本发明的目的是一种重组生产和纯化蛋白激酶的方法，所述蛋白激酶选自酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶组成的组，该方法通过在微生物宿主细胞中表达编码所述激酶的核酸，形成包含所述蛋白激酶的内含体，分离，溶解，复性(naturing)，和纯化所述蛋白激酶而进行，其特征在于所述纯化是通过在至少70％的所述正确折叠的蛋白激酶不结合于所述吸附剂的条件下与疏水吸附剂进行疏水相互作用而进行和回收不结合所述吸附剂的蛋白激酶。未折叠的蛋白质结合吸附剂。
优选的是，所述蛋白激酶是src、pkb、c-met、lck、aurora或p38。
依照本发明的吸附剂优选固体或凝胶材料，有经过疏水残基如苯基、丁基、或辛基残基修饰的纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖等组成(HIC吸附剂、疏水相互作用层析吸附剂)。
优选的是，用包含至少0.1M KCl或NaCl、更优选0.1-1M KCl或NaCl的水溶液中的疏水性吸附剂处理激酶。更高的KCl或NaCl浓度也是可能的，只要蛋白激酶不以超过蛋白激酶蛋白质物质总量70％的非期望大量发生结合。另外，高盐浓度可能使蛋白激酶不稳定。
另外，所述疏水相互作用处理优选在存在至少1M精氨酸或具有通式I的化合物的条件下进行R2-CO-NRR1(I)，其中R和R1是氢或饱和或不饱和的、支化或非支化的C1-C4烷基链，且R2是氢、NHR1或饱和或不饱和的、支化或非支化的C1-C3烷基链。
发明详述上文已经定义了可以依照本发明生产和纯化的蛋白激酶。优选的是，依照本发明的方法可用于SRC激酶和环AMP依赖性蛋白激酶(PKA)的生产和纯化。Src家族的成员有例如Src、Fyn、Yes、Fgr、Lyn、Hck、Lck、和Blk。这些是非受体蛋白激酶，分子量范围为52-62kD。它们的特征是共同结构组织，即包含六个不同功能结构域Src同源结构域4(SH4)、独特结构域、SH3结构域、SH2结构域、催化结构域(SH1)、和C端15调控区。环AMP依赖性蛋白激酶(PKA)是STK家族的成员。在已经研究过的所有原核和动物细胞中，环AMP是激素作用的胞内介导物。这些由激素诱导的细胞应答包括甲状腺激素分泌、皮质醇分泌、孕酮分泌、糖原分解、骨吸收、以及心率和心肌收缩力度的调控。PKA发现于所有动物细胞中，而且认为它负责环AMP在大多数这些细胞中的作用。
可以依照本发明生产的上文所述蛋白激酶都在生物化学过程中发挥重要作用。为了进一步说明代谢关联，不仅关注天然的蛋白激酶，而且还关注这些天然存在蛋白激酶的突变体。
依照本发明有用的吸附剂(HIC吸附剂)优选由被疏水配基取代的凝胶基质组成。取代的程度通常在10-50μmol/ml凝胶的范围内。优选的配基是例如C2-C8烷基残基或简单的芳基(像苯基)残基。通常，疏水相互作用通过添加盐而增强。如果使用HIC吸附剂进行层析，那么正确折叠形式的激酶的结合程度并不高，因此在流出液中进行回收。
尤其优选使用由苯基、丁基、或辛基取代的交联琼脂糖。这样的吸附剂是例如苯基、丁基、或辛基琼脂糖(如交联琼脂糖，4％是球形的，平均颗粒大小为90μm，颗粒大小范围为45-165μm，取代程度约为50μmol丁基/ml凝胶)。
疏水吸附剂的处理可以以常见方式进行，如用吸附剂的悬浮液处理包含激酶的溶液或进行层析(HIC)。
术语“至少70％的所述蛋白激酶不结合”指在重组生产和复性(naturation)后回收的蛋白质中，它包含在含激酶的水溶液复性后存在的正确折叠形式、非正确折叠形式(如多聚体等)的所述蛋白激酶、以及来自宿主细胞的其它蛋白质杂质，至少70％的正确折叠形式不结合吸附剂且发现于用吸附剂处理激酶溶液后的上清液中或如果将吸附剂用于层析HIC纯化中而发现于流出液中。
术语“正确折叠”指蛋白质在复性后采取天然的三维结构。这不依赖催化活性，而且还包括无催化活性的突变体。优选的是，活性蛋白激酶是依照本发明生产的。
可以通过在复性后用至少0.1M KCl或NaCl、更优选0.1-1M KCl或NaCl处理这种激酶的水溶液来实现激酶与吸附剂的结合率低于30％。更高的KCl或NaCl浓度也是可能的，只要蛋白激酶不以超过蛋白激酶蛋白质物质总量70％的非期望大量发生结合。另外，很高的盐浓度可能使蛋白激酶不稳定。
对于具有通式I的化合物，优选采用甲酰胺、乙酰胺、尿素或尿素衍生物诸如乙脲或甲脲。可以使用精氨酸，例如碱性精氨酸的盐酸化物或另一种滴定形式。然而，优选采用L-精氨酸，更优选采用L-精氨酸的盐酸化物形式。
多肽在微生物宿主细胞的重组表达过程中形成不溶性内含体。内含体是在编码基因过度表达的情况中发生的蛋白酶抗性错误折叠形式的期望蛋白质的折射性聚集物(Misawa，S.和Kumagai，I.，Biopolymers，51297-307，1999)。
适于重组基因表达的原核宿主细胞是例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，诸如大肠杆菌和枯草杆菌。合适的大肠杆菌菌株是诸如UT5600、AB101、XL1、K12、X1776、和W3110等大肠杆菌菌株。然而，其它肠杆菌科以及诸如克雷伯氏杆菌属、沙门氏菌属、或枯草杆菌属等微生物、假单胞菌属、或链霉菌属也适于作为宿主细胞。同样适于作为宿主细胞的还有酵母菌株，诸如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。
通常将编码多肽的核酸插入表达载体。合适的载体对于本领域熟练技术人员而言是众所周知的，例如质粒或噬菌体。
宿主细胞的发酵也是依照本领域熟练技术人员已知的方法进行的。在达到预定的细胞数目后(通过发酵液/细胞悬浮液的光密度来测量)，诱导重组多肽的表达，并进行培养直至达到稳定期(在分批培养的情况中)。在细胞培养完成后，收获细胞，分离并处理内含体，即依照已知方法的溶解和复性。
提供下面的实施例、附图、和参考文献是为了帮助理解本发明，所附权利要求书列出了本发明的真正范围。应当理解的是，可以对所列流程进行修改而不违背本发明的精神。
图1如本文所述进行复性和疏水层析后的Src活性。活性发现于上清液(SN)中(EL＝洗脱液)。
图2复性和丁基层析级分的SDS-PAGE，考马斯蓝染色。虽然在丁基上清液(SN)中保持了活性，但是切出了大量的失活src蛋白。1蛋白质分子量标准，2复性，3复性+KCl，4丁基SN，5超滤/浓缩。
图3复性和添加KCl或硫酸铵后的src活性。添加在疏水层析中常用的硫酸铵造成上清液中活性src的丧失。高达1M的KCl使溶液中的src保持活性并能够在丁基琼脂糖上分离失活的src。
图4SDS-PAGE，考马斯蓝染色。泳道1是标准蛋白质，泳道2是重新折叠和丁基琼脂糖处理后的aurora激酶制剂。箭头aurora激酶。
图5重新折叠和丁基琼脂糖处理后的aurora激酶的大小排阻层析。Superdex 75(Pharmacia)10/30。缓冲液50mM TRIS pH7.5，500mM NaCl，10％甘油，3mM Chaps。流速0.5ml/分钟。
具体实施例方式
实施例1
src的重组生产a)克隆将Src激酶结构域克隆到pQE32(QIAGEN GmbH)的BamHI/HindIII位点中，并通过PCR在其N端引入凝血酶切割位点。
b)发酵为了制备接种物，将包含重组激酶蛋白生产所用表达质粒的适当大肠杆菌菌株甘油保存物1ml加到100ml LB培养基中，并在旋转摇床上于37℃培养8-10小时。将此预培养物转移到装有更多LB培养基和葡萄糖的经灭菌发酵罐中。在期望蛋白激酶不溶性表达成内含体时，将主要培养物的温度维持于37℃。通过提高搅拌速度将整个发酵过程中培养基的溶氧浓度保持在高于20％的饱和度。在pH值升高时添加葡萄糖并持续补充酵母-蛋白胨溶液(2ml/分钟)进行额外的养分输送。当检测到光密度不再升高时，停止这种补料分批发酵。通过离心收获培养肉汤。
c)IB制备将生物物质悬浮于含Tris和MgSO4的缓冲液中。如果需要，添加溶菌酶和DNA酶(如来自Merck的Benzonase)。通过匀浆裂解细菌细胞以释放其中的内含体。补充的DNA酶使悬浮液保持液态，这对于进一步的处理是至关重要的。于室温培育期后，向悬浮液中添加含NaCl、EDTA、和Brij液的第二种缓冲液。于室温培育期后，通过离心由上清液分离隐蔽的内含体。然后将沉淀悬浮于含Tris和EDTA的第三种缓冲液以清洗IB(内毒素释放)，并于室温搅动下温育和离心。
d)src的复性将1.3g内含体于室温悬浮于100ml 0.1M TRIS pH8.0、8M盐酸胍、10mM EDTA、10mM DTT。将此src溶解物边搅动边滴加到含1M TRIS pH7.0、0.5M精氨酸、10mM DTT、10片Complete的10升重新折叠缓冲液中。重新折叠过程于8℃持续3-5天，无需搅动。
由于失活的未折叠src的高度聚集和然后活性级分免疫共沉淀，因此在此阶段用不同的缓冲液(含多种添加剂的醋酸盐、磷酸盐、MES、TRIS pH5-9)进行透析是不成功的。必需在透析前通过疏水层析除去复性缓冲液中的失活的未折叠src。
e)分批疏水层析将重新折叠的蛋白质溶液设为1M KCl。随后加入40g丁基琼脂糖4Fast Flow(Amersham)，并于8℃结合1小时。过滤除去丁基琼脂糖后，上清液包含正确折叠的活性src蛋白。在这些条件下，未折叠的无活性蛋白质结合丁基琼脂糖。此方法使得有活性的和无活性的src得以分离(图1和2)。如果需要，可以通过额外的层析步骤即Ni-鳌合层析和大小排阻层析实现进一步的纯化。
正如在图3中能够看到的，添加KCl(0.2M、0.5M、和1.0M)证实优于硫酸铵。相同浓度的硫酸铵早就引起活性src的沉淀。因为在柱子上损失了大量的活性，所以使用导致活性src结合疏水材料的条件是不合适的。洗脱液只显示低水平的src蛋白和活性回收。
f)src检测使用Eu标记(PT66 Lance Eu-W1024(Wallac))的磷酸酪氨酸抗体，并检测时间分辩荧光信号，由此测量src激酶对src底物肽YA133的磷酸化。
实施例2aurora的重组生产a)克隆依照以下流程设计并克隆用于在细菌中表达人全长野生型Aurora A激酶和衍生物的载体构建体，所述激酶和衍生物用于激酶测定法(如Elisa、HTRF、FP)和生物结构目的。
使用基因特异性寡核苷酸引物和Pwo DNA聚合酶(Roche DiagnosticsGmbH)通过标准PCR由人HeLa cDNA文库(Clontech)扩增编码人全长Aurora A激酶(第1-403位残基)的ORF，随后亚克隆到细菌表达载体中。以这些载体为模板，使用基因特异性寡核苷酸引物通过PCR生成截短形式的Aurora A，并通过定点诱变生成Aurora A突变型蛋白。对于最终的表达构建体，使用基因特异性引物和Pwo DNA聚合酶通过PCR由相应的Aurora A基础载体扩增野生型和突变型Aurora A激酶结构域(第114-403位残基)。通过NdeI和XhoI限制性位点将PCR产物亚克隆到含有或不含N端RGS-(His)6标签在T5启动子控制下的经修饰的pQE40表达载体。通过测序证实了所有载体插入片段的序列。随后将载体转化到大肠杆菌BL21和UT5600菌株中，用于通过大规模发酵以内含体形式表达蛋白质。在用1mM异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl-D-thiogalactopyranoside)于37℃过夜诱导前，将大肠杆菌菌株BL21和UT5600于37℃在补充氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中培养至光吸收值达到0.5-0.8，在该菌株中表达蛋白质。诱导后，通过离心收获细胞，重悬，并依照给定流程制备内含体。
b)发酵为了制备接种物，将包含重组激酶蛋白生产所用表达质粒的适当大肠杆菌菌株甘油保存物1ml加到100ml LB培养基中，并在旋转摇床上于37℃培养8-10小时。将此预培养物转移到装有更多LB培养基和葡萄糖的经灭菌发酵罐中。将主要培养物的温度维持于37℃。在pH值升高时添加葡萄糖并持续补充酵母—蛋白胨溶液(2ml/分钟)进行额外的养分输送。当检测到光密度不再升高时，停止这种补料分批发酵。通过离心收获培养肉汤。
c)IB制备将生物物质悬浮于含Tris和MgSO4的缓冲液中。如果需要，添加溶菌酶和DNA酶(如来自Merck的Benzonase)。通过匀浆裂解细菌细胞以释放其中的内含体。于室温培育期后，向悬浮液中添加含NaCl、EDTA、和Brij液的第二种缓冲液。于室温另外的培育期后，通过离心由上清液分离隐蔽的内含体。然后将沉淀悬浮于含Tris和EDTA的第三种缓冲液以清洗IB，并于室温搅动温育和离心。
d)aurora的复性将160mg内含体于室温悬浮于10ml 0.1M TRIS pH8.0、8M盐酸胍、10mM EDTA、10mM DTT。将此aurora溶解物边搅动边滴加到含1M TRISpH7.0、0.5M精氨酸、10mM DTT的1升重新折叠缓冲液中。重新折叠过程于8℃持续1天，无需搅动。
e)分批疏水层析将重新折叠的蛋白质溶液设成1M KCl。30分钟后加入5g丁基琼脂糖4 Fast Flow(Amersham)，并于8℃结合1小时。过滤除去丁基琼脂糖后，上清液主要包含正确折叠的活性aurora蛋白。在这些条件下，未折叠的蛋白质结合丁基琼脂糖。如果需要，可以通过额外的层析步骤即离子交换和大小排阻层析实现进一步的纯化。
f)重新折叠蛋白质的分析正如在SDS-PAGE和大小排阻层析中看到的，重新折叠后丁基琼脂糖批次的上清液含有90％以上的单体aurora激酶。
参考文献Brazil，D.P.和Hemmings，B.A.，Trends Biochem.Sci.，11657-664，2001Clark，E.D.，Curr.Opin.Biotechnol.，12202-207，2001Datta，S.R.等人，Genes Dev.，132905-2927，1999Egan，S.E.和Weinberg，R.A.，Nature，365781-783，1993Hardie，G.和Hanks，S.，The Protein Kinase Facts Books I，AcademicPress，San Diego，Calif.，1995，第7-20页Hunter，T.，Cell，50823-829，1987Lee，S.Y.，Trends Biotechnol.，1498-105，1996Lilie，H.，Current Opinion Biotechnol.，9497-501，1998Mattes，R.，Semin.Thromb.Hemost.，27325-336，2001Misawa，S.和Kumagai，I.，Biopolymers，51297-307，1999Panda，A.K.等人，J.Biotechnol.，75161-172，1999Thomas，S.M.和Brugge，J.S.，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，13513-609，1997WO 2003/01651权利要求
1.一种重组生产和纯化蛋白激酶的方法，所述蛋白激酶选自由酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶组成的组，所述方法通过在微生物宿主细胞中表达编码所述激酶的核酸，形成包含所述激酶的内含体，分离，溶解，复性，和纯化所述激酶来进行，其特征在于所述纯化是通过在至少70％所述正确折叠的蛋白激酶不结合所述吸附剂的条件下与疏水吸附剂进行疏水相互作用而进行和回收不结合所述吸附剂的蛋白激酶。
2.依照权利要求1的方法，其特征在于所述激酶是src、pkb、c-met、lck或p38。
3.依照权利要求1或2的方法，其特征在于所述吸附剂是苯基-、辛基-或丁基-琼脂糖。
4.依照权利要求1至3的方法，其特征在于将所述激酶施加到包含至少0.1M KCl或NaCl的水溶液中的层析物质上。
5.依照权利要求4的方法，其特征在于所述水溶液额外包含至少1M精氨酸或具有通式I的化合物R2-CO-NRR1(I)，其中R和R1是氢或饱和或不饱和的、支化或非支化的C1-C4烷基链，和R2是氢、NHR1或饱和或不饱和的、支化或非支化的C1-C3烷基链。
全文摘要
一种重组生产和纯化蛋白激酶的方法，所述蛋白激酶选自由酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶组成的组，所述方法通过在微生物宿主细胞中表达编码所述激酶的核酸，形成包含所述激酶的内含体，分离，溶解，复性，和纯化所述激酶来进行，其特征在于所述纯化是通过在至少70％所述蛋白激酶不结合所述吸附剂的条件下与疏水吸附剂进行疏水相互作用而进行和回收不结合所述吸附剂的蛋白激酶。
文档编号C12N9/12GK1624123SQ20041009804
公开日2005年6月8日 申请日期2004年12月2日 优先权日2003年12月2日
发明者胡贝特·赫腾贝格尔, 康拉德·霍诺尔德, 克里斯蒂安·克莱因, 彼得拉·吕格尔 申请人:霍夫曼—拉罗奇有限公司