专利名称：可调控分子马达微动力生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米器件动力引擎的纳米生物传感器领域，更具体地涉及一种可调控分子马达微动力生物传感器。另外，本发明还涉及该可调控分子马达微动力生物传感器在生物大分子、病毒分子等的检测中的应用。
背景技术：
无论电子器件的发展、化学反应机理的研究还是对生命过程的认识，当今科学技术已全面进入微纳尺度时代，奇特功能的分子马达是新型的纳米机械材料等新技术的生长点，生物马达-纳米器件的动力引擎，纳米器件要投入实用，离不开能量的传递，也就是说需要分子数量级的微小马达。
有些技术革命是以新发现的能量-机械功转化的方式为标志，例如蒸汽机的发明驱动了工业革命。分子马达(纳米马达)这一最新发现的能量转化技术，勿庸置疑地将会驱动一场不亚于工业革命的另一场革命-纳米器件革命，从而将人类带入一个崭新的纪元。
现阶段合成纳米马达刚刚处于雏形，所以目前人类还没有能力制造纳米引擎。但是大自然已经给我们提供了能够高效率地执行特定功能的生物纳米马达。生物马达产生动力的机理研究是当今科学研究最激动人心的领域。
生物膜中的F-ATP酶分子马达是多亚基复合物(如图1)，膜区部分的基本组成为a∶b∶c＝1∶2∶10~12，称为F0-ATP酶；F1在膜区外与F0相偶联，称F1-ATP酶；F1-ATP酶分子马达的组成α∶β∶γ∶δ∶ε＝3∶3∶1∶1∶1。F0F1-ATP酶当质子从膜内向膜外流动时通过F0-C环旋转启动F1的γ亚基顺时针方向而旋转运动，并在F1部分的三个催化位点上将ADP和无机磷合成ATP；反之，当F1水解时，α3β3驱动α3β3γ、ε和c环的F0，偶联启动反时针方向旋转，将质子从细胞膜外向细胞膜内转运，因此F0F1-ATP酶是一对互为可逆分子机器。在生理条件下，F0F1-ATP酶在线粒体内主要进行氧化磷酸化，在光合菌中进行光合磷酸化，分别将电子能(或光能)转化成质子梯度差，驱动ATP合成(Trends in Biochemical Sciences，卷27，2002，154-160)。
自1997年日本科学家公开世界上最小、最快、效率最高的旋转马达之后，世界上已有多个实验室重复和发展了分子马达的研究成果(J.Biol.Chem.，276，1665-1668，2001)。上述研究用荧光标记的蛋白微丝(大约1-2μM长度)连接到分子马达的γ亚基上，在荧光显微镜直接观察分子马达的旋转。但由于蛋白微丝(大约1-2μM长度)对于10nm的分子马达来说显然是很大的负荷，检测的灵敏度低，且不可调控。因此，尽管分子马达具有重要的应用前景，但是存在两个关健问题(1)缺乏对分子马达的调控技术；(2)不能灵敏地将分子马达旋转的信号传递出来。这限制了分子马达研究和应用领域的发展。
发明内容
针对上述研究背景，本发明人深入研究，用荧光探针作为分子马达旋转的灵敏信号传感器，在不需要外接很重的负荷下就可以方便地获得分子马达的旋转信号，并利用抗体技术实现对分子马达旋转功能的调控，和作为生物微动力传感器件的应用。
因此，本发明的一个目的是提供一种可调控分子马达作为微动力生物传感器件(如图2)，其包含以下部分(1)旋转马达F0F1-ATP酶，如图2中的3和4所示；(2)光能转换装置光反应中心与复合物(RC)和泛醌，如图2中的9所示；(3)电子转换装置与光能转换装置为同一体系，如图2中的11所示，例如以复合物(Chromatophores)为例，其本身含有直径为大约30-60nm的双层磷脂酶体，内有一个F0F1-ATP酶，6-11个RC光能转换复合物；(4)信号分子输出装置是由光激发与发射装置(如图2中的10所示)和荧光探针(如图2中的5所示)组成；(5)能源系统由水，ATP，ADP，无机磷，和可见光组成(如图2中的12所示)；(6)保护层双层脂膜作位内膜的功能性的保护层(如图2中的6所示)；(7)支架材料和双层脂膜的固定材料分别如图2中的7和8所示。
在本发明的一个优选实施方案中，上述荧光探针是位于膜外侧的Lipids-荧光素(DHPE，(Flurescein(N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1，2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphosphoethanolamine，triethyl-ammonium salt)(Molecular Probes公司，美国，F362)。Lipids-荧光素可以特异性地标记到细胞膜外侧，其对环境pH变化极其敏感(Biocheim，biophys，Acta 939，289，17，J.phys Chem.81，1755(1977))。当标记在细胞膜外侧时，ATP酶水解导致F1-ATP马达逆时针旋转，同时将质子向细胞膜内转运，使胞外的pH值上升，在光激发下Lipids-荧光素的荧光信号增加。反之，荧光素荧光信号降低。在本发明的另一个优选实施方案中，上述荧光探针是位于膜内侧的荧光素(Molecular Probes公司，美国，F1300，fluorescein)。当将荧光素特异性地标记在细胞膜内侧时，分子马达旋转水解导致质子向细胞膜内转运，使胞内的pH值降低；反之当ATP合成时，质子向细胞膜外转运，使胞内的pH值升高，同样可以得到类似的结果。因此用该细胞膜单向pH值荧光探针技术可以将荧光强度与分子马达的旋转(或称质子转移能力)直接相关(如图3所示)。
在本发明的一个实施方案中，分子马达旋转是由ATP水解驱动的。
在本发明的另一个实施方案中，分子马达旋转是由能转换的跨膜电化学电位差驱动的。所述跨膜电化学电位差是由光能或化学能转换的。
在本发明的另一个实施方案中，通过将F0F1-ATP酶的β亚基与该β亚基的抗体(第一抗体)结合，和备选地进一步与第二抗体(特异性识别第一抗体的IgG)结合来调控分子马达的旋转速度。
本发明还提供上述可调控分子马达微动力生物传感器在生物大分子、病毒分子等的检测中的应用，其中(1)将按照权利要求1-7中任何一项的分子马达微动力生物传感器与生物大分子、病毒分子特异性抗原的抗体结合；(2)将(1)中获得的分子马达微动力生物传感器与待测样品接触；(3)比较(2)中获得的分子马达微动力生物传感器和未与待测样品接触的分子马达微动力生物传感器在光激发下的荧光强度。
在本发明的一个实施方案中，所述分子马达微动力生物传感器是通过β亚基抗体-生物素-链酶抗生物素-生物素与生物大分子、病毒分子特异性抗原的抗体结合。
本发明提供的分子马达微动力生物传感器具有灵敏度高、可调控等优点，在经过适当修饰后(如结合生物大分子、病毒分子特异性抗原的抗体)，可以在单分子水平上检测目标生物大分子或病毒分子等。本发明的分子马达微动力生物传感器有望发展成新一代微动力单分子传感器，将使生物传感器的功能材料、纳米器件的制造技术水平跃上一个新台阶，并推动生物芯片、生物医药、环境、国防、能源、信息等众多领域的革命性进步，有极其广泛的应用和巨大的经济与社会效益。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述，但不应理解为是对本发明进行限定。
图1是F0F1-ATP分子马达的主要组成；图2是本发明分子马达微动力生物传感器的示意图(1待测的样品(抗原)；2β亚基抗体；3F1-ATP马达；4F0-ATP马达；5信号分子(荧光探针)；6脂双层；7支架；8固体表面；9光能转换装置；10光能激发装置；11电子转换装置；12能源ATP/ADP和H+；13微反应器的池体积与包裹(如96孔平板，荧光显微镜的样品池与盖等)；图3是Lipids-荧光素信号与F1-ATP酶分子马达旋转的偶联(H+浓度/荧光信号单方向标记在细胞内侧与分子马达旋转的偶联AATP水解前BATP水解后；图中小红点表示荧光分子单方向标记)；
图4是可调控分子马达微动力生物传感器的组装与工作原理；图5是样品的测定过程；图6(a)是外侧荧光标记的荧光强度与pH值之间的关系；(b)是外侧荧光标记的荧光强度与Na2NO3浓度之间的关系；(c)外侧荧光标记的荧光强度与不同抑制剂之间的关系；(d)内侧标记的荧光素的荧光强度变化与pH值之间的关系(pH从左到右4.2；5.0；5.4；6.0；6.4；7.0；7.4；7.8；8.2；8.6，在0.1mM Tricine缓冲体系中)；图7(a)是在不同负荷下F0F1-分子马达旋转速度的变化的曲线图(C对照转运120个H+/秒(计算值)；B加一抗后，60转/秒；A加一抗和二抗后，12转/秒)(图从上到下分别为A，B，C)；(b)是在不同负荷下F0F1-分子马达旋转速度变化的柱形图(10个样品的平均值)；图8是光启动旋转研究的模式图(体系建立过程中F0F1的模式图A表示完整的F0F1；B表示用EDTA(10mM)处理使F0F1失去F1-ATP亚基；C表示离心分离得到完整F1；D表示失去δ亚基后的F1；E表示F0与失去δ亚基的F1复合后的F0F1分子马达旋转实验体系)；图9表示光激发启动F0-c-F1分子马达旋转的特异性检测病毒方法的实验示意图。
图10光激发启动F0-c-F1分子马达旋转的特异性检测病毒方法结果。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明，下面通过实施例予以进一步的举例说明，但所举实施例并非是对本发明进行限定。
实施例1可调控分子马达微动力生物传感器的组装如图4所示，进行分子马达微动力生物传感器的组装。
(1)分子器件光合作用的复合物(Chromatophores)制备培养光合作用细菌(R.Capsulatus，I 20来源于中科院微生物所细胞库，(保藏号1.2359))。培养基KH2PO4，1.0g，MgCl20.5g，CaCl2，0.1g，NaCl 1.0g，醋酸钠1.0g，琥珀酸钠1g，酵母膏，1.0g，NaHCO30.5g，蛋白胨0.5g(OXOID英国)，微量元素1.0ml，维生素液1.0ml，蒸馏水1.0L，pH6.8，8磅，高压灭菌30分钟。维生素液成分生物素0.1g(进口分装)，烟酸0.35g，烟酸硫胺素(Thiamine dichloride)0.3g，泛酸钙(Ca-panthothenate)0.1g，维生素B12(Vitamin B12，0.05g，盐酸吡多胺(Pyridoxolium Hydrochloride，Fluka)0.1g，蒸馏水1.0L；微量元素成分FeCl24H2O 1.8g；CoCl26H2O 0.25g；NiCl26H2O，0.01g；CuCl22H2O 0.01g，MnCl24H2O 0.07g；ZnCl20.1g，B3PO40.5g，Na2SeO35H20.01g，NaMoO4H2O 0.03g，蒸馏水1.0L)温度30-35℃。收获细菌的培养温度为28℃，在光照(4,000Lx)下培养5-7天，5000g离心收集。载体(Chromatophores)的提取样品用TS缓冲液(50mM，Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸，Amresco进口分装)pH8.0，0.25M蔗糖；5mM MgCl2)洗涤一次，然后再加入15ml的TS缓冲液，悬浮后，加入1mg/ml的溶菌酶(sigma分装)，在冰中孵育30分钟，超声(20％振幅，Cole Parmer CPX 600超声仪13#探头，昆山市超声仪器公司KQ218型超声仪)10分钟，25,000g离心30分钟，保留上清，再将上清180,000g在4℃离心90分钟，沉淀为载色体(Chromatophores)。此复合物为含一个分子马达F0F1-ATPase，多个光转换载体(图2中部分的3，9)。
(2)荧光探针的单方向标记在上述复合物中加入荧光(商品号F-362分子探针公司荧光素DHPE(荧光素-磷脂))作为细胞外的荧光发射体，(F1300，分子探针公司荧光素，作为细胞内的探针)，剩余的通过离心(10000g/30min，4℃)洗去。
(3)双层脂膜的制备用大豆磷脂制备，将100mg纯化的大豆磷脂溶于三氯甲烷，用氮气吹干，后再加入适量的乙醚振荡，用氮气吹干，盖好密封，保存于-20℃，取一小瓶(20mg)已处理好的磷脂，加入1ml Tris缓冲液，用Cole ParmerCPX 600超声仪13#探头冰浴超声3-5分钟(振幅5％-10％之间)至悬液透明，为脂质体。
(4)光能转换装置由生物与化学分子复合材料组成如LH1RC和泛醌(光反应中心与复合物1，从光合菌R.Rubrum，ATCC No11170中提取，泛醌(Qb，Sigma，产品)纯化，按文献Nadia Gabellini等Biocheimca，Biophysica Acta，(1989)974，202-210的方法重组，或biochim.biophy.Acta，(1989)，202-210的方法重组)。
(5)支架材料与双层脂膜固定固体表面(如玻璃)，先用多聚赖氨酸涂铺，然后用生物素-AC5-sulfo-Osu(Dojindo，Japan)连接后再用链霉抗生物素-连接，双层脂膜装有-脂-生物素，(PE-生物素(Avidin公司产品)，溶于乙醇(1mg/ml，2μl)，加入到双层脂膜(20mg/ml)中约2-3分钟后，用10,0000g/30min离心一次，将装有双层脂膜的装有-脂-生物素的样品与固体表面的链霉抗生物素-连接。根据需要，用β亚基抗体与F1-ATP马达的β亚基专一性结合，用另一IgG(羊抗兔，sigma，进口分装)二抗可以特异性识别β亚基的一抗，这样就组成了一对负荷只差别三个分子的分子马达(3个β亚基)。
由此完成本发明分子马达微动力生物传感器的组装。
实施例2零负荷下分子马达微动力生物传感器的荧光信号(1)传感器检测的方法将样品分别装在玻璃表面/或装入荧光池(1ml)(日立仪器，F-4500型号)，在488nm下激发，520nm为发射波长；当样品在2mM ATP(sigma公司)启动下，本发明的分子马达将细胞外的质子向细胞内转运，F1逆时针方向旋转，可使细胞外的pH从8.0增加到9.0，这时荧光探针Lipids-荧光素组装在细胞膜外侧(或内侧)，可以方便地将信号记录下来，如果这时分子马达载重不同的负荷，如带有一分子的抗体时其旋转的速度就可以产生明显的变化，该变化用组装在细胞膜外侧(或内侧)的荧光探针Lipids-荧光素(或荧光素)就能方便地记录下来。
(2)零负荷下F1逆时针方向旋转的证明跟据分子马达工作原理，F0F1-马达为可逆机器，当ATP水解成ADP和磷时，三个β亚基分别处于三个不同的构象，三个不同的构象驱动γ亚基逆时针旋转，并且伴随着质子从细胞外向细胞内转移；反之，当跨膜质子转运通过F0驱动F1-顺时针方向旋转，并将ADP和磷合成为ATP，成为生命过程中的“货币”。因此，本体系中当ATP水解成ADP和磷时，伴随着质子从细胞外向细胞内转移；这时溶液环境中的pH值就会改变，而且随F1-逆时针方向旋转数增加，荧光值也增加。另外ATP酶的抑制剂对分子马达的旋转也会产生影响，从而影响荧光值(除非另外指出，本发明以外侧标记的荧光探针Lipids-荧光素为例，如图6(a)，(b)和(c))。
从图6(a)，(b)和(c)可以看到，探测分子马达旋转的生物传感器的探测原理是分子马达旋转速度与F0F1-分子马达直接偶联相关。图6(a)表示了荧光强度与pH直接相关；图6(b)说明荧光强度变化与Na2SO3浓度关系相关，Na2SO3是F1-ATP酶的激活剂；图6(c)不同ATP酶激活剂和抑制剂对荧光强度的影响，NaN3是F1-ATP酶的抑制剂，PNP-AMP是F1-ATP酶的抑制剂，DCCD(二环己基碳二亚胺)是F0离子通道的抑制剂，因此，上述主要抑制剂都能抑制Na2SO3激活，并与质子通道相关。说明本方法荧光探针与单方向标记与FOF1-ATP马达的偶联可以作为H+-ATP酶离子通道(分子马达)的生物传感器。
当使用内侧标记的荧光素时，可获得类似的结果，如图6(d)所示。
实施例3不同负荷下分子马达微动力生物传感器的荧光信号β亚基抗体的制备嗜热菌Bacillas，PS3的表达与β亚基纯化参照文献(科学通报，2004，(13)1342-1347)进行，将纯化的β亚基用完全佐剂以1∶1乳化后，在250g家兔背部多点免疫(开始每两周注射1ml)，一个月后，再加强免疫1-2次，得到多克隆抗体。
在实施例1中组装的分子马达微动力生物传感器基础上，用β亚基抗体与F1-ATP马达的β亚基专一性结合，用另一IgG(羊抗兔，sigma，进口分装)二抗可以特异性识别β亚基的一抗，这样就组成了一对负荷只差别三个分子的分子马达(3个β亚基)。
依据实施例2所述的检测方法，测定在不同负荷下分子马达微动力生物传感器的荧光信号(如图7(a)和7(b))。分子马达平均旋转速度的推算方法用样品取20μl长，直径0.289mm的毛细管(micropipets vwrScientific公司产品)离心15,000转/90min得到，压塑体积比为2.5∶38，计算1μl溶液的细胞为1.2×1012个，直径为60nm，已知样品的浓度和体积和pH值的变化，就可以推算出平均旋转速度(每秒转运H+数)。(C＝F2/2.3RTX β，其中β＝-Δ[H+总量]/pH，Biophysical Journal，(86)，2004，4094-4109)图7(b)进一步说明，当分子马达连接不同负荷如一抗、一抗加二抗时，其旋转速度就产生明显变化，同时荧光强度也产生明显变化。因此，通过改变分子马达的负荷就能控制分子马达的旋转，实现对分子马达的调控。
实施例4光激发分子马达的旋转和分子马达特异性检测病毒为了证明光激发驱动分子马达的旋转，用光激发跨膜质子转运启动F0调控F1旋转并检测在不同负荷条件下旋转速度的变化，我们将F1F0-ATP分子马达的结构进行如图8所示修饰。
所用材料为细菌pSWM92/DK8表达的δW28L，F1是A.E.Senior教授(美国Rechester，大学医学中心)赠送。F1的纯化和δ去除按文献SeniorJaachim Webber，Susan Wilke，Mount，和Alan E.Senior，Quantatitive Determination of Binding affinity of Subunit in E.Coli，F1-ATPase，J.B.C.272(21)18390-18396(2002)，并与去除F1的chromatophores杂交后将样品在-20℃下保存。
在该实验体系中缺少了δ亚基后，质子梯差启动F0旋转与F1偶联过程中，不能进行ATP合成，而是质子梯差的能量传递给F1产生转动量(体系中加入NaN3和ATP，目的是抑制ATP的水解)。当光启动(用550nm以上的波长，光照20分钟)光合菌中的电子转移时，并偶联质子从胞外向胞内转移，形成跨膜梯差，当停止光照后，跨膜梯差启动Fc-和F1-α3β3γ、ε旋转，该体系的旋转与F1上的负荷直接相关。当F1与禽流感病毒β亚基抗体(预先结合生物素)与链霉抗生物素-连接，(该链霉抗生物与生物素素素-F0F1-ATP马达预先结合在玻璃表面)。
另外病毒分子(禽流感病毒(H9)哈尔宾兽医研究所提供抗体，禽流感病毒样品的制备与纯化按文献(动物病毒学，科学出版社，(1997)，殷震，刘景华主编)预先与生物素连接后，加入上述F0F1-ATP马达-生物素-链霉抗生物素-生物素-病毒体系(见图10)，荧光信号观察用optonAxiovert 405M，倒置荧光显微镜，CCD Princeton instrument公司，ModelRTE/CCD-782，中科院西安精密光学研究所生产像增强器，G2 II18/18。
如图9所示，C(对照)的荧光强度在10分钟后下降大约30％，该结果说明F0驱动F1旋转，同时质子从胞内向外转运，使体系的荧光强度发生下降；DCCD，在体系中加入2mM DCCD，阻断F0的质子通导，这时体系的荧光强度在15分钟后看不到变化；病毒，禽流感病毒H9(按文献方法得到)，用禽流感病毒的抗体与生物素结合后再与β亚基抗体上的链霉抗生物素结合，洗去多余生物素，然后用禽流感病毒与禽流感病毒的抗体产生特异性的结合，用PBS洗去非特异性部分，这时虽然存在质子从胞内向外转运，但是F1的负载使F1旋转速度变慢，从而调控F0的质子通导的转运，这时体系荧光强度看不到变化。因此与光激发启动F1旋转与其负荷直接相关(上述实验以10个样品的平均值)。本实施例证明本发明的分子马达微动力生物传感器可以用于在单分子水平上检测病毒及大分子。
应当理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。
权利要求
1.一种可调控分子马达微动力生物传感器，其包含以下部分(1)旋转马达F0F1-ATP酶；(2)光能转换装置光反应中心与复合物(RC)和泛醌；(3)电子转换装置与光能转换装置为同一体系；(4)信号分子输出装置由光激发与发射装置和荧光探针组成；(5)能源系统由水，ATP，ADP，无机磷，和可见光组成；(6)保护层双层脂膜作位内膜的保护层；(7)支架材料和双层脂膜的固定材料。
2.按照权利要求1的分子马达微动力生物传感器，其中所述荧光探针是位于膜外侧的Lipids-荧光素。
3.按照权利要求1的分子马达微动力生物传感器，其中所述荧光探针是位于膜内侧的荧光素。
4.按照权利要求1-3中任何一项的分子马达微动力生物传感器，其中所述分子马达旋转是由ATP水解驱动的。
5.按照权利要求1-3中任何一项的分子马达微动力生物传感器，其中所述分子马达旋转是由能转换的跨膜电化学电位差驱动的。
6.按照权利要求5的分子马达微动力生物传感器，其中所述跨膜电化学电位差是由光能或化学能转换的。
7.按照权利要求1-6中任何一项的分子马达微动力生物传感器，其中将F0F1-ATP酶的β亚基与该β亚基的抗体(第一抗体)结合，和备选地进一步与第二抗体(特异性识别第一抗体的IgG)结合来调控分子马达的旋转速度。
8.按照权利要求1-7中任何一项的分子马达微动力生物传感器在生物大分子、病毒分子等的检测中的应用，其中(1)将按照权利要求1-7中任何一项的分子马达微动力生物传感器与生物大分子、病毒分子特异性抗原的抗体结合；(2)将(1)中获得的分子马达微动力生物传感器与待测样品接触；(3)比较(2)中获得的分子马达微动力生物传感器和未与待测样品接触的分子马达微动力生物传感器在光激发下的荧光强度。
9.按照权利要求8的应用，其中所述分子马达微动力生物传感器是通过β亚基抗体-生物素-链酶抗生物素-生物素与生物大分子、病毒分子特异性抗原的抗体结合。
全文摘要
本发明属于纳米器件动力引擎的纳米生物传感器领域，更具体地涉及一种可调控分子马达微动力生物传感器。另外，本发明还涉及该可调控分子马达微动力生物传感器在生物大分子、病毒分子等的检测中的应用。本发明用荧光探针作为分子马达旋转的灵敏信号传感器，并利用抗体技术实现对分子马达旋转的调控。本发明提供的分子马达微动力生物传感器具有灵敏度高、可调控等优点，有望发展成新一代微动力分子传感器，有极其广泛的应用和巨大的经济与社会效益。
文档编号C12Q1/04GK1789425SQ200410098929
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者乐加昌 申请人:中国科学院生物物理研究所