一种快速分离目标染色体表达序列的方法

专利名称：一种快速分离目标染色体表达序列的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速分离目标染色体表达序列的方法。
背景技术：
染色体微切割和微克隆(Chromosome microdissection andmicrocloning)是指在显微镜下，借助显微操作系统对目标染色体或染色体片段进行切割，将目标染色体或染色体片段分离出来，并克隆位于目标染色体上的DNA的技术。其应用领域不只局限于对染色体研究的细胞遗传水平，在染色体进化研究(Jamilena等，1995；Houbean等，1996)、遗传图谱的构建(Schondelmaier等，1993；Arumuganathan等，1994)、基因组物理作图、分子标记遗传连锁图谱构建(Jung等，1992；Schondelmaier等，1993)、染色体的原位杂交或染色体涂染探针(Zhou等，1999；傅俊江等，1998)等研究领域也得到广泛应用。虽然以上几方面工作已取得了一些成绩，但染色体微切割、微分离技术的真正优势并未充分利用。除非将这一工作与功能基因组研究联系起来。从这一角度来看，分离目标染色体或染色体片段的表达序列，将会使这一技术的应用更有价值。因为目标染色体上的表达序列的分离，不仅可以提供作图标记和基因的分子标记，还与功能基因组研究工作相关，并可能是分离目标染色体或染色体片段上功能基因的有效方法。目前已经有一些相关的工作报道，即在染色体微切割和微分离技术的基础上，进一步分析相应的染色体或染色体片段的表达序列。
近年来，发展了多种从基因组DNA或染色体DNA分离表达序列的方法。(1)探针筛选法。这是一种是基于常规的探针杂交直接筛选法。它主要有两种方式，一种方式是用染色体微克隆文库中的片段作为探针，在cDNA文库中筛选同源性片段，即又称为直接筛选法，另一种是利用cDNA片段作为探针对染色体微克隆文库进行筛选。该方法是以常规的点杂交为基础的，准确性应当很高，目前利用这种方法已从人及动物染色体上分离了相应的表达序列(Yokoi等，1994；Kao等，1994；Wei等，1996；Yu等，1997)。但是此法主要的缺点是涉及到大量的克隆操作及克隆杂交筛选等繁琐步骤，费工费时。(2)借助显微切割的cDNA捕获法(Microdissection-mediated cDNA capture)。在这种方法中，首先用加接头的cDNA为探针直接对染色体制片进行原位杂交，然后通过充分洗涤将染色体制片上的未杂交cDNA洗掉，再通过显微操作切割并分离目标染色体或染色体上的目标片段，分离到的目标染色体片段作为模板，用cDNA接头上的引物进行严格条件的PCR扩增，结果那些与该染色体上DNA杂交的同源性的cDNA就被扩增(Yokoyama等，1997；Kim等，2001；Gracia等，1997)。该方法操作繁琐，直接导致同源片断分离的效率。同以上方法相比，本发明使用方法在液相操作，步骤简单，后期检测准确快速，假阳性率低，表达序列分离效率高等优点。

发明内容
针对上述研究背景，本发明人深入研究，采用染色体微切割、微克隆技术，同时与同源片段特异扩增技术(Hybrid specific amplification，HSA，Lecerf F等2001)相结合，并参考抑制消减杂交(suppressionsubtractive hybridization，SSH，Diatchenko L.等，1996)技术中的相关原理与程序，建立了一个快速分离目标染色体表达序列的方法。
本发明的一个目的是提供一种分离目标染色体的表达序列的方法，包含以下步骤(1)分离目标染色体；(2)获得带有接头的目标染色体DNA；(3)获得带有另一种接头的总细胞cDNA；(4)将上述目标染色体DNA和总细胞cDNA进行同源杂交；(5)进行抑制PCR扩增同源序列，获得目标染色体上的表达序列。
在本发明的一个实施方案中，通过微玻璃针分离的方法获得目标染色体。
在本发明的另一个实施方案中，目标染色体DNA的获得是利用PCR的方法(LA-PCR或DOP-PCR方法)获得的，将获得的目标染色体DNA用限制性核酸内切酶酶切，并加连接接头。
在本发明另一个实施方案中，带有另一种接头的cDNA的获得是将提取的总细胞mRNA反转录成cDNA，并加上接头。
在本发明另一个实施方案中，目标染色体上表达序列的获得是利用单链cDNA或双链cDNA。
在本发明一个优选实施方案中，目标染色体上表达序列的获得包括利用单链cDNA进行目标染色体表达序列分离，其包含(1)利用3’端特异引物反转录第一链，获得长短不同的cDNA；(2)与目标染色体DNA合并变性再复性，加入100倍Cot1DNA封阻，形成染色体DNA和cDNA的杂交链；(3)利用染色体DNA上的接头序列和cDNA的3’端特异引物抑制PCR扩增杂交链，获得所述染色体的表达序列。
在本发明另一个优选实施方案中，目标染色体上表达序列的获得包括利用双链cDNA进行染色体表达序列分离，其包含(1)反转录合成双链cDNA，限制性核酸内切酶酶切，加连接接头；(2)与目标染色体或染色体片段的DNA合并变性再复性，加入100倍Cot1DNA封阻，形成染色体DNA和cDNA的杂交链；(3)利用染色体DNA上的接头序列和cDNA的接头序列抑制PCR扩增杂交链，获得染色体表达序列。
由于本发明的方法中应用了DNA复性动力学和抑制PCR原理，能降低染色体DNA和cDNA中高拷贝片段的数量，并可避免微切割染色体DNA扩增过程中受外源DNA的污染，还能富集低表达量的DNA片段，为目标染色体EST及新基因的分离奠定了重要基础。


下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述，但不应理解为是对本发明进行限定。
图1是利用单链cDNA分离染色体表达序列的技术路线；
图2是利用双链cDNA分离染色体表达序列的技术路线；图3是黑麦1R染色体的显微分离过程(图中黑色箭头所示为带有随体的黑麦1R染色体所在位置，白色箭头所指为分离并粘附在玻璃针上的1R染色体)；图4是染色体DNA的扩增产物的电泳结果(1.0％琼脂糖凝胶)；图5是1R染色体DNA同源的表达序列扩增产物的电泳结果(1.5％琼脂糖凝胶)，1直接用PN1扩增杂交终产物结果；2直接用PN2扩增杂交终产物结果；3杂交终产物的二轮PCR扩增结果；4分子量标记(从上至下依次为1000、750、500、250、100bp)；图6是1R染色体DNA同源的表达序列克隆的PCR产物电泳；图7杂交特异扩增终产物克隆的点杂交分析a.以黑麦苗期总cDNA为探针的点杂交结果b.以显微切割的1R染色体DNA扩增产物探针的点杂交结果c.以黑麦基因组总DNA为探针的点杂交结果，其中8A为1R DNA，8B为cDNA，8C是黑麦基因组DNA，8D是中国春小麦基因组DNA，8E是与分离得到的终产物，即1R染色体DNA和cDNA中同源序列片段，1H是空白质粒DNA，其它为用引物PN1和PN2扩增得到的克隆子插入片段的扩增产物。
具体实施例方式
为了实现上述目的，本发明的一种优选实施方式如下所示。
显微分离目标染色体，LA-PCR(linker adaptor PCR)或DOP-PCR(degenerate oligonucleotide primed PCR)方法(Johnson等1990；Wesley等，1989；Telenius等，1992)获得染色体DNA，其中优选显微分离是借助倒置显微镜使用微玻璃针分离目的染色体。将分离的染色体直接放入含有蛋白酶K反应缓冲液，浓度为50ng/μl，用1×T4DNA连接酶缓冲液配制。在37℃水浴中温育以便蛋白酶K充分消化去蛋白，时间为4小时，然后70℃温育20min使酶失活。如果采用DOP-PCR的方法，即可放入-20℃备用。如果采用LA-PCR方法，则在原体系中加入限制性核酸内切酶Sau3A-I进行酶切，用量为0.02U，反应时间为3小时，70℃ 20min使酶失活。加入制备好的浓度为5ng/μl的接头2μl，其中使用的接头为Sau3A接头，用1×T4连接酶缓冲液和20mmol/L ATP配制成5ng/μl的工作浓度。Sau3A接头是由23mer和19mer的两个寡核苷酸片段形成，制备接头时，先将23mer寡核苷酸磷酸化，与等摩尔19mer寡核苷酸共变性退火制成。加入T4DNA连接酶0.5μl(3U/μl)，连接反应最终体积为24.5μl。16℃连接过夜后，70℃ 20min失活连接酶。针对分离染色体的来源，要对蛋白酶K消化蛋白时间进行摸索，以普通小麦为材料，消化4小时为宜。
将上述处理的染色体进行两轮LA-PCR扩增或DOP-PCR扩增获得染色体DNA。LA-PCR第一轮底物为带有接头的染色体DNA，以对应Sau3A接头的19mer为引物进行35个循环扩增。第二轮扩增是取5μl第一轮产物为底物，扩增25个循环。DOP-PCR第一轮底物为经蛋白酶K处理的染色体，以简并引物进行35个循环扩增。第二轮扩增取5μl第一轮产物为底物，扩增25个循环。其中，为了有效避免外源DNA的污染，上述各步骤尽量保证在无菌条件下进行。载玻片及盖玻片事先在洗液或盐酸∶乙醇＝1∶9中浸泡一天以上，双蒸水冲洗干净后再置于95％乙醇中，擦干，120℃烘烤2小时待用。吸管、滤纸、刀片均经高压灭菌，卡宝品红染液经抽滤灭菌后，紫外灯下照射1小时以上，在超净工作台中进行压片。PCR扩增使用的Eppendorf管、Tip头等均经过高压灭菌，再紫外线照射处理30min以上。无菌水、酶解混合液、人工接头、蛋白酶K等酶液等溶液均经抽滤或紫外线灭菌处理。
上述过程设两种严格对照阳性对照加入约10pg基因组DNA为初始底物，阴性对照中不加任何底物，其它所有操作过程同上。这是监控试验效果和污染情况不可或缺的一步。
杂交前处理染色体DNA。合并适量第二轮PCR产物于离心管中，加等体积酚/氯仿，11000g离心1分钟，取上清后再用等体积酚/氯仿抽提，抽提后上清用氯仿同样方式抽提一次，取上清加1/10体积3MNaAc(pH5.8)，两倍乙醇于-20℃沉淀2小时，16000g离心10分钟，70％乙醇洗一次，室温干燥后溶于10μl去离子无菌水中。在50μl体系中，用10U Sau3A酶切染色体DNA(1μg)37℃酶切过夜，70℃灭活20min，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于适量去离子无菌水中(300ng/μl)，加入1μl接头(接头一)，接头浓度10μM，接头采用Clontech公司的消减抑制杂交试剂盒中接头，在10μl体系中，加入0.5U T4DNA连接酶(New England Biolabs)，16℃连接16小时，72℃灭活10min，-20℃贮存备用。利用LA-PCR方法获得染色体DNA时，使用23mer和19mer序列制成的接头，用19mer为引物，该引物退火温度较低，能提高扩增效率。但在后面的抑制PCR中，为了达到抑制效果和提高扩增特异性，所以对染色体DNA进行二次酶切，更换接头为接头一。
cDNA准备。提取一定时期阳性植株或经过特殊处理后阳性植株RNA，若利用单链cDNA分离染色体表达序列，第一链合成使用5’连接M4-13序列的Oligo-dT为引物，第一链合成后纯化，稀释约300ng/μl备用。若利用双链cDNA分离染色体表达序列，则继续合成第二链cDNA并进行末端补平。将纯化的双链cDNA溶于适量去离子水中，在50μl体系内，用10-15U限制性核酸内切酶Sau3A消化过夜，70℃20分钟灭活限制性内切酶，然后经过酚/氯仿纯化，乙醇沉淀，溶于适量去离子水中(300ng/μl)，加入1μl接头(接头二)，接头浓度10μM，接头采用Clontech公司的消减抑制杂交试剂盒中接头，在10μl体系中，加入0.5U T4DNA连接酶(New England Biolabs)，16℃连接16h，72℃灭活10min，-20℃贮存备用。
分离目标染色体上的表达序列。
同源杂交。将合成的单链或双链cDNA约300ng、连好接头一的附加染色体扩增产物约500ng及100倍的Cot1共同乙醇沉淀，溶于4μl杂交缓冲液(50mM Hepes，pH8.3；0.5M NaCl；0.02mM EDTA，pH8.0；10％(wt/vol)PEG 8000)，上覆石蜡油，98℃变性1.5min，68℃杂交10小时。10小时后加入新鲜单链cDNA或双链cDNA约300ng(溶解在1×杂交缓冲液中)，继续在同样条件下杂交10小时。杂交结束后用稀释缓冲液(20mM Hepes，pH8.3；50mM NaCl；0.2mM EDTA)稀释至100μl，72℃加热稳定7分钟，-20℃贮藏。
抑制PCR。在PE480(Perkin Elmer，Norwalk，Conn.，USA)上进行，两轮反应为25μl体系，程序同Clontech消减杂交PCR程序(PCR-Select cDNA Subtractive Kit)，其中，若利用单链cDNA分离染色体表达序列，第一轮引物用P1和M4-13，第二轮用PN1和M4-13扩增。若利用双链cDNA分离染色体表达序列，第一轮引物用P1和P2，第二轮用PN1和PN2扩增。两轮程序均加单引物扩增做对照。
表达序列筛选。取纯化的染色体第二轮PCR产物1μl(约100ng/μl)、1μl T4DNA连接酶缓冲液、1μlPGEM-T载体(promega)(60ng/μl)、T4DNA连接酶(New England Biolabs)1μl(3U/μl)、无菌水补至终体积10μl，混匀，4℃连接16小时。转化大肠杆菌，挑获得的白色菌落，常规方法提取质粒，用引物PN1和M4-13或PN1和PN2进行扩增鉴定，插入片段确为这两个引物扩增得到的片段。PCR扩增释放的克隆片段，各取1μl PCR产物点在Hybond+尼龙膜(Amersham公司)上，平行点三张膜，分别用分离染色体DNA，阳性植株的cDNA及酶切的基因组DNA为探针与膜杂交。点膜后，将DNA面朝上依次放在以下溶液中饱和的滤纸上碱变性液(1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH)变性5分钟；中和液(3mol/LNaCl，0.5mol/L Tris HCl，pH7.4)8分钟；2×SSC 5分钟。室温下稍干，DNA面朝下在紫外透射仪(BIO-RAD，USA)上照射1分钟，进行杂交，探针的标记和Southern杂交过程参照B.M.公司的“The Guide Bookto DIG System User”。选取阳性的克隆测序。
注引物和接头说明1.染色体DNA获得使用的接头，由23mer和19mer引物制成，在LA-PCR扩增时使用19mer做为引物。在DOP-PCR时使用6MW为引物。
序列如下23mer引物5′-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3′19mer引物5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′23mer和19mer合成接头如下5′-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3′3′-GACTCGAGCTTAAGCTGGG-5′6MW引物5′-CCGACTGATCNNNNNNATGTGG-3′(N＝A，T，C，G)2.杂交时染色体使用引物和接头接头一，
5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′3′-CCCGTCCACTAG-5′P1，5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′PN1，5′-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′3.杂交时cDNA使用接头接头二，5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′3′-CCTCCCGCCACTAG-5′P2，5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3′PN2，5′-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′4.单链cDNA 5′连接M4-13序列M13-4，5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′实施例黑麦1R染色体表达序列的分离一材料和方法1.材料及染色体标本制备材料为黑麦(S.cereale L)(中科院遗传与发育研究所提供)。黑麦具大型染色体，约为8～14μm，主要由具中部和近中部着丝点染色体组成，2n＝14，其中只有一对1R染色体具有随体。
染色体标本制备1)将黑麦种子在温室(25℃)中萌发，当根长至0.5～1cm时即可用于预处理。在0～4℃的冰水中处理萌发的种子24小时，即可获得足够的中期分裂相。2)将预处理过的萌发种子置于95％乙醇∶冰醋酸(3∶1)的卡诺固定液中固定10分钟，再转至70％乙醇中，4℃保存待用。3)将种子在灭菌的蒸馏水中洗净，切取根尖。将根尖置于2％纤维素酶(Onozuka，R-10，Serva)与2％果胶酶(Y-23，Serva)的混合液中，37℃酶解1小时；之后用无菌蒸馏水洗三次，卡宝品红染色压片，镜检。液氮冻片法去盖片，直接或气干后用于显微切割操作。
2.引物及接头1)用于染色体DNA扩增的LA-PCR使用引物和接头参照Albani等人(1993)设计的2条引物23mer引物5′-GATCCTGAGCTCGAATTCGACCC-3′；19mer引物5′-GGGTCGAATTCGAGCTCAG-3′，引物1磷酸化后，加入引物2，90℃变性2min，55℃退火20min，冷却至室温成接头。
2)用于染色体DNA扩增的简并引物该引物是在简并引物6MW(Telenius等，1992)基础上设计的。序列为，DOP-引物5′-CCGACTGATCNNNNNNATGTGG-3′3)用于杂交样品的接头接头一，5′-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′3′-CCCGTCCACTAG-5′接头二，5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′3′-CCTCCCGCCACTAG-5′上述接头及引物是均是应用于SSH中的接头和引物(Diatchenko等，1996)，但接头由原来的平端改为Sau3A的GATC粘端。
4)扩增PCR引物P1，5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′P2，5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3′PN1，5′-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′PN2，5′-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′M13-4，5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′5)接头制备将用于合成接头的寡核苷酸片段用TE溶液溶解，等摩尔混合后加热到70℃，在2小时内冷却到10℃。-20℃保存。
3黑麦1R染色体的显微分离及其DNA的PCR扩增1)染色体显微分离取直径1mm左右的细玻璃棒，在微型酒精灯上拉制成直径为1～3μm针尖的玻璃针，同时针尖具120℃左右的弯度。将选好的制片置于液氮中速冻数秒，取出后用刀片迅速揭掉盖片，气干待用。制好的玻璃针固定在Leitz显微操作器(Germany)上，同时置气干的制片于倒置显微镜下，镜下选取所需分裂相。低倍镜下缓慢下针，逐级换上高倍镜，调节针尖的位置，最后针尖对准所要分离的染色体进行来回拨离，使其从分裂相中脱落，并粘附在玻璃针尖上。慢慢通过显微操作器提升玻璃针，之后将粘附有染色体的针尖折断于含有10μl反应缓冲液的20μl的PCR管中，高速离心数秒钟，-20℃存放待用。
反应缓冲液用1×Taq缓冲液(Promage)配制，含50ng/μl蛋白酶K(BM)。
2)微分离染色体的体外扩增(1)酶解去蛋白装有染色体的PCR管放于37℃酶解4h后70℃处理品20min失活蛋白酶K。
(2)酶切加接头加入限制性核酸内切酶Sau3A-I进行酶切，用量为0.02U，反应时间3小时，70℃ 20min使酶失活连接，加入Sau3A接头2μl(5ng/μl)，T4DNA连接酶0.5μl(3U/μl)，连接反应最终体积为24.5μl。16℃连接过夜后，70℃20min失活连接酶。
(3)PCR扩增按下列体系加入反应成分10×Taq酶缓冲液5.0μl，2.5mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs 4.0μl，引物(对于LA-PCR引物为19mer引物，对于DOP-PCR引物为简并引物6MW)0.7μl(330ng/μl)，Taq酶0.5μl(5U/μl)，最后用紫外处理过的无菌水补至终体积50μl混匀。
PCR在Biometra PCR仪(Germany)上进行，DOP-PCR程序如下第一轮PCR程序为94℃预变性5min，接着进入94℃ 1min，30℃ 1.5min，72℃ 3min，其中30℃变化至72℃需3min。5个这样的循环后接着进入25个循环94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1.5min，并且每圈自动延伸1s；最后72℃延伸10min，4℃保温。LA-PCR程序如下94℃预变性5min，接着进入94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 3min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保温。
第二轮PCR扩增是取1/10(5μl)的第一轮PCR产物作为模板，反应体系同上，PCR程序为94℃预变性5min；接着25个循环94℃ 1min，55℃ 1.5min，72℃ 3min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
如电泳检测第二轮扩增信号仍很弱，可进行第三轮扩增。即取1/10的第二轮PCR产物作为模板，其他条件同第二轮扩增。
(3)染色体DNA扩增纯化合并PCR产物于离心管中，加等体积酚/氯仿，11000g离心1分钟，取上清后再用等体积酚/氯仿抽提，抽提后上清用氯仿同样方式抽提一次，取上清加1/10体积3M NaAc(pH5.8)，两倍乙醇于-20℃沉淀2小时，16000g离心10分钟，70％乙醇洗一次，室温干燥后加10μl去离子无菌水溶解，保存于-20℃。
4.黑麦苗期RNA分离和cDNA合成1)TRIzol法提取总RNA(TRIzol Kit，GIBCOL)，按产品说明进行50-100mg样品+1mL TRIzol研磨成匀浆；15-30℃温浴5min，加0.2mL氯仿，封好盖，用手激烈摇动15s，15-30℃温温浴2-3min，低温离心15min(＜12,000xg)；上相移入新管，加0.5mL异丙醇沉淀RNA，15-30℃温浴10min，离心10min(＜12,000xg)；去上相，加75％乙醇(＞1mL)涡悬洗沉淀，低温离心5min(＜7,500xg)气干或真空抽干(忌真空离心，不要干透)，枪头上下吹打溶于180μl不含Rnase的水。
2)cDNA合成(1)反转录反应合成单链cDNA(Takara RNA PCR kit(AMV)ver 2.1)A按下列反应组成调制反应液MgCl224μl10×RNA PCR缓冲液 2μl
不含Rnase的ddH2O8.5μldNTP混合物 2μlRnase抑制剂 0.5μlAMV逆转录酶 1μlOligo dT-接头引物1μl样品(1μg总RNA) 1μl20μl/样总共品B按以下条件进行反转录反应42℃ 15min～30min99℃ 5min5℃5min经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于去离子无菌水中(~300ng/μl)，-20℃贮存备用。
(2)双链cDNA合成利用双链分离表达序列，必须对总RNA纯化，mRNA分离采用Stratagene公司的mRNA分离试剂盒分离纯化，程序如下(i)65℃加热RNA样品5min，置冰上，加入20μl 10×样品缓冲液使样品缓冲液终浓度达到1×。预热洗脱液到65℃；(ii)取下纯化柱两端盖，拉出10ml注射器内柄，将注射器与纯化柱连接，以每两秒一滴的速度将贮存的缓冲液推出；(iii)取下注射器，向纯化柱内加入200μl高盐缓冲液，以每两秒一滴的速度推出高盐缓冲液直到排净。重复(iii)；(iv)将RNA样品加入纯化柱，以每两秒一滴的速度推出到一个DEPC处理过的1.5ml离心管中。将过柱回收的样品重新按(iv)步骤过柱；(v)向纯化柱内加入200μl高盐缓冲液，以每秒一滴的速度推出高盐缓冲液，重复(v)；(vi)用低盐缓冲液以每秒一滴的速度洗三遍，每次200μl；(vii)用200μl已经预热到65℃的洗脱液以每秒一滴的速度洗脱RNA，用DEPC处理过的1.5ml离心管回收，置冰上；
(viii)紫外分光光度计测260和280nm的读数，260/280值为2时，样品很纯；(ix)向样品中加入500μl预冷的乙醇，-20℃过夜；(x)用冷冻离心机以12000rpm，4℃离心30min，70％乙醇洗沉淀，沉淀干燥后，溶于20μlDEPC处理过的水中。
取mRNA 2μg，用OligoD(T)Primer进行cDNA合成(ZAP-cDNASynthesis kit，Stratagene)。
A.cDNA第一链合成(i)预热37℃水浴；(ii)冰上融化所有非酶的第一链试剂，简短涡悬、离心使药品汇于管底；(iii)冰上建立如下体系(按顺序)5.0μl 10×Buffer、3.0μldNTP Mix、2.0μl Link-Primer(1.4μg/μl)、17.5μl DEPC-H2O、1.0μl Rnase Block Ribonuclease Inhibitor(40U/μl)；(iv)混匀，稍离心5s，加上经70℃水浴保温15min后立即置冰上变性5min的mRNA，轻轻混匀，室温下退火10min；(v)加入1.5μl MMLV-RT(50U/μl)终体积为50μl；(vi)轻轻混匀，稍离心汇于管底；(vii)37℃温浴1-1.5h；(viii)准备16℃水浴；(ix)1h后，从37℃水浴中取出第一链反应置冰上。
B.cDNA第二链合成(i)冰上融化所有非酶的第二链试剂，简短涡悬、离心使药品汇于管底；(ii)在第一链反应体系中顺序加入20μl 10×Buffer、6.0μl dNTPMix、114μl DEPC-H2O、2.0μl Rnase H(1.5U/μl)和11μl DNA polymeraseI(9.0U/μl)；(iii)轻轻混匀，稍离心汇于管底，16℃温浴2.5h，注意温度一定不要大于16℃，否则易形成发夹结构；(iv)第二链反应2.5h后，立即置冰上。
C.cDNA末端补平(i)冰上加下列试剂23μl dNTP Mix，2μl Pfu DNA polymerase(2.5U/μl)；(ii)快速涡悬简短离心后，72℃温浴30min，不要超过30min；(iii)反应结束后，加200μl酚/氯仿[1∶1(v∶v)]抽提一次，室温高速离心2min，上清转入另一新离心管；(iv)用等体积氯仿抽体一次，转上清于另一新管；(v)加20μl 3M NaAc，400μl 100％乙醇，混匀，-20℃过夜；(vi)4℃，12000rpm离心1h，收集cDNA沉淀，70％乙醇轻轻洗，不要混合和涡悬；(vii)全速离心2min，吸出乙醇，吹干沉淀；(viii)沉淀重悬于10μl无菌去离子水中，-20℃备用。
5.利用液相杂交和PCR方法获得黑麦1R染色体上cDNA片段1)杂交样品制备取染色体DNA和双链cDNA各1μg，分别于50μL体系用10U的Sau3A酶(Promage)于37℃酶切过夜。70℃ 20分钟灭活限制性内切酶。取酶切产物(约300ng)、1μl接头，接头浓度10μM，接头采用Clontech公司的消减抑制杂交试剂盒(Cat.No.637401)中接头，在10μl体系中，加入0.5U T4DNA连接酶(New England Biolabs)，16℃连接16h，72℃灭活10min，-20℃贮存备用。其中染色体DNA用接头一连接，cDNA片段用接头二连接。连接完毕后，染色体DNA中加入100倍Cot1DNA经氯仿/酚抽提后共同乙醇沉淀。利用单链cDNA分离表达序列时，为了获得3′端信息，不进行酶切，只对染色体DNA进行酶切，其余处理同双链。
2)杂交将合成的单链或加了街头的双链cDNA约300ng、连好接头的附加染色体扩增产物约500ng及100倍的Cot1共同乙醇沉淀，溶于4μl杂交缓冲液(50mM Hepes，pH8.3；0.5M NaCl；0.02mM EDTA，pH8.0；10％(wt/vol)PEG8000)，上覆石蜡油，98℃变性1.5min，68℃杂交10h。10h后加入新鲜单链cDNA或双链cDNA约300ng(溶解在1×杂交缓冲液中)，继续在同样条件下杂交10h。杂交结束后用稀释缓冲液(20mMHepes，pH8.3；50mM NaCl；0.2mM EDTA)稀释至100μl，72℃加热稳定7分钟，-20℃贮藏。
3)杂交样品的PCR扩增在PE480上进行，两轮反应为25μl体系，程序同Clontech消减杂交PCR程序，其中，若利用单链cDNA分离染色体表达序列，第一轮引物用P1和M4-13，第二轮用PN1和M4-13扩增。若利用双链cDNA分离染色体表达序列，第一轮引物用P1和P2，第二轮用PN1和PN2扩增。两轮程序均加单引物扩增做对照，看抑制效果。模板为1μL已稀释杂交DNA样品，外侧引物各1μL(5μM)22μL PCR master mixture prepared usingPremixEX(Takara).PCR程序为72℃末端补平10min，30PCR循环(94℃ 30秒，68℃ 30秒，72℃ 1.5分钟)。72℃延伸7分钟。扩增产物用TE缓冲液稀释10倍，取1μL稀释的PCR产物作为模板，按第一轮的PCR条件进行15-25个循环的扩增，引物则改用接头内侧的引物。
6.扩增产物的克隆扩增产物利用T-vector(T-，Promage)克隆，转化子提取质粒，用引物PN1和M4-13或PN1和PN2进行扩增鉴定，插入片段确为这两个引物扩增得到的片段。
1)与载体的连接反应本实验采用的载体是从Promega公司购买的pGEM-T载体。由于这种载体的插入位点3’端匀具突出的T(胸苷)，可大大提高其与PCR产物的连接效果(有些Taq聚合酶常在扩增片段的3’端加上一个与模板无关的A(腺苷))。同时PGEM-T载体也具多克隆位点，方便了插入片段的释放。在进行连接反应时，取纯化的染色体PCR产物1μl(约100ng/μl)、1μlT4DNA连接酶缓冲液、1μl PGEM-T载体(60ng/μl)、T4DNA连接酶1μl(3U/μl)、无菌水补至终体积10μl，混匀，4℃连接16h。
2)大肠杆菌感受态细胞的制备活化E.coli菌株DH5α(中科院遗传与发育研究所提供)。从平板上挑取单菌落于10ml LB液体培养基中，37℃摇床上培养过夜。次日，取1ml菌液加入到100ml新鲜LB培养基中，37℃快速摇动培养2～3h。D当OD值达到0.5～0.6时，冰浴菌液30min。6000rpm离心5min收集菌体。弃上清，加入10ml预冷的无菌CaCl2(0.1mol/L)溶液悬浮细胞。冰浴15min。6000rpm离心5min。弃上清，将菌体细胞重新悬浮于2ml的CaCl2(0.1mol/L)溶液中。分装到预冷的Eppendorf管中，200μl/管。
3)连接反应产物的转化取连接产物1μl于200μl大肠杆菌感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min。42℃水浴热击90s，立即置冰浴中1～2min。加入800μl LB液体培养基，37℃保温1小时(可置于37℃水浴中或37℃ 150rpm的摇床上)。同时在Amp(100g/L)的LB固体平板上均匀涂布40μl X-gal(20μg/μl)和4μl IPTG(200μg/μl)溶液。温育之后，从1mL菌液中，取100μl涂布于平板上。37℃培养过夜。重组克隆子的鉴定。
经培养，在含IPTG和X-gal(32g/L)的Amp(100g/L)LB平板上，出现了白色菌落和蓝色菌落，白色菌落为重组子。
7.扩增产物及其克隆片段的PCR扩增鉴定对扩增产物及克隆片段利用其接头上的内侧单个引物进行扩增，同时应用两个引物扩增才能得到片段，而单用一个引物不能扩增，则能证明扩增片段及克隆是来源由两DNA样品中同源杂交的产物。
8.点杂交法对扩增产物及克隆片段分别用地高辛标记的显微分离染色体DNA的扩增产物和总cDNA作探针进行斑点杂交检测，以进一步确定扩增产物及克隆片段是否来自显微分离染色体的DNA扩增产物。
1)点膜随机挑选的克隆子的PCR扩增产物DNA逐一点在划有方格的Hybond+尼龙膜(Amersham)上。用镊子将膜转入一培养皿中、其底部具有浸润过变性液(0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl)的滤纸上，放置5min。再将膜转移至浸湿了中和液(1.5mol/L NaCl，0.5mol/L Tris.Cl，pH7.4)的滤纸上，放置8min。将膜转移至浸湿了2×SSC的滤纸上，放置5min。取出后放在干的滤纸上室温下稍干，DNA面朝下在紫外透射仪上照射1分钟，备用；2)探针标记按产品说明进行(DIG DNA Labeling and DetectionKit，Boehringer Mannheim)
取1μg左右的待标记DNA(染色体DNA、cDNA、EcoR I酶切黑麦基因组DNA)，加无菌双蒸水至15μl，沸水中煮10min，并迅速置冰上冷却。在上述相同的Eppendorf管中加入六核苷酸混合液2μl，10×dNTPs(1mmol/L dATP，1mmol/L dCTP，1mmol/L dGTP，0.65mmol/L dTTP，0.35mmol/L DIG dUTP，pH7.5)2μl，Klenow酶1μl(2U/μl)，混匀后，37℃反应过夜。加入2μl 0.2mol/L EDTA(pH8.0)终止反应。加入2.5μl 4mol/LLiCl和75μl预冷的无水乙醇混匀，-20℃放置2h以上。12000rpm离心15min，70％冷乙醇冲洗。风干DNA沉淀，并溶于50μl TE中(pH8.0)；3)预杂交在杂交盒中，放入杂交尼龙膜，并加入适量的DIG杂交液(5×SSC，0.1％ N-lauroylsarcosine，0.02％SDS，10％封阻剂)，65℃保温至少1h；4)杂交在100μl的杂交液中加入适量探针混匀，沸水中变性5min，并迅速置于冰上。倒去预杂交液，加入适量的杂交液和已变性的探针，摇匀(加入杂交液的量要根据膜的大小而定)。用胶布封好杂交盒，65℃杂交过夜；5)洗膜倒去杂交液，室温下2×SSC、0.1％SDS溶液中洗2次，每次5min。65℃、0.1×SSC、0.1％SDS溶液中洗两次，每次15min；6)检测洗后的杂交膜在马来酸缓冲液中(0.1mol/L马来酸、0.15mol/L NaCl，pH7.5)浸洗1～5min。加入适量(1ml/cm2)1×封阻液(1％封阻剂溶于马来酸缓冲液中)，反应30min。用1×封阻液稀释地高辛碱性磷酸酶偶联抗体(1∶10000)至75mU/ml。将膜置于适量抗体溶液中室温反应30min。用马来酸缓冲液洗膜2次，每次15min。将膜转移至检测缓冲液中(0.1mol/L Tris.Cl，0.1mol/L NaCl，50mmol/L MgCl2，pH9.5)平衡2～5min。加入适量(0.1ml/cm2)的显色液(NBT和X-phosphate)，同时显色过程避光且切勿振荡。显色适当后加入双蒸水或TE缓冲液终止显色反应。拍照、记录结果。
二结果
1.技术体系的确定本发明基本路线如图1和图2所示图2为显微切割分离的染色体DNA扩增产物和双链cDNA用Sau3A酶切，分别加上不同的接头即接头1和接头2，分别变性后再合并复性，结果在最后的杂交体系中少量的单链外，将会产二类杂交链，一是由同一样品来源的DNA链复性产生的，另一种是不同样品来源的同源片段复性得到的杂交链。
接下来将复性的片段用Taq酶补平接头，用接头外侧的引物进行扩增，则未复性的单链不能被扩增，而同一来源的DNA复性产生的双链两侧为同一种接头，造成片段两侧有较长的互补序列，在PCR扩增过程中易于形成所谓的锅柄结构(panhandle)并抑制了正常的扩增反应，只有不同来源的DNA复性产生的双链两侧是不同的接头，补平后不会产生互补序列并可正常扩增，因此通过这一方法就可以选择地扩增出两DNA样品的同源序列。
由于本实施例中将显微切割染色体DNA和总cDNA作为样品，所以通过这种HSA可以扩增得到显微切割染色体DNA和总cDNA间的同源序列，这就是我们所要分离的染色体上的表达序列(图2)。
利用单链cDNA与切割染色体DNA杂交获得目标染色体上表达序列技术路线与利用双链cDNA与切割染色体DNA杂交获得目标染色体上表达序列技术路线类似(图1)，只是单链cDNA不经过酶切。
2.黑麦1R染色体的显微分离及其DNA的PCR扩增按照前述方法，在显微镜下用微细玻璃针可分离获得黑麦1R染色体，见图3。利用PCR方法可获得黑麦1R染色体DNA，见图4。
3.1R染色体上表达序列片段的扩增及克隆按材料和方法中的程序得到了染色体DNA和cDNA中同源的杂交片段扩增产物，获得的扩增产物大小在100-500bp之间(图5)。扩增片段用T-vector载体克隆，克隆子的鉴定直接利用PN1，PN2或PN1和M4-13进行PCR验证，发现插入片段在100-500bp之间(图6)。
4.扩增产物及克隆片段来源鉴定对产物及克隆的进一步分析是以地高辛标记的显微分离1R染色体DNA和总cDNA作为探针对扩增产物及克隆片段进行斑点杂交，检测结果显示除作为对照的空载质粒DNA没有杂交信号外，其它克隆子扩增片段均有杂交信号，显示克隆片段与1R染色体DNA和cDNA同源，进一步证实了克隆的正确性(图7，a，b)。
为分析克隆的片段在基因组中的拷贝数，用地高辛标记的黑麦基因组DNA作为探针对克隆片段进行斑点杂交，结果表明59个克隆中，只有一个克隆(6E)有较强的杂交信号，这表明它应是多拷贝序列(＜2％)，其它58个克隆均无杂交信号，为单低拷贝片段的克隆(＞98％)。这与单染色体DNA文库中单低拷贝克隆比例(约50％)相比高得多(图7，c)。
随机挑选一个克隆测序，测序结果表明，此表达序列为硫氧化还原蛋白基因(Secale cereale thioredoxin-like protein(Trx)mRNA)，该基因位于黑麦的1R染色体上，序列如下。
1TTTTTTTTTT TTCACAAAAC TAGCATTTTA CCAGCAGGGT CATCTTACAG TTTCACAGCA61 ATGCATATG GGCGTCGCAA AATTGTAAAA CATTGTCTAG ACGGAGAAGA CACGGAAACT121 GTACACCAGG AAACTATCAT GCAACACACA AAACACACAA GCATGGCAGC CAGATATAT181 AAGCCATGAC AAGCTGGCTC TGTTCTAATT CTGTAGCATG GTTCAACTGC CATCACCAAG241 AGCTTGTACT TTCTTCTCGA GCTCAGGTTT GTTGGCGCCG ACGAGCTTGT CGATC应当理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。
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权利要求
1.一种分离目标染色体的表达序列的方法，包含以下步骤(1)分离目标染色体；(2)获得带有接头的目标染色体DNA；(3)获得带有另一种接头的总细胞cDNA；(4)将上述目标染色体DNA和总细胞cDNA进行同源杂交；(5)进行抑制PCR扩增同源序列，获得目标染色体上的表达序列。
2.根据权利要求1的方法，其中通过微玻璃针分离的方法获得目标染色体。
3.根据权利要求1或2的方法，其中目标染色体DNA的获得是利用PCR的方法(LA-PCR或DOP-PCR方法)获得的，将获得的目标染色体DNA用限制性核酸内切酶酶切，并加连接接头。
4.根据权利要求1-3中任何一项的方法，其中带有另一种接头的cDNA的获得是将提取的总细胞mRNA反转录成cDNA，并加上接头。
5.根据权利要求1-4中任何一项的方法，其中目标染色体上表达序列的获得是利用单链cDNA或双链cDNA。
6.根据权利要求5的方法，其中目标染色体上表达序列的获得包括利用单链cDNA进行目标染色体表达序列分离，其包含(1)利用3’端特异引物反转录第一链，获得长短不同的cDNA；(2)与目标染色体DNA合并变性再复性，加入100倍Cot1DNA封阻，形成染色体DNA和cDNA的杂交链；(3)利用染色体DNA上的接头序列和cDNA的3’端特异引物抑制PCR扩增杂交链，获得所述染色体的表达序列。
7.根据权利要求5的方法，其中目标染色体上表达序列的获得包括利用双链cDNA进行染色体表达序列分离，其包含(1)反转录合成双链cDNA，限制性核酸内切酶酶切，加连接接头；(2)与目标染色体或染色体片段的DNA合并变性再复性，加入100倍Cot1DNA封阻，形成染色体DNA和cDNA的杂交链；(3)利用染色体DNA上的接头序列和cDNA的接头序列抑制PCR扩增杂交链，获得染色体表达序列。
8.根据权利要求6或7的方法，其中使用的封阻Cot1DNA是染色体DNA浓度的100倍。
9.根据权利要求6-8中任何一项的方法，其中合并变性温度为98℃，反应时间为1.5分钟。
10.根据权利要求6-9中任何一项的方法，其中复性温度为68℃，时间为10小时。
全文摘要
本发明涉及一种分离目标染色体上表达序列的方法，其包含分离目标染色体；获得带有接头的目标染色体DNA；获得带有另一种接头的总细胞cDNA；将上述目标染色体DNA和总细胞cDNA进行同源杂交；进行抑制PCR扩增同源序列，获得目标染色体上的表达序列。该方法能快速有效地获得目标染色体的表达序列，具有周期短和操作方便的优点。
文档编号C12N15/10GK1789417SQ200410098959
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月17日 优先权日2004年12月17日
发明者胡赞民, 姜淑梅, 石锐, 周若楠, 陈宇红, 胡军, 尹维波 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所