专利名称：一种100bp梯度核糖核酸分子量标志物及其制备的制作方法
技术领域：
本发明是使用聚合酶链反应(PCR)技术，制备100bp梯度的DNA分子量标志物，属于分子生物学试剂制备领域。
背景技术：
在DNA合成及各种方式的基因操作过程中，需要对合成的或进行操作的DNA分子大小变化进行监测，常用的方法是通过将待测DNA分子与一种已知分子量的DNA混合标准物质同时进行电泳，通过比较待测DNA分子与DNA分子标准物质在电泳过程中的迁移程度来判断待测DNA分子的大小。因此，需要制备一些已知分子量的标准DNA。制备标准DNA的方法有多种化学合成法通过化学反应的方法将4种不同的脱氧核糖核苷酸腺嘌呤(dATP)，鸟嘌呤(dGTP)，胞嘧啶(dCTP)，胸腺嘧啶(dTTP)结合在一起，合成目标大小的DNA片段，该方法操作十分繁琐，效率极低，合成的DNA长度受到严重的限制，一般可合成DNA的长度不超过400bp，大分子量的DNA片段无法直接用化学合成法来合成。
片段连接法先用化学合成法合成一些小分子量的DNA分子，再用酶促连接反应将小分子DNA一个一个逐步连接起来，形成不同大小的DNA分子。理论上讲可以制备各种大小的DNA分子，但操作却十分繁琐，无法实现大规模制备。
酶解法用一种或两种限制性内切酶对噬菌体DNA(如φχ174)，质粒DNA(PBR322)进行切割，产生不同大小的DNA片段，作为分子量标志，该方法的缺点是酶切产生的DNA片段大小受到所用的限制性酶种类的限制，DNA分子的制备和纯化过程比较复杂，成本高且产率低。
聚合酶链反应法DNA聚合酶链反应已广泛用于基因克隆和DNA片段的制备。经查阅国内专利文献，尚未发现有以质粒PBR322为模板，设计11对特异性引物，通过聚合酶链反应，制备由11条DNA带组成的100bp梯度DNA分子量标志物的报道。
发明内容
本发明的目的是基于聚合酶链反应的原理提供一种DNA分子量标志物及其快速制备的方法。本发明制备的产物作为分子量参照物，用于分子生物学实验中对DNA分子大小的变化进行监测。
本发明的技术方案本发明的100bp梯度DNA分子量标志物是由100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp，共11条DNA条带组成的混合物，溶于三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠组成的缓冲液(TE溶液)中，每条DNA带的终浓度为4ng/μl。在进行DNA电泳时，取3-5μl分子量标志物与待检测样本同时进行电泳，电泳一段时间后，分子量标志物会在琼脂糖凝胶上产生11条清晰的、分子量大小不同的DNA条带。该分子量标志物的制备是通过如下技术实现的，包括模板DNA(质粒PBR322)，11对特异性引物，Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶缓冲液，4种脱氧核糖核苷酸(dTTP，dATP，dCTP，dGTP)，无离子水，PCR仪，琼脂糖凝胶，溴化乙啶，溴酚兰，0.25ml离心管，凝胶电泳槽及电泳电源，紫外光灯，紫外分光光度计。取11个无菌的0.25ml的离心管，在每一个离心管中将模板DNA与相应DNA条带的一对特异性引物混合，在有Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶缓冲液、4种脱氧核糖核酸存在的条件下，在PCR仪上，在同一个PCR扩增条件下，对11条DNA片段同时进行聚合酶链反应扩增，30个循环后，结束扩增反应。从每个反应管中取少量的样品在含有溴化乙啶的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束后，在紫外线灯上观察合成的DNA片段的大小及纯度。在确定扩增产物符合目标大小，并且具有高度的特异性后，用酚∶氯仿为1∶1的混合溶剂抽提，去除其中的蛋白质成份；用乙醇沉淀法沉淀DNA分子，干燥沉淀物。用一定体积的TE溶液溶解沉淀的DNA，用紫外分光光度计测定DNA溶液的浓度。将11条DNA条带按每条的终浓度为4ng/μl的比例混合，即可制成100bp梯度的DNA分子量标志物。
聚合酶链反应原理在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)溶液，TaqDNA聚合酶，和一对特异性引物，将上述溶液加热，使模板DNA在高温下(如95℃)变性，双链解链成单链；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下(如37℃)与模板DNA互补退火，形成部分的双链；溶液温度再升至中温(如72℃)，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，以结合在单链模板DNA上的引物为合成起点，按模板DNA链碱基的配对要求，合成其互补链，这样一条双链分子便变成两条双链分子。如此反复按顺序改变反应温度，即高温变性，低温退火和中温延伸合成，这样三次温度改变为一个循环，每经过一次循环使反应管中的特异区段的DNA数目增加1倍。一般样品经过30次左右的循环扩增，最终使原始的模板DNA数量增加到数百万倍。可以在短时间内大量生产某种DNA分子。
一、材料1质粒PBR322为通用质粒，为闭环状超螺旋结构DNA，全长为4361bp，其核苷酸序列如下所示，该质粒保存在大肠杆菌Ecoli JM109中，购自美国PROMEGA公司。
ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa60ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg 120caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt 180gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata 240tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg 300ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac 360cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac 420aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca 480cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg 540actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct 600caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat 660gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt 720cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct 780ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct 840tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa 900acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt 960cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc 1020cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca 1080tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc 1140gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat 1200tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg 1260ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga 1320attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac 1380
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重蒸酚，氯仿，70％冷乙醇，无水乙醇，蛋白胨，酵母抽提物，NaCl，琼脂粉，无离子水。
3设备微量移液器，PCR仪，紫外荧光灯，紫外分光光度计，低温高速离心机，电泳仪，温箱，恒温摇床，振荡混匀器。
二、试剂配制LB肉汤蛋白胨1.0gNaCl 1.0g酵母抽提物0.5g调PH值至7.2-7.4，加无离子水至100ml。高压灭菌。
LB平板蛋白胨1.0gNaCl 1.0g酵母抽提物0.5g琼脂粉1.2g调PH值至7.2-7.4，加无离子水至100ml。高压灭菌，冷却到55℃铺平皿。
TE缓冲液Tris10mM(PH 8.0)EDTA-Na21mM
TBE缓冲液Tris-硼酸 0.045M(PH8.0)EDTA-Na20.001M凝胶载样缓冲液溴酚兰 0.25％蔗糖 40％(w/v)1％琼脂糖凝胶在一个250ml的锥形瓶中，加入100ml TBE缓冲液，1.0g琼脂糖，混匀后在微波炉或电炉上加热溶解，待琼脂糖完全融化后冷却到60℃，加入溴化乙啶至终浓度为0.5μg/ml，然后在插有梳子的凝胶槽中灌制凝胶，冷却后即可使用。
三、引物设计与合成11条DNA带的PCR扩增用引物均为本发明的发明人根据质粒PBR322的DNA序列，用引物设计软件primer express进行设计。分别如下100bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGATGCAGATCCGGAACA-3′ 1678-1661200bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GTATGGATGCGGCGGGACCA-3′ 1778-1759300bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GGTAATGATACCGATGAAACGA-3′ 1878-1857400bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GCGTTAATGTCTGGCTT-3′1978-1962500bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGCGCGAGGCAGCT-3′ 2078-2065600bp 正向引物5′-CTCCCTCGTG CGCTCTCCTGTTCC-3′2642-2665反向引物5′-TTAATTTAAAAGGATCTAGGTG-3′ 3239-3218700bp 正向引物5′-CCGTGTATGAAATCTAACAAT-3′80-100反向引物5′-GCTGCCGGCACCTGTCCTACG-3′777-757800bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGAGTCAGTGAGCGAGGA-3′ 2378-2361900bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-ACATGTTCTTTCCTGCGTT-3′ 2478-24601000bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGTCGATTTTTGTGATGCT-3′ 2578-25601200bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598
反向引物5′-GCTTGGAGCGAACGACCTAC-3′ 2778-2759引物合成由上海博亚生物制品有限公司合成，合成后的干粉样引物用无离子水溶解成浓度为12.5μM的溶液。
图1 PCR扩增结果1.100bp，2.200bp，3.300bp，4.400bp，5.500bp，6.600bp，7.700bp，8.800bp，9.900bp，10.1000bp，11.1200bp。
图2 100bp梯度DNA标志物实物的电泳图谱。
图3实施例2的图示1.菌落1的PCR扩增结果，2.菌落2的PCR扩增结果，3，DNA分子量标志。
具体实施例方式
实施例1100bp梯度DNA分子量标志物的制备方法，具体包括如下步骤。
1质粒PBR322DNA的制备将含有质粒PBR322的细菌接种到3ml LB肉汤培养基中(含有氨苄青霉素100μg/ml)，37℃振荡培养过夜。以12000g离心收集细菌，再用质粒DNA纯化试剂盒纯化PBR322质粒，质粒DNA提取的过程按试剂盒的说明书进行。
2.DNA条带的制备-聚合酶链反应取11个0.25ml的PCR用薄壁离心管，分别标上100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp的标志，按以下方案，在每个管中加入聚合酶链反应用的各种试剂10×Taq DNA聚合酶缓冲液10μl4×dNTP8μl正向引物 2μl反向引物 2μlPBR322 DNA 1μl(50ng)无离子水 75μl盖好盖子后，混匀，在100℃水浴中煮沸变性10min，冷却后短暂离心，收集管壁上的冷凝水，并置于冰上，加入2μl的Taq DNA聚合酶(3U)，最终的反应体积为100μl。将反应管插入PCR仪(PE2400)的孔槽中进行DNA扩增，按如下温度设置扩增条件变性94℃ 10sec退火50℃ 20sec
延伸72℃50sec循环次数为30，最后72℃保温7min，终止反应。
3聚合酶反应产物的鉴定将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液(TBE)，使凝胶浸于液面下约3-5mm。将每个扩增产物取5μl与2μl凝胶载样缓冲液混合，加入凝胶孔中。以1-5V/cm的电压进行电泳，使样本向阴极移动，当溴酚蓝移到凝胶的三分之二处时停止电泳。将凝胶放在紫外灯上，观察扩增结果。结果如图1。
4.DNA纯化与浓度测定将每个含有单一DNA条带的样品转移到一个干净无菌的1.5ml的离心管中，加入1倍体积的重蒸酚，1倍体积的氯仿，在振荡混匀器上混匀30sec，再以12000g的速度离心10min，小心将上层含有DNA的水相液体转移到另一个干净的离心管中，再分别加入等体积的重蒸酚，氯仿，振荡混匀后，以同样的速度离心，将上清液转移到另一干净的离心管中，再加入2倍体积的氯仿，相同的方法再抽提一次，最后将上清液转移到一新的干净离心管中，加入2倍体积的冷乙醇(-30℃)，颠倒混匀，置于-80℃冰箱中沉淀15min，或-30℃冰箱中沉淀2h，再以12000g的速度在4℃离心15min，倒掉上清液，用70％的冷乙醇轻轻洗涤沉淀和管壁，小心倒掉乙醇，将有DNA沉淀的离心管放在室温下干燥10-20min，至DNA沉淀物开始变白为止，用10-50μl TE溶液溶解沉淀。
取DNA溶液2μl与98μl TE溶液混合，作50倍稀释。在紫外分光光度计上，测定溶液在波长280nm和260nm处的吸光度A值。计算溶液中DNA的实际浓度。
DNA浓度＝A值×50mg/ml×50(稀释倍数)，[1AOD280＝50mg/ml]DNA的纯度A260/A280＝1.8-2.05.100bp梯度DNA分子量标志物的构建设定每只100bp梯度DNA分子量标志物的总量为100μl，每个DNA片段的终浓度是4ng/ul，每次的用量为5μl，其中100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bpDNA带的量均为20ng。根据每种DNA片段溶液的启始浓度，按照以上设定要求，将11条片段混合到一起，组成100bp梯度的DNA分子量标志物，如图2。
实施例2用于鉴定阳性克隆菌落用接种环挑取转化平板上菌落1和菌落2，分别悬浮于无离子水中，煮沸裂解。以此裂解为模板，使用基因特异性引物进行PCR扩增，取5μl本发明的分子量标志物和菌落1、菌落2的扩增产物各10μl，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束，在紫外光下观察结果。结果表明，菌落1的扩增产物产生分子量在700-800bp的单一DNA条带，与被克隆的目标基因大小相似，初步证明该菌落为阳性克隆菌落，而菌落2的扩增产物没有任何的DNA条带出现，证明该菌落为阴性克隆菌落。如图3。
权利要求
1.一种100bp梯度DNA分子量标志物，其特征是由11条DNA带组成的混合物，每条DNA带的终浓度为4ng/μl，11条DNA带是以质粒PBR322为模板DNA，用11对特异性引物，经PCR扩增，所得DNA带的长度分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp。
2.如权利要求1所述100bp梯度DNA分子量标志物的制备方法，其特征是以质粒PBR322为模板DNA，用11对特异性引物，在有Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶缓冲液、4种脱氧核糖核苷酸dTTP、dATP、dCTP、dGTP存在的条件下，在PCR仪上，在同一个PCR扩增条件下进行聚合酶链反应，同时合成11条DNA片段，所得DNA带的长度分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp，再经纯化、混合而成；(1)模板DNA采用质粒PBR322的DNA；(2)11条DNA带的引物DNA序列100bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGATGCAGATCCGGAACA-3′ 1678-1661200bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GTATGGATGCGGCGGGACCA-3′1778-1759300bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GGTAATGATACCGATGAAACGA-3′ 1878-1857400bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-GCGTTAATGTCTGGCTT-3′ 1978-1962500bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGCGCGAGGCAGCT-3′ 2078-2065600bp正向引物5′-CTCCCTCGTG CGCTCTCCTGTTCC-3′ 2642-2665反向引物5′-TTAATTTAAAAGGATCTAGGTG-3′ 3239-3218700bp正向引物5′-CCGTGTATGAAATCTAACAAT-3′ 80-100反向引物5′-GCTGCCGGCACCTGTCCTACG-3′ 777-757800bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′ 1581-1598反向引物5′-CGAGTCAGTGAGCGAGGA-3′2378-2361900bp 正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′1581-1598反向引物5′-ACATGTTCTTTCCTGCGTT-3′ 2478-24601000bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′1581-1598反向引物5′-CGTCGATTTTTGTGATGCT-3′ 2578-25601200bp正向引物5′-CTGAGCAACAACATGAAT-3′1581-1598反向引物5′-GCTTGGAGCGAACGACCTAC-3′ 2778-2759每条引物溶液的浓度为12.5μM；(3)DNA条带的制备-聚合酶链反应取11个0.25ml的PCR用薄壁离心管，分别标上100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp的标志，按以下方案，在每个管中加入聚合酶链反应用的试剂10×TaqDNA聚合酶缓冲液 10μl4×dNTP 8μl正向引物 2μl反向引物 2μlPBR322 DNA 1μl，为50ng，无离子水 75μl盖好盖子后，混匀，在100℃水浴中煮沸变性10min，冷却后短暂离心，收集管壁上的冷凝水，并置于冰上，加入2μl的3U Taq DNA聚合酶，最终体积为100μl，将反应管插入PCR仪的孔槽中进行DNA扩增，按如下温度设置扩增条件变性 94℃ 10sec退火 50℃ 20sec延伸 72℃ 50sec循环次数为30，最后72℃保温7min，终止反应；(4)聚合酶反应产物的鉴定将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使凝胶浸于液面下约3-5mm，将每个扩增产物取5μl与2μl凝胶载样缓冲液混合，加入凝胶孔中，以1-5V/cm的电压进行电泳，使样本向阴极移动，当溴酚兰移到凝胶的三分之二处时停止电泳，在紫外灯上观察PCR产物的纯度及产量；(5)DNA纯化与浓度测定用酚∶氯仿为1∶1的混合溶剂抽提，去除其中的蛋白质成份，用乙醇沉淀法沉淀DNA分子，干燥沉淀物，用一定体积的三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸二钠组成的缓冲液溶液溶解沉淀的DNA，用紫外分光光度计测定DNA溶液的浓度。(6)100bp梯度DNA分子量标志物的构建将100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp共11条DNA混合，使各条带的终浓度为4ng/μl。
全文摘要
一种100bp梯度核糖核酸(DNA)分子量标志物及其制备，属于分子生物学试剂制备技术领域。该分子量标志物是由11条DNA条带组成的混合物，11条DNA带的长度分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、1200bp，每条DNA带的浓度为4ng/μl。其制备方法为以质粒PBR322为模板DNA，用11对特异性引物，在有Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶缓冲液、4种脱氧核榶核苷酸(dTTP、dATP、dCTP、dGTP)存在的条件下，在PCR仪上，在同一个扩增条件下进行聚合酶链反应，同时合成11条DNA片段，再经纯化、混合而成。本发明的特点是能按预定目标快速、精确、大量地制备用于DNA分子量标志物的不同长度的DNA分子。
文档编号C12N15/11GK1654650SQ20041010320
公开日2005年8月17日 申请日期2004年12月29日 优先权日2004年12月29日
发明者余传信, 殷旭仁 申请人:江苏省血吸虫病防治研究所