专利名称：经修饰的腈水解酶及它们在产生羧酸的方法中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有经修饰的底物接纳性的新腈水解酶，以及获得它们的方法和上述腈水解酶的用途。该腈水解酶由多肽序列编码，其中所述多肽序列在相应于野生型粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)296位的位置包含非酪氨酸的氨基酸。本发明还涉及编码该腈水解酶的核酸序列和氨基酸序列、包含所述核酸序列的表达构建体、包含所述核酸序列或表达构建体的载体，以及包含核酸序列、表达构建体或载体的生物，优选微生物。本发明还涉及制备羧酸的方法，优选从外消旋腈制备经取代的手性羧酸的方法。
背景技术：
有机化学合成中需要手性和光学活性羧酸作为大量药物和作物保护活性成分的起始材料。手性羧酸可用于通过非对映异构体盐的经典消旋物分解。特别相关的是取代或非取代的R-(-)-或S-(+)-扁桃酸。该化合物的酶促合成基于腈水解酶。
腈水解酶为催化腈水解成相应的羧酸和铵离子的酶(Faber，Biotransformations in Organic Chemistry，Springer Verlag，Berlin/Heidelberg，1992，ISBN 3-540-55762-8)。腈水解酶最初发现于植物中(Thimann和Mahadevan(1964)Arch Biochem Biophys 105133-141)并随后从多种微生物中分离出(Kobayashi和Shimizu(1994)FEMSMicrobiology Letters 120217-224)，像假单胞菌属(Pseudomonas)、诺卡氏菌属(Nocardia)、节杆菌属(Arthrobacter)、镰孢霉属(Fusarium)、红球菌属(Rhodoccocus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、金杆菌属(Aureobacterium)、产碱菌属(Alcaligenes)、红假单胞菌属(RhodoPseudomonas)、棒杆菌属(Corynebacterium)KO-2-4菌株、不动杆菌属(Acinetobacter)、杆菌属(Bacillus)、贪噬菌属(Variovorax)、短杆菌属(Brevibacterium)、乳酪杆菌属(Caseobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)和假丝酵母属(Candida)。腈水解酶具有不同的底物特异性，但根据其特异性可粗略地分成三组脂肪族腈特异的腈水解酶、芳香族腈特异的腈水解酶和芳基乙酰腈特异的腈水解酶(Kobayashi等，(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90247-251；前述Kobayashi和Shimizu(1994)；Lévy-Schil等(1995)Gene 16115-20；Layh等(1998)J Mol Catal BEnzymatic 5467-474)。
使用腈水解酶的手性和非手性羧酸和α-羟基羧酸的酶促合成在本领域中有所描述(例如Yamamoto等(1991)Appl Environ Microb573028-3032；Faber，《Biotransformations in Organic Chemistry》，第二版，Springer-Verlag，Berlin，1995；Lévy-Schil等(1995)Gene 16115-20；Cowan等(1998)Extremophiles 2207-216；WO 03/000840、WO 96/09403、WO 92/05275、EP-B 0 348 901、US 5,283,193、EP-A-0 449 648、EP-B-0473 328、EP-B-0 527 553、EP-B-0 332 379、US 5,296,373、EP-A-0 610 048、EP-A-0 610 049、EP-A 0 666 320、WO97/32030)。这些方法的缺点为其经常导致仅有低光学纯度的产物和/或其仅得到低的时空得率。WO 01/34786描述了具有162位半胱氨酸残基氨基酸改变的经修饰的腈水解酶。该腈水解酶用于水解2-羟基-4-(甲基硫代)丁腈。WO 01/34786中的“选择性”定义为得到的产物2-羟基-4-(甲基硫代)丁酰胺和2-羟基-4-(甲基硫代)丁酸的比例。未提及腈水解酶对不同底物的选择性。
大多数腈水解酶具有非常狭窄的底物接纳性范围，这使其仅对一种或数种腈具有可接受效率的转化。这是发展新产物生物催化方法的障碍并产生不经济的方法。因此提供经修饰的，优选更宽底物接纳性的腈水解酶成为一个目标。
发明概述因此，本发明首要的实施方案涉及分离的编码腈水解酶的多肽，其中该多肽包含至少选自以下序列的一个序列a)(K/R/H)XXDXXGX(X*)，b)与的腈水解酶共有序列具有至少50％同源性，且选自以下的序列i)KAINDPVGH(X*)ii)GH(X*)SRPDV，和c)与的腈水解酶共有序列具有至少35％同源性，且选自以下的序列i)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和ii)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，条件是包含于所述分离的多肽的该序列中，X*表示非酪氨酸氨基酸残基，并且其中X*位于如SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的位置。优选与所述腈水解酶共有序列的同源性至少为40％，更优选至少为60％或80％，最优选至少为90％或95％。
更优选地，腈水解酶共有序列为DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，最优选腈水解酶共有序列为DPAGH(X*)SRPDVLSLLV。
尤其优选本发明的腈水解酶含有选自如下的序列a)(K/R)XXXDXXG(H/Y/S)(X*)，b)KXXXDXXGX(X*)，c)KAINDPVGH(X*)，d)GH(X*)SRPDV，e)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和f)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，其中X代表任一氨基酸，条件是含于本发明所述腈水解酶的所述序列中，X*代表非酪氨酸的氨基酸残基，并且其中X*位于如SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的位置。优选本发明腈水解酶含有选自以下的序列a)KAINDPVGH(X*)，
b)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，或最优选DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，位于如SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的位置的X*氨基酸残基优选选自半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰氨、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸。更优选X*氨基酸残基选自丙氨酸、半胱氨酸、天冬酰氨和丝氨酸。最优选X*氨基酸残基选自丙氨酸和半胱氨酸。
优选本发明腈水解酶与同本发明的该腈水解酶除SEQ ID NO2所述野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应位置的氨基酸残基外相同的腈水解酶相比表现出经调节的(更优选为更广的)底物接纳性。
本发明的另一个实施方案涉及编码本发明腈水解酶的核酸序列。
本发明的另一个实施方案还涉及包含至少一个编码本发明腈水解酶的核酸序列的重组表达构建体。
本发明的另一个实施方案还涉及包含至少一个本发明重组表达构建体和/或至少一个编码本发明腈水解酶的核酸的重组表达载体。
本发明的另一个实施方案涉及产生优选地具有经调节底物接纳性的腈水解酶的方法，其中该方法至少包含用另一氨基酸置换位于如SEQ IDNO2所述野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应位置的至少一个酪氨酸的步骤。优选突变编码该腈水解酶的核酸实现所述置换。
本发明的另一个实施方案涉及通过用另一氨基酸置换该腈水解酶中位于如SEQ ID NO2所述野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应位置的至少一个酪氨酸来调节腈水解酶底物接纳性的方法。优选突变编码该腈水解酶的核酸实现所述置换。
本发明的另一实施方案涉及产生羧酸的方法，其中腈通过本发明一种或多种腈水解酶的作用转化成相应的羧酸。
附图简述
图1以Y296野生型作为对照/标准，不同Y296突变就转变外消旋2-氯扁桃腈的相对比活性[RSA]比较(见实施例2)。y-轴代表相对比活性[RSA]。比活性如下测量。通过将野生型(Y296)酶的活性设成1.0计算相对比活性。X-轴代表不同的突变A(Y296A)、F(Y296F)、C(Y296C)、G(Y296G)、N(Y296N)、T(Y296T)、S(Y296S)。每一测试的突变体与野生型Y296腈水解酶相比表现更高的活性。
图2突变体腈水解酶Y296C和野生型腈水解酶Y296就转变不同芳基乙酰腈的比较。y-轴代表相对比活性[RSA]。比活性如下测量。相对比活性通过将针对未取代扁桃腈的活性设成100％计算。X-轴代表不同的检测底物MN(扁桃腈)、2-CMN(2-氯扁桃腈)、3-CMN(3-氯扁桃腈)、4-CMN(4-R-氯扁桃腈)、4-BMN(4-溴扁桃腈)和4-MeMN(4-甲基扁桃腈)。突变体对每一测试的取代扁桃腈表现显著更高的活性，而对未取代的扁桃腈的活性保持不变。
图3不同突变体腈水解酶就转变2-氯扁桃腈的比较。y-轴代表相对比活性[RSA]，其如下使用扁桃腈作为100％标准测量和计算。X-轴代表测试的不同腈水解酶1650SEQ ID NO2所述的粪产碱菌腈水解酶(野生型)；1650Y296C来自SEQ ID NO2所述的粪产碱菌腈水解酶，但具有Y296C变异；1650Y296A来自SEQ ID NO2所述的粪产碱菌腈水解酶，但具有Y296A变异；8750SEQ ID NO4所述的粪产碱菌腈水解酶(野生型)；8750Y296A来自SEQ ID NO4所述的粪产碱菌腈水解酶，但具有Y296A变异；338SEQ ID NO6所述的假单胞菌腈水解酶(野生型)；338Y297A来自SEQ ID NO6所述的假单胞菌腈水解酶，但具有Y297A突变；所有检测的突变体比相应的野生型酶表现对2-氯扁桃腈显著更高的活性。
图4a-f全长腈水解酶氨基酸序列的比对展示的为下列序列的比对表1图4中比对序列的来源和参考文献
*提供的为GenBank或者SwissProt登录号或专利/专利申请号。图4e中箭头所示的为SEQ ID NO2中所述与野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的保守酪氨酸残基。
图5a-e全长腈水解酶氨基酸序列的比对
WO 03/000840中公开并且描述为表现R-2-氯扁桃腈转变活性的序列与粪产碱菌腈水解酶Nit1650(DE19848129-A1)、粪产碱菌腈水解酶NitJM3_(P20960；EP0527553)、粪产碱菌腈水解酶Nit8750(WO9964607)和来自假单胞菌属菌种的腈水解酶进行比对。来源于WO 03/000840序列通过其专利申请号之后的序列号指示(例如WO2003000840.332代表来自WO 03/000840的序列号332)。图5d中箭头所示的为SEQ ID NO2中所述与野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的保守酪氨酸残基。
发明详述野生型粪产碱菌中296位相应酪氨酸残基的置换导致腈水解酶底物接纳性的修饰。观察到得到的腈水解酶可以转变未修饰腈水解酶不能或仅能很少转变的腈底物。这允许以能够令人满意的经济的效益大范围转变腈，而这不能通过本领域已知的腈水解酶实现。这种效果伴随酶对所述腈底物催化活性的增加。
因此本发明首要的实施方案涉及编码具有腈水解酶活性的蛋白质的分离的多肽序列，其在与SEQ ID NO2中所述的野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的位置包含非酪氨酸的氨基酸。
在本领域中所述的几乎所有的腈水解酶中，相应于SEQ ID NO2中所述的野生型粪产碱菌296位的酪氨酸残基都是保守的。一小部分注释为腈水解酶的多肽(例如WO 03/000840中所述的)在酶的这部分含有不同的氨基酸序列(根据相应DNA的电子结果)。然而因为这些酶中的一些不包含为所有已知腈水解酶特征的催化三元体(triad)(见下文；Pace&Brenner(2001)Genome Biology 2(1)1-9)，所以很可能这些差别为测序错误的结果(例如，造成移码)或者这些序列不属于腈水解酶超家族类型的酶。然而这些酶与SEQ ID NO2中所述的野生型粪产碱菌296位周围区域仅具有非常低或者无显著的同源性，并且不含有上述序列标签。
在此使用的术语“相应于与SEQ ID NO2中所述的野生型粪产碱菌296位”优选意指编码腈水解酶的多肽序列中该多肽序列与SEQ ID NO2中所述序列进行比对之后与SEQ ID NO2中所述野生型粪产碱菌296位残基适合或匹配的位置。此类比对可通过使用计算机软件工具进行，如FASTA(例如，3.3t09版，2001年5月18日；评分矩阵(scoring matrix)blosum62；Henikoff & Henikoff(1992)Proc Natl Acad Sci USA 8910915-10919；Pearson WR & Lipman DJ(1988)Proc Natl Acad Sci USA852444-2448)、GAP或GAP-ENDWeight(“-Endweight”penalizes endgaps like other gaps；评分矩阵blosum62Henikoff&Henikoff(1992)ProcNatl Acad Sci USA 8910915-10919；Needleman&Wunsch(1970)J MolBiol 48443-453)。其他腈水解酶中相应于SEQ ID NO2中所述的野生型粪产碱菌296位的位置也可通过多重比对鉴定(例如图4和图5所展示的)。下表(表2)代表了包含相应于SEQ ID NO2中所述的野生型粪产碱菌296位残基的区域的比对。序列来源于GenBank/SwissProt和其他来源(例如，专利申请号WO 03/000840)。例如如图4和图5展示的比对使用下列参数配置Gap开放罚分10；Gap延伸罚分0.05；Gap分离罚分范围8；同一性％用于比对延迟40的ClustalW算法(如Vector NTI Suite 7软件包的AlignX特征中包括的版本1.7；Informax；加权矩阵(Weight Matrix)用于蛋白质的Blosum)；Thompson JD等(1994)Nucl Acids Res224673-4680；Higgins DG等，(1996)Methods Enzymol 266383-402)进行。
表2代表相应于SEQ ID NO2中所述的野生型粪产碱菌296位区域(箭头所示)的腈水解酶部分序列。″腈水解酶″(第2列)代表比对序列的来源。定义与图例给出的定义相对应(图4和图5)。“起点(1)”指第4列中展示的相应腈水解酶序列中的序列标签的第一个氨基酸残基的位置。此位置可容易地用于计算相应于SEQ ID NO2中所述的野生型粪产碱菌296位的准确位置。相似性和同一性通过GAP-ENDWeight算法使用评分矩阵blosum62和下面限定的参数计算。
共有序列(395) D GHYSRPDV LLV
术语“大约”用于此处是指近似地、粗略地、左右或在……范围之内。当术语“大约”与数字范围连用时，其通过将界限扩展至高于或低于所列数值而修饰此范围。一般地，术语“大约”用于此处是修饰所述数值以百分之二十上下(或高或低)变动的数值。
正如在此使用的，词语“或者”是指具体列表中的任一成员并且也包括此列表成员的任一组合。
术语“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合体或单链或双链、正义或反义形式的杂合体。该术语包括含已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或连接的核酸，其为合成、天然存在和非天然存在的，具有与参照核酸相似的结合特性，并以与参照核酸相似的方式代谢。此类类似物的例子不局限地包括硫代磷酸酰、氨基磷酸、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、核酸肽(PNAs)等等。
除非另外指出，特定核酸序列也暗含包括其保守性修饰的变体(例如简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。术语“核酸”在此可与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互换地使用。
在此使用的短语“核酸序列”指代表核苷酸的简写、字母、文字或词语的连续列表。在一个实施方案中，核酸可为“探针”，它是相对较短的核酸，通常长度少于100个核苷酸。核酸探针通常为长度从约50个核苷酸到约10个核苷酸。核酸的“靶区域”为鉴定为有关的核酸部分。核酸的“编码区”为当置于适当调节序列控制之下时，以序列特异方式转录和翻译产生特定多肽或蛋白质的核酸部分。编码区被认为是编码多肽或蛋白质。
术语“基因”指与能以某种方式调节多肽表达的适当调节序列有效连接的编码区。基因包括编码区(开放阅读框，ORF)前面(上游)和后面(下游)的DNA非翻译调节序列(例如启动子、增强子、阻抑物等等)，以及各编码区(即外显子)之间适当的间插序列(即内含子)。
术语“多肽”、“肽”、“寡肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在此可互换地用来指连续氨基酸残基的聚合物或寡聚物。术语适用于其中一个或多个氨基酸为相应天然氨基酸和天然氨基酸聚合物的类似物或模拟物的氨基酸聚合物。此外，在此使用的术语“多肽”指通过肽键或经修饰的肽键互相连接的氨基酸，并可含有非基因编码的20个氨基酸的经修饰的氨基酸。多肽可通过天然加工(如翻译后加工)或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰。
修饰可发生在于多肽中的任一处，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基端。同样类型的修饰以相同的或不同的程度存在于给定多肽中多个位点是受欢迎的。给定多肽也可具有多种类型的修饰。修饰不局限地包括乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、共价交联或环化、黄素或血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂类或脂类衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、二硫键结构、去甲基化、半胱氨酸或焦谷氨酸结构、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定结构、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、pergylation、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、selenoylation、硫酸盐化和转移RNA介导向蛋白质加入氨基酸(如精氨酰化)(见《Proteins-Structure and Molecular Properties》，第二版，Creighton TE，Freeman WH和Company，New York(1993)；《Posttranslational Covalent Modification of Proteins》，Johnson BC编，Academic Press，New York，1-12页(1983))。修饰也包括与短肽(“标签”如6×HIS-标签)或更大结构域(例如麦芽糖结合蛋白质、GST-蛋白质、硫氧还蛋白)的N端或C端融合。
术语“氨基酸”指天然存在或合成的氨基酸，以及以与天然氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物或氨基酸模拟物。天然存在氨基酸为遗传密码编码的氨基酸以及后来修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然氨基酸具有相同的基础化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基或R基结合的碳(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。
如在此使用的，术语“氨基酸序列”指代表氨基酸残基的简写、字母、文字或词语的列表。在此可用通常已知的三字母标志或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的一字母标志指代氨基酸。核酸同样可用其通常接受的单字母代码指代。在此使用的简写为氨基酸的常规一字母代码A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸(见L. Stryer，Biochemistry，1988，W.H.Freemanand Company，New York)。在此使用的字母“X”在氨基酸序列中可代表任一氨基酸残基。
此处所用术语“分离的”指从其原始环境中取出的物质。例如活的动物中存在的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但是从一些或全部天然系统中共存材料分离的同一多核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可为载体部分和/或此类多核苷酸或多肽可为组合物的部分，并仍然为分离的，因为这样的载体或组合物不是其原始环境的部分。
术语“天然的”或“天然来源的”在本文中指至少可在一种未改变、突变或人为操纵的生物体中获得的有机组织、多肽、核酸序列。
术语与例如核酸序列(或生物体、表达盒或包含该核酸序列的载体)相关的“重组体”指所有通过重组方法来源的构建体，其中a)该核酸序列或b)与该核酸序列a)有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或c)(a)和(b)不位于其天然遗传环境中或已被重组方法修饰，修饰的例子为一个或多个核苷酸残基的置换、加入、缺失、倒位或插入。天然遗传环境指来源生物体中的天然染色体位点，或指存在于基因组文库中。就基因组文库而言，优选保持(至少部分地保持)核酸序列的天然环境。此环境与核酸序列至少在一面相邻并具有长度至少为50bp，优选至少500bp，尤其优选至少1000bp，极其优选至少5000bp的序列。天然存在的表达框-例如天然存在的启动子与相应基因的组合-当其通过非天然的、合成的“人工”方法(如诱变)修饰时即成为重组表达盒。此类方法已有描述(US 5,565,350；WO 00/15815；也见上文)。优选地，在此使用的与核酸相关的术语“重组”指核酸与其在天然环境中不相邻的核酸共价连接并相邻。
“重组”多肽或蛋白质指通过重组DNA技术产生的多肽或蛋白质，即从编码所需多肽或蛋白质的外源重组DNA构建体转化的细胞中产生。
重组核酸和多肽也可包含自然中不存在，但经人修饰、改变、突变或另外其他操作的分子。“重组多肽”为与天然存在多肽至少一个氨基酸残基不同的非天然存在多肽。产生所述重组多肽和/或核酸的优选方法可包含定向或非定向诱变、DNA改组或其他循环重组(recursive recombinant)方法。尤其优选的获得此类重组分子的方法可包括基因改组。改组方法为本领域公知，并描述于例如WO 01/12817和它所引用的参考文献中。在此使用术语“改组”来指出不同序列间的重组，在一些实施方案中改组可包括通过同源重组或通过非同源重组的交换，如通过cre/lox和/或flp/frt系统。改组可通过使用多种不同形式进行，这包括例如体外和体内改组形式、计算机模拟(in silico)改组形式、使用单链或双链模板的改组形式、基于引物的改组形式、基于核酸断裂的改组形式、寡核苷酸介导的改组形式，所有基于不同序列间的重组事件并更详细地描述或在此处下文中参考的改组形式，以及其他相似的基于重组的形式。
“合成的”多肽或蛋白质为通过化学合成(例如固相肽合成)制备的多肽或蛋白质。化学肽合成为本领域所熟知(例如见Merrifield(1963)，Am.Chem.Soc.852149-2154；Geysen等(1984)Proc Natl Acad Sci USA 813998)并且合成试剂盒和自动肽合成仪可商业购买(例如CambridgeResearch Biochemicals，Cleveland，United Kingdom；Applied Biosystems，Inc.的431A型合成仪，Foster City，CA)。此类设备通过直接合成或者通过合成一系列能用其他已知技术耦联的片段，提供得到本发明肽的简便方法。
在此使用的关于两个核酸序列的术语“同一性”应理解为指借助程序算法(program algorithm)GAP(Wisconsin Package版本10.0，Universityof Wisconsin，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，USA；Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.253389及以下)计算的同一性，其中设置下列参数缺口权重(Gap weight)50 长度权重(Length weight)3平均匹配(Average match)10 平均错误匹配(Average mismatch)0例如与序列SEQ ID NO1在核酸水平具有至少60％同源性的序列应理解为指通过利用以上系列参数的程序算法与序列SEQ ID NO1比较具有至少60％同一性的序列。其中适当使用评分矩阵(blosum62)。
在此使用的关于两个多肽的术语“同一性”应理解为指借助程序算法GAP(Wisconsin Package版本10.0，University of Wisconsin，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，USA；)计算的同一性，其中设置下列参数缺口权重8 长度权重2平均匹配2,912 平均错误匹配-2,003例如与序列SEQ ID NO2在蛋白质水平具有至少60％同源性的序列理解为是指通过利用以上系列参数的程序算法与序列SEQ ID NO2比较具有至少60％同一性的序列。
正如在此使用的，“同源性”与“同一性”在本文的核苷酸序列中有相同的意思。然而就氨基酸序列而言，“同源性”包括相同的或保守的氨基酸置换的百分比。同源性百分比可根据Smith和Waterman(1981)Adv ApplMath 2482和Needleman&Wunsch(1970)J Mol Biol 48443-453的算法使用评分矩阵blosum62计算。
正如在此使用的，就两个或多个核酸序列而言，当使用上述已知的序列比较算法比较和排比最大相应序列时，两核酸序列具有至少99.5％的核苷酸同一性，则为“基本相同”。此外为确定序列是否基本相同，编码区中的同义密码子可看作相同的，以解释遗传密码的简并性。一般地，确定基本同一性的区域必须跨越至少20个残基，最常见的是序列在至少约25-200个残基中基本相同。
正如在此使用的，就两个或多个氨基酸序列而言，当使用上述已知的序列比较算法比较和排比最大相应序列时，两个氨基酸序列具有至少99.5％同一性时，则为“基本相同”。此外为确定序列是否基本相同，如果多肽基本保持其生物学功能，则保守氨基酸置换可看作是相同。
“杂交”指核酸链与互补链在互补碱基处通过氢键连接的过程。杂交鉴定法可为灵敏的并且为选择性的，以便可以在甚至以低浓度存在的样品中鉴定特定的目的序列。严格条件通过预杂交和杂交溶液中的盐或甲酰胺浓度和/或杂交温度限定，并为本领域所熟知。严格性可通过降低盐浓度，增加甲酰胺浓度或提高杂交温度而增加。此处使用的术语“标准条件”指例如依赖于核酸，0.1至5×SSC (1×SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.2)之间浓度或另外存在50％甲酰胺的缓冲水溶液中42-58℃温度，例如5×SSC，50％甲酰胺中42℃。DNADNA杂合体的杂交条件优选包含0.1×SSC和温度约20-45℃，优选为约30-45℃。DNARNA杂合体的杂交条件优选包含0.1×SSC和温度约30-55℃，优选为45-55℃。这些陈述的杂交温度为例如100个核苷酸长度和50％G+C含量的核酸在无甲酰胺的条件下计算的解链温度。DNA杂交的实验条件描述于遗传学相关教科书如Sambrook等，《Molecular Cloning》，Cold Spring HarborLaboratory，1989，并可通过技术人员已知的公式计算，例如依赖于核酸长度、杂合体的性质或G+C含量计算。技术人员可在下列教科书中找到关于杂交的其他信息Ausubel等(编)，1985，《Current Protocols inMolecular Biology》，John Wiley&Sons，New York；Hames和Higgins(编)，1985，《Nucleic Acids HybridizationA Practical Approach》，IRLPress at Oxford University Press，Oxford；Brown(编)，1991，《EssentialMolecular BiologyA Practical Approach》，IRL Press at Oxford UniversityPress，Oxford。具体而言，如在此使用的，“严格杂交条件”包括50％甲酰胺、5×SSPE、0.3％SDS和200ng/ml的剪切和变性的鲑精DNA中42℃的温度和其等价条件。以上范围和条件的改变为本领域所熟知。
此处使用的术语“变体”指在一个或多个核苷酸或氨基酸残基(分别地)修饰的本发明多核苷酸或多肽，并且其中多肽或编码的多肽保留腈水解酶活性。可通过任何数量的方法产生变体，例如易错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归集团诱变(reaursive ensemble mutagenesis)、指数集团诱变、定点诱变、基因重组(reassembly)、基因定点饱和诱变或它们的任意组合。
“保守性修饰变体”用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列而言，保守性修饰变体指编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸或就不编码氨基酸序列的核酸而言，指基本相同的序列。具体地，可通过产生其一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位点被混合碱基和/或脱氧次黄苷残基置换的序列实现简并密码置换(Batzer等(1991)Nucleic Acid Res 195081；Ohtsuka等(1985)J Biol Chem 2602605-2608；Rossolini等(1994)Mol CellProbes 891-98)。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任一给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。这样在密码子限定丙氨酸的每一位点，密码子可变为任一所述的相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异为“沉默变异”，其为一种保守性修饰变异。在此引用的编码多肽的每一个核酸序列也描述了核酸的每一个可能沉默变异。技术人员会认识到核酸中的每一密码子(除AUG，(在一些生物中与GUG一起)通常为甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常为色氨酸的唯一密码子)可以被修饰来产生功能相同的分子。因此编码多肽的核酸的每一个沉默变异包含在每一个所述序列中。
关于氨基酸序列，技术人员会认识到改变、添加或删除编码序列中单个氨基酸或小部分氨基酸的核酸、肽、多肽或蛋白质的单个置换、缺失和添加为改变造成用化学相似的氨基酸置换氨基酸的“保守性修饰变体”。提供功能相似氨基酸的保守置换表为本领域所熟知。此类保守性修饰变体除之外并且不排除多态变异体、种间同系物和本发明的等位基因。
此处使用的术语“腈水解酶”包括表现腈水解酶活性的所有多肽。
术语“腈水解酶活性”一般指将腈水解成其相应羧酸和氨的能力。“腈水解酶活性”优选地指催化两摩尔等价水加入腈基引起相应羧酸形成的特性
术语“腈水解酶”优选地包含EC-类3.5.5.1(腈水解酶)、3.5.5.2(蓖麻碱腈水解酶)、3.5.5.4(氰丙氨酸腈水解酶)、3.5.5.5(芳基乙酰腈水解酶)、3.5.5.6(溴苯腈腈水解酶)和3.5.5.7(脂肪族腈水解酶)的酶。更优选的为芳基乙酰腈水解酶(EC 3.5.5.5)。
腈水解酶可包含一般在具有腈水解酶活性的酶中保守的保守氨基酸残基或基序。这些保守残基可通过例如多个腈水解酶序列的比对鉴定。保守残基包含例如SEQ ID NO2所述野生型粪产碱菌腈水解酶序列163位的半胱氨酸残基，其参与了腈水解酶的反应机制(Kobayashi等(1993)ProcNatl Acad Sci USA 90247-251)。在腈水解酶多肽中鉴定了保守基序的三个区域。这与腈水解酶中存在的催化三联体(E-K-C)对应(Pace&Brenner(2001)Genome Biology 2(1)1-9)1.fPEaf2.hRKl.pT3.l.CWEn..p大写字母表示腈水解酶中90％或更高的一致，小写字母表示50％或更高的一致。盒中的点表示非保守的残基。优选地，下列残基(下划线的)在所有鉴定的腈水解酶中完全保守第一个基序或区域的第三个氨基酸(E，谷氨酸)；第二个基序中的第二个残基(R，精氨酸)；第二个基序在的第三个残基(K，赖氨酸)；第三个基序中的第三个残基(C，半胱氨酸)；和第三个基序中的第五个残基(E，谷氨酸)。
本发明中参考序列为SEQ ID NO2所述来源于粪产碱菌腈水解酶的腈水解酶。特定氨基酸或核酸位点的所有定义、标记和描述是与该序列的原始序列比较而完成，并可由本领域技术人员使用例如图4或图5描述的序列比对转变成其他腈水解酶。
腈水解酶可为天然的、合成的或重组来源。本领域已知大量天然表达腈水解酶的生物。根据本发明，修饰的腈水解酶优选地选自细菌、酵母、真菌、植物或动物来源的腈水解酶。腈水解酶更优选地来源于微生物、最优选地为细菌来源。也可从环境源，例如未经详细生物鉴定的土壤或海洋材料中分离腈水解酶。
大量腈水解酶及其序列为本领域公知。这些腈水解酶包括但不限于来源于Acidovorax facilis 72W(Gavagan JE等(1999)Appl MicrobiolBiotechnol 52654-659)、不动杆菌属菌种AK 226(Yamamoto K undKomatsu K(1991)Agric Biol Chem 55(6)1459-1466)、不动杆菌属菌种RFB1(Finnegan I等(1991)Appl Microbiol Biotechnol 36142-144)、粪产碱菌ATCC 8750(Yamamoto K等(1991)Appl Environ Microbiol 57(10)3028-3032)，粪产碱菌JM3(Nagasawa T等(1990)Eur J Biochem 194765-772)、拟南芥(NIT1/NIT2/NIT3；Vorwerk S等(2001)Planta 212508-516)、节杆菌属菌种J-1(Bandyopadhyay AK等(1986)Appl EnvironMicrobiol 51(2)302-306)、苍白芽孢杆菌(Bacillus pallidus)Dac521(Cramp R等(1997)Microbiology 1432313-2320)、丛毛单胞菌(Comamonas)属菌种NI1(Cerbelaud E等(1996)Ind Chem Libr8189-200)、睾丸酮丛毛单胞菌(Levy-Schil S等(1995)Gene 16115-20)、尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum f.sp.)melonis(Goldlust A und Bohak Z(1989)Biotechnol Appl Biochem 11581-601)、茄病镰孢菌(Fusariumsolani)(Harper BH(1977)Biochem J 167685-692)、臭鼻克雷白氏杆菌(Klebsiella ozaenae)(McBride KE等(1986)Appl Environ Microbiol52(2)325-330)、假单胞菌属fluoreszenz DSM 7155(Layh N等(1998)JMol Catal BEnzym 5467-474)、假单胞菌属菌种(Layh N等(1992)ArchMircobiol 158405-411)的腈水解酶，假单胞菌属菌种aus的腈水解酶(S1)(Dhillon J等(1999)Can J Microbiol 45811-815)、来源于假单胞菌属菌种13的腈水解酶(Yanase H等(1982)Agric Biol Chem 462925)，玫瑰色红球菌J1(Kobayashi M等(1989)Eur J Biochem 182349-356)、玫瑰色红球菌K22(Kobayashi M等(1990)J Bacteriol 172(9)4807-4815)、玫瑰色红球菌NCIB 11215(Harper BH(1985)Int J Biochem 17(6)677-683)、玫瑰色红球菌NCIB 11216(Harper BH(1977)Biochem J 165309-319)、玫瑰色红球菌PA34(Bhalla TC等(1992)Appl Microbiol Biotechnol 37184-190)、玫瑰色红球菌属菌种ATCC 39484(Stevenson DE等(1992)Biotechnol Appl Biochem 15283-302)的腈水解酶和从环境源分离和例如WO 03/000840、WO 01/48175和WO 02/279079中所述的腈水解酶。
分离的本发明的多肽编码腈水解酶活性的酶，其包含至少一个选自以下的序列a)(K/R/H)XXDXXGX(X*)，b)与腈水解酶共有序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％或80％，最优选至少90％或95％的同源性的序列，其中所述的共有序列选以下序列i)KAINDPVGH(X*)ii)GH(X*)SRPDV，c)与腈水解酶共有序列具有至少35％，优选至少40％，更优选至少60％或80％，最优选至少90％或95％的同源性的序列，其中所述的共有序列选自以下序列i)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和ii)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，条件是包含于所述具有腈水解酶活性的酶的该序列中，所述X*残基代表非酪氨酸的氨基酸残基，并且其中X*位于SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的位置。
尤其优选地，本发明的腈水解酶包含选自下组的序列a)(K/R)XXXDXXG(H/Y/S)(X*)，b)KXXXDXXGX(X*)，c)KAINDPVGH(X*)，d)GH(X*)SRPDV，e)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和f)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，
其中X代表任一氨基酸，条件是包含于本发明所述腈水解酶的该序列中，X*代表非酪氨酸的氨基酸残基，并且其中X*位于SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的位置。本发明的腈水解酶优选包含选自以下的序列a)KAINDPVGH(X*)。
b)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L ，或者最优选DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，在优选的实施方案中，X*残基选自半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸。更优选地，X*残基选自丙氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和丝氨酸。最优选地，X*残基选自丙氨酸和半胱氨酸。
在优选的实施方案中，本发明的腈水解酶被选自以下的多肽序列所进一步表征a)包含与SEQ ID NO2、4、6或8的氨基酸序列至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％相同的多肽分子；和b)包含至少一个SEQ ID NO2、4、6或8所述序列的至少20个连续氨基酸，优选50个连续氨基酸的多肽分子。
本领域公知的腈水解酶可通过本领域技术人员已知的大量方法突变或转变成本发明的腈水解酶。诱变方法可为随机或定向的，并可包括，例如W098/42727中所述的方法；定点诱变(Ling等(1997)Anal Biochem.254(2)157-78；Dale等(1996)Methods Mol Biol 57369-74；Smith(1985)Ann Rev Genet 19423-462；Botstein&Shortle(1985)Science 2291193-1201；Carter(1986)Biochem J 2371-7；Kunkel(1987)“寡核苷酸定向诱变的效能”Nucleic Acids&Molecular Biology，Eckstein F和LilleyDMJ编，Springer Verlag，Berlin)；使用含尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82488-492；Kunkel TA等(1987)Methods in Enzymol 154,367-382；Bass SV等(1988)Science242240-245)；寡核苷酸指导的诱变(综述见Smith(1985)Ann Rev Genet19423-462；Botstein&Shortle(1985)Science 2291193-1201；Carter(1986)Biochem J 2371-7，Zoller & Smith(1982)Nucleic Acids Res 106487-6500，Zoller & Smith(1983)Methods in Enzymol 100，468-500，Zoller& Smith(1987)Methods in Enzymol.154，329-350)；硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等(1985)Nucl Acids Res 138749-8764；Taylor等(1985)Nucl Acids Res 138765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein(1986)Nucl Acids Res 149679-9698；Sayers等(1988)Nucl Acids Res 16791-802；Sayers等(1988)Nucl Acids Res 16803-814)；使用缺口双链DNA的诱变(Kramer等(1984)Nucl Acids Res 129441-9456；Kramer和Fritz(1987)Methods in Enzymol 154350-367；Kramer等(1988)NuclAcids Res.167207；Fritz等(1988)Nucl Acids Res 166987-6999)。
腈水解酶序列的修饰可通过例如在编码天然来源的酶的序列上诱变实现(Skandalis等(1997)Chemistry&Biology 48889-898；Crameri等(1998)Nature 391288-291)。诱变可包括化学试剂诱变(Singer和Fraenkel-Conrat(1969)Prog Nucl Acid Res Mol Biol 91-29)、易错PCR诱变(Leung等(1989)Technique 111-15)、组合PCR(combinative PCR)诱变(上面提到的Crameri等(1998)；Shao等(1998)Nucleic Acids Res26681-683)或定向诱变(《Directed MutagenesisA Practical Approach》(1991)McPherson MJ编，IRL PRESS)等等。此外在本发明中使用的腈水解酶可通过筛选DNA库获得，尤其是多种来源的cDNA或基因组DNA，尤其是通过腈水解酶重组或随机改变，通过定向分子进化或者筛选陆地或其他群落生境的DNA文库获得的DNA库。
其他适当的方法包括点错配修复(Kramer等(1984)Cell 38879-887)、使用修复缺陷的宿主菌株的诱变(Carter等(1985)Nucl Acids Res 134431-4443(1985)；Carter(1987)Methods in Enzymol.154382-403)、缺失诱变(Eghtedarzadeh&Henikoff(1986)Nucl Acids Res 145115)、限制—选择和限制—纯化(Wells等(1986)Phil Trans R Soc Lond A317415-423)、全基因合成诱变(Nambiar等(1984)Science 2231299-1304；Sakamar&Khorana(1988)Nucl Acids Res 146361-6372；Wells等(1985)Gene 34315-323(1985)；Grundstrom等(1985)Nucl Acids Res.133305-3346)、双链断裂修复(Mandecki(1986)Proc Natl Acad Sci.USA 837177-7181)。关于多个上述方法的其它细节可在Methods in Enzymology，Vol.154中找到，其也描述了解决多种诱变方法问题的有用控制。此外，可使用其他随机诱变方法引入突变(例如，通过诱变菌株的传代等等)。
诱变的试剂盒可商业购买。例如可从Stratagene、Bio-Rad、Roche、Clontech Laboratories、Life Technologies(Gibco BRL)、New EnglandBiolabs、Pharmacia Biotech和Promega Corp.获得。
除了SEQ ID NO2所述野生型粪产碱菌腈水解酶296位相应位置被另一氨基酸改变外，还可对腈水解酶进行其他改变以获得新的或经修饰的特性。这可通过本领域已知的“定向进化”方法实现。当反复选择具有改进性能的变体时，它组合了在相当程度上改变酶的方法(Arnold&Volkov(1999)Current Opin Chem Biol 354-59；Kuchner和Arnold(1997)Tibtech 15523-530)。例如可以使用WO 01/12817中所述的方法以及其引用的方法。获得经修饰的腈水解酶的优选方法可包含定向或非定向诱变、DNA改组或其他循环重组方法。在优选的实施方案中，核酸“家族”(例如编码不同物种腈水解酶的核酸序列)的改组用于建立重组多核苷酸文库。当核酸家族改组后，编码不同菌株、物种同源多肽的核酸或基因家族或其部分用作核酸的不同形式。
本发明可以包括建立编码腈水解酶的多核苷酸重组体文库，然后筛选以鉴定编码表现所需特性的腈水解酶的文库成员，例如提高的酶促活性、立体专一性、区域专一性和对映特异性(enantiospecificity)、对抑制剂降低的敏感性、改变的稳定性(例如，溶解稳定性、pH稳定性、热稳定性等)等。重组体文库可使用多种方法中的任一种建立，所述方法包括但不限于例如WO 01/12817中所述的改组方案和其引用的参考文献。
此处所用术语“底物接纳性”指腈水解酶转变特异腈底物的能力。优选通过酶的腈水解酶活性测量底物接纳性。
术语“更广的底物接纳性”对本发明特定腈水解酶而言指该特定腈水解酶与同该特定腈水解酶具相同氨基酸序列但在SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶296位相应的位置包含酪氨酸的腈水解酶相比对至少一种腈水解底物表现更高的腈水解酶活性。优选所述活性增加至少10％，优选20％，更优选地50％，最优选100％或更高。
优选本发明的腈水解酶表现出关于芳基乙酰腈的增加的活性，更优选表现出关于取代的扁桃腈的增加的活性。扁桃腈芳基可携带一个或多个取代。优选的取代为烷基(优选为甲基)、烷氧基(优选地为甲氧基)、卤素或硝基。取代扁桃腈可选自但不限于邻氟扁桃腈、对氟扁桃腈、间氟扁桃腈、邻氯扁桃腈、对氯扁桃腈、间氯扁桃腈、邻溴扁桃腈、对溴扁桃腈、间溴扁桃腈、邻硝基扁桃腈、对硝基扁桃腈、间硝基扁桃腈、邻甲基扁桃腈、对甲基扁桃腈、间甲基扁桃腈、邻甲氧基扁桃腈、对甲氧基扁桃腈或间甲氧基扁桃腈。更优选的为邻氯扁桃腈.
优选使用本发明方法产生光学活性羧酸，其中所述的方法包含至少一种选自以下的化合物R-扁桃酸、S-扁桃酸、R-对氯扁桃酸、S-对氯扁桃酸、R-间氯扁桃酸、S-间氯扁桃酸、R-邻氯扁桃酸、S-邻氯扁桃酸、S-邻溴扁桃酸、S-对溴扁桃酸、S-间溴扁桃酸、S-邻甲基扁桃酸、S-对甲基扁桃酸、S-间甲基扁桃酸、R-邻溴扁桃酸、R-对溴扁桃酸、R-间溴扁桃酸、R-邻甲基扁桃酸、R-对甲基扁桃酸或R-间甲基扁桃酸。更优选的为R-邻氯扁桃酸。
而本发明的另一个实施方案包含编码本发明腈水解酶的核酸序列。优选所述核酸序列编码具有腈水解酶活性的酶，其包含至少一个选自以下的序列a)(K/R/H)XXDXXGX(X*)，b)与腈水解酶共有序列具有至少50％，优选至少60％，更优选至少70％或80％，最优选至少90％或95％的同源性的序列，其中所述的共有序列选自以下序列i)KAINDPVGH(X*)
ii)GH(X*)SRPDV，和c)与腈水解酶共有序列具有至少35％，优选至少40％，更优选至少60％或80％，最优选至少90％或95％的同源性的序列，其中所述的共有序列选自以下序列i)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和ii)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，条件是包含于具有腈水解酶活性的酶的该序列中，所述X*残基代表非酪氨酸的氨基酸残基，并且其中X*位于SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的位置。
更优选地，本发明的核酸序列编码包含选自以下序列的腈水解酶a)(K/R)XXXDXXG(H/Y/S)(X*)，b)KXXXDXXGX(X*)，c)KAINDPVGH(X*)，d)GH(X*)SRPDV，e)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和f)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，其中X代表任一氨基酸，条件是该含于本发明所述腈水解酶的序列中，X*代表非酪氨酸的氨基酸残基并且其中，X*位于SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的位置。
甚至更优选地，编码具有腈水解酶活性的酶的本发明核酸，包含选自以下的序列a)KAINDPVGH(X*)，b)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L 或，最优选地，DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，在优选的实施方案中X*残基选自半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸。更优选的，X*残基选自丙氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和丝氨酸。最优选的，X*残基选自丙氨酸和半胱氨酸.
最优选地，本发明核酸序列被选自以下序列所进一步表征
a)与SEQ ID NO4、3、5或7的核酸序列至少60％，优选80％，更优选90％，最优选地95％一致的核酸序列；b)包含至少一个SEQ ID NO4、3、5或7所述序列的至少20个连续碱基，优选50个连续碱基，更优选100个连续碱基的核酸序列。
为重组表达根据本发明的腈水解酶，可将编码该腈水解酶的核酸序列引入表达构建体。
术语“表达构建体”一般指任何核酸构建体，其中其表达(转录以及如果适当的话翻译)产生腈水解酶的核酸分子优选与至少一个遗传控制元件有效连接。术语“遗传控制序列”应广义理解，并指所有对表达盒或本发明重组微生物的实体化(materialization)、复制或功能具有影响的序列。这些遗传控制元件为例如诱导物或阻抑物结合并因此调节核酸表达的序列。遗传控制元件可提高、调节、保证或修饰在原核或真核生物中的转录和/或翻译。遗传控制序列在例如“Goeddel；《Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology 185》，Academic Press，San Diego，CA(1990)”、“Gruber和Crosby，《Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnolgy》中，CRC Press，Boca Raton，Florida，Glick和Thompson编，第七章，89-108”和在其引用的参考文献中有所描述。
除这些新的调节序列之外，也可能存在于实际的结构基因上游(前面)的这些天然调节序列的调节，其中这些序列在适当时被遗传修饰，以使天然调节关闭，并且基因表达增加。然而核酸构建体也可具有更简单的结构，也就是说没有其他调节信号插入本发明核酸序列的上游，并且未删除天然启动子及其调节。相反，以不再发生调节的方式突变天然调节序列，并且基因的表达增加了。核酸构件体可额外有利地包含一个或多个与启动子功能性连接的增强子序列，其使核酸序列增加表达成为可能。也可以在DNA序列的3’端插入有利的其他序列，如其他调节元件或终止子。根据本发明的核酸在构建体中可以一个或多个拷贝存在。构建体也可包含其他标记，如适于选择构建体的抗生素抗性或营养缺陷型互补基因。
在优选的实施方案中，编码本发明腈水解酶的核酸序列与确保其在生物体(例如微生物或植物)中表达的至少一个启动子有效连接。
有效连接应理解为指例如启动子与待表达的核酸序列(例如腈水解酶)和(如果适当的话)其他调节序列(如终止子)以当核酸序列重组表达时每一调节序列能实现其功能的方式连续排列。化学意义上的直接连接并不总是必需的。遗传控制序列(如增强子序列)也可从远离的位置，或实际上从其他DNA分子上执行对靶序列的功能。优选的排列为重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列之后，以使两个序列互相共价连接。启动子序列和重组表达的核酸序列之间的距离优选少于500碱基对，尤其优选少于200碱基对，极其优选少于100碱基对。
有效连接和表达盒可通过常规的重组和克隆技术产生，如例如Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)《Molecular CloningALaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor(NY)中，Silhavy TJ，Berman ML和Enquist LW(1984)《Experiments with Gene Fusions》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)中，Ausubel FM等(1987)《Current Protocols inMolecular Biology》，Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience和Gelvin等(1990)《Plant Molecular Biology Manua1》中所述。然而作为带有特定限制性内切酶切割位点的接头或作为信号肽的其他序列也可位于两序列之间。序列的插入也可引起融合蛋白质的表达。
根据本发明的表达盒包含在各自宿主生物中发挥功能的、位于重组表达的核酸序列5’-上游的启动子和3’-下游的终止子序列作为额外遗传控制序列，以(如果适当的话)还含有在每一种情况下与重组表达的核酸序列有效连接的其他常规调节序列。
依赖于用本发明表达盒或载体转化的宿主生物，优选不同的遗传控制序列。
在微生物中实施本发明的有利调节序列为例如存在于启动子中的序列，这些启动子如有利于用于革兰氏阴性细菌中的cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、rhaP(rhaPBAD)、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子。其他有利的调节序列为例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2，真菌或酵母启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中的序列。就此而论，有利的启动子还有丙酮酸脱羧酶启动子和例如汉逊酵母属pr Pichia甲醇氧化酶的启动子(例如AOX启动子)。也可以使用人工启动子进行调节。
适于在植物生物体中表达腈水解酶的植物特异的启动子可包括组成型启动子(例如CaMV 35S启动子(Franck等(1980)Cell 2l285-294)，OCS启动子，泛素启动子(Holtorf S等(1995)Plant Mol Biol 29637-649)，拟南芥腈水解酶-1基因启动子(GenBank Acc.No.U38846，核苷酸3862-5325或到5342)，组织特异性启动子(例如菜豆异类黄酮灵启动子；US 5,504,200)或化学诱导启动子(综述文章Gatz等(1997)Annu Rev Plant Physiol PlantMol Biol 4889-108)。
原则上，所有其调节序列如同以上所述的天然启动子都可用于根据本发明的方法。此外也可有利地使用合成启动子。
本发明的表达构建体或载体也可包含其他功能元件。术语功能元件应广义理解，并指对根据本发明的表达盒、载体或重组生物体的产生、扩增或功能具有影响的所有元件。下列以例子形式提到，但不限于此a).选择标记选择标记对于成功选择和分离转化或同源的重组细胞并对防止染色体外DNA构建体随时间丢失是有用的。选择标记赋予对杀生物化合物，如代谢阻遏物(例如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸，WO 98/45456)、抗生素(例如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、G 418、博来霉素或潮霉素)或除草剂(例如膦丝菌素或草甘膦)的抗性。
适于原核生物的选择标记可包括但不限于Amp(氨苄青霉素抗性；β-内酰胺酶)、Cab(羧苄青霉素抗性)、Cam(氯霉素抗性)、Kan(卡那霉素抗性)、Rif(利福平抗性)、Tet(四环素抗性)、Zeo(Zeocin抗性)或Spec(壮观霉素抗性)。选择压力通过培养基中一定水平的抗生素保持(例如氨苄青霉素100mg/l、羧苄青霉素100mg/l、氯霉素35mg/l、卡那霉素30mg/l、利福平200mg/l、四环素12.5mg/l、壮观霉素50mg/l)。
对于在植物中使用，尤其优选的选择标记为那些给予除草剂抗性的选择标记。例子为膦丝菌素乙酰转移酶(PAT；de Block等(1987)EMBO J62513-2518)、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、磺酰脲-和咪唑啉酮-钝化乙酰乳酸合酶、Bromoxyni_降解腈水解酶(bxn)。其他真核生物中可使用卡那霉素-或G418-抗性基因(NPTII；NPTI)。
选择标记还包含适于与主生物中的遗传缺陷互补的序列，例如与氨基酸合成缺陷互补。互补允许宿主细胞在缺乏该氨基酸的培养基上生长。适当的例子有色氨酸(例如trpC)、亮氨酸(例如leuB)或组氨酸(例如hisB)合成缺陷。相应的微生物菌株可商业购买(例如从Clontech Inc.购买)并可分别被选择标记(例如TRP1、Leu2或HIS3)互补。
b)转录终止序列转录终止序列阻止非预期的转录(例如连读)，并提高质粒和/或mRNA的稳定性和/或数量。
c)Shine-Dalgarno序列(SD)对翻译的起始有用。用于大肠杆菌(E.coli)表达的适当共有序列为例如5’-TAAGGAGG-3’。该序列可位于ATG起始密码子上游4-14核苷酸处，其中最合适的为上游8个核苷酸。为防止可能降低翻译效率的二级RNA结构，相应的区域应优选为富含A/T。
d)起始密码子起始密码子为翻译起始的点。在大肠杆菌和高等真核生物中ATG为最常用的起始密码子。在大肠杆菌中GTG可备选地使用。
e)标签和融合蛋白可将重组蛋白质与短肽(“标签”)或其他蛋白质(“融合蛋白”)在N-或C-端的融合，以能够提高的表达、可溶性、检测或纯化。优选融合部分包含允许表达和纯化之后去掉融合部分的蛋白酶(例如thrombine或因子X)切割位点。
f)多克隆位点(MCS)允许和辅助一个或多个核酸序列的插入。
g)终止密码子/翻译终止子三个可能的终止密码子中TAA为优选的(因为TAG和TGA在一些条件下允许连续翻译)。可使用多个终止密码子以确保翻译终止。
h)报告基因报告基因编码通过其颜色和酶活性而易于定量的蛋白质，以便能够评估使转化效率、表达位点和表达时间。本文中极其优选的为编码报告蛋白质的基因(Schenborn E & Groskreutz D(1999)MolBiotechnol 13(1)29-44)，如绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素转移酶、萤光素酶(Ow等(1986)Science 234856-859)或β-半乳糖苷酶。
i)复制起点，其确保根据本发明的表达盒或载体在例如大肠杆菌中的扩增。可提及的实例为ORI(DNA复制起点)，pBR322ori或P15A ori(Sambrook等《Molecular Cloning.A Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。
j)农杆菌介导的植物转化所必需的元件，如T-DNA的左或右边界或病毒区域(Vir region)。
k)表达盒介导的分子伴侣蛋白质(例如GroELS、dnaKJ、grpE或clpB)的表达，已知其特别是在重组表达系统中，能增加正确折叠蛋白质的水平(US 5,635,391)。
l)宿主扩增过程中促进质粒分离和分布的元件(例如cer-位点；Wilms B等(2001)Biotechnol Bioeng 73(2)95-103)。
可有利地使用包含表达盒的载体实现向生物体或其细胞、组织、器官、部分或种子中引入根据本发明的表达盒。表达盒可通过适当的限制性切割位点引入载体(例如质粒)。形成的质粒首先引入大肠杆菌。选择、培养正确转化的大肠杆菌，并通过技术人员熟悉的方法获得重组质粒。限制性分析和测序可用来验证克隆步骤。载体的实例可为质粒、粘粒、噬菌体、病毒或农杆菌。在有利的实施方案中，表达盒通过质粒载体引入。
适当质粒的实例在大肠杆菌中为pUC18、PUC19、pBlueScript系列、pKK223-3、pJOE2702、pBAD、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，在链霉菌中为pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在杆菌中为pUB110、pC194或pBD214，在棒杆菌中为pSA77或pAJ667，在真菌中为pALS1、pIL2或pBB116，在酵母中为2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23，或在植物中为pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。在高等真核生物(例如哺乳动物)细胞中表达的载体含有基于SV40、乳头瘤病毒、腺病毒或多瘤病毒的病毒序列(Rodriquez RL & Denhardt DT编；《载体分子克隆载体及其用途的调查》，Butterworths(1988)，Lenstra等(1990)Arch Virol 1101-24)。所述质粒代表一小部分可以选择的质粒。其他质粒为技术人员所熟知并可见于例如《Cloning Vectors》(Pouwels PH等编Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0444904018)。包含调节序列控制下能够表达使本发明腈水解酶的所有核酸序列被认为是本发明的一部分。
本发明还涉及重组生物或组织、器官、部分、细胞或其繁殖材料，其包含本发明的腈水解酶、编码所述腈水解酶的核酸序列、包含该核酸序列的重组表达盒或包括该表达盒的重组载体。
此类重组生物可例如通过用相应蛋白质或核酸转化或转染产生。转化生物(或转化细胞或组织)的产生需要在相关宿主细胞中引入相关DNA(例如表达载体)、RNA或蛋白质。可使用多种方法实施这一称为转化(转导或转染)的操作(Keown等(1990)Methods in Enzymology 185527-537)。例如可通过显微注射或通过用DNA-包被的微粒的轰击直接引入DNA或RNA。细胞也可化学透化例如使用使用聚乙二醇透化，以便DNA可通过扩散进入细胞。DNA也可通过磷酸钙介导或与含DNA单位(如微细胞、溶酶体或脂质体)融合引入。另一个引入DNA的适当方法为电穿孔，其中细胞用电脉冲可逆地透化。优选的常用方法包括(但不限于)磷酸钙介导的转化、DEAE-葡聚糖介导的转化、阳离子脂质介导的转化、电穿孔、转导和感染。这些方法为本领域技术人员所熟知(Davis等(1986)BasicMethods In Molecular Biology；Sambrook J等(1989)Molecular cloningA laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel FM等(1994)Current protocols in molecular biology，John Wiley和Sons；Glover DM等(1995)DNA Cloning Vol.1，IRL Press ISBN 019-963476-9)。
在植物中，除了这些“直接”转化技术之外，转化也可通过使用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的细菌感染实现。农杆菌介导的转化最适于双子叶植物细胞。此方法为本领域熟知并描述(Horsch RB等(1985)Science 2251229f.；EP 120516；Hoekema，The Binary Plant Vector System，OffsetdrukkeriiKanters B.V.，Alblasserdam，Chapter V；An等(1985)EMBO J 4277-287)。当使用农杆菌时，表达盒整合到特定质粒中，或整合到穿梭或中间载体，或整合到二元(binary)载体中。优选使用二元载体(Holsters等(1978)Mol Gen Genet 163181-187)。已知多种二元载体，其中一些可商业购买，例如pBI101.2或pBIN19(Clontech Laboratories，Inc.USA)。
当选择标记为引入的DNA的一部分时，可从未转化细胞中选择转化细胞。可作为标记的基因的实例为上文提供的所有能赋予抗生素或除草剂抗性的基因。对植物而言，技术人员熟悉从植物细胞或植物部分再生完整植物的方法。再生方法例如由Fennell等(1992)Plant Cell ReD.11567-570；Stoeger等(1995)Plant Cell Rep.14273-278；Jahne等(1994)Theor Appl Genet 89525-533所描述的。
本发明还涉及用至少根据本发明的核酸序列、根据本发明的表达盒或根据本发明的载体之一转化的重组生物，细胞、细胞培养物、组织、部分(如在为植物生物情况下的叶、根等)或来源于此类生物的繁殖材料。术语生物应广义理解，并指原核和真核生物，优选指细菌、酵母(例如酵母、克孢酵母式毕赤(Pichia)酵母)、真菌(如曲霉式青霉)、非人类动物生物或植物。优选的植物生物在上文指出。
术语“微生物”或“细菌”包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。优选的为所有肠杆菌属(Enterobacteriaceae)和种和所有放线菌目(Actinomycetales)和种。尤其优选的为肠杆菌科埃希氏菌属(Escherichia)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形菌(Proteus)、肠道细菌属(Enterobacter)、克雷博氏杆菌属(Klebsiella)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏杆菌属(Shigella)、爱德华菌(Edwardsielle)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、摩根氏菌属(Morganella)、普罗威登斯菌属(Providencia)和耶尔森氏菌属(Yersinia)的菌种。其他优选的为土壤农杆菌属、假单胞菌属、伯克氏菌属(Burkholderia)、诺卡氏菌属(Nocardia)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)、棒状杆菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、杆菌属、梭菌属(Clostridium)、蓝细菌(Cyanobacter)、葡萄菌(Staphylococcus)、产气杆菌属(Aerobacter)、产碱杆菌属、玫瑰色红球菌属和链霉菌属(Streptomyces)的所有种。对于表达重组腈水解酶，埃希氏菌菌种为最优选，尤其是大肠杆菌。
此处使用的术语“植物”或“植物生物”指能光合作用的任何生物。优选生物为分化的多细胞有机体。术语包括植物界高等和低等植物的所有属和种。还包括成熟植物、种子、枝条和幼苗、和部分、繁殖材料和来源于它的培养物，例如细胞培养物。尤其优选的为单子叶和双子叶植物，特别是为动物或人饲料或食物目的或为工业利用种植的植物，像玉米、小麦、大麦、芸苔(Canola)、大豆、水稻、甘蔗、甜菜、马铃薯、萝卜(beet)、烟草棉花等。
重组生物可用上述转化或转染生物体的方法产生。
本发明的微生物可在允许所述微生物生长的培养基中生长和繁殖。所述培养基可为合成的或天然来源。使用不同的培养基取决于微生物，并为本领域技术人员公知。为了微生物的生长，培养基包含碳源、氮源、无机盐并任选地包含少量的维生素和/或痕量元素。
优选的碳源为例如多元醇(如丙三醇)、糖类像例，如单糖、二糖或多糖(例如葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、淀粉或纤维素)、复合糖源(例如糖蜜)、糖磷酸(例如果糖-1，6-二磷酸)、糖醇(例如甘露醇)、醇(例如甲醇或乙醇)、羧酸(例如柠檬酸、乳酸或乙酸)、油和脂肪(例如大豆油或菜籽油)、氨基酸或氨基酸混合物(例如酪蛋白氨基酸；Difco)或不同的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺)或氨基糖，其中后者也可用作氮源。更优选的为葡萄糖和多元醇，尤其是丙三醇。
优选的氮源为包含所述化合物的有机或无机氮化合物或材料。实例为铵盐(例如NH4Cl或(NH4)2SO4)、硝酸盐、尿素和复合氮源，如酿酒酵母自溶物、豆粉、麦麸、酵母提取物、蛋白胨、肉膏、酪蛋白水解物、酵母或马铃薯蛋白，其也经常用作碳源。
无机盐的实例包括钙、镁、钠、钴、钼、锰、钾、锌、铜和金属盐。特别优选对应的阴离子为氯、硫酸根、硫和磷酸根离子。提高产量的一个重要问题为控制培养基中Fe2+或Fe3+离子浓度。
培养基任选地包含其他生长因子，例如维生素或生长促进因子，所述生长促进因子如生物素、2-酮基-L-古洛糖酸、抗坏血酸、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸或吡多辛、氨基酸(例如丙氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸或缬氨酸)、羧酸(例如柠檬酸、甲酸、乳酸)或像二硫苏糖醇之类的物质。
单个营养成分的平衡依赖于发酵方式并根据个别需要采用。培养基成分可在发酵的开始时，在需要它之前进行灭菌后提供或在发酵过程中根据培养需要连续或间断加入。
以确保产物的最佳产量(例如最佳腈水解酶活性产量)方式选择发酵和生长条件。优选的发酵条件为温度15-40℃，优选为温度25-37℃。pH优选地保持在pH 3-9的范围，优选为pH 5-8。发酵时间一般地可从数小时到数天，优选为8小时到21天，更优选地为4小时到14天。优化培养基和发酵条件的方法为本领域所熟知(Applied Microbiol Physiology，“APractical Approach(PM Rhodes、PF Stanbury编，IRL-Press，1997，S.53-73，ISBN 0199635773)。
本发明还涉及制备光学活性、手性或非手性羧酸的方法，其包含在根据本发明的核酸序列编码的氨基酸序列或生长的、休眠的或破坏的上述微生物(＝宿主生物)在存的条件下将腈转变成光学活性、手性或非手性羧酸，所述微生物或含有根据本发明的核酸序列，或含有包含与一个或多个调节信号的连接的本发明核酸序列的本发明核酸构建体，或含有根据本发明的载体的。
本方法有利的实施方案为将光学活性手性或非手性脂肪族腈转变成相应的羧酸。
如此处使用的术语“腈”优选指含有至少一个腈基的任何有机化合物。术语“腈”也包括醛或酮和氰化物的混合物，其引起至少一个腈形成。此处使用的术语“氰化物”应指包含或引起氰离子(CN-)释放的化合物。术语“氰离子”优选应包括氰酸和/或氰酸盐，更优选氰化钠或氰化钾。本文使用的术语“混合物”应指所有醛/酮和氰化物的定量组合，其引起腈的形成。混合物优选地由等摩尔或几乎等摩尔量的醛/酮和氰化物组成。
本发明另一个优选的实施方案为制备光学活性、手性或非手性羧酸的方法，其中通式I的腈在本发明的腈水解酶，或生长的、休眠的或破坏的上述微生物存在的条件下被转变成通式II的羧酸，所述微生物含有编码本发明腈水解酶的核酸序列，或含有根据本发明的表达盒或根据本发明的载体。
其中式I和II中的取代基和变量具有下列意义-R1、R2、R3可互相独立地选自氢，取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10烷基或C1-C10烷氧基，取代或非取代的芳基或杂芳基、羟基、卤素(如氟、氯或溴)、C1-C10烷基氨基和氨基，并且其中至少两个，优选地全部取代基R1、R2和R3为不同的。
式I和II中的R1、R2或R3取代基之一为芳基(如苯基)是有利的。还优选式I和II中的R1、R2或R3取代基之一为羟基，且另一个为氢或甲基。
适合作为所述R1、R2、R3基团的取代基为例如一个或多个如卤素(如氟、氯或溴)、巯基、硝基、氨基、羟基、烷基、烷氧基、链烯基、链烯氧基、炔基或其他芳香族或其他饱和或非饱和的非芳香环或环系统之类的取代基。优选如C1-C6-烷基(如甲基、乙基、丙基或丁基)之类的为烷基基团、芳基(如苯基、硫代苯基)、卤素(如氟、氯、溴)、羟基或氨基。
在优选的实施方案中，制备光学活性、手性或非手性羧酸的方法包括将通式III的腈转变成通式IV的羧酸。
其中式I和II中的取代基和变量具有下列意义n＝0或1m＝0、1、2或3，其中m＞2时两个相邻的碳原子间有一个或没有双键p＝0或1A、B、D和E互相独立地为CH、N或CR7当n＝0时，H＝O、S、NR4、CH或CR7，或当n＝1时，H＝CH、N或CR7。
其中两个相邻的变量A、B、D、E或H可能一起形成另一个取代或非取代的芳香族、饱和或部分饱和的5-8个碳原子的环，环中可含有一个或多个杂原子(如O、N或S)，并且变量A、B、D、E或H中不超过三个为杂原子，并且其中R4选自氢、取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10-烷基，并且其中R5、R6、R7可独立地选自氢、取代或非取代，分枝或不分枝的C1-C10烷基或C1-C10烷氧基、取代或非取代的芳基或杂芳基、羟基、卤素(如氟、氯或溴)、C1-C10烷基氨基和氨基。
适合作为所述R4、R5或R6基团的取代基为例如一个或多个如卤素(如氟、氯或溴)、巯基、硝基、氨基、羟基、烷基、烷氧基、链烯基、链烯氧基、炔基或其他芳香族或其他饱和或非饱和非芳香环或环系统之类的取代基。优选如C1-C6-烷基(如甲基、乙基、丙基或丁基)之类的烷基基团、芳基(如苯基、硫代苯基)、卤素(如氯、氟或溴)、羟基或氨基。
上述烷基基团可包含取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10-烷基链如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基、正丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。优选的为甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基或异丁基。
上述链烯基基团可包含分枝或不分枝的C2-C10链烯基链，如乙烯基、丙稀基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、2-甲基丙稀基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-1-丁烯基、2-甲基-1-丁烯基、，3-甲基-1-丁烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1，1-二甲基-2-丙稀基、1，2-二甲基-1-丙稀基、1，2-二甲基-2-丙稀基、1-乙基-1-丙稀基、1-乙基-2-丙稀基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、4-己烯基、5-己烯基、1-甲基-1-戊烯基、2-甲基-1-戊烯基、3-甲基-1-戊烯基、4-甲基-1-戊烯基、1-甲基-2-戊烯基、2-甲基-2-戊烯基、3-甲基-2-戊烯基、4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、2-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1，1-二甲基-2-丁烯基、1，1-二甲基-3-丁烯基、1，2-二甲基-1-丁烯基、1，2-二甲基-2-丁烯基、1，2-二甲基-3-丁烯基、1，3-二甲基-1-丁烯基、1，3-二甲基-2-丁烯基、1，3-二甲基-3-丁烯基、2，2-二甲基-3-丁烯基、2，3-二甲基-1-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-3-丁烯基、3，3-二甲基-1-丁烯基、3，3-二甲基-2-丁烯基、1-乙基-1-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1，1，2-三甲基-2-丙稀基、1-乙基-1-甲基-2-丙稀基、1-乙基-2-甲基-1-丙稀基、1-乙基-2-甲基-2-丙稀基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、4-庚烯基、5-庚烯基、6-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、4-辛烯基、5-辛烯基、6-辛烯基、7-辛烯基、壬烯基或癸烯基。优选的为乙烯基、丙稀基、丁烯基或戊烯基。
上述烷氧基基团可为取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10-烷氧基链如甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基、1，1-二甲基乙氧基、戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基、1，1-二甲基丙氧基、1，2-二甲基丙氧基、2，2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基、己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，2-二甲基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2，2-二甲基丁氧基、2，3-二甲基丁氧基、3，3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1，1，2-三甲基丙氧基、1，2，2-三甲基丙氧基、1-乙基-1-甲基丙氧基、1-乙基-2-甲基丙氧基、己烯氧基、庚烯氧基、辛烯氧基、壬烯氧基或癸烯氧基和其分枝同源物。
上述烷基羰基基团为取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10-烷基羰基链如甲基羰基、乙基羰基、正丙基羰基、1-甲基乙基羰基、正丁基羰基、1-甲基丙基羰基、2-甲基丙基羰基、1，1-二甲基乙基羰基、正戊基羰基、1-甲基丁基羰基、2-甲基丁基羰基、3-甲基丁基羰基、2，2-二甲基丙基羰基、1-乙基丙基羰基、正己基羰基、1，1-二甲基丙基羰基、1，2-二甲基丙基羰基、1-甲基戊基羰基、2-甲基戊基羰基、3-甲基戊基羰基、4-甲基戊基羰基、1，1-二甲基丁基羰基、1，2-二甲基丁基羰基、1，3-二甲基丁基羰基、2，2-二甲基丁基羰基、2，3-二甲基丁基羰基、3，3-二甲基丁基羰基、1-乙基丁基羰基、2-乙基丁基羰基、1，1，2-三甲基丙基羰基、1，2，2-三甲基丙基羰基、1-乙基-1-甲基丙基羰基、1-乙基-2-甲基丙基羰基、正庚基羰基、正辛基羰基、正壬基羰基或正癸基羰基。优选的为甲基羰基、乙基羰基、正丙基羰基、正丁基羰基、异丙基羰基或异丁基羰基。
上述链烯基羰基基团可为分枝或不分枝的C2-C10-链烯基羰基链如乙烯基羰基、丙稀基羰基、1-丁烯基羰基、2-丁烯基羰基、3-丁烯基羰基、2-甲基丙稀基羰基、1-戊烯基羰基、2-戊烯基羰基、3-戊烯基羰基、4-戊烯基羰基、1-甲基-1-丁烯基羰基、2-甲基-1-丁烯基羰基、3-甲基-1-丁烯基羰基、1-甲基-2-丁烯基羰基、2-甲基-2-丁烯基羰基、3-甲基-2-丁烯基羰基、1-甲基-3-丁烯基羰基、2-甲基-3-丁烯基羰基、3-甲基-3-丁烯基羰基、1，1-二甲基-2-丙稀基羰基、1，2-二甲基-1-丙稀基羰基、1，2-二甲基-2-丙稀基羰基、1-乙基-1-丙稀基羰基、1-乙基-2-丙稀基羰基、1-己烯基羰基、2-己烯基羰基、3-己烯基羰基、4-己烯基羰基、5-己烯基羰基、1-甲基-1-戊烯基羰基、2-甲基-1-戊烯基羰基、3-甲基-1-戊烯基羰基、4-甲基-1-戊烯基羰基、1-甲基-2-戊烯基羰基、2-甲基-2-戊烯基羰基、3-甲基-2-戊烯基羰基，4-甲基-2-戊烯基羰基，1-甲基-3-戊烯基羰基，2-甲基-3-戊烯基羰基，3-甲基-3-戊烯基羰基、4-甲基-3-戊烯基羰基、1-甲基-4-戊烯基羰基、2-甲基-4-戊烯基羰基、3-甲基-4-戊烯基羰基、4-甲基-4-戊烯基羰基、1，1-二甲基-2-丁烯基羰基、1，1-二甲基-3-丁烯基羰基、1，2-二甲基-1-丁烯基羰基、1，2-二甲基-2-丁烯基羰基、1，2-二甲基-3-丁烯基羰基、1，3-二甲基-1-丁烯基羰基、1，3-二甲基-2-丁烯基羰基、1，3-二甲基-3-丁烯基羰基、2，2-二甲基-3-丁烯基羰基、2，3-二甲基-1-丁烯基羰基、2，3-二甲基-2-丁烯基羰基、2，3-二甲基-3-丁烯基羰基、3，3-二甲基-1-丁烯基羰基、3，3-二甲基-2-丁烯基羰基、1-乙基-1-丁烯基羰基、1-乙基-2-丁烯基羰基、1-乙基-3-丁烯基羰基、2-乙基-1-丁烯基羰基、2-乙基-2-丁烯基羰基、2-乙基-3-丁烯基羰基、1，1，2-三甲基-2-丙稀基羰基、1-乙基-1-甲基-2-丙稀基羰基、1-乙基-2-甲基-1-丙稀基羰基、1-乙基-2-甲基-2-丙稀基羰基、1-庚烯基羰基、2-庚烯基羰基、3-庚烯基羰基、4-庚烯基羰基、5-庚烯基羰基、6-庚烯基羰基、1-辛烯基羰基、2-辛烯基羰基、3-辛烯基羰基、4-辛烯基羰基、5-辛烯基羰基、6-辛烯基羰基、7-辛烯基羰基、壬烯基羰基或癸烯基羰基。优选的为乙烯基羰基、丙稀基羰基、丁烯基羰基或戊烯基羰基。
上述芳基基团可为环或环系统中含有6-20个碳原子的取代或非取代的芳基基团。这可包含融合到-起的芳环或烷基、烷基羰基、链烯基或链烯基羰基链、羰基、氧或氮连接的芳环。芳基基团也可适当的经由C1-C10-烷基、C3-C8-链烯基、C3-C6-炔基或C3-C8-环烷基链与基础框架。优选的为苯基或萘基。
上述芳基羰基基团可为环或环系统中含有6-20个碳原子的取代或非取代的芳基羰基基团。环系统可包含融合到-起的芳环或由烷基、烷基羰基、链烯基或链烯基羰基链、羰基、氧或氮连接的芳环。优选的为苯基羰基或萘基羰基。
上述杂芳基系统可为取代或非取代的、简单或融合的芳环系统，可带有一个或多个芳香杂环(3-7个成员环)，环中可含有一个或多个杂原子(如N、O或S)，并可适当地由C1-C10-烷基、C3-C8-链烯基或C3-C8-环烷基链与基础框架连接。此类杂芳基基团的实例为吡唑、咪唑、噁唑、异噁唑、噻唑、三唑、吡啶、喹啉、异喹啉、吖啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪酰胺、吩嗪、嘌呤或喋啶。杂芳基基团可由杂原子或由环或环系统中的各碳原子或由取代基与基础框架连接。杂芳基羰基基团指由羰基基团与基础框架连接的芳香杂环基团。优选的为吡啶、咪唑、嘧啶、嘌呤、吡嗪酰胺或喹啉。
上述烷基氨基基团可为取代或非取代的、分枝或不分枝的C1-C10-烷基氨基链，如甲氨基、乙氨基、正丙氨基、1-甲基乙氨基、正丁氨基、1-甲基丙氨基、2-甲基丙氨基、1，1-二甲基乙氨基、正戊氨基、1-甲基丁氨基、2-甲基丁氨基、3-甲基丁氨基、2，2-二甲基丙氨基、1-乙基丙氨基、正己氨基、1，1-二甲基丙氨基、1，2-二甲基丙氨基、1-甲基戊氨基、2-甲基戊氨基、3-甲基戊氨基、4-甲基戊氨基、1，1-二甲基丁氨基、1，2-二甲基丁氨基、1，3-二甲基丁氨基、2，2-二甲基丁氨基、2，3-二甲基丁氨基、3，3-二甲基丁氨基、1-乙基丁氨基、2-乙基丁氨基、1，1，2-三甲基丙氨基1，2，2-三甲基丙氨基、1-乙基-1-甲基丙氨基、1-乙基-2-甲基丙氨基、正庚氨基、正辛氨基、正壬氨基或正癸氨基。优选的为甲氨基、乙氨基、正丙氨基、正丁氨基、异丙氨基或异丁氨基。
优选的腈包括芳香族或芳香杂环腈，如2-苯基丙腈、2-羟基-2-苯基乙酰腈、2-氨基-2-苯基乙酰腈、2-氯苯基丙腈、2-羟基苯基丙腈、苯并腈、苯基乙酰腈、反式-苯乙烯腈、2-羟基-4-苯基-丁酸腈、3-氰基噻吩或3-氰基甲基噻吩。优选的为芳基-乙酰腈，更优选的为取代扁桃腈。扁桃腈芳基可带有一个或多个取代。优选的取代可为烷基(优选的为甲基)、烷氧基(优选的为甲氧基)、卤素或硝基。取代扁桃腈可选自但不限于邻氟扁桃腈、对氟扁桃腈、间氟扁桃腈、邻氯扁桃腈、对氯扁桃腈、间氯扁桃腈、邻溴扁桃腈、对溴扁桃腈、间溴扁桃腈、邻硝基-扁桃腈、对硝基扁桃腈、间硝基扁桃腈、邻甲基扁桃腈、对甲基扁桃腈、间甲基扁桃腈、邻甲氧基扁桃腈、对甲氧基扁桃腈或间甲氧基扁桃腈。更优选的为邻氯扁桃腈。
在根据本发明的方法中，外消旋腈指由两个对映异构体的50∶50混合物组成的腈，或由富含混合物中两个对映异构体之一的任何其他混合物组成的腈，或由乙醛/甲酮化合物和氰化物混合组成的腈。
根据本发明的方法中，“光学活性”羧酸指显示富含一种对映异构体的羧酸。该方法优选地引起至少70％ee，优选至少90％ee，尤其优选至少98％ee，极其优选至少99％ee的对映异构体纯度。在本发明优选的实施方案中与SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶296位相应的氨基酸残基与非酪氨酸的氨基酸残基交换不引起得到的产物对映异构体纯度的实质降低，交换更优选地引起未改变的或提高的对映异构体纯度。
根据本发明的方法可在温度0-80℃实施是有利的，优选在温度10-60℃实施，尤其优选地在温度15-55℃实施。
根据本发明的方法在pH 4-11实施是有利的，优选在pH 4-9实施。
在本发明方法中使用按重量计算0.01-30％的腈或0.01-30％的相应醛或酮和0.01-30％氰化物(例如氰氢酸)是有利的。可以使用过量的氰化物实施方法。在一些情况下，这引起高于所述的氰化物含量。取决于腈，反应中可使用不同数量的腈。对于与相应的醛和氰化物平衡的腈(羟腈)，使用腈的最小量(介于0.01-5％重量百分比的量)是有利的，因为醛通常对微生物或酶有毒性。同样以按重量计算0.01-10％数量使用挥发性腈是有利的。更大量的羟腈或腈会阻滞反应。在具有低的或基本上无溶解性的腈或仅非常小量地溶于水介质的腈的情况下，可能使用比所述更大的量，并且是有利。为提高转变和得率，以控制外消旋腈的加入有利地实施反应。产物可在反应终结束之后分离或在旁路中连续地取出。本发明的方法可以分批式方法进行，其中离析物在过程的开始以一定浓度提供，并随后转变成相应的产物。备选地，离析物可连续地加入反应混合物中，例如以保持离析物浓度恒定或几乎恒定的方式加入反应混合物中。
上述适当的醛或酮指适当地以碱催化的反应后，在醛或酮和氰化物(例如氰氢酸)之间形成腈的化合物。醛和氰化物之间的反应引起化醛和氰化物平衡中具有优势的羟腈的产生。与羟腈平衡的建立指可能用仅能转变腈的一个异构体的酶如此获得理论的100％产量，因为外消旋腈连续地再充。对所有其他腈来说，不为酶转变的腈(＝“错误的”或其他对映异构体)有利地通过化学反应外消旋并返回加工过程以能达到理论的100％产量，或者丢弃或纯化和具保留的立构中心的化学水解。
酶促腈水解的方法优选地在水溶液中实施。
根据本发明的方法使可以将大量的外消旋腈转变成光学活性的羧酸。本发明方法可以转变至少25mmol腈/hxmg蛋白质或至少25mmol腈/hxg微克干重微生物，优选至少30mmol腈/hxmg蛋白质或至少30mmol腈/hxg干重，尤其优选地至少40mmol腈/hxmg蛋白质或至少40mmol腈/hxg干重，极其优选地至少50mmol腈/hxmg蛋白质或至少50mmol腈/hxg干重。
可以将包含本发明核酸、核酸构建体或载体的生长的细胞用于本发明的方法。也可使用休眠的、固定的、透化的或破坏的细胞。破坏的细胞指例如通过用如溶剂之类的处理造成可通透的细胞或通过酶处理、机械处理(例如氟氏细胞压碎器或超声)或其他方法分解的细胞。以这种方式获得的粗提物适于并对本发明的方法有利。纯化或部分纯化的酶也可用于此方法。固定的微生物或酶同样适于并可有利地用于反应中。
可有利地通过萃取或结晶或者通过萃取和结晶从水反应溶液中分离根据本发明的方法中制备的光学活性羧酸。为此目的，可浓缩水反应溶液(例如通过蒸发或低压升华干燥法)，并用如无机酸(例如HCl或H2SO4)或有机酸有利地酸化到pH 3或低于3的pH值，然后用有机溶剂萃取。萃取可重复多次以增加产量。可使用的有机溶剂原则上适当的加入盐之后与水呈现相界的所有溶剂。有利的溶剂如甲苯、苯、己烷、甲基叔丁醚或乙酸乙酯。
浓缩有机相之后，通常可以较好的化学纯度分离产物，即高于90％的化学纯度。然而，萃取之后含产物的有机相也仅可部分浓缩，可结晶产物。为此目的，有利地将溶液冷却到温度0-25℃(室温)。也可直接从有机溶液中结晶。结晶产物可重吸收于相同或不同的溶剂中，以重新结晶并再次结晶。随后至少一次的结晶(依赖于共晶组合物的情况)进一步增加产物的对映异构体纯度。
然而，光学活性的羧酸也可在用酸有利地酸化到pH低于3之后从水反应溶液中立即结晶出。这有利地需要通过加热减少水溶液体积10-90％，优选20-80％，尤其优选30-70％以使其浓缩。优选用冷却进行结晶。结晶优选的温度为0-15℃。同样优选由萃取或适当的随后结晶产生光学活性羧酸。
用这些优选的实施类型，可依赖于反应使用的腈以60-100％，优选以80-100％，尤其优选以90-100％的得率分离本发明方法的产物。分离的产物具有＞90％，优选＞95％，尤其优选＞98％的高化学纯度。此外，产物具有还可通过结晶进一步增加的高对映异构体纯度。以这种方式获得的产物适于用作有机合成制备药物或农用化学品的起始材料或者用作外消旋物分解(racemate resolution)的起始材料。
而本发明另一个实施方案涉及在植物生物中实现除草剂抗性的方法，其中该植物生物用包含编码腈水解酶的核酸序列的表达盒转化，其中所述的腈水解酶在与如SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶296位相应的位置含有非酪氨酸的氨基酸，其中所述的核酸序列受在该植物生物中发挥功能的启动子的控制。优选的除草剂为腈除草剂，更优选为3，5-二溴-4-羟基苯并腈(Bromoxynil_)。
在此描述的实施例和实施方案应理解为仅为描述目的，其多种修饰和改变可建议于本领域的技术人员，并包括在此应用的宗旨和权限之内和附加权利要求的范围之内。所有的出版物、专利和引用的专利申请书为所有目的在此引用作为参考。
序列SEQ ID NO1编码粪产碱菌种腈水解酶的核酸序列(DE19848129-A1)。
SEQ ID NO2编码粪产碱菌种腈水解酶的氨基酸序列(DE19848129-A1)。
SEQ ID NO3编码粪产碱菌种腈水解酶的核酸序列(WO 99/64607)。
SEQ ID NO4编码粪产碱菌种腈水解酶的氨基酸序列(WO 99/6460)。
SEQ ID NO5编码假单胞菌属菌种腈水解酶的核酸序列。
SEQ ID NO6编码假单胞菌属菌种腈水解酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO7编码玫瑰色红球菌腈水解酶的核酸序列(DE10010149)。
SEQ ID NO8编码玫瑰色红球菌腈水解酶的氨基酸序列(DE10010149)。
实施例实施例1通过用其他氨基酸置换Y296产生经修饰的腈水解酶使用重叠序列延伸PCR通过定点诱变实现如SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶296位酪氨酸的取代。建立下列方法
使用下列引物
上面指出的引物中，NNN可代表任何碱基(A；T；C；G；摆动引物(wobbleprimer))。
PCR反应使用Pfu-聚合酶(Stratagene)，使用下列温度方案进行95℃3分钟；95℃45秒，55℃45秒和72℃2分50秒，25个循环；72℃10分钟；保存于4℃备用。所有PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳(E-Gel，Invitrogen)和柱层析(GFX-Kit，Pharmacia)纯化。3号PCR的产物随后用NdeI和HindIII消化，并克隆到相应消化的pDHE载体(DE19848129-A1)中。
实施例2用2-氯扁桃腈测定酶促活性用如实施例1所述产生的质粒转化大肠杆菌TG1并铺于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上。获得的克隆转到0.2ml液体LB-氨苄青霉素培养基中，并于37℃生长过夜。部分此培养物用于接种含2g/l用于诱导表达的L-鼠李糖的0.2ml液体LB-氨苄青霉素培养基。培养物生长过夜，收获并分析其催化2-氯扁桃腈的活性。为此目的在85μl 10mM PipespH7.2和25μl 2-氯扁桃腈(2-CMN)(48mM于甲醇中)加入90μl细胞悬浮液(于10mM Pipes pH7.2中)。50℃孵育40分钟后，通过加入HCl终止反应。通过HPLC分析上清液的2-氯扁桃酸。分离具有最高活性的克隆，从中制备质粒DNA，测序并转化进含pAgro pHSG575的TG10。(大肠杆菌TG10为包含鼠李糖异构酶rhaA缺陷的大肠杆菌TG1衍生物；pAgro(pBB541；Tashifumi Tomoyasu等(2001)Mol Microbiol 40(2)397-413)，且pHSG575(Takeshita S等(1987)Gene 6163-74)共表达伴侣分子GroELS的质粒)。
在还含有壮观霉素(50μg/ml)、氯霉素(chloramphenicole)(10μg/ml)和(如果对于酶诱导需要的话)L-鼠李糖(0.5g/L)和IPTG(0.1mM)的4ml规模的液体LB-氨苄青霉素中培养之后，以上选择克隆的活性得到验证。图1描述了与未修饰的对照TG10 pDHE1650 pAgro pHSG575比较，一些克隆的活性及其序列。
活性通过确定羧酸产量[μmol/(l*min)]计算。通过相对于测定法中使用的以600nm(OD600)下测量的光密度[mmol/(l*min*OD600)]表示的微生物生物量进行标准化而获得比活性。“相对比活性”通过将获得于特定标准底物(例如野生型腈水解酶)的比活性设为1.0并通过比例法(rule ofthree)转化其他腈水解酶的比活性计算。
实施例3腈水解酶(SEQ ID NO2)和其Y296C突变体底物接纳性的比较用包含SEQ ID NO2所述腈水解酶表达盒(pDHE1650)和其Y296C突变体(如上所述产生)的pDHE载体转化的大肠杆菌TG10预培养物在包含氨苄青霉素(100μg/ml)、壮观霉素(50μg/ml)、氯霉素(chloramphenicole)(10μg/ml)的25mL液体LB培养基中37℃连续振荡(200转/分)23小时。10ml得到的培养物用于接种包含氨苄青霉素(100μg/ml)、壮观霉素(50μg/ml)、氯霉素(chloramphenicole)(10μg/ml)、0.1mM IPTG和0.5g/L鼠李糖的400mL LB培养基并37℃连续振荡(200转/分)培养18小时。收获产生的生物质并用10mM Tris/HCl pH 7.0洗涤。
底物接纳性检测通过使用25μl细胞悬浮液/ml 10mM PIPES pH7.0/包含6mM所指示腈的10％MeOH，于40℃分别进行0.5小时和2小时而实施。反应通过加入1M HCl终止，上清通过HPLC分析。结果在图2中描述。显然，Y296位的突变造成对取代的芳基乙酰腈更广泛的底物接纳性。而未修饰的酶仅以低活性转变取代的腈，修饰造成对每一检测的取代底物的活性增加，而对未取代的底物活性保持不变。
通过测定羧酸产量[μmol(l*min)]计算活性。通过相对于测定法中使用的以600nm(OD600)下测量的光密度[mmol(l*min*OD600)]表示的微生物生物量相行标准化而获得比活性。“相对比活性”通过将获得于特定标准底物(例如未取代的扁桃腈)的比活性设为100％并通过比例法转化对其他底物的比活性计算。
实施例4通过用其他氨基酸置换Y296产生经修饰的腈水解酶4.1使用重叠序列延伸PCR通过定点诱变实现用丙氨酸取代粪产碱菌ATCC8750腈水解酶(SEQ.ID NO.4，称为“Nit8750ALCFA”)的酪氨酸Y296。建立下列方法
引物
如实施例1中所述进行PCR反应和克隆。所获克隆的质粒-DNA经测序证明携带编码经修饰的腈水解酶Nit8750_ALCFA-Y296A的所需突变。
4.2使用重叠序列延伸PCR通过定点诱变实现用丙氨酸取代假单胞菌属菌种腈水解酶(SEQ.ID NO.6，称为“Nit338_PSESP”；残基Y297与腈水解酶Nit1650_ALCFA和Nit8750_ALCFA中的Y296对应)的酪氨酸Y297。建立下列方法
引物
如实施例1中所述进行PCR反应和克隆。所获克隆的质粒-DNA经测序证明的携带编码经修饰的腈水解酶Nit338_PSESP-Y296A的所需突变。实施例5腈水解酶Nit8750_ALCFA和其Y296A突变体、Nit338_PSESP和其Y297A突变体底物接纳性的比较将分别包含SEQ ID NO4所述腈水解酶及其Y296A突变体，SEQ IDNO6所述腈水解酶及其Y297A突变体的表达盒的pDHE载体(如上所述产生)转化的单独的的大肠杆菌TG10预培养物在包含氨苄青霉素(100μg/ml)、壮观霉素(50μg/ml)、氯霉素(chloramphenicole)(10μg/ml)的25mL液体LB培养基中于37℃连续振荡(200转/分)下生长23小时。10ml所得的各培养物用于接种包含氨苄青霉素(100μg/ml)、壮观霉素(50μg/ml)、氯霉素(chloramphenicole)(10μg/ml)、0.1mM IPTG和0.5g/L鼠李糖的单批400mL LB培养基并在37℃连续振荡(200转/分)下生长18小时。分开收获产生的生物质，并用10mM Tris/HCl pH 7.0洗涤。
底物接纳性检测通过使用25μl单一细胞悬浮液/ml 10mM PIPESpH7.0/分别包含10mM扁桃腈和2-氯扁桃腈的10％MeOH，于40℃分别进行0.5小时和2小时而实施。反应通过加入1M HCl终止，上清通过HPLC分析。结果在图3中以2-氯扁桃腈对扁桃腈的比活性比率描述。通过将各野生型腈水解酶对扁桃腈的比活性设为100％，并通过比例法转化其它腈水解酶的比活性和2-氯扁桃腈的比活性进行计算。
Y296/Y297位的突变(每一个与SEQ ID NO2所述的粪产碱菌腈水解酶中Y296对应)造成对取代的芳基乙酰腈独立于野生型腈水解酶的更广泛的底物接纳性。而未修饰的酶仅以低活性转变取代的腈，修饰造成对每一个测试的取代底物活性的增加。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>经修饰的腈水解酶及它们在产生羧酸的方法中的用途<130>AE20020055<140>
<141>
<160>8<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>1071<212>DNA<213>粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1068)<223>编码腈水解酶<220>
<221>变异<222>(886)..(888)<223>用于非酪氨酸修饰变异的密码子<400>1atg cag aca aga aaa atc gtc cgg gca gcc gcc gta cag gcc gcc tct 48Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser1 5 10 15ccc aac tac gat ctg gca acg ggt gtt gat aaa acc att gag ctg gct 96Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala20 25 30cgt cag gcc cgc gat gag ggc tgt gac ctg atc gtg ttt ggt gaa acc 144Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr35 40 45tgg ctg ccc gga tat ccc ttc cac gtc tgg ctg ggc gca ccg gcc tgg 192Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp50 55 60tcg ctg aaa tac agt gcc cgc tac tat gcc aac tcg ctc tcg ctg gac 240Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp65 70 75 80agt gca gag ttt caa cgc att gcc cag gcc gca cgg acc ttg ggt att 288Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile85 90 95
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1.分离的编码腈水解酶的多肽，其中所述多肽包含至少一个这样选自以下序列a)(K/R/H)XXDXXGX(X*)，b)与腈水解酶共有序列具有至少50％同源性的序列，其中所述的腈水解酶共有序列选自i)KAINDPVGH(X*)ii)GH(X*)SRPDV，和c)与腈水解酶共有序列具有至少35％同源性的序列，其中所述的腈水解酶共有序列选自i)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和ii)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，条件是包含于所述分离的多肽的该序列中，X*代表非酪氨酸的氨基酸残基，并且其中X*位于如SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的位置。
2.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽包含至少一个选自以下的序列a)(K/R)XXXDXXG(H/Y/S)(X*)，b)KXXXDXXGX(X*)，c)KAINDPVGH(X*)，d)GH(X*)SRPDV，e)DP(A/V)GH(X*)SRPDV(L/T)(S/R)L，和f)DPAGH(X*)SRPDVLSLLV，其中X*代表任何氨基酸，条件是包含于所述分离的多肽的该序列中X*代表非酪氨酸的氨基酸残基，并且其中X*位于如SEQ ID NO2所述的野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应的位置。
3.权利要求1或2的分离的多肽，其中X*选自半胱氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸和苏氨酸。
4.权利要求1-3所述的分离的多肽，其中所述多肽编码的腈水解酶与同该腈水解酶除了SEQ ID NO2所述野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应位置的氨基酸残基外相同的腈水解酶比较表现出经调节的接纳性。
5.权利要求1-4中任何一项的分离的多肽，其中所述多肽还由以下多肽序列描述a)包含与SEQ ID NO2、4、6或8的氨基酸序列至少60％，优选80％，更优选90％，最优选地95％相同的氨基酸序列的多肽分子；和b)包含至少一个SEQ ID NO2、4、6或8所述序列的至少20个连续氨基酸，优选50个连续氨基酸的片段的多肽分子。
6.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-5中任何一项的多肽的序列。
7.重组表达构建体，其包含至少一个权利要求6的核酸。
8.重组表达载体，其包含至少一个权利要求5的重组表达构建体和/或至少一个权利要求6的核酸。
9.重组生物，其包含至少一个权利要求8的重组表达载体，至少一个权利要求7的重组表达构建体和/或至少一个权利要求6所述的核酸。
10.权利要求9的重组生物，其中该生物选自细菌、真菌、藻类或植物生物。
11.权利要求9或10的重组生物，其中微生物为埃希氏菌属、红球菌属、诺卡氏菌属、链霉菌属或分歧杆菌属的细菌。
12.生产具有经调节的底物接纳性的腈水解酶的方法，其至少包含在该腈水解酶中用另一个氨基酸置换SEQ ID NO2所述野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应位置的至少一个酪氨酸的步骤。
13.调节腈水解酶底物接纳性的方法，其至少包含在该腈水解酶中用另一个氨基酸置换SEQ ID NO2所述野生型粪产碱菌腈水解酶中296位相应位置的至少一个酪氨酸的步骤。
14.生产羧酸的方法，其中腈或醛或酮与氰化物的混合物通过权利要求1-5中任何一项的一个或多个多肽之一，或权利要求9-11任何一项的一个或多个生长的、休眠的或破坏的重组生物的作用转变成相应的羧酸。
15.权利要求14的方法，其中至少一个通式I的腈被转变成通式II的羧酸 其中取代基R1、R2、R3可互相独立地选自氢、取代或未取代、分枝或不分枝的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基或杂芳基、羟基、卤素、C1-C10-烷基氨基和氨基，并且基团R1、R2和R3中至少有两个不同。
16.权利要求14或15的方法，其中腈选自外消旋邻氯扁桃腈、对氯扁桃腈、间氯扁桃腈、邻溴扁桃腈、对溴扁桃腈、间溴扁桃腈、邻甲基扁桃腈、对甲基扁桃腈和间甲基扁桃腈和与此项权利要求的腈对应的醛和氰化物的混合物。
17.权利要求14-16中任何一项的方法，其中产生的光学活性羧酸选自R-扁桃酸、S-扁桃酸、R-对氯扁桃酸、S-对氯扁桃酸、R-间氯扁桃酸、S-间氯扁桃酸、R-邻氯扁桃酸、S-邻氯扁桃酸、S-邻溴扁桃酸、S-对溴扁桃酸、S-间溴扁桃酸、S-邻甲基扁桃酸、S-对甲基扁桃酸、S-间甲基扁桃酸、R-邻溴扁桃酸、R-对溴扁桃酸、R-间溴扁桃酸、R-邻甲基扁桃酸、R-对甲基扁桃酸和R-间甲基扁桃酸。
18.在植物生物中实现除草剂抗性的方法，其中用包含编码腈水解酶的核酸序列的表达盒转化所述植物生物，其中所述腈水解酶在SEQ ID NO2所述野生型粪产碱菌腈水解酶296位相应的位置包含非酪氨酸的氨基酸，其中所述该核酸序列受在该植物生物中发挥作用的启动子的控制。
全文摘要
本发明涉及具有经修饰的底物接纳性的新的腈水解酶、获得它们的方法和上述腈水解酶的用途。所述腈水解酶由多肽序列编码，其中所述多肽序列在与野生型粪产碱菌296位相应的位置包含非酪氨酸的氨基酸。本发明还涉及编码该腈水解酶的核酸序列和氨基酸序列，涉及包含所述核酸序列的表达构建体，包含核酸序列或表达构建体的载体，涉及包含核酸序列、表达构建体或载体的生物体，优选微生物。本发明额外涉及制备羧酸的方法，优选从外消旋腈制备取代的手性羧酸。
文档编号C12N15/55GK1753990SQ200480005397
公开日2006年3月29日 申请日期2004年2月24日 优先权日2003年2月27日
发明者T·泽林斯基, M·凯塞勒, B·豪尔, T·弗里德里希 申请人:巴斯福股份公司