专利名称：测定细胞内环状核苷酸的浓度的测试方法
技术领域：
本发明涉及对环状鸟嘌呤核苷-3′，5′-一磷酸盐(cGMP)或环状的腺嘌呤核苷-3′，5′-一磷酸盐(cAMP)的胞内浓度进行定量光学分析的方法。该方法可用于鉴别和评估对参与环状核苷酸cGMP和cAMP的生成和分解的受体或酶的活性有影响的测试物质的药理学特性。因此该方法适合用于获得例如可溶的和膜结合的鸟苷酸环化酶、磷酸二酯酶(PDE)、NO合成酶和G蛋白质耦合的受体(GPCR)的调节物。
本发明描述了一种方法，该方法借助于重组细胞系对细胞内的cGMP或cAMP的浓度进行测量。所述细胞系通过将环状核昔酸活化的离子通道(CNG-通道)、一种钙敏感的光蛋白以及受体或酶组合一起重组表达，以便找到调节物。该方法适用于自动化，以及以高的或非常高的处理能力(″高通量筛选″(HTS)和″超高通量筛选″(uHTS))来寻找调节物。
现有的测量cGMP或cAMP的胞内浓度的方法存在缺陷由于使用了放射性，非常昂贵，不能或只能部分地用于自动测量，并且非常昂贵。
用于测定cGMP和cAMP的传统商业系统是放射性技术如″放射性免疫分析″(RIA；例如来自于IBL，Hamburg)，″闪烁接近分析法″(SPA；AmershamBioscience，UK)和非放射性的″酶联免疫吸附分析″(ELISA；例如来自于Amersham Bioscience，Uk)。
上面描述的方法不能用于在活的细胞中“原位”测定cGMP和cAMP胞内浓度。在测量时必须将细胞破碎，并随后提取出环状核苷酸。
另一种测量cAMP胞内浓度的方法是借助于诱导性的启动子系统(″cAMP-应答元件″，CRE)和荧光素酶(Goetz等人，J.Biomol.Screen.(2000)5377-384)进行测量。该方法的缺点是为了形成信号必须启动转录和转译，这导致测量过程持续几小时以上。因此不适于快速测量细胞中实际的cAMP浓度。
本发明的任务是找到一种改进的非放射性的方法，用于测量细胞内cGMP或cAMP的浓度。该方法可以非常快速实施，并且有更高的灵敏性。该方法应当能够自动化并适合以高试样或测试化合物通量(HTS和uHTS)进行筛选。
本发明范围内的测试化合物优选的是分子量为100到500，或者100到1000，或以上的小分子化合物。在本发明方法中可以是使用单一物质或其混合物。本发明范围内的测试化合物包括抗体、天然物质、天然物质的提取物、肽、蛋白质及核酸。上面所述只是为了举例说明，而不是穷举。
为了建立酶和受体的筛选系统，以单一或不同组合的方式，将各种各样的对细胞内cAMP或cGMP水平有影响的由环状核苷酸活化的离子通道(CNG通道)转染到细胞中，所述的细胞另外还组合表达钙敏感的光蛋白。接着用各种各样的酶或受体转染所述细胞，以检测高通量筛选细胞的能力。在此例如使用可溶性的鸟苷酸环化酶，因为它在受刺激的情况下，能够形成胞内cGMP。例如β-肾上腺素能受体可用作为受体，其在活化之后，诱导胞内cAMP浓度上升。
CNG通道是内在膜蛋白，它被环状核苷酸cGMP和cAMP打开。所述的离子通道家族包括能渗透钠、钾和钙离子的非选择性阳离子通道。功能性的通道是由四种相同的或不同的亚单位(同源或异源四聚体)形成的。不同的亚单位组合将影响其对cGMP和cAMP的敏感性(Biel等人，TCM(1996)6，274-280；Kaupp和Seifert，Physiol.Rev.(2002)82，769-824)。CNG1-CNG6的通道亚单位已被克隆和公开了，其最新的分类命名为CNGA1-CNGB3(Bradley等人，Science(2001)294，2095-2096)。还存在拼接变型，如CNG4.3(Sauter等人，PNAS(1998)95，4696-4701)。
随着胞内cGMP或cAMP浓度的上升，CNG通道被打开，并且通过其流入钙离子。这时借助于钙敏感的荧光指示剂，如FURA，Fluo-3或借助于钙敏感的发光蛋白，如水母发光蛋白或奥贝林(Obelin)证实流入的钙离子。
来源于水母(Aequorea victoria)的发光蛋白水母发光蛋白在细胞中是高敏感的钙指示剂。水母发光蛋白复合物由蛋白质Apoaequorin，分子氧和发光体腔肠素组成。在钙存在时(Ca2+-离子)复合物发出蓝光，在466nM处有最大发光量(Jones等人，Trends Biotechnol.(1999)17，477-481)。
另一个发光蛋白是奥贝林，它是从不同的水螅纲如双叉薮枝(Obelialongissirna)克隆得到。它是由Apoobelin、O2和发光体腔肠素组成。钙存在时同样发出蓝光(Illarionov等人，Methods Enzymol.(2000)305，223-49)。
鸟苷酸环化酶负责由GTP产生cGMP。可以分为可溶性的和膜结合的鸟苷酸环化酶。可溶性的鸟苷酸环化酶是一个来自于α和β亚单位的异源二聚体。其对于内皮NO合成酶制备的一氧化氮(NO)是天然的受体，因此可以借助于释放NO的物质如SIN-1活化其药理学特性。由于由鸟苷酸环化酶制备的cGMP诱导血管放松，所述的酶包括有高价值的药物学靶(Hobbs AJ.，TIPS(1997)18，484-491)。膜结合的具有跨膜蛋白的片段，被不同的激动剂如ANP、BNP、CNP或鸟苷蛋白活化(Wedel和Garbers，Annual Rev.Physiol.(2001)63，215-233)。
另一个药物上有用的蛋白家族是所谓的G蛋白质结合的受体(GPCR)。它们是在细胞内具有胞外激素作用的内在膜蛋白。该受体与不同的G蛋白质的耦合，影响到细胞内cAMP或钙的水平。所谓的Gq耦合的受体的活化导致钙从内部存贮中释放，从而提高了细胞质中钙的浓度。所谓的Gs耦合的受体的活化导致cAMP浓度提高，所谓的Gi耦合的受体的活化却相反地导致胞内cAMP含量下降(Gurrath M.，Curr.Med.Chem.(2001)8，1605-1548)。Gs耦合的受体的一个例子是所谓的β-肾上腺素能受体，它借助于激动剂如异丙肾上腺素起刺激作用(Dzimiri N.，Pharmakol.Rev.(1999)51，465-501)。
由鸟昔酸环化酶和GPCRs产生的环状核苷酸cGMP或cAMP被所谓的磷酸二酯酶(PDEs)水解为GMP或AMP。磷酸二酯酶构成了酶家族，基于物质特异性、在体内的调节和表达方式可清楚地区分其成员(Francis等人，Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.(2001)65，1-52)。PDEs对胞内cAMP和cGMP水平的控制起着决定性的作用，并且也是药物学干扰的重要的靶。
令人惊奇的是，CNG3-通道(SEQ ID NO5，Acc.No.X 89600)或者特别是CNG2通道(Seq ID Nr.1.Acc.No.X55010)与一种发光蛋白的组合，特别适合于检测胞内cGMP浓度的变化(附图1)。
同样令人惊奇的是，CNG2/CNG4.3/CNG5(Seq ID Nr.1/Seq ID Nr.2，Acc.No.AJ000515/Seq ID Nr.3，Acc.No.U12623)与发光蛋白的组合可以非常好地适合检测胞内cAMP浓度的变化(附图3)。对于适用于cAMP测量，特别好的是CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5(Seq ID Nr.4/Seq ID Nr.2/Seq ID Nr.3)与发光蛋白的组合。对于CNG2突变体CNG2(T537A)(Seq ID Nr.4)，其氨基酸苏氨酸-537被丙氨酸替代(Altenhofen等人，PNAS(1991)88，9868-9872)。
可以使用常规载体如pcDNA1.1 Amp或pcDNA3(Invitrogen LifeTechnologies)来制备重组细胞系。采用例如Lipofectamin(Invitrogen LifeTechnologies)的转染试剂转染合适的质粒构建体。
在测量时，将细胞置于384孔微滴板(MTP上，每孔1500个细胞，置于1536孔的MTP上，每孔250个细胞。在37℃/5％CO2条件下培养1-2天后，将细胞培养基(添加了10％胎牛血清的DMEM/F12)去掉，在37℃/5％CO2条件下在无钙的蒂罗德溶液(Tyrode)中用腔肠体(0.8μg/ml)对细胞加载3小时。然后在无钙蒂罗德溶液中加入测试物质和相应的控制物质(例如SIN-1或异丙基肾上腺素)，在前述细胞孵育5-10分钟。随后，在附加了含超过峰值(钙终浓度3mM)钙的蒂罗德溶液的暗箱中，借助于″电荷耦合器件(Charge-comple device)″照相机进行实际的测量。
为了直接测量物质的效果，将带腔肠体的细胞装入含钙的蒂罗德溶液中。然后在暗箱内将物质加入，在物质加入后立即进行测量(附图5).
该方法的优点在于测量的灵敏度高，单位测试点费用低，适用于HTS或uHTS。该方法具有极好的信噪比，达到了50-150倍刺激因子。另外，测试物使用的时间非常短，原因是几秒钟后即可观察到信号(附图5)。该方法的优点是将测试物质在所使用的细胞的非特异性作用(例如借助细胞毒性)降低到最小。此外，该方法适用对所谓的″孤儿受体″(指其自然配体未知的受体)进行定性，因为借助于光或荧光测量，既可观察到细胞内cAMP(Gs耦合和Gi耦合)的变化，也可观察到细胞内钙浓度(Gq耦合)的变化。
本发明涉及用于测量环状核苷酸胞内浓度的方法，其特征在于制备和使用一种细胞，所述细胞将CNG通道与发光蛋白一起表达，并且借助于发光蛋白的发光信号测定环状核苷酸的胞内浓度。
根据本发明在上述的方法中，其中CNG通道是指CNG2或CNG3通道。
上述方法是本发明的组成部分，其中环状核苷酸是cGMP。
同样在根据本发明的前述方法中，其中环状核苷酸是cAMP并制备和使用一种细胞，该细胞表达CNG2/CNG4.3/CNG5通道的组合。
本发明涉及前述方法，其中环状核苷酸是cAMP并制备和使用一种细胞，该细胞表达CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5通道的组合。
本发明的主题是前述方法，其中发光蛋白是水母发光蛋白。
本发明还涉及上面所述的方法，其中发光蛋白是奥贝林。
本发明涉及用于筛选用于识别受体配体的测试化合物的方法，其中使用一种如上所述的方法，在所用的细胞中表达受体，并且具有一个允许受体配体结合的胞内信使系统，导致通过离子通道的离子流可测量的调节，将该细胞用测试物质孵育，选出调节发光的那些测试物质。
本发明还涉及这样的方法，其中所述的受体是G蛋白耦合的受体。
本发明还涉及相应的方法，其中G蛋白耦合的受体是孤儿受体。
本发明的主题还在于另一方法，用于筛选识别磷酸二酯酶调节物的测试物质的方法，其中使用前述方法之一，其中所用的细胞表达磷酸二酯酶，将细胞用测试物孵育，选出能够调节发光的那些测试物。
本发明同样涉及用于筛选识别鸟苷酸环化酶的调节物的测试化合物的方法，其中使用前述方法之一，该方法将所用的细胞用测试物孵育，选出能够调节发光的那些测试物。
本发明还涉及用于筛选识别NO合成酶的调节物的测试化合物的方法，其中使用了上面描述的方法之一，该方法以所用的细胞表达NO合成酶以及可溶性鸟苷酸环化酶，该细胞用测试化合物孵育，选出能够调节发光的那些测试物。
本发明还涉及一种相应的方法，其中在不同的细胞中表达NO合成酶和可溶性鸟苷酸环化酶。
本发明还涉及一种细胞，它是由前述任一种方法制备的。
附图1图解显示测定胞内cGMP浓度的方法。
附图2用SIN-1活化可溶性鸟苷酸环化酶之后，测量发光值。″相对光单位″(RLU＝″相对光单位″)的测量进行1分钟。显示了在该时间内相对于SIN-1浓度的测得的光量。
附图3图解显示测定胞内cAMP浓度的方法。
附图4在用异丙肾上腺素激活β-肾上腺素能受体之后发光值的测量。在无钙的蒂罗德溶液中用异丙肾上腺素孵育10分钟。通过加入钙开始测量。以秒间隔测量″相对光单位″(RLU＝″相对光单位″)。在加入钙之后和用0M(星型)，10-7M(四边形)和10-6M(三角形)异丙肾上腺素预培养时，发光信号随时间的走向。
附图5在含钙的蒂罗德溶液中用异丙肾上腺素激活β-肾上腺素能受体之后，发光信号的动力学。在暗箱内加入激动剂异丙肾上腺素(10-6M)后开始测量。
实施例在细胞系中补充表达例如可溶性的鸟苷酸环化酶，在cGMP测试系统中，将钙敏感的光蛋白与CNG2通道(Seq ID Nr.1)一起表达，因此在鸟苷酸环化酶刺激剂SIN-1的帮助下，胞内cGMP浓度剂量依赖性地提高并且检测到更强的发光信号(附图2)。
在细胞系中补充表达例如β-肾上腺素能受体，在cGMP测试系统中，将钙敏感的光蛋白与CNG通道种类CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5(seq ID Nr.4/SeqID Nr.2/Seq ID Nr.3)一起表达，从而借助于剂量依赖性的异丙肾上腺素激活该受体，导致cAMP浓度升高和发光信号增强(附图4)。在含钙的蒂罗德溶液中装载具有腔肠体的细胞，以便可以直接向暗箱内的细胞供给激动剂异丙肾上腺素。然后在几秒钟内观察到发光信号(附图5)。
序列表<110>Bayer AG，BHC<120>用于测定胞内环状核苷酸浓度的测试方法<130>Le A 36 621<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3166<212>DNA<213>Bos taurus<400>1gctcacctac tggcaggctg gggtgtgcag gccccacagt gagagggtca gacatccagc 60cagtgggcag aactgtttct ccagtgggca agtgctgccc tgggccgagg cctcgacctc120gcctcagctg taggcatggg ctcctctgag tcactgccgg cctcccctgc tggcctcagg180cagggcgggc agctctttga ctgagaggct gagaagctgc gtggggattc ggggatcccc240ctggtctggg gacaggagct ttgggaggtc tctactgtcc cttggtgctg atgagctccc300gagggttcgt ctctgactgg aagcttcttg gacagaccta tagcctgtgg ccaagggaca360ccctgcctcg gaatccgtct ggtgaggaaa ggtgagggtc ctggttgtac atggaggatg420acagaaaaag ccaatggcgt gaagagctcc ccagccaata accacaacca ccatgcccct480cctgccatca aggccagtgg caaagatgac cacagggcca gcagccggcc acagtctgct540gctgctgatg acacctcctc agagctacag caactggcag agatggatgc cccccagcag600aggaggggtg gcttccgcag gattgcccgc ctggtggggg tcctcagaga gtgggcttac660aggaacttcc gtgaggagga gcctagacct gactcattcc ttgagcgttt ccgggggcct720gagctccaca ccgtgacaac acaacaagga gacggcaaag gcgacaagga cggcgagggc780aagggcacca agaagaagtt tgaactcttt gtcttggacc cagccgggga ctggtactac840cgctggcttt ttctcattgc cttgcccgtc ctctacaact ggtgcctatt ggtggccaga900gcctgcttca gtgacctgca gaaaggctac tacatagtgt ggctggtgct ggattacgtc960tcagatgtgg tctacatcgc agacctcttc atccgactgc gcacaggttt cttggagcag 1020gggctactgg tgaaagacac caagaagttg cgggacaact acatccacac catgcagttt 1080aagctggatg tggcctccat catccctaca gacctgatct attttgctgt ggggatccat 1140aaccctgagg tgcgcttcaa ccgcctgcta cactttgccc gcatgtttga gttctttgac 1200cgcactgaga cacgcaccag ctaccccaac atcttccgaa taagcaacct gatcctctac 1260atcttgatca tcattcactg gaatgcctgc atctactatg ccatctccaa gtccatcggc 1320tttggggtag acacctgggt ttaccccaac atcactgacc ctgagtatgg ctacctgtct 1380agggagtaca tctattgcct ttactggtct acactgaccc tcaccaccat tggggagaca 1440ccaccccctg taaaggatga ggagtacctg tttgtcatct ttgacttcct gattggtgtc 1500ctcatctttg ccaccatcgt gggaaatgtg ggctccatga tctccaacat gaatgccacc 1560
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权利要求
1.测定胞内环状核苷酸浓度的方法，其特征在于i)制备和使用一种细胞，该细胞将CNG通道与发光蛋白一起表达，和ii)借助于发光蛋白的发光信号测定细胞内环状核苷酸的浓度。
2.权利要求1的方法，其中所述的CNG通道是指CNG2或CNG3通道。
3.权利要求1或2的方法，其中所述的环状核苷酸是cGMP。
4.权利要求1的方法，其中所述的环状核苷酸是cAMP，并且制备和使用一种细胞，该细胞表达CNG2/CNG4.3/CNG5通道的结合体。
5.权利要求1的方法，其中所述的环状核苷酸是cAMP，并且制备和使用一种细胞，该细胞表达CNG2(T537A)/CNG4.3/CNG5通道的结合体。
6.权利要求1-5的方法，其中发光蛋白是水母发光蛋白。
7.权利要求1-5的方法，其中发光蛋白是奥贝林。
8.一种用于鉴定受体-配体的测试化合物的筛选方法，其中使用了权利要求1-7之一的方法，该方法中使用的细胞能够表达受体并且具有胞内信使系统，该系统允许受体-配体结合，引起通过离子通道的离子流的可测量调节，将该细胞用测试物质孵育，并选出能够调节发光的测试物质。
9.权利要求8的方法，其中所述的受体是G-蛋白质偶合的受体。
10.权利要求9的方法，其中所述的G-蛋白质偶合的受体是孤儿受体。
11.一种用于鉴定磷酸二酯酶的调节物的测试化合物的筛选方法，其中使用了权利要求1-7之一的方法，该方法中使用的细胞表达磷酸二酯酶，将该细胞用测试物质孵育，并选出能够调节发光的测试物质。
12.一种用于鉴定鸟苷酸环化酶的调节物的测试化合物的筛选方法，其中使用了权利要求1-7之一的方法，该方法中使用的细胞表达鸟苷酸环化酶，将该细胞用测试物质孵育，选出能够调节发光的测试物质。
13.一种用于鉴定NO合成酶的调节物的测试化合物的筛选方法，其中使用了权利要求1-7之一的方法，该方法中使用的细胞表达NO合成酶以及可溶的鸟苷酸环化酶，将该细胞用测试物质孵育，选出能够调节发光的测试物质。
14.权利要求13的方法，其中在不同的细胞中表达NO合成酶和可溶性的鸟苷酸环化酶。
15.按权利要求1-14之一的方法制备的细胞。
全文摘要
本发明涉及对细胞内环状核苷酸cGMP和cAMP的浓度进行定量光学分析的方法。所述的方法利用了以重组方式将特定CNG通道、钙敏感的光蛋白和不同靶蛋白组合表达的细胞系，以找出调节物。以该方式修饰的细胞系适用于高通量筛选(HTS和uHTS)，并且可用于鉴别对参与环状核苷酸cGMP和cAMP的形成或分解的受体或酶的活性有影响的药物。
文档编号C12Q1/26GK1761879SQ200480007094
公开日2006年4月19日 申请日期2004年3月6日 优先权日2003年3月18日
发明者F·温德尔 申请人:拜耳医药保健股份公司