改良的转化体以及用其制造聚酯的方法

专利名称：改良的转化体以及用其制造聚酯的方法
技术领域：
本发明涉及为了酶合成共聚聚酯所必需的基因、利用该基因发酵合成聚酯的微生物、以及使用该微生物制造聚酯的方法。
背景技术：
现知道至今为止在大量的微生物中，将聚羟基链烷酸(以下，简称为PHA)等聚酯作为能源储存物质储藏在菌体内。作为其代表例是3-羟基丁酸(以下，简称为3HB)的均聚物聚-3-羟基丁酸(以下，简称为P(3HB))，其在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中于1925年最初被发现(参照非专利文献1)。P(3HB)为热塑性高分子，由于可以在自然环境中被生物降解，因此作为环保塑料而受到注目。可是，由于P(3HB)结晶性高，具有硬而脆的性质，在实际应用上限制了其应用范围。因此，形成了以改良该性质为目的的研究。
其中，公开了含有3-羟基丁酸(3HB)和3-羟基戊酸(以下，简称为3HV)的共聚物(以下，简称为P(3HB-co-3HV))的制备方法(参照专利文献1、2)。该P(3HB-co-3HV)与P(3HB)相比，由于富有柔软性，被认为可以应用于广泛的用途。可是，实际应用时，即使P(3HB-co-3HV)增加3HV的摩尔分数，其物理特性也缺乏变化，特别是使用于膜等时，由于柔软性没有提高到所需程度，只能利用于洗发液瓶子或1次性剃刀的把手等硬质成型体的领域。
近年，进行了对3HB和3-羟基己酸(以下，简称为3HH)这两种成分的共聚聚酯(以下，简称为P(3HB-co-3HH))的制造方法的研究(参照专利文献3、4)。这些专利文献的P(3HB-co-3HH)的制造方法是使用从土壤分离的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)，由油酸等脂肪酸或橄榄油等油脂发酵生产。另外，还形成了关于P(3HB-co-3HH)的性质的研究(参照非专利文献2)。在此报告中，将碳原子数12个或12个以上的脂肪酸作为唯一的碳源，培养豚鼠气单胞菌，发酵生产3HH为11～19摩尔％的P(3HB-co-3HH)。已知，该P(3HB-co-3HH)随着3HH摩尔分数的增加，由P(3HB)的硬而脆的性质渐渐地变为显示柔软的性质，并显示超过P(3HB-co-3HV)的柔软性。可是，在该制备方法中，由于菌体生产量为4g/L、聚合物含量为30％，聚合物生产率低，为面向实用化，需要进一步探索获得高生产率的方法。
PHA合成酶基因是从生产P(3HB-co-3HH)的豚鼠气单胞菌(A.caviae)克隆的(参照专利文献5、非专利文献3)。将该基因导入富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha，旧名为真氧产碱菌(Alcaligenes eutrophus))得到转化体，使用植物油脂作为碳源培养转化体，达到了菌体含量4g/L、聚合物含量80％(参照非专利文献4)。另外，还公开了以大肠杆菌等细菌或植物为宿主的P(3HB-co-3HH)的制造方法，但没有记载其生产率(参照专利文献6)。
上述聚合物P(3HB-co-3HH)，通过控制3HH摩尔分数，可以具有由硬质聚合物到软质聚合物的宽范围物理特性，因此，可以期待向电视机的框体等要求硬度的物体到线或膜等要求柔软性的物体的广泛领域的应用。可是，这些制备方法的聚合物生产率依然低，仍不足以作为该聚合物实用化的生产方法。
最近，由吉瀬等报道了一种构建大肠杆菌的方法，该方法是通过在进化工学上改变来源于豚鼠气单胞菌的P(3HB-co-3HH)合成酶并将其基因导入到大肠杆菌中，从而构建与导入了野生型基因的大肠杆菌相比，高蓄积P(3HB-co-3HH)的大肠杆菌(参照非专利文献5)。其中，可以得到E2-50株以及T3-11株作为P(3HB-co-3HH)合成酶比活性提高了的菌株。E2-50株是P(3HB-co-3HH)合成酶的第149个氨基酸天冬酰胺被丝氨酸取代的突变菌株，T3-11株是第171个氨基酸天冬氨酸被甘氨酸取代的突变菌株。E2-50株的变异酶比活性提高到天然型的约1.5倍，T3-11株提高到天然型的约1.2倍。可是，通常，由于大肠杆菌不能利用廉价的油脂作为碳源，另外，不具有合成P(3HB-co-3HH)的构成单元的途径中必要的乙酰辅酶A缩合酶，因此，如果不从其它的途径导入油脂分解类或底物供给类的基因等，则不能得到廉价并且有效的生产体系。另外，アマラ等也取得了比活性提高到5倍的突变体，但在将葡萄糖作为碳源时的聚合物生产率只不过稍有提高(参照非专利文献6)。在大肠杆菌中，提高了活性的变异型聚合物合成酶不能充分地发挥其能力，另外，大肠杆菌也不能直接利用廉价的植物油脂作为碳源等，在经济性方面缺乏作为聚合物生产宿主的实用性。
由Leaf等进行了将菌体生产率高的酵母作为宿主的生物降解性聚酯的生产研究(参照非专利文献7)。在作为酵母的一种的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中导入富养罗尔斯通氏菌(R.eutropha)的聚酯合成酶基因而制作转化体，并通过以葡萄糖作为碳源进行培养，确认了P(3HB)的蓄积。可是，在上述研究中生产的聚合物含量停留在0.5％，该聚合物是具有硬而脆的性质的P(3HB)。并且还进行了在酿酒酵母中表达来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的聚酯合成酶基因，将脂肪酸作为碳源生产含有碳原子数5或5以上的单体的共聚物研究。此时，生产的聚合物含量也停留在0.5％(参照非专利文献8)。另外，还进行了在巴斯德毕赤氏酵母(PichiaPastoris)的过氧化物酶体中，定位表达来源于相同的假单胞菌种的聚酯合成酶基因，并且将油酸作为碳源生产聚酯的研究。按照该研究，示出了每单位干燥菌体蓄积了1％重量的聚合物(参照非专利文献9)。可是，这种程度的蓄积量，是完全不够的。
已知酵母的增殖快，菌体生产率高。其中，过去，属于假丝酵母(candida)属的酵母作为单细胞蛋白质备受瞩目，研究了将正构烷烃作为碳源生产菌体作为饲料。另外，近年还报道了开发假丝酵母(Candida)属的宿主载体体系，使用了基因重组技术的物质生产(参照非专利文献10)。将产朊假丝酵母(Candida utilis)作为宿主的α-淀粉酶的生产率高达约12.3g/L，期待具有这样高的物质生产能力的假丝酵母(candida)属微生物作为聚合物生产用宿主。另外，与细菌相比，由于菌体与培养液的分离容易，还可以使聚合物的提取精制工序更加简单。
因此，虽然开发了使用假丝酵母(candida)属酵母等生产具有优异的物理特性的P(3HB-co-3HH)的方法，但在聚合物的生产率方面还必须进一步加以改良(参照专利文献7)。作为提高单位菌体的聚合物生产量的方法之一，可以举出增加聚合物合成酶的菌体内量的方法。作为增加聚合物合成酶的菌体内量的方法，有使用强启动子的方法或使用拷贝数多的质粒的方法、在质粒或染色体中导入多个酶表达单元的方法等。可是，已知如果增加单位菌体的酶的分子数，将引起生产的聚合物的分子量降低(参照非专利文献11、12)。由于聚合物的分子量对生物降解性聚合物的物理特性带来很大的影响，因此，期望开发不导致分子量的降低而提高生产率的方法。
专利文献1特开昭57-150393号公报专利文献2特开昭59-220192号公报专利文献3特开平5-93049号公报专利文献4特开平7-265065号公报专利文献5特开平10-108682号公报专利文献6国际公开第00/43525号小册子专利文献7国际公开第01/88144号小册子非专利文献1M.Lemoigne，Ann.Inst.Pasteur，39，144(1925)非专利文献2Y.Doi，S.Kitamura，H.Abe，Macromolecules 28，4822-4823(1995)非专利文献3T.Fukui，Y.Doi，J.Bacteriol，vol.179，No.15，4821-4830(1997)非专利文献4T.Hukui等，Appl.Microbiol.Biotecnol.49，333(1998)非专利文献5T.Kichise等，Appl.Environ.Microbiol.68，2411-2419(2002)非专利文献6Amara AA.等，Appl.Microbiol.Biotecnol.59，477-482(2002)非专利文献7Microbiology，vol.142，pp1169-1180(1996)非专利文献8Poirier Y.等，Appl.Microbiol.Biotecnol.67，5254-5260(2001)非专利文献9Poirier Y.等，FEMS Microbiology Lett.，vol.207，pp97-102(2002)非专利文献10化学与生物 Vol.38，No.9，614(2000)非专利文献11Sim S.J.等，Neture Biotechnology，vol.15，pp63-67(1997)非专利文献12Gerngross T.U.，Martin D.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.92，pp6279-6283(1995)发明内容发明要解决的课题本发明鉴于上述现状，其目的在于提供一种可以在酵母中以有功能并且有效的方式表达的PHA合成酶突变基因、用含有该突变基因的基因表达盒转化酵母得到的转化体，以及通过培养该转化体而制造的具有生物降解性以及优异的物理特性的P(3HB-co-3HH)等聚酯。
解决问题的手段本发明者们进行了各种研究，结果发现，在来源于豚鼠气单胞菌的PHA合成酶的氨基酸序列中导入特定的突变，将编码该突变的氨基酸序列的基因与在酵母中实质上发挥功能的启动子、终止子相连，构建基因表达盒，再将该基因表达盒导入到酵母中，得到转化株，通过培养该转化株，可以从该培养生产并回收聚酯并且预计生产率极高。
即，本发明涉及在酵母中应用来源于豚鼠气单胞菌的PHA合成酶突变体的基因。
具体地，涉及一种含有PHA合成酶突变基因和在酵母中发挥功能的启动子以及终止子的基因表达盒，所述PHA合成酶突变基因是编码在含有序列表1所示氨基酸序列的来源于豚鼠气单胞菌的PHA合成酶中，进行至少1个以下的(a)～(h)的氨基酸取代而得到的PHA合成酶突变体的PHA合成酶突变基因。
(a)Asn-149被Ser取代(b)Asp-171被Gly取代(c)Phe-246被Ser或Gln取代(d)Tyr-318被Ala取代(e)Ile-320被Ser、Ala或Val取代(f)Leu-350被Val取代(g)Phe-353被Thr、Ser或His取代(h)Phe-518被Ile取代另外，本发明还涉及在编码上述PHA合成酶突变体的PHA合成酶突变基因中，添加编码过氧化物酶体定位信号的DNA而形成的基因。
作为其优选的实施方案，是关于上述基因，其中的过氧化物酶体定位信号含有由序列号2或序列号3所示的氨基酸序列；更加优选的实施方案，是关于上述基因，其中编码过氧化物酶体定位信号的DNA碱基序列为序列号4或序列号5所示的碱基序列。
作为其他的优选的实施方案，是关于上述基因，其中编码来源于豚鼠气单胞菌的PHA合成酶的基因中至少1个CTG密码子变换为TTA、TTG、CTT、CTC或CTA。
另外，本发明还涉及含有上述基因和在酵母中发挥功能的启动子以及终止子的基因表达盒。
另外，本发明涉及转化体，其是将1个或1个以上所述基因表达盒导入到酵母中得到的转化体；优选其中的酵母为麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)。
另外，本发明还涉及一种制造聚酯的方法，其特征在于，从培养该转化体而得到的培养物中收获聚酯；优选所述聚酯为共聚下述式(1)表示的3-羟基丁酸和下述式(2)表示的3-羟基己酸而得到的共聚聚酯。 以下，详细地说明本发明。
(1)聚酯合成酶的有用的突变体在本发明中，将在序列号1表示的来源于豚鼠气单胞菌的PHA合成酶的氨基酸序列中，进行至少1个以下的(a)～(h)的氨基酸取代而得到的PHA合成酶突变体作为有用的突变体使用。
(a)Asn-149被Ser取代(b)Asp-171被Gly取代(c)Phe-246被Ser或Gln取代(d)Tyr-318被Ala取代(e)Ile-320被Ser、Ala或Val取代(f)Leu-350被Val取代(g)Phe-353被Thr、Ser或His取代(h)Phe-518被Ile取代在此，例如，所说的「Asn-149」，是指氨基酸序列中第149位的天冬酰胺，(a)的氨基酸取代是将第149位的天冬酰胺变换为丝氨酸。
作为获得上述突变体的方法，可以举出例如以下的方法。改变来源于豚鼠气单胞菌等细菌的聚酯合成酶的氨基酸序列，取得改良了酶活性·底物特异性·热稳定性等性质的突变体的方法已知有多种，特别是，利用分子进化技术的方法(特开2002-199890号公报)等由于可以迅速地得到期望的突变体，因此，有用性高。另外，可以通过计算机辅助酶构象或预想的构象来鉴定有用的氨基酸突变等，例如可以使用Shrike程序(特开2001-184831号公报)。
这样被鉴定的氨基酸取代(突变)是否显示目的宿主的预想效果，需要对应于实际情况才可以确认。这是因为，T.Kichise等Appl.Environ.Microbiol.68，2411-2419(2002)、或Amara AA.等Appl.Microbiol.Biotechnol.59，477-482(2002)利用分子进化技术从大肠杆菌得到的突变体，是最适应用于取得这些突变体的大肠杆菌的生长条件的突变体，不能保证在不同的生长或增殖条件或对其他的菌种也合适，另外，在计算机上构建的突变体的准确度仍然是不足的。
另外，通过分子进化技术得到的突变，可以通过将其进行组合来获得更加合适的突变体，在本发明中，优选使用进行了2个或2个以上上述(a)～(h)的氨基酸取代而得到的突变体。
(2)酵母突变基因的构建作为编码了通过上述(1)中记载的方法而得到的突变体的基因，可以举出与在序列号1表示的来源于豚鼠气单胞菌的PHA合成酶的氨基酸序列中，进行上述(1)的氨基酸取代对应的DNA突变的基因等。另外，优选导入了在适应于酵母的PHA合成酶基因中，对应于上述(1)的氨基酸取代的DNA突变的基因。
作为适应于酵母的PHA合成酶基因，没有特别的限定，可以举出，例如，在麦芽糖假丝酵母中编码与豚鼠气单胞菌PHA合成酶基因相同的氨基酸序列的基因，即ORF2(记载于WO 01/88144的序列号3)等。
即，如果直接使用来源于细菌的基因，则有在宿主酵母中读取密码子显示异常的情况，例如，在麦芽糖假丝酵母中，密码子CTG不被翻译成亮氨酸而是被翻译成丝氨酸(H.Sugiyama et al，Yeast 11，43-52(1995))。这样的问题，可以通过使用改良的基因来解决，在这种改良的基因中，预先将至少1个CTG密码子变换为对应于亮氨酸的其他密码子(TTA、TTG、CTT、CTC、CTA)。另外，考虑到宿主所用基因的密码子使用频率，可以构建·利用具有变更为使用频率高的密码子的基因。
为了在上述适应于酵母的PHA合成酶基因中导入上述(1)中记载的氨基酸取代(突变)，可以使用定点诱变法将基因密码子的突变导入到目标位点。以定点诱变方式在基因的氨基酸序列中引入突变的方法，可以使用重组DNA法、PCR法等来进行。例如，在希望导入突变的PHA合成酶基因的目的位点两侧存在适当的限制酶识别序列时，可以通过盒式诱变法来进行用上述限制酶切断序列，取出含有希望导入突变的位点的区域，将其插入通过化学合成等只在目的位点导入突变的DNA片段。另外，通过PCR导入位点特异性突变的方法还可以如下进行用突变引物和扩增引物扩增PHA合成酶基因的一侧，所述突变引物在需要导入突变的位点导入了目标突变，所述扩增引物不具有包含该基因一个末端序列的突变；用另一突变引物和另一扩增引物扩增所述基因的另一侧，所述另一突变引物具有与上述突变引物互补的序列，所述另一扩增引物不具有包含该基因另一末端序列的突变；将得到的2种扩增片段退火后，再用上述2种扩增引物进行PCR。对于以定点方式得到的构建体，通过测定碱基序列进行确认。碱基序列可以通过在该技术领域已知的方法，使用自动碱基序列分析仪等来测定。
一般地，使用酵母发酵生产聚酯时，碳源为葡萄糖或油脂类、脂肪酸类等，只要是酵母可以利用的物质，则可以不受特别限制地使用。特别是，将油脂类、脂肪酸类或正构烷烃(n-paraffin)等作为碳源发酵生产聚酯时，这些碳源经过β氧化路线进行代谢，β氧化路线的代谢中间体可以有效地作为聚酯合成的底物使用(T.Fukui，Y.Doi，J.Bacteriol.，179，No.15，4821-4830(1997)；Q.Ren等，J.Bacteriol.，182，No.10，2978-2981(2000))。在此，在酵母中的β氧化由于是在作为细胞内小体的过氧化物酶体内进行，为了高效地合成聚酯，优选参与聚酯合成的酶处于过氧化物酶体中。
向过氧化物酶体输送的蛋白质，在游离的核糖体上合成，通过处于此蛋白质序列中的过氧化物酶体定位信号的作用，向过氧化物酶体进行输送(S.Subramani，J.Membrane Biol.，125，99-106(1992)、板井康能，化学与生物，35，No.10，687-695(1997)、E.H.Hettema，Biochim.Biophys.Acta，1451，17-34(1999))。
因此，在本发明中，优选将编码这些过氧化物酶体定位信号的DNA添加在编码参与聚酯合成的酶的基因，即上述PHA合成酶突变基因上，由此，可以将参与聚酯合成的酶，即PHA合成酶突变体定位在过氧化物酶体上部，从而可以高效地合成聚酯。
已知处于羧基末端的过氧化物酶体定位信号含有3个氨基酸的序列「(丝氨酸/丙氨酸/半胱氨酸)-(赖氨酸/精氨酸/组氨酸)-亮氨酸」。在这里，例如，所说的(丝氨酸/丙氨酸/半胱氨酸)是指丝氨酸、丙氨酸或半胱氨酸的任何一种的意思。为了使PHA合成酶突变体定位在过氧化物酶体中，可以将上述3个氨基酸添加在该酶的羧基末端上。其中，优选将最常见的羧基末端过氧化物酶体定位信号「丝氨酸-赖氨酸-亮氨酸」(以下简称为SKL)(序列号2)、或在热带假丝酵母(Candida tropicalis)中作为羧基末端过氧化物酶体定位信号(J.D.Aitchison et al.，J.Biol.Chem.，266，23197-23203(1991))的「丙氨酸-赖氨酸-异亮氨酸」(以下简称为AKI)(序列号3)添加在羧基末端。
对应于上述氨基酸的碱基序列没有特别的限制，例如，如果是例如SKL，可以使用序列号4、如果是AKI，可以使用序列号5。
另外，作为过氧化物酶体定位信号，还已知存在于N末端附近的9个氨基酸的序列「(精氨酸/赖氨酸)-(亮氨酸/缬氨酸/异亮氨酸)-(5个氨基酸)-(组氨酸/谷氨酸)-(亮氨酸/丙氨酸)」。将这些序列插入到PHA合成酶突变体中，也可以使该酶定位于过氧化物酶体中。
为了将编码了上述过氧化物酶体定位信号的DNA添加在PHA合成酶突变基因中，可以使用化学合成法、PCR法等。
(3)基因表达盒的构建本发明的基因表达盒，是含有上述(2)的突变基因和在酵母中发挥功能的启动子以及终止子的物质。
为了在酵母中表达上述(2)的突变基因，在该基因的5’上游，启动子、上游活化区域(UAS)等DNA序列是必要的，而在该基因的3’下游，poly(A)附加信号、终止子等DNA序列是必要的。在酵母的染色体上如果具有满足上述条件的适当的位点，也可以直接插入该基因，另外，也可以在具有适当的启动子和终止子的质粒中插入该基因，并用该质粒转化酵母。
在本发明中，优选在该基因的5’上游连结启动子、在该基因3’下游连结终止子，从而构建出基因表达盒，并用其转化酵母。使用的启动子、终止子只要是在作为宿主的酵母中发挥功能的，任何序列均可以使用。启动子有组成型表达的和诱导型表达的，任何一种启动子均可使用。在本发明中，使用麦芽糖假丝酵母作为宿主时，上述启动子、终止子优选在麦芽糖假丝酵母中发挥功能的物质，因此优选来源于麦芽糖假丝酵母。更加优选使用来源于麦芽糖假丝酵母的ALK1、ALK2、ALK5基因的启动子、来源于ALK1基因的终止子。
例如，作为启动子，可以使用麦芽糖假丝酵母的ALK1基因(GenBankD00481)的启动子ALK1p(WO 01/88144)、ALK5基因的启动子ALK5p(序列号6)等。另外，还可以使用通过在这些启动子的上游添加多个ARR(alkaneresponsible region)序列而提高了启动子活性的启动子(木暮等，2002年日本农艺化学大会演讲要旨集，p191)(序列号7)。另外，作为终止子，可以使用麦芽糖假丝酵母的ALK1基因的终止子ALK1t(WO 01/88144)等。
另外，上述启动子、终止子的碱基序列只要是在麦芽糖假丝酵母中发挥功能的序列，也可以是缺失、取代和/或添加1个或多个碱基的碱基序列。在此，所说的「缺失、取代和/或添加1个或多个碱基的碱基序列」是指按照在蛋白质酶增刊基因扩增PCR法TAKKAJ 35(17)，2951-3178(1990)或HenryA.Erlich编加藤郁之进鑑译PCR技术(1990)等记载的本领域技术人员已知的方法，以可以缺失、取代和/或添加的数目进行碱基缺失、取代和/或添加而得到的碱基序列。
在添加了编码过氧化物酶体定位信号的DNA的编码豚鼠气单胞菌PHA合成酶突变体的基因中，在其5’上游连接上述启动子，在其3’下游连接终止子。
用于构建基因表达盒的载体，可以是任何能在大肠杆菌中自主复制的质粒，另外，它们还可以具有能在酵母中自主复制的区域。能在酵母中自主复制的载体在菌体内被保持。另外，还可以将基因表达盒整合到染色体上。作为载体的一例，可以使用能在麦芽糖假丝酵母中自主复制的pUTU1(M.Ohkuma，et al.，J.Biol.Chem.，vol.273，3948-3953(1998))。
作为将启动子以及终止子和结构基因连结，构建本发明的基因表达盒的方法，没有特别的限定。除了后述的本实施例中记载的方法以外，为了形成限制酶位点，还可以使用PCR法。例如，可以使用WO 01/88144中记载的方法。
(4)宿主对本发明所说的酵母，没有特别限制，可以使用菌株保藏单位(例如IFO、ATCC等)保藏的Aciculoconidium属、Ambrosiozyma属、Arthroascus属、Arxiozyma属、阿舒氏囊霉菌属(Ashbya属)、Babjevia属、Bensingtonia属、Botryoascus属、Botryozyma属、酒香酵母属(Brettanomyces属)、布氏弹孢酵母属(Bullera属)、Bulleromyces属、假丝酵母属(Candida属)、Citeromyces属、Clavispora属、隐球酵母属(Cryptococcus属)、Cystofilobasidium属、德巴利氏酵母属(Debaryomyces属)、德克氏酵母属(Dekkera属)、Dipodascopsis属、双足囊菌属(Dipodascus属)、Eeniella属、Endomycopsella属、丝囊霉属(Eremascus属)、假囊酵母属(Eremothecium属)、Erythrobasidium属、Fellomyces属、Filobasidium属、Galactomyces属、地霉属(Geotrichum属)、小季氏酵母属(Guilliermondella属)、有孢汉逊氏酵母属(Hanseniaspora属)、汉逊氏酵母属(Hansenula属)、Hasegawaea属、Holtermannia属、Hormoascus属、Hyphopichia属、伊氏酵母菌属(Issatchenkia属)、克勒克氏酵母属(Kloeckera属)、克勒克氏孢属(Kloeckeraspora属)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces属)、Kondoa属、Kuraishia属、Kurtzmanomyces属、Leucosporidium属、油脂酵母属(Lipomyces属)、Lodderomyces属、鳞斑霉属(Malassezia属)、梅奇酵母属(Metschnikowia属)、Mrakia属、Myxozyma属、拿逊氏酵母菌(Nadsonia属)、Nakazawaea属、针孢酵母属(Nematospora属)、Ogataea属、卵孢酵母属(Oosporidium属)、Pachysolen属、Phachytichospora属、Phaffia属、毕赤氏酵母属(Pichia属)、Rhodosporidium属、红酵母属(Rhodotorula属)、糖酵母属(Saccharomyces属)、类糖酵母属(Saccharomycodes属)、复膜孢糖酵母属(Saccharomycopsis属)、Saitoella属、Sakaguchia属、Saturnospora属、裂芽酵母属(Schizoblastosporion属)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces属)、许旺氏酵母属(Schwanniomyces属)、锁掷酵母属(Sporidiobolus属)、掷孢酵母属(Sporobolomyces属)、Sporopachydermia属、Stephanoascus属、梗孢酵母属(Sterigmatomyces属)、Sterigmatosporidium属、Symbiotaphrina属、Sympodiomyces属、Sympodiomycopsis属、有孢圆酵母属(Torulaspora属)、Trichosporiella属、丝孢酵母属(Trichosporon属)、三角酵母属(Trigonopsis属)、Tsuchiyaea属、Udeniomyces属、Waltomyces属、威克酵母属(Wickerhamia属)、拟威克酵母属(Wickerhamiella属)、拟威尔氏酵母属(Williopsis属)、Yamadazyma属、Yarrowia属、Zygoascus属、接合糖酵母属(Zygosaccharomyces属)、拟接合魏立氏酵母属(Zygowilliopsis属)、Zygozyma属等酵母。
另外，作为本发明转化宿主使用的酵母，没有特别的限定，但在上述之中，优选假丝酵母属、Yarrowia属的酵母，更加优选麦芽糖假丝酵母、ヤロウイア·リポリテイカ(Yarrowia lipolytica)，特别优选麦芽糖假丝酵母。
另外，在作为转化宿主使用的酵母中，麦芽糖假丝酵母AC16株于平成12年11月15日以保藏号FERM BP-7366在日本国茨城县つくば市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心进行国际保藏。
(5)转化体的制备本发明的转化体是在酵母中导入1个或1个以上上述(3)的基因表达盒而形成的。
为了将参与聚合物合成的基因表达盒重组载体导入到酵母中，可以按照已知的方法进行。例如，可以使用钙法(Lederberg，E.M.et al.，J.Bacteriol.，119，1072(1974))或电穿孔法(Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，1.8，第4页(1994))等。另外，还可以利用Fast Track TM-Yeast Transformation KitSM(Geno Technology)这样的市售的转化试剂盒。
作为宿主的一例，可以使用麦芽糖假丝酵母CHA1株(S.Kawai，et al.，Agric.Biol.Chem.，vol.55，59-65(1991))。使用上述的转化法，用含有参与聚合物合成的基因表达盒的质粒载体等转化本菌株，可以制备如后述实施例所示的具有pARR-ORF2S等质粒的麦芽糖假丝酵母转化体。
另外，作为导入了pARR-149NSx2的转化体的AC16 pUTA-149NSx2(保藏号FERM BP-10019，基于布达佩斯条约将原保藏日平成15年5月8日的国内保藏移交为国际保藏)、质粒pARR-149NS/171DGx2(保藏号FERMBP-10017，保藏日平成16年4月27日，基于布达佩斯条约的国际保藏)分别被国际保藏在日本国茨城县つくば市东1丁目1番地1中央第6的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
(6)聚酯的制造本发明的聚酯的制造方法是从培养本发明的上述转化体而得到的培养物中收获聚酯。
即，本发明的聚酯的制造可以是在培养基中添加上述转化体进行培养后，通过从得到的该培养菌体或培养物中回收聚酯来进行。在这里，培养温度为该菌体的可以繁殖的温度，优选15℃～40℃，更加优选20℃～40℃，特别优选28℃～34℃。另外，培养时间没有特别的限定，但优选间歇培养1～7天，或者也可以连续培养。
培养基只要是酵母可以利用的则没有特别限定，例如，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类、其他的有机营养源等的培养基。
作为碳源，只要是酵母可以利用的物质，则没有特别的限定，可以使用例如碳水化合物、油脂类、脂肪酸类、正构烷烃等。作为碳水化合物，可以举出，例如葡萄糖、蔗糖、甘油等。作为油脂类，可以举出，例如菜子油、椰子油、棕榈油、棕榈仁油等。作为脂肪酸类，可以举出，例如己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸等饱和·不饱和脂肪酸或这些脂肪酸的酯或盐等脂肪酸衍生物。作为正构烷烃，可以举出，例如十二烷、十四烷等。
另外，启动子的表达为诱导型时，可以在适当的时候添加诱导物质(例如，醇等)。诱导物质有时也是主要的碳源。
作为一例，在麦芽糖假丝酵母的培养时，也可以使用油脂类作为碳源进行培养。另外，在不能利用油脂或不能有效利用油脂的酵母中，还可以通过在培养基中添加脂肪酶来改善。另外，还可以通过转化脂肪酶基因来赋予油脂利用能力。
作为氮源，除了例如氨、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐以外，还可以举出胨、肉膏、酵母提取物等。
作为无机盐类，可以举出，例如磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。
作为其他的有机营养源，可以举出，例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸类；维生素B1、维生素B12、维生素H(biotin)、烟酰胺、泛酸、维生素C等维生素类等。
在本发明中，聚酯从菌体回收可以使用例如下面的方法。培养结束后，用离心分离器等从培养液中分离菌体，将该菌体用蒸馏水以及甲醇等洗净后，使之干燥。用氯仿等有机溶剂从该干燥菌体中抽提聚酯。在通过过滤等从含有该聚酯的有机溶剂溶液中除去菌体成分，在该滤液中加入甲醇或己烷等不良溶剂使聚酯沉淀。沉淀的聚酯通过过滤或离心分离与上清液脱离，使之干燥，从而可以回收聚酯。在本发明中，由于可以使用酵母作为生产聚酯的菌体，因此，可以利用上述简便的分离回收方法。
得到的聚酯可以通过例如气相色谱法或核磁共振法等来进行分析。分子量可以利用GPC法测定。回收的干燥聚合物用氯仿溶解后，可以使用安装了Shodex K805L(昭和电工社制)的岛津制造所制造的GPC系统，将氯仿作为移动相来分析该溶液。分子量标准试样可以使用市售的标准聚苯乙烯。
如上述，在本发明中，用含有编码酶活性改良了的麦芽糖假丝酵母PHA合成酶突变体的基因、或添加了编码过氧化物酶体定位信号的DNA且编码酶活性改良了的麦芽糖假丝酵母PHA合成酶突变体的基因，并含有在酵母中发挥功能的启动子以及终止子的基因表达盒，构建麦芽糖假丝酵母重组株，并培养该转化体，可以高效地合成聚酯。
另外，在本发明中，作为聚酯，可以优选制造共聚下述式(1)表示的3-羟基丁酸和下述式(2)表示的3-羟基己酸而得到的聚酯P(3HB-co-3HH)。 发明的效果按照本发明，可以在酵母中，有效地生产具有生物降解性以及优异的物理特性的共聚以上述式(1)、(2)表示的3-羟基丁酸或3-羟基己酸为例的3-羟基链烷酸而得到的共聚聚酯。
附图的简单说明[

图1]是简单图示实施例中从pUAL1构建pSTARR的过程和用到的各种质粒。
是简单图示实施例中从pSTARR构建pARR-149NSx2等的过程和所用的各种质粒。
实施发明的最佳方案以下，通过实施例更加具体地说明本发明。但是，本发明并不是将其技术范围限定在这些实施例中。
(实施例1)PHA合成酶基因的合成和修饰基于序列号1所示的来源于麦芽糖假丝酵母的PHA合成酶(T.Fukui，etal.，FEMS Microbiology Letters，vol.170，69-75(1999))的氨基酸序列，合成该PHA合成酶基因。
另外，麦芽糖假丝酵母是将CTG密码子翻译成丝氨酸而不是亮氨酸的酵母。因此，在亮氨酸密码子中没有分配CTG。在麦芽糖假丝酵母中，对应于各氨基酸的密码子优先选择使用频率高的密码子。密码子的使用频率以Klaus Wolf著的Nonconventional Yeast in Biotechnology(published出版)作为参考。这样，设计PHA合成酶基因ORF2(WO 01/88144的序列号3)，化学合成后，克隆到载体pUCNT(记载于WO 94/03613)中。
接着，为了将该PHA合成酶第149个氨基酸天冬酰胺取代为丝氨酸，使用序列号8和序列号9作为PCR引物，对已克隆了PHA合成酶基因的pUCNT进行扩增。在扩增时使用了Stratagene社制造的Pfu聚合酶。PCR的条件是将96℃1分钟、60℃1分钟、68℃11分钟作为1个循环，将其反复进行18次后，加入限制酶DpnI，将作为模板的质粒切断，转化大肠杆菌JM109株，从转化体回收质粒。使用序列号10～14的引物，确认碱基序列。碱基序列的决定使用了PERKIN ELMER APPLIED BIOSYSTEMS社制造的DNA测序仪310遗传分析器。这样，构建了只将基因突变导入到目的位点的PHA合成酶突变基因ORF2-149NS。
(实施例2)含有PHA合成酶突变基因的表达盒的构建为了在麦芽糖假丝酵母中表达PHA合成酶，将来源于麦芽糖假丝酵母的启动子连结在实施例1中记载的PHA合成酶突变基因ORF2、ORF2-149NS各自的5’上游，将同样来源的终止子连结在所述基因各自的3’下游。作为启动子，使用在Alk2基因(GenBank X55881)启动子的上游添加了ARR序列的启动子ARRp，在每一种基因的3’下游连结麦芽糖假丝酵母Alk1基因(GenBank D00481)的终止子ALK1t。ARRp是由东京大学提供的基因(序列号15)，通过在PstI位点与EcoRI-XhoI接头结合，在EcoT14I位点结合序列号16所示的合成DNA，将ARRp变换为可以被XhoI以及NdeI消化。用EcoRI将载体pUAL1(记载于WO 01/88144)切断后，通过平滑末端化并进行连接反应，构建除去了EcoRI切断位点的pUAL2。用PvuI/PvuII将pUAL2切断，结合在pSTV28(宝酒造社制)的PvuI/SmaI位点，构建pSTAL1。将pSTAL1用EcoRI/NdeI消化，与上述ARRp连接，构建pSTARR。在图1中示出了从pUAL1构建pSTARR的模式和各种质粒的模式图。
为了在麦芽糖假丝酵母中表达实施例1中记载的ORF2、ORF2-149NS，并且定位到过氧化物酶体，在ORF2、ORF2-149NS的羧基末端添加过氧化物酶定位信号。作为添加的过氧化物酶定位信号，在羧基末端使用了Ser-Lys-Leu(SKL)氨基酸序列。以将被克隆到pUCNT中的ORF2以及ORF2-149NS作为模板，使用序列号17和18作为引物，构建ORF2S和ORF2S-149NS。在pSTARR的NdeI和PstI位点结合这些PHA合成酶突变基因，从而构建出pSTARR-ORF2S和pSTARR-ORF2S149NS。
最终连结PHA合成酶突变基因的载体是pUTA-1(记载于WO01/88144)。用XhoI/SalI从pSTARR-ORF2S、pSTARR-ORF2S149NS切出表达盒，使之与pUTA-1的SalI位点结合，构建pARR-ORF2S以及pARR-149NS。另外，用SalI消化pARR-ORF2S以及pARR-149NS，并与XhoI/SalI切割pSTARR-ORF2S和pSTARR-ORF2S149NS得到的表达盒结合，构建出pARR-ORF2Sx2以及pARR-149NSx2。在图2中示出了从pSTARR构建pARR-149NSx2等的模式和各种质粒的简单的图。
(实施例3)转化体的构建酵母菌培养所用的试剂，只要不是特别说明均使用从和光纯药购买的试剂。宿主为ADE1基因破坏株，使用被国际保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的麦芽糖假丝酵母AC16株(FERM BP-7366)，在该宿主中分别导入含有上述本发明基因表达盒的质粒pARR-ORF2S、pARR-149NS、pARR-ORF2Sx2以及pARR-149NSx2。在宿主中导入质粒的方法是电穿孔法。基因导入装置使用了BTX社制造的ELECTRO CELLMANIPULATOR 600。比色杯使用了BIO MEDICAL CORPORATION CO.LTD制造的BM6200。在100μl感受态细胞中加入1μl质粒，然后从中取出100μl感受态细胞/质粒溶液，注入到比色杯中，并安装在脉冲发生器上。接着，在静电容量40μF、阻抗值246ohm、电压1.9KV的条件下施加电脉冲。脉冲后，在各自的比色杯中加入1M的山梨糖醇1ml，缓和地进行混合，在室温放置1小时。导入质粒后，用选择平板(0.67w/v％ Yeast Nitrogen basewithout amino acid(Difco社制)，2w/v％葡萄糖，2w/v％琼脂)进行培养，取得转化体。其中，导入了质粒pARR-149NSx2的转化体作为AC16pUTA-149NSx2被保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(FERM BP-10019)。
(实施例4)使用转化体生产聚合物导入了聚合物生产必要的基因的麦芽糖假丝酵母转化体如下进行培养。培养基使用YNB培养基(0.67w/v％ Yeast Nitrogen base without amino acid，2w/v％葡萄糖)作为预培养用的培养基，将在M2培养基(12.75g/L硫酸铵、1.56g/L磷酸二氢钾、0.33g/L磷酸一氢钾·3水合物、0.08g/L氯化钾、0.5g/L氯化钠、0.41g/L硫酸镁·7水合物、0.4g/L硝酸钙·7水合物和0.01g/L氯化铁(III)·4水合物)中添加了2w/v％的棕榈油和0.45ml/L溶解在盐酸中的痕量元素(1g/mL硫酸铁(II)·7水合物、8g/mL硫酸锌(II)·7水合物、6.4g/mL硫酸镁(II)·4水合物、0.8g/mL硫酸铜(II)·5水合物)的培养基作为生产培养基使用。
将各转化体的甘油贮存液500μl接种到加入了50ml预培养用培养基的500ml坂口氏烧瓶中，培养20小时，再以10v/v％接种到加入了300ml生产培养基的2L坂口氏烧瓶中。将其在培养温度30℃、振荡速度90rpm、培养2天的条件下进行培养。通过离心分离从培养液中回收菌体，悬浮在80ml的蒸馏水中，用超高压均化器(APV社制造的Rannie 2000，在15,000Psi进行15分钟)破碎后，进行离心分离，将得到的沉淀物用甲醇洗净后，冷冻干燥。
将得到的干燥菌体粉碎，添加100ml氯仿，搅拌过夜进行提取。过滤除去菌体，将滤液用旋转蒸发器浓缩至1～2ml，在浓缩液中添加约10ml的己烷，使聚合物析出。此时的培养结果示于表1。分子量测定按如下进行。将10mg回收的干燥聚合物溶解在5ml氯仿中后，通过过滤除去不溶物。对溶液进行分析，该分析使用安装了Shodex K805L(300×8mm、2柱相连)(昭和电工社制)的岛津制作所制造的GPC系统，将氯仿作为移动相。分子量标准试样使用市售的标准聚苯乙烯，测出的为重均分子量。3HH摩尔分数通过NMR分析(JOEL，JNM-EX400)来测定。


如上述结果所示，与通过含有包含编码野生型PHA合成酶的基因的表达盒的质粒pARR-ORF2S、pARR-ORF2Sx2转化的酵母相比，在通过含有包含编码本发明PHA合成酶突变体的基因的表达盒的质粒pARR-149NS、pARR-149NSx2转化的酵母中，聚合物含量和3HH摩尔分数提高。这些结果不仅可以确认本发明PHA合成酶突变体活性得到提高的效果，而且发现了得到的PHA的分子量也有增加的倾向。这样，确认了本发明的PHA合成酶突变体的有用性。
(实施例5)二重突变体使用实施例1记载的方法制作将PHA合成酶第171个氨基酸天冬氨酸取代为甘氨酸而得到的突变体。作为用于导入突变的引物，使用了序列号19和序列号20。另外，以实施例1制作的PHA合成酶突变基因ORF2-149NS作为模板，用与实施例1同样的方法制作将第149个氨基酸天冬酰胺取代成丝氨酸、第171个氨基酸天冬氨酸取代为甘氨酸的二重突变体。这样，得到了PHA合成酶突变基因ORF2-171DG以及PHA合成酶二重突变基因ORF2-149NS/171DG。
接着，使用这些突变基因，按照实施例2记载的方法，将序列号17和18作为引物添加信号序列，将它们克隆到质粒pSTARR中，构建出pSTARR-ORF2S171DG和pSTARR-ORF2S149NS/171DG。将这些突变基因表达盒按照实施例2记载的方法导入到pUTA-1中，权建质粒pARR-171DG和pARR-149NS/171DG。接着，构建用LAC4基因(GenBank M84410)的终止子LACt(序列号21)代替终止子ALK1t所得到的表达盒。用PstI/SalI除去pSTARR-ORF2S171DG以及pSTARR-ORF2S149NS/171DG的ALK1t，作为替代，用序列号22和23所示的引物制作导入了LAC4t的质粒。将这种含有取代了终止子的PHA合成酶突变基因的表达盒分别用XhoI/SalI切割，并使之结合在质粒pARR-171DG和pARR-149NS/171DG的SalI位点，得到了导入了2个含有PHA合成酶突变基因的表达盒的质粒pARR-171DGx2和pARR-149NS/171DGx2。其中，质粒pARR-149NS/171DGx2被保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(FERM BP-10017)。
用实施例3的方法将这些质粒导入到麦芽糖假丝酵母AC16株(FERMBP-7366)中，用实施例4记载的方法进行聚合物生产和聚合物分析，其结果示于表2，并与实施例4的结果进行比较。


如上述结果所示可知，与通过含有包含编码野生型PHA合成酶的基因的表达盒的质粒pARR-ORF2Sx2转化的酵母相比，在通过含有包含编码本发明PHA合成酶突变体的突变基因的表达盒的质粒pARR-171DGx2转化的酵母中，聚合物含量提高，在通过含有包含编码PHA合成酶二重突变体的二重突变基因的表达盒的质粒pARR-149NS/171DGx2转化的酵母中，聚合物含量进一步提高，同时3HH摩尔分数提高。这样，确认了本发明的PHA合成酶突变体的有用性。
工业实用性按照本发明，可以在酵母中，有效地生产具有生物降解性以及优异的物理特性的共聚以上述式(1)、(2)表示的3-羟基丁酸或3-羟基己酸为首的3-羟基链烷酸而得到的共聚聚酯。
权利要求
1.一种基因表达盒，该基因表达盒含有聚羟基链烷酸合成酶突变基因和在酵母中发挥功能的启动子以及终止子，所述聚羟基链烷酸合成酶突变基因是编码在含有序列表1所示氨基酸序列的来源于豚鼠气单胞菌的聚羟基链烷酸合成酶中，进行至少1个以下的(a)～(h)的氨基酸取代而得到的聚羟基链烷酸合成酶突变体的聚羟基链烷酸合成酶突变基因(a)Asn-149被Ser取代(b)Asp-171被Gly取代(c)Phe-246被Ser或Gln取代(d)Tyr-318被Ala取代(e)Ile-320被Ser、Ala或Val取代(f)Leu-350被Val取代(g)Phe-353被Thr、Ser或His取代(h)Phe-518被Ile取代。
2.一种基因，该基因是将编码过氧化物酶体定位信号的DNA添加到聚羟基链烷酸合成酶突变基因中而得到的基因，所述聚羟基链烷酸合成酶突变基因是编码在含有序列表1所示氨基酸序列的来源于豚鼠气单胞菌的聚羟基链烷酸合成酶中，进行至少1个以下的(a)～(h)的氨基酸取代而得到的聚羟基链烷酸合成酶突变体的聚羟基链烷酸合成酶突变基因(a)Asn-149被Ser取代(b)Asp-171被Gly取代(c)Phe-246被Ser或Gln取代(d)Tyr-318被Ala取代(e)Ile-320被Ser、Ala或Val取代(f)Leu-350被Val取代(g)Phe-353被Thr、Ser或His取代(h)Phe-518被Ile取代。
3.按照权利要求2记载的基因，其中，过氧化物酶体定位信号包含由序列号2或序列号3所示氨基酸序列。
4.按照权利要求3记载的基因，其中，编码过氧化物酶体定位信号的DNA碱基序列是序列号4或序列号5表示的序列。
5.按照权利要求2～4中的任一项记载的基因，其中，在编码来源于豚鼠气单胞菌的聚羟基链烷酸合成酶的基因中，至少1个CTG密码子被变换为TTA、TTG、CTT、CTC或CTA。
6.一种基因表达盒，该基因表达盒包含权利要求2～5中的任一项记载的基因和在酵母中发挥功能的启动子以及终止子。
7.一种转化体，其特征在于，该转化体是在酵母中导入1个或1个以上权利要求1或6记载的基因表达盒而形成的。
8.按照权利要求7记载的转化体，其中，酵母是麦芽糖假丝酵母。
9.一种制造聚酯的方法，其特征在于，从培养权利要求7或8记载的转化体而得到的培养物中收获聚酯。
10.按照权利要求9记载的制造聚酯的方法，其中，聚酯是共聚下述式(1)表示的3-羟基丁酸和下述式(2)表示的3-羟基己酸而得到的共聚聚酯。[化1]
全文摘要
本发明涉及包含导入了突变的来源于豚鼠气单胞菌的聚羟基链烷酸(PHA)合成酶基因和在酵母中发挥功能的启动子以及终止子的基因表达盒；将该基因表达盒导入到酵母中而得到的转化体；使用了该转化体的聚酯的制造方法。按照本发明，可以在酵母中有效地生产具有生物降解性以及优异的物理特性的共聚3－羟基链烷酸而得到的共聚聚酯。
文档编号C12N1/19GK1791673SQ200480013329
公开日2006年6月21日 申请日期2004年5月14日 优先权日2003年5月15日
发明者大窪雄二, 长冈哲也, 横沟聪, 松本圭司, 高木正道, 太田明德 申请人:株式会社钟化