专利名称：用于精子染色的方法
背景技术：
本发明总体上涉及能分离精子用于产生性别富集的精子的染色方法。
通过人工授精(AI)的动物受精及体外受精后的胚胎移植是已经建立的方法。在家畜生产工业中，影响具有一种或多种目的特征的后代的繁殖结果具有明显益处。以举例方式，在乳品工业中预选择雌性后代以保证乳牛的产生是有经济利益的。将精子分离为携带X及Y染色体细胞的富集群，也称为性别富集的精液或性别富集的精子，是获得预选择后代的一种方法。
Johnson等人(美国专利号5,135,759)描述了根据DNA含量，用流式细胞仪/细胞分选器将携带完全X及Y染色体的精子群分离为携带X染色体的精子的富集群及携带Y染色体的精子富集群。如描述的，将精子与DNA选择性染料于30至39℃的温度混合1小时(39℃)至1.5小时(30℃)。然后当精子通过激光束时，用流式细胞仪测定发出的荧光量。由于根据物种的不同，携带X染色体的精子包含的DNA多于携带Y染色体的精子大约3至5％，携带X染色体的精子产生的荧光强度高于携带Y染色体的精子。包含预定荧光强度的单种精子的小滴带电荷并通过静电作用偏转到收集容器中，然后将收集的性别富集精子群用于显微注射或人工授精。
Seidel等人(WO 02/43574)也描述了用流式细胞仪将精子分离为携带X及Y染色体细胞的性别富集群。Seidel等人描述了在30℃及40℃之间的温度对细胞染色。
Didion等人(WO 02/41906)描述了在约17℃至30℃的温度对精细胞染色。根据Didion等人的描述，这些染色温度避免了在较高温度染色可导致的某些作用，如降低精子活力及功效。此外，认为在分选期间，较低温度染色对精子定向具有有益作用。
发明概述本发明的多个方面提供了对精细胞染色的相对快速及有效的方法，并且提供了摄取染料所需时间减少的方法，因此减少了收集精液及产生携带X及Y染色体的精细胞的性别富集群之间消耗的时间。
简而言之，因此本发明涉及用于精细胞染色的方法，此方法包括形成包含完整活精细胞及DNA选择性荧光染料的染色混合物，以及将染色混合物置于至少约40℃的温度。
本发明的其它方面部分是显然的，且部分在下文中指出。
附图简述
图1A-1D图示了实施例1中研究的结果，其中测定了对精子在39℃及41℃用不同浓度Hoechst 33342染料染色的荧光强度。
图2A-2D图示了实施例2中研究的结果，其中测定了对精子在39℃及41℃用不同浓度Hoechst 33342染料染色的荧光强度。
图3A-3D图示了实施例3中研究的结果，其中测定了对精子在39℃及43℃用不同浓度Hoechst 33342染料染色的荧光强度。
图4A及4B图示了实施例4中研究的结果，其中测定了对精子在39℃及43℃用不同浓度Hoechst 33342染料染色的荧光强度。
图5A及5B图示了实施例5中研究的结果，其中测定了对精子在39℃及45℃用不同浓度Hoechst 33342染料染色的荧光强度。
图6A及6B图示了实施例6中研究的结果，其中测定了对精子在39℃及47℃用不同浓度Hoechst 33342染料染色的荧光强度。
图7A及7B图示了实施例7中研究的结果，其中测定了于39℃及43℃对未染色或用60μM Hoechst 33342染料染色的精子活动能力百分数(％motility)及前进活动能力百分数(％progressive motility)。
图8A及8B图示了实施例8中研究的结果，其中于39℃及45℃对未染色或用60μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图9A-9C图示了实施例9中研究的结果，其中于41℃、43℃及45℃对未染色或用80μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图10A-10C图示了实施例10中研究的结果，其中于41℃、43℃及45℃对未染色或用100μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图11图示了实施例11中研究的结果，其中于47℃对未染色或用100μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图12图示了实施例12中研究的结果，其中于49℃对未染色或用100μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图13A及13B图示了实施例13中研究的结果，其中于43℃对未染色、用125μM Hoechst 33342染料或用150μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图14A及14B图示了实施例14中研究的结果，其中于43℃对未染色、用200μM Hoechst 33342染料或用250μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图15A及15B图示了实施例15中研究的结果，其中于45℃对未染色、用125μM Hoechst 33342染料或用150μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图16A-16C图示了实施例16中研究的结果，其中于45℃对未染色、用200μM Hoechst 33342或用250μM Hoechst 33342对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图17A-17C图示了实施例17中研究的结果，其中于43℃对未染色、用300μM Hoechst 33342、用350μM Hoechst 33342或用400μM Hoechst33342对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图18A-18C图示了实施例18中研究的结果，其中于43℃对未染色、用0.6μM SYBR 14、用6.0μM SYBR 14或用60μM SYBR 14对精子染色的精子活动能力百分数及前进活动能力百分数进行测定。
图19A-19B图示了实施例19中研究的结果，其中于39℃和45℃对用100μM双苯甲亚胺(bisbenzimide)-BODIPY缀合物(BBC)或6μM SYBR14对精子染色的精子荧光强度进行测定。
图20图示了实施例20中研究的结果，其中于41℃用在TCA缓冲液或在含10mM丙酮酸的TCA缓冲液中的400μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子前进活动能力百分数进行测定。
图21图示了实施例21中研究的结果，其中于41℃用在TCA缓冲液或在含10μM维生素K的TCA缓冲液中的400μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子前进活动能力百分数进行测定。
图22图示了实施例22中研究的结果，其中于41℃用在TCA缓冲液或在含100μM维生素K的TCA缓冲液中的400μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子前进活动能力百分数进行测定。
图23图示了实施例23中研究的结果，其中于41℃用在TCA缓冲液或在含1mM硫辛酸的TCA缓冲液中的400μM Hoechst 33342染料对精子染色的精子前进活动能力百分数进行测定。
图24图示了实施例24中研究的结果，其中于41℃用在包含10mM丙酮酸的TCA中的300μM Hoechst 33342染料对精子染色且然后用含10mM丙酮酸的TCA或pH 6.2的基于碳酸盐的抑制剂稀释3倍后，对精子前进活动能力百分数进行测定。
图25图示了实施例24中研究的结果，其中于41℃用在(1)包含10mM丙酮酸的TCA中的300μM Hoechst 33342染料对精子染色且然后用相同缓冲液稀释3倍的TCA或(2)用在pH7.3的基于碳酸盐的缓冲液中的300μM Hoechst 33342染料对精子染色且然后用pH 6.2的基于碳酸盐的抑制剂稀释3倍后，对精子前进活动能力百分数进行测定。
图26图示了实施例24中研究的结果，其中于41℃用在包含10mM丙酮酸的TCA中或pH 6.2的基于碳酸盐的抑制剂中的300μM Hoechst33342染料对精子染色的精子前进活动能力百分数进行测定。
优选实施方案详述令人惊讶的是，已经确定了在较高温度即在40℃以上的温度对细胞染色所需的时间低于在较低温度对细胞染色所需的时间，可用染料对精细胞染色用于流式细胞仪方法，而对精细胞的活力没有显著影响。在一个实施方案中，精细胞于至少41℃的温度暴露于染料。在另一实施方案中，精细胞于至少42℃的温度暴露于染料。在另一实施方案中，精细胞于至少43℃的温度暴露于染料。在另一实施方案中，精细胞于至少44℃的温度暴露于染料。在另一实施方案中，精细胞于至少45℃的温度暴露于染料。然而，通常将精细胞暴露于远高于45℃以上的温度并经历一段有效时间段可有害地影响细胞成活力。因此，在一个实施方案中，精细胞于至少41℃但不超过50℃的温度暴露于染料。在另一实施方案中，精细胞于至少41℃但不超过48℃的温度暴露于染料。在另一实施方案中，精细胞于至少41℃但不超过47℃的温度暴露于染料。例如，在一个目前优选的实施方案中，精细胞于至少42℃但不超过47℃的温度暴露于染料。通过进一步举例的方式，在另一目前优选的实施方案中，精细胞于至少43℃但不超过45℃的温度暴露于染料。
本发明的方法可用于对牛、猪、马或其它哺乳动物的完整、活精细胞染色，所述精细胞来自新鲜获得精子样本或来自解冻的深低温保藏精子样本。多种收集活精子的方法是已知的并且包括例如人造阴道法或带手套法。取决于物种及物种内的具体动物，一般每毫升牛精子样本包含约5亿至约50亿个精细胞。
大体上，根据本发明的一方面，通过形成包含精细胞及DNA选择性染料的染色混合物对精细胞染色。精细胞对渗透压及pH的显著变化有些敏感。为降低对精子成活力的影响，因此，一般优选考虑此类因素而形成的染色混合物。与此类考虑因素一致，染色混合物可以多种方式形成。
在一个实施方案中，纯精子与DNA选择性染料组合。因此例如以纯固体形式的染料，包括自由流动粉末或液体组合物可与纯精子组合。备选地，染料溶解或分散的非经缓冲液体可与纯精子组合。然而，在每种此类方法中，一般优选对于纯精子不引起精子受到足可本质上有害影响它们成活力的渗透压或pH显著改变的染色混合物。
在另一实施方案中，纯精子与缓冲液体组合，染料在所述缓冲液体中溶解或分散以形成染色混合物。有益地，对于纯精子而言，缓冲液有助于避免任何足可本质上有害影响它们成活力的作为形成混合物后果的渗透压或pH显著变化。
在另一实施方案中，精子源与缓冲液组合以形成精子悬液且精子悬液其后与染料组合以形成染色混合物。在与染料接触前将精细胞悬浮在经缓冲液体中可有益地保护精细胞免于受加入染料而导致的pH及渗透压的显著变化。在本实施方案中，精子源可为纯精子。备选地，精子源可为通过离心获得或应用其它将精子分离为级分的方法获得的包含精子的精液衍生物。
在另一实施方案中，DNA选择性染料与缓冲液组合或作为缓冲液配方的一部分而包括，从而形成缓冲的染料溶液。因此，例如，纯固体形式的染料(包括自由流动粉剂)或液体组合物可与缓冲液或缓冲液配方的任何组分组合，然后再将各组分组合，以形成缓冲的染料溶液，所述缓冲的溶液然后可与纯精液或精子悬液组合。
可单一应用或组合应用多种生物学缓冲液以保护精细胞免受pH及渗透压的显著变化。一般地，此类缓冲液浓度约为0.001M至约1.0M且pH在约4.5至约8.5之间。常见的生物学缓冲液包括例如磷酸盐、二磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐及乳酸盐。此类缓冲液也可包含营养源，例如糖和/或抗生素，如链霉素。优选的缓冲液包括TCA、TEST、柠檬酸钠、TL及HEPES。在本发明的某些实施方案中，将精液样本用表I中描述的一种或多种缓冲溶液稀释。例如，在一个实施方案中，精液样本用具有表I所述组分的TCA#1缓冲液稀释。在另一实施方案中，精液样本用具有表I所述组分的TCA#2缓冲液稀释。在另一实施方案中，精液样本用具有表I中所述组分的TEST缓冲液稀释。在另一实施方案中，精液样本用具有表I所述组分的柠檬酸钠缓冲溶液稀释。又在另一实施方案中，精液样本用具有表I所述组分的TL缓冲溶液稀释。在另一实施方案中，精液样本用具有表I所述组分的HEPES缓冲溶液稀释。又在另一实施方案中，精细胞可用每25mL纯水中包含0.204g NaHCO3、0.433g KHCO3及0.473g C6H8O7·H2O的缓冲溶液稀释(水中含0.097摩尔/升NaHCO3、0.173摩尔/升KHCO3、0.090摩尔/升C6H8O7·H2O)以形成精子悬液。
表I
应用的缓冲液的量一般取决于几个因素，例如，染色混合物中的特定缓冲液及目的精子浓度(个精子/毫升)。因此，应用足量的缓冲液以获得个精子/毫升的目的浓度。在一个实施方案中，加入缓冲液以获得包含低于纯精液样本中精子浓度的精子悬液。在另一实施方案中，加入缓冲液以获得包含自约1×106个精子/毫升至约5×109个精子/毫升的精子悬液。在另一实施方案中，加入缓冲液以获得包含约200×106个精子/毫升以下的精子悬液。又在另一实施方案中，加入缓冲液以获得包含自约1×106个精子/毫升至约200×106个精子/毫升的精子悬液。又在另一实施方案中，加入缓冲液以获得包含自约20×106个精子/毫升至约200×106个精子/毫升的精子悬液。在另一实施方案中，加入缓冲液以获得包含自约30×106个精子/毫升至约175×106个精子/毫升的精子悬液。又在另一实施方案中，加入缓冲液以获得包含自约50×106个精子/毫升至约150×106个精子/毫升的精子悬液。又在另一实施方案中，加入缓冲液以获得包含自约100×106个精子/毫升至约150×106个精子/毫升的精子悬液。又在另一实施方案中，加入缓冲液以获得包含约150×106个精子/毫升的精子悬液。
对染色混合物中染料浓度进行选择以使足量染料与DNA结合以将携带X及Y染色体的精子分选为性别富集群。此外，优选在合理短时期中足可提供对精子定量染色而不会有意影响细胞成活力的染料浓度。对特定应用而言，影响目的浓度的因素包括染料性质、染色混合物中精子浓度、染色混合物的pH、允许精细胞摄入染料的时间及在摄入期间的温度。但是通常染色混合物中的染料浓度一般为任何浓度范围，一般约0.1μM至约1000μM之间。例如，染料的浓度可维持“相对低”的浓度范围，即约0.1μM至约250μM浓度；在本实施方案中，浓度优选自约100μM至约200μM，更优选约100μM，又更优选约200μM，且甚至更优选约150μM。备选地，染料浓度维持在“中间”浓度范围，即约250μM至约700μM的浓度；在本实施方案中，浓度优选自约300μM至约700μM，更优选约300μM，又更优选约400μM，且甚至更优选约600μM。此外，染料的浓度可维持在“相对高”浓度范围，即浓度约700μM至约1000μM；在本实施方案中，浓度优选自约800μM至约1000μM，更优选约800μM，又更优选约900μM，且甚至更优选约1000μM。因此，在一个实施方案中，染料浓度为约100μM至约200μM。在另一实施方案中，染料浓度为约10μM至约100μM。在另一实施方案中，染料浓度为约20μM至约80μM。又在另一实施方案中，染色混合物中染料浓度为约20μM至约60μM。此外，已报道对大部分物种染色的最佳浓度报道为约每150×106个精子为约40μg，即大约为70μM。参见，例如L.A.Johnson和Glenn Welch，Theriogenology(1999)。
染色混合物的pH优选维持在约6.0至约8.0的范围。更优选地，染色混合物的pH保持在约7.1至约7.6的范围。又更优选地，染色混合物的pH保持在约7.3至7.4的范围。又更优选地，染色混合物的pH保持在约7.35。
某些染料能通透精细胞并特异结合DNA而不需进一步干涉以增加细胞的通透性。然而，对另一些染料，在染色前处理精子以增加通透速率而不会令人不能接受地使成活力或活动能力降低是令人希望的。可应用本领域技术人员已知的任何合适方法。此类方法包括电穿孔、应用细胞通透增强溶液，例如温和表面活性剂或化学冲击。当应用其它或更严格技术是令人希望的或有益的时，此类处理可包括应用脂质体或以本领域技术人员应用的许多技术将染色剂、染料、基因或载体导入到活细胞中。这些方法包括但不限于如通过Gordon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，1980)应用并自此之后扩展到兔、绵羊、牛及猪的显微注射；DEAE-葡聚糖-介导的转移；磷酸钙共沉淀及其它技术，所有所述技术是本领域技术人员公知的。又在其它情况下，离心精子并在其它培养基中重新悬浮经离心精子可是令人希望的，然而可基于相同或基本上相同的缓冲液系统以去除某些可干扰以后加工步骤的某些组分(所述某些组分之前可能已加至精子悬液)。
允许染色混合物中精细胞摄取染料持续足可获得目的程度DNA染色的一段时间。大体上，摄入期在约1分钟至160分钟之间。在一个实施方案中，摄入期低于90分钟。在另一实施方案中，摄入期低于60分钟。在另一实施方案中，摄入期低于40分钟。在另一实施方案中，摄入期低于25分钟。如以前谈及的，摄入期多少取决于一系列其它参数，包括摄取温度、染料性质及染料浓度。在某些实施方案中，摄入期为约2分钟至约25分钟。又在其它实施方案中，摄入期为约5分钟至20分钟。又在其它实施方案中，摄入期为约2分钟至约10分钟。在其它实施方案中，摄入期为约2分钟以下。
在整个摄入期或部分摄入期，染色混合物处于本发明的升高温度。因此，例如染色混合物可在40℃以上维持约摄入期的至少1％、5％、10％、20％或甚至更高百分率。在一个实施方案中，染色混合物的温度在摄入期升高。在另一实施方案中，染色混合物的温度在摄入期降低。然而，在每一这些实施方案中，对温度变化的速率进行控制以优选避免对精细胞成活力的任何显著负面影响。
在任何情况下，摄入期足可使染料与DNA结合以致可基于携带X及Y染色体的精子之间不同及可测定的荧光强度对携带X及Y染色体的精细胞进行分选。在一个实施方案中，染色程度足可允许基于携带X及Y染色体的精子各自的荧光而对携带X及Y染色体的精子区别分选为至少约60％纯度的X及Y群。染色程度优选足可允许基于携带X及Y染色体的精子各自的荧光而将携带X及Y染色体的精子区别分选为至少约70％纯度的携带X及Y染色体的精子群，更优选至少约80％纯度，甚至更优选至少约85％纯度，且又更优选至少约90％纯度。
一旦与DNA结合并用UV或可见光激发，本发明所述染料发出荧光。在一个实施方案中，染料为用紫外线辐射激发发出荧光的染料。此类染料包括例如双苯甲亚胺如Hoechst 33342及Hoechst 33258，每种所述染料可自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)商品化获得。有益地，例如，Hoechst 33342具有低毒性，足够的细胞通透性，对DNA特异，与DNA结合后可大大增强荧光，且在荧光强度和给定细胞或样本中存在的DNA量之间表现出线性关系。
在另一实施方案中，染料为用可见光激发后发出荧光的染料。此类染料包括例如可见光可激发染料，自Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)可商业获得的SYBR-14及在WO 02/41906中描述的双苯甲亚胺-BODIPY缀合物6-{[3-((2Z)-2-{[1-(二氟硼烷基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2H-吡咯-5-基)丙酰基]氨基}-N-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，3’H-2，5’-双苯并咪唑-2’-基]苯氧基}乙酰基)氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺(“BBC”)。
在本发明的一个实施方案中，染料可通过与另一部分结合进行修饰。例如，根据本发明的特定方面，双苯甲亚胺(双苯并咪唑)可通过加入荧光团进行修饰，通过可见光激活缀合物导致荧光反应。由于与DNA结合增强它们的荧光，优选这些缀合物与双苯甲亚胺分子相似。并且由于缀合物对可见光反应发出荧光而优于双苯甲亚胺分子。
特别优选的荧光团为可见光可激发的二吡咯甲烷二氟化硼衍生物。二吡咯甲烷二氟化硼染料为如美国专利号5,338,854及4,774,339(文中引用作为参考)中所描述、可自Molecular Probes Inc的商品名BODIPYO获得。示例的双苯甲亚胺-二吡咯甲烷二氟化硼缀合物的制备在WO 02/41906中描述。也可应用以前段落中描述的本类其它荧光团例如荧光素及其衍生物。
本领域技术人员理解此类经荧光团修饰染料可通过修饰或官能化而制备，从而使所述缀合物具有染色的其它适宜特性，这样使它们在目的pH及温度范围具有足够细胞通透性。例如，通过(1)改变DNA染料的pKa，(2)通过加入适当接头连接的阳离子或阴离子的离子型增强通透的基团，或(3)加入非离子型增强通透的基团如乙二醇或聚乙二醇部分，可进行化学修饰以增强适当细胞通透性。
在本发明范围中，双苯甲亚胺及可见波长荧光团可以许多不同方式连接。WO 02/41906示例了它们可进行连接的一种方式；然而，本领域技术人员可易于选择许多其它荧光团及连接方法。协助此类选择的供应者及咨询机构对本领域技术人员是易于自从事制备及出售荧光团的商业实体例如Molecular Probes Inc.(Eugene，OR)获得的。
优选地，选择不会对成活力、通透性、稳定性、摄取、细胞保存、流式细胞术、制剂或荧光特性导致显著负面作用的连接双苯甲亚胺及可见波长荧光团的化学物。优选地对连接物的化学官能性进行选择以增强特性如稳定性、通透性、成活力、摄取、细胞保存、流式细胞术、制剂或荧光特性。
文中公开的方法可应用于最近获自特定来源的精子(即，在染色前几分钟或几小时内获得自牛、猪或其它哺乳动物来源)或可应用于深低温保存并接着融化的精子。在每种情况下，细胞计数分选的结果可通过向染色溶液中加入猝灭剂以降低死精子荧光而改善。多种猝灭剂以及猝灭剂的用途是本领域公知的，如对于碘化丙锭(Garner等人，Bio.of Reprod.，53276-84(1995))及FD&C # 40(Johnson等人，Theriogenology，521323-1341(1999))所证实的那样。FD&C # 40在本方法中特别有用，因为其在低浓度应用是无毒的。同样，SYBR-14与碘化丙锭的组合是有益的，由于这使活精子与濒死细胞及死细胞可见并可使活精子自濒死细胞及死细胞分离。因此，在本发明的一个实施方案中，精细胞与染料及猝灭剂两者组合以形成染色混合物。在优选的实施方案中，精细胞与Hoechst33342及FD&C # 40组合。又在另一实施方案中，精细胞与SYBR-14及碘化丙锭组合。当分选融化的深低温保藏精子样本时，猝灭剂是有用的，应当理解它们的用途不仅仅限于此，且它们可有益地用于新近获得的精子样本。
除了缓冲剂外，染色混合物中也可包括其它添加剂以增强精子的成活力或活动能力；这些添加剂可作为精子源、染料源的一部分提供或单独提供给染色混合物。此类添加剂包括能源、抗生素、调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物、活动能力抑制剂及精浆。
一般而言，活动能力抑制剂通过刺激哺乳动物附睾或附睾管的流体环境，引起染色混合物中的细胞模仿哺乳动物例如公牛附睾中的精细胞；因此例如抑制剂抑制精子的代谢活性和/或活动能力。抑制剂可为对精子活动能力具有抑制作用的任何组合物，例如染色混合物中相对高钾离子的浓度趋于抑制精子活动能力。因此，在一个实施方案中，优选染色混合物包含钾离子源并且染色混合物中钾浓度至少为约0.05摩尔/升是优选的。更优选地，钾浓度至少为约0.05摩尔/升至约0.5摩尔/升。又更优选地，钾浓度至少约0.1摩尔/升至约0.3摩尔/升。最优选地，钾浓度为约0.173摩尔/升。此类染色混合物一般但不必要也包含钠离子源。当钠存在时，钾与钠的摩尔比值分别大于1∶1。优选地，钾与钠的摩尔比值为至少约1.25∶1。又更优选地，钾与钠的摩尔比值为至少约1.5∶1。又更优选地，钾与钠的摩尔比值为至少约1.75∶1。又更优选地，钾与钠的摩尔比值为至少约1.78∶1。在一个特定实施方案中，钾与钠的摩尔比值为至少约2∶1。
染色混合物又可包含能下调碳水化合物摄取的离子或二氧化碳源。在本实施方案中，二氧化碳源可为例如一种或多种碳酸盐。在一个实施方案中，染色混合物包含NaHCO3及KHCO3，因此提供了钾离子及钠离子源以及部分二氧化碳的压力。例如，在一个实施方案中，染色混合物包含在水溶液中的NaHCO3及KHCO3，优选水中包含NaHCO3、KHCO3及C6H8O7.H2O；通过进一步举例方式，染色混合物可用如Salisbury &Graves，J.Reprod.Fertil.，6351-359(1963)中公开的水中包含0.097摩尔/升NaHCO3、0.173摩尔/升KHCO3、0.090摩尔/升C6H8O7.H2O的抑制缓冲液形成。只要精细胞暴露于活动能力抑制剂，它们一般保持静止。
此种调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物的实例包括例如丙酮酸、维生素K、硫辛酸、谷胱甘肽、黄素、醌、超氧化物歧化酶(SOD)及SOD模拟物。如果包括在染色混合物中，此种组合物可以足可实施保护作用而不有害影响精子健康的浓度存在。取决于以下因素，如所应用的特定组合物或染色混合物中精子的浓度，示例的浓度范围包括自约10μM至约50mM。例如，如果组合物中包括丙酮酸，它可在染色混合物中以自约0.5μM至约50mM的浓度存在，优选自约1mM至约40mM，更优选自约2.5mM至约25mM，又更优选自约10mM至约20mM，甚至又更优选约15mM，且最优选约10mM。如果组合物中包括维生素K，它可在染色混合物中以自约1μM至约100μM的浓度存在，优选自约10μM至约100μM，优选自约50μM至约100μM的浓度存在，且最优选约100μM。如果组合物中包括硫辛酸，它可在染色混合物中以自0.1mM至约1mM的浓度存在，优选自约0.5mM至约1mM，更优选约0.5mM，且最优选约1mM。染色混合物可包含任一以上实施方案的组合物或为以上列出浓度的任意组合。例如，染色混合物可包含调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物，所述组合物包含浓度约10mM的丙酮酸及浓度约100μM的维生素K。备选地，染色混合物可包含这样的组合物，所述组合物包含浓度约10mM的丙酮酸及浓度约1mM的硫辛酸。又另一实例包括包含这样组合物的染色混合物，所述组合物包含浓度约10mM的丙酮酸、浓度约100μM的维生素K及浓度约1mM的硫辛酸。
一旦根据本发明对精子进行染色，可对它们进行制备用于分选且然后使用允许根据基于荧光分离的任何已知方法进行分选。一般应用且公知的方法包括如在美国专利号5,135,759、5,985,216、6,071,689、6,149,867及6,263,745以及WO 99/33956及WO 01/37655中示例及描述的流式细胞仪系统。在一个实施方案中，例如，在本发明的升高温度维持时，经染色细胞可与鞘液组合或制备用于分选。在另一实施方案中，例如，经染色细胞自升高温度冷却，其中染料摄取在较低温度如室温进行，其中后续加工步骤也在室温进行，以能在这个实施方案中达到目的程度的分离，然而，一般优选在本发明升高温度的温度以下没有显著染料摄入量发生。
实施例实施例1用人工阴道自性成熟公牛收集公牛精液，并将样本在经温度控制容器中于37℃运输到染色装置中。收到样本后，根据标准及公知方法(Farrell等人，Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))对精液浓度、视觉活动能力、pH及膜完整性、活动能力及前进活动能力通过Hamilton-Thorn活动能力分析仪(IVOS)进行分析。基于精液浓度，制备8×5mL精子悬液。在pH 7.35的41℃ TCA缓冲液中悬浮精子而制备四个5mL 150×106个精子/毫升样本。再在pH 7.35的39℃ TCA缓冲液中悬浮精子而制备另外四个5mL 150×106个精子/毫升样本。对于精子悬液，加入水溶解的10mM的Hoechst溶液以产生如在表1中看到的染料浓度(“Hoechst的目标浓度(μM))。将精子悬液在41℃及39℃水浴中维持。通过自精子悬液样本中取出500μL并通过流式细胞仪测定染料的摄取(即确定荧光强度)对精子悬液进行分析。
表1
分析结果在图1A-1D中总结。
实施例2除了用于对精子染色的Hoechst 33342浓度外，如实施例1相同方式获得并制备精子样本。表2列出了实施例2中应用的浓度。将悬液在41℃及39℃水浴中维持。定时自每个样本中取出500μL样本并通过流式细胞仪以确定荧光强度进行分析。
表2
分析结果在图2A-2D中总结。
实施例3除了用于对精子染色的Hoechst 33342浓度及染色温度外，如实施例1相同的方式获得、制备、染色及分析精子样本。表3列出了实施例3中应用的浓度及温度。
表3
分析结果在图3A-3D中总结。
实施例4除了用于对精子染色的Hoechst 33342浓度及染色温度外，如实施例1相同的方式获得、制备、染色及分析精子样本。表4列出了实施例4中应用的浓度及温度。
表4
分析结果在图4A及4B中总结。
实施例5除了用于对精子染色的Hoechst 33342浓度及染色温度外，如实施例1相同的方式获得、制备、染色及分析精子样本。表5列出了实施例5中应用的浓度及温度。
表5
分析结果在图5A及5B中总结。
实施例6除了用于对精子染色的Hoechst 33342浓度及染色温度外，如实施例1相同的方式获得、制备、染色及分析精子样本。表6列出了实施例6中应用的浓度及温度。
表6
分析结果在图6A及6B中总结。
实施例7用人工阴道自性成熟公牛收集公牛精子，并将样本在经温度控制容器中于25℃运输到染色装置中。收到样本后，通过已知分析方法对精液的浓度、视觉活动能力、IVOS活动能力及前进活动能力、pH及膜完整性进行分析。基于精液浓度，制备4×1mL的150×106个精子/毫升的悬液。在pH 7.35的41℃ TCA缓冲液中悬浮精液而制备两个1mL 150×106个精子/毫升样本。再在pH 7.35的43℃ TCA缓冲液中悬浮精液而制备另外两个1mL 150×106个精子/毫升样本。向每个温度的一个样本中加入6μL 10mM Hoechst溶液以产生60μM的染料浓度。悬液在41℃及43℃水浴中维持。定时自精子悬液样本中取出50μL，转移到锥形管并加入200μL适当温度的TCA缓冲液，以产生浓度为30×106个精子/毫升的最终精子悬液。将30×106个精子/毫升精子悬液样本立即通过IVOS进行分析。对活动能力百分率及前进活动能力(Prog Mot)百分率的IVOS结果在图7A及7B显示。
实施例8除了以下各项不同外，如实施例7对公牛精液进行收集、分析、在缓冲液中悬浮、用Hoechst 33342染色以及通过IVOS分析。将样本在60μM浓度染色并在39℃及45℃的温度维持。IVOS分析结果在图8A及8B中显示。
实施例9除了以下各项不同外，如实施例7对公牛精子进行收集、分析、在缓冲液中悬浮、用Hoechst 33342染色以及通过IVOS分析。将样本在80μM浓度染色并在41℃、43℃及45℃的温度维持。IVOS分析结果在图9A-9C中显示。
实施例10除了以下各项不同外，如实施例7对公牛精液进行收集、分析、在缓冲液中悬浮、用Hoechst 33342染色以及通过IVOS分析。将样本在100μM浓度染色并在41℃、43℃及45℃的温度维持。IVOS分析结果在图10A-10C中显示。
实施例11除了以下各项不同外，如实施例7对公牛精液进行收集、分析、在缓冲液中悬浮、用Hoechst 33342染色以及通过IVOS分析。将样本在100μM浓度染色并在47℃的温度维持。IVOS分析结果在图11中显示。
实施例12
除了以下各项不同外，如实施例7对公牛精液进行收集、分析、在缓冲液中悬浮、用Hoechst 33342染色以及通过IVOS分析。将样本在100μM浓度染色并在49℃的温度维持。IVOS分析结果在图12中显示。
实施例13除了以下各项不同外，如实施例7对公牛精液进行收集、分析、在缓冲液中悬浮、用Hoechst 33342染色以及通过IVOS分析。将样本在浓度125μM及150μM染色，且每个样本在水浴43℃的温度维持。IVOS分析结果在图13A及13B中显示。
实施例14除了以下各项不同外，如实施例7对公牛精液进行收集、分析、在缓冲液中悬浮、用Hoechst 33342染色以及通过IVOS分析。将样本在200μM及250μM浓度染色，且每个样本在水浴43℃的温度维持。IVOS分析结果在图14A及14B中显示。
实施例15除了以下各项不同外，如实施例7对公牛精液进行收集、分析、在缓冲液中悬浮、用Hoechst 33342染色以及通过IVOS分析。将样本在125μM及150μM浓度染色，且每个样本在水浴45℃的温度维持。IVOS分析结果在图15A及15B中显示。
实施例16除了以下各项不同外，如实施例7对公牛精液进行收集、分析、在缓冲液中悬浮、用Hoechst 33342染色以及通过IVOS分析。将样本在200μM、250μM及300μM浓度染色，且每个样本在水浴45℃的温度维持。IVOS分析结果在图16A-16C中显示。
实施例17除了以下各项不同外，如实施例7对公牛精液进行收集、分析、在缓冲液中悬浮、用Hoechst 33342染色以及通过IVOS分析。将样本在300μM、350μM及400μM浓度染色，且每个样本在水浴43℃的温度维持。IVOS分析结果在图17A-17C中显示。
实施例18用人工阴道自性成熟公牛收集公牛精液，并将样本在经温度控制容器中于25℃运输到染色装置中。收到样本后，通过已知分析方法对精液的浓度、视觉活动能力、IVOS活动能力及前进活动能力、pH及膜完整性进行分析。基于精液浓度，通过将精液在pH 7.35的43℃ TCA缓冲液中悬浮制备4×1mL的150×106个精子/毫升的悬液。向三个样本中加入SYBR14染料溶液以产生0.6μM、6μM及60μM的染料浓度。悬液在43℃水浴中维持。定时将50μL样本转移到锥形管并加入200μL适当温度的TCA缓冲液，以产生30×106个精子/毫升的最终精子浓度。将样本立即在IVOS上进行分析。对活动能力百分率及前进活动能力(Prog Mot)百分率的IVOS结果在图18A-18C中显示。
实施例19除了应用的染料及浓度外，如实施例1相同的方式获得、制备、染色及分析精子样本。浓度100μM的BBC及浓度为6μM的SYBE 14用于染色精子悬液并将温度在45℃水浴中维持。表7列出了实施例19中应用的浓度及温度。
表7
分析结果在图19A及19B中总结。
实施例20用人工阴道自性成熟公牛收集公牛精液并将样本用2份碳酸盐缓冲液稀释用于在经温度控制容器中于25℃运输到染色装置中。收到样本后，根据标准及公知方法(Farrell等人，Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))对精液的浓度、活动能力及前进活动能力通过Hamilton-Thorn活动能力分析仪(IVOS)进行分析。基于精液浓度，取出一份碳酸盐精子悬液，对精子悬液于500×g离心5分钟，弃去上清液并用pH 7.3的41℃TCA缓冲液重新悬浮沉淀物，从而制备1mL 150×106个精子/毫升的悬液。再在pH 7.3的包含10mM丙酮酸的41℃ TCA缓冲液中悬浮精液制备另一1mL 150×106个精子/毫升的悬液。对于精子悬液，加入水溶解的10mM的Hoechst溶液以产生400μM Hoechst的染料浓度。染色期间将精子悬液在41℃水浴中维持。通过自染色精子悬液中取出50μL，在相同温度加入200μL相同缓冲液并通过IVOS分析以测定前进活动能力百分率(％Prog Mot)对精子悬液进行分析。IVOS分析结果在图20中总结。
实施例21除了以下各项不同外，如实施例20中相同的方式获得并制备精子样本。悬浮精子并用于染色及IVOS分析的缓冲液为TCA及包含10μM维生素K的TCA。IVOS分析结果在图21中总结。
实施例22除了以下各项不同外，如实施例20中相同的方式获得并制备精子样本。悬浮精子并染色及IVOS分析的缓冲液为TCA及包含100μM维生素K的TCA。IVOS分析结果在图22中总结。
实施例23除了以下各项不同外，如实施例20中相同的方式获得并制备精子样本。悬浮精子并染色及IVOS分析的缓冲液为TCA及包含1mM硫辛酸的TCA。IVOS分析结果在图23中总结。
实施例24用人工阴道自性成熟公牛收集公牛精液并将样本在经温度控制容器中于25℃运输到染色装置中。收到样本后，根据标准及公知方法(Farrell等人，Theriogenology，49(4)871-9(1998年3月))对精液的浓度、活动能力及前进活动能力通过Hamilton-Thorn活动能力分析仪(IVOS)进行分析。基于精液浓度，通过在TCA缓冲液或在基于碳酸盐的抑制剂中悬浮精液而制备几管450×106个精子/毫升悬液。以下表III图示了应用的组分及染色条件。
表III
对于精子悬液，加入水溶解的10mM Hoechst溶液以产生300μMHoechst的浓度。精子悬液在41℃水浴中维持30分钟，然后如每个图中特别指出稀释到一般用于分选的浓度，用含10mM丙酮酸的TCA或pH6.2的基于碳酸盐的抑制剂稀释到150×106个精子/毫升。通过在每个图中指定的时间期限自经染色且经稀释悬液中取出50μL并加入200μL 25℃pH7.3的含10mM丙酮酸TCA以启动静止期的逆转，允许至少5分钟的平衡期且通过IVOS分析以测定前进活动能力百分数，对精子悬液进行分析。IVOS前进活动能力百分数的比较参见图24-26。
权利要求
1.用于染色精细胞的方法，所述方法包括形成含有完整的活精细胞和DNA选择性荧光染料的染色混合物，以及使染色混合物处于40℃以上的温度。
2.权利要求1所述的方法，其中染料为UV可激发或可见光可激发的染料。
3.权利要求2所述的方法，其中染料选自双苯甲亚胺、SYBR-14及其缀合物、类似物或衍生物。
4.权利要求3所述的方法，其中染料选自Hoechst 33342、Hoechst33258、SYBR-14和6-{[3-((2Z)-2-{[1-(二氟硼烷基)-3，5-二甲基-1H-吡咯-2-基]亚甲基}-2H-吡咯-5-基)丙酰基]氨基}-N-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1H，3’H-2，5’-双苯并咪唑-2’-基]苯氧基}乙酰基)氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺。
5.权利要求1所述的方法，其中染色混合物处于所述温度一段时间，足可允许染料结合DNA，从而基于荧光可对携带X和Y的精细胞差异分选。
6.权利要求5所述的方法，其中时间期间为自约1分钟至约160分钟。
7.权利要求5所述的方法，其中时间期间为小于约60分钟。
8.权利要求5所述的方法，其中时间期间为小于约30分钟。
9.权利要求5所述的方法，其中染料浓度为自约0.1μM至约1000μM。
10.权利要求9所述的方法，其中染料浓度为自约100μM至约600μM。
11.权利要求5所述的方法，其中染色混合物处于约41℃以上的温度。
12.权利要求11所述的方法，其中染色混合物处于约41℃与约50℃之间的温度。
13.权利要求12所述的方法，其中染色混合物处于约41℃与约47℃之间的温度。
14.权利要求13所述的方法，其中染色混合物处于约42℃与约45℃之间的温度。
15.权利要求14所述的方法，其中染色混合物处于约43℃的温度。
16.权利要求1所述的方法，其中形成染色混合物的步骤包括将缓冲液与精细胞组合。
17.权利要求16所述的方法，其中将缓冲液与精细胞组合以形成精子悬液，以及将精子悬液与DNA选择性染料组合以形成染色混合物。
18.权利要求1所述的方法，其中形成染色混合物的步骤包括将缓冲液与DNA选择性染料组合以形成缓冲的染料溶液，以及将缓冲的染料溶液与精细胞组合以形成染色混合物。
19.权利要求1所述的方法，所述方法还包括将猝灭剂与染色混合物组合的步骤。
20.权利要求19所述的方法，其中猝灭剂选自FD&C#40和碘化丙锭。
21.权利要求20所述的方法，其中猝灭剂为FD&C#40。
22.权利要求20所述的方法，其中猝灭剂为FD&C#40且染料为Hoechst 33342。
23.权利要求20所述的方法，其中猝灭剂为碘化丙锭且染料为SYBR-14。
24.权利要求1所述的方法，其中染色混合物还包含活动能力抑制剂。
25.权利要求1所述的方法，其中形成染色混合物的步骤包括将活动能力抑制剂与精细胞组合以形成受抑制的精子悬液，以及将受抑制的精子悬液与DNA选择性染料组合以形成染色混合物。
26.权利要求25所述的方法，其中活动能力抑制剂包含基于碳酸盐的活动能力抑制剂。
27.权利要求26所述的方法，其中基于碳酸盐的活动能力抑制剂包含NaHCO3、KHCO3和C6H8O7·H2O。
28.权利要求27所述的方法，其中基于碳酸盐的活动能力抑制剂包含水溶解的0.097摩尔/升NaHCO3、0.173摩尔/升KHCO3和0.090摩尔/升C6H8O7·H2O。
29.权利要求1所述的方法，其中染色混合物还包含调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物。
30.权利要求29所述的方法，其中调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物选自丙酮酸、维生素K、硫辛酸、谷胱甘肽、黄素、醌、超氧化物歧化酶和超氧化物歧化酶模拟物。
31.权利要求30所述的方法，其中调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物选自丙酮酸、维生素K和硫辛酸。
32.权利要求31所述的方法，其中调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物包含浓度自约0.5μM至约50mM的丙酮酸。
33.权利要求32所述的方法，其中调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物包含浓度自约10mM至约15mM的丙酮酸。
34.权利要求33所述的方法，其中调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物包含浓度约10mM的丙酮酸。
35.权利要求31所述的方法，其中调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物包含浓度约1μM至约100μM的维生素K。
36.权利要求35所述的方法，其中调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物包含浓度约100μM的维生素K。
37.权利要求31所述的方法，其中调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物包含浓度自约0.1mM至约1.0mM的硫辛酸。
38.权利要求31所述的方法，其中调节细胞内或细胞外氧化/还原反应的组合物包含浓度约1.0mM的硫辛酸。
全文摘要
根据将精细胞与DNA选择性荧光染料在约40℃以上升高的温度组合的方法，对精细胞进行染色。此方法允许染色时间减少。此后根据常规分离方法包括流式细胞术可对细胞进行有效分选。
文档编号C12N5/06GK1795004SQ200480014519
公开日2006年6月28日 申请日期2004年3月29日 优先权日2003年3月28日
发明者M·安扎尔, C·L·路德维格, J·A·格雷厄姆, J·A·格伦策尔 申请人:孟山都技术公司