专利名称：Sars病毒抗原的细胞表面表达载体和用该载体转化的微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在微生物表面表达SARS抗原的载体，由该载体转化的微生物，以及用于预防SARS的疫苗，该疫苗包括转化的微生物或其提取物以及纯化的物质。更具体而言，本发明涉及一种表面表达载体，其包括一种编码诱导SARS的冠状病毒的抗原蛋白的基因，以及一种或两种或多种编码微生物表面锚定序列(anchoring motif)的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的pgsB，pgsC和pgsA基因，还涉及被该载体转化的微生物以及包括该转化微生物作为有效成分的SARS疫苗。
背景技术：
严重急性呼吸性综合征(SARS)是一种新型的流行性疾病，自从2002年11月在中国广东省首次开始爆发，其已遍布全球，包括香港、新加坡、加拿大(多伦多)等地区。该流行病表现出呼吸性症状，如发烧38℃或更高、咳嗽、呼吸困难、非典型性肺炎。SARS的作用物就是变异性致病冠状病毒。
通常，冠状病毒家族成员是具有(+)RNA的很大的RNA病毒。染色体由约29,000至31,000碱基对组成，显微镜下可观察到该病毒呈冠状。能引起人类上呼吸道疾病，引起动物的呼吸系统、肝脏、神经和肠道疾病。自然界中存在三组冠状病毒，其中组I和组II感染哺乳动物，组III感染鸟类。
已知的冠状病毒有时会引起免疫体系能力较弱的人类发生与肺部有关的疾病，或引起动物如狗、猫、猪、鼠、鸟等的严重疾病。冠状病毒突变率很高，重组率高达约25％。推测这些特点导致原始冠状病毒发生变异，而形成新型的突变的冠状病毒(SARS冠状病毒)，该病毒从动物传播至人类。
根据世界卫生组织(WHO)的统计，自2002年11月起，31个国家中有7,447名SARS疑似患者，其中有551名死亡。2003年的SARS感染危险区域包括中国的北京、广东、香港、内蒙古、山西和天津，新加坡、加拿大的多伦多、台湾、蒙古的乌兰巴托、菲律宾等。然而，还有传播到全世界的风险。
自从2002开始爆发以来，关于SARS冠状病毒，德国热带医学的研究所首先对SARS病毒的核苷酸序列进行破译。该研究小组通过PCR(聚合酶链式反应)破译了一部分基因的核苷酸序列。破译结果提供给了一家德国生物工程公司Artus GmbH，用来开发检测SARS病毒感染的试剂盒。该试剂盒通过将SARS疑似患者体内的病毒基因扩增来检测出SARS的感染。
之后，到目前SARS病毒的全基因组已被破译，已完全分析了超过12个分离出的毒株的序列。首先被分离出的Urbani株[取自死于SARS的WHO代表团医生的名字，SARS-Cov株(Rota，PA，Science 1085952，2003；GenBankAccession AY278741)]的全部序列是美国CDC研究小组破译的。加拿大大不列颠哥伦比亚癌症研究中心(Canada British Columbia Cancer search center)小组分析了2003年4月12日从加拿大多伦多一名患者体内分离出的SARSTor2病毒株的全部序列(Marra，M.A.，Science 1085953，2003；GenBankAccession 274119)。
尽管这两个研究小组分析了不同地区SARS感染者体内分离出的冠状病毒，但这两种病毒显示出的区别仅是15个碱基对的不同。这暗示了SARS是从同一病毒被诱导产生的。还有，根据SARS冠状病毒的基因分析结果，可以看出SARS冠状病毒的蛋白质组成与现存冠状病毒的蛋白质组成相同，但基因组以及基因组编码的氨基酸同源性却很低。鼠肝炎病毒和火鸡支气管病毒都与SARS冠状病毒有相似性。但是，分子分类学分析提供了SARS冠状病毒与其它冠状病毒的相关性，结果说明SARS冠状病毒与现存的组不同。
目前，SARS冠状病毒的鉴定始于PCR，抗体检测的阳性结果是由ELISA或IFA所确定的。病毒的分离是通过对PCR鉴定的患者进行细胞培养检测，以确定SARS冠状病毒的感染。
目前还没有治疗SARS的基本方法，只有辅助治疗。对SARS冠状病毒这种新的流行病的作用物的研究才刚刚起步，还没有开发出预防SARS的疫苗。世界各地已开始了开发预防SARS的疫苗的多方面研究。
在微生物的细胞表面上附着并表达所需蛋白的技术被称作细胞表面展示技术(cell surface display technology)。细胞表面展示技术采用微生物如细菌或酵母菌的表面蛋白作为表面锚定序列而在表面上表达外源蛋白，这种技术的应用范围包括重组活疫苗的制备、肽/抗体库的构建以及筛选、全细胞的吸附、全细胞的生物转化催化剂等。该技术的应用范围由细胞表面上表达的蛋白质所决定。因此，细胞表面展示技术具有巨大的工业应用潜力。
对于连续的细胞表面展示技术，表面锚定序列是至关重要的。本技术的核心是选择并开发出能在细胞表面有效表达外源蛋白的结构。
因此，为了选择表面锚定序列，应考虑以下特征(1)它应该具有分泌信号来帮助外源蛋白通过细胞内膜，从而使外源蛋白能转运至细胞表面上。(2)它应具有靶信号来帮助外源蛋白稳定地固定到细胞外膜的表面上。(3)它可在细胞表面上大量地被表达，而不影响细胞的生长。(4)它与蛋白的大小无关，且能表达外源蛋白而不会改变蛋白的三维结构。然而，还没有开发出满足上述条件的表面锚定序列。
已知的和目前使用的表面锚定序列通常分为四种类型的细胞外膜蛋白、脂蛋白、分泌蛋白、表面器官蛋白如鞭毛蛋白。在革兰氏阴性菌中，已经使用了细胞外膜蛋白，诸如LamB、PhoE(Charbit et al.，J.Immunol.，1391658，1987；Agterberg et al.，Vaccine，885，1990)、OmpA等。采用的脂蛋白有诸如TraT(Felici et al.，J.Mol.Biol.，222301，1991)、PAL(与脂蛋白有关的肽聚糖)(Fuchsetal.，Bio/Technology，91369，1991)以及Lpp(Francisco et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，4892713，1992)。作为表面锚定序列来表达外源蛋白的有黏着在1型菌毛上的菌毛蛋白(fimbriae protein)，如FimA或FimH(Hedegaard etal.，Gene，85115，1989)，以及菌毛蛋白(pili protein)如PapA pilu亚单位。此外，还有报道能作为表面锚定序列的包括冰核蛋白(ice nucleation protein)(Jungetal.，Nat.Biotechnol.，16576，1998；Jung et al.，Enzyme Microb.Technol.，22348，1998；Lee etal.，Nat.Biotechnol.，18645，2000)，Klebsiela oxytoca的支链淀粉酶(Komacker et al.，Mol.Microl.，41101，1990)、Neiseria的IgA蛋白酶(Klauser et al.，EMBO J.，91991，1990)、附着在大肠杆菌上的AIDA-1、志贺菌属的VirG蛋白，以及Lpp和OmpA的融合蛋白。据报道，在使用革兰氏阳性菌的情况下，可利用金黄色葡萄球菌中的蛋白A和FnBPB蛋白为表面锚定序列、利用乳酸菌的表面壳蛋白进行表面表达、利用革兰氏阳性菌的表面蛋白如化脓性葡萄球菌遗传因子(Staphylococcus pyogenes)的M6蛋白(Medaglini，D et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，926868，1995)、炭疽热细菌的S-层蛋白EA1、枯草芽孢杆菌CotB等作为锚定序列能有效表达疟疾抗原。
本发明人开发了一种能在微生物细胞表面上有效表达外源蛋白的新型载体，该载体使用杆菌属菌株的聚-γ-谷氨酸合成酶复合物基因(pgsBCA)作为新型表面锚定序列，还开发了一种在被该载体转化的微生物表面上大量表达外源蛋白的方法(韩国专利申请号10-2001-48373)。
研究人员已开始从事利用上述表面锚定序列通过基因工程方法在适于进行大量生产的细菌体内稳定表达致病性抗原或抗原决定部位的研究。尤其是，已有报道，与减毒致病菌或病毒疫苗相比，口服表面上表达外源免疫原的非致病活菌后，能诱导更持久、更强的免疫应答。免疫应答的诱导归功于细菌表面结构的佐剂作用，从而增加了表面上表达的外源蛋白的抗原性以及活体对活菌产生的免疫应答。利用该表面表达体系开发非致病性细菌的重组活疫苗已引起了人们的注意。
因此，本发明人成功地通过选择基因并对非致病性微生物表面上的蛋白质分析，来大量表达SARS冠状病毒抗原，其中，食品安全得以保障，如通过源于杆菌菌株的聚-γ-谷氨酸合成复合物基因(pgsBCA)作为表面锚定序列而转化的乳酸菌，并开发了经济且稳定的疫苗，通过口服微生物来诱导血液中产生SARS冠状病毒的抗体和粘膜免疫。
发明内容
因此，本发明的一个目的在于提供一种通过利用微生物表面表达体系来表达SARS冠状病毒抗原的载体，以及被载体转化的微生物。
本发明的另一个目的在于提供一种在表面表达SARS冠状病毒抗原的转化的微生物，用于预防SARS的疫苗，该疫苗包括从微生物中提取的SARS冠状病毒抗原或从微生物中纯化的SARS冠状病毒抗原作为有效成分。
为了实现上述目的，本发明提供的表面表达载体包括一种或两种或多种编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的pgsB，pgsC和pgsA基因以及一种编码SARS冠状病毒的刺突抗原蛋白或核壳抗原蛋白的基因。
根据本发明，任何编码SARS冠状病毒的刺突抗原蛋白的基因都可用作表面抗原蛋白基因。可单独使用SARS冠状病毒的刺突抗原蛋白基因或其两种或多种复合物。编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的基因优选包括pgsA。刺突抗原蛋白可以是SARS SA，SARS SB，SARS SC，SARS SD或SARS SBC，核壳抗原蛋白可以是SARS NA，SARS NB或SARS N。
本发明提供了一种被表达载体转化的微生物以及制备SARS冠状病毒的刺突抗原蛋白或核壳抗原蛋白的方法，该方法包括培养所述微生物。
本发明适用的微生物可以是对生物体无毒的任何微生物或减毒微生物。例如，所述微生物适宜地选自革兰氏阴性菌，如大肠杆菌(E.coli)，伤寒杆菌(Salmonella typhi)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)，志贺菌(Shigella)等，或革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌属(Bacillus)，乳酸菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和链球菌(Streptococcus)等。尤其优选的是可食用微生物，如乳酸菌。
本发明还提供了一种用于预防SARS的疫苗，其包括表面上表达抗原蛋白的微生物、从已破碎的该微生物细胞膜组成中提取的粗提物、或从微生物中纯化的抗原蛋白作为有效成分。
本发明的疫苗可以作为药物应用以预防由SARS冠状病毒诱导产生的SARS(严重急性呼吸综合征)。
本发明的疫苗可口服服用，或存在于食品中，或皮下或腹膜内注射或经鼻内途径施用。
至今，SARS冠状病毒的感染已知由传染性飞沫感染呼吸器官所导致，推测在呼吸器官的粘膜表面发生。因此，通过粘膜免疫来预防感染是非常重要的。由于在表面上表达SARS冠状病毒抗原的微生物能更有效地在粘膜上诱导抗体的形成，因此通过口服或鼻内途径施用转化的微生物得到的疫苗比胃肠外施用的疫苗在预防SARS冠状病毒方面更有效。
通过结合下述附图进行详细说明，从而对本发明的进一步目的以及优点进行更充分的了解。
图1为根据Kyte-Doolittle方法的亲水图、Jameson-wolf方法的抗原性指数和Emini方法的表面可能性图所显示出的猪的传染性胃肠炎病毒的4种抗原位点(A，B，C，D)与SARS冠状病毒的刺突蛋白之间的关系。
图2为根据Kyte-Doolittle方法的亲水图，Jameson-wolf方法的抗原性指数和Emini方法的表面可能性图所显示出的猪的传染性胃肠炎病毒的核壳蛋白与SARS冠状病毒的核壳蛋白之间的关系。
图3A是本发明的包括革兰氏阴性和革兰氏阳性菌为宿主的表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS SA的基因图，图3B是本发明的pHCE2LBpgsA-SARS SC的基因图，图3C是本发明的pHCE2LBpgsA-SARS SBC的基因图。
图4A是本发明的载体pHCE2LBpgsA-SARS NB的基因图，图4B是本发明的pHCE2LBpgsA-SARS N的基因图。
图5A、5B和5C通过Western免疫印迹显示pgsA的特异性抗体与融合蛋白间的特异性结合，来鉴定乳酸菌中与细胞外膜蛋白pgsA融合的SARSSA、SARS SC和SARS SBC抗原的表达。
图6A和6B采用乳酸菌细胞的蛋白片段作为pgsA的特异性抗体进行Western免疫印迹，来识别与乳酸菌中细胞外膜蛋白pgsA融合的SARS SA和SARS SBC抗原的表面表达，图6C为通过FACS扫描检测乳酸菌中的SARS SBC抗原的表面表达。
图7A和7B采用乳酸菌细胞的蛋白片段作为pgsA的特异性抗体进行Western免疫印迹，来识别与乳酸菌中细胞外膜蛋白pgsA融合的SARS NB和SARS N抗原的表面表达。
图8为本发明的分别用进行表面表达的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB载体转化酪乳酸杆菌菌株，并且通过ELISA(酶联免疫吸附检测)鉴定出该转化菌株具有抗原部分的表面表达，该转化菌株经口服和鼻内给药后，在小鼠血清中所测得的SARS SA和SARS SC抗原的IgG抗体值。
图9为本发明的分别用进行表面表达的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB载体转化酪乳酸杆菌菌株，并且通过ELISA鉴定出该转化菌株具有抗原部分的表面表达，该转化菌株经口服和鼻内给药后，在小鼠的洗肠液和支气管和肺泡的洗液中所测得的SARS SA和SARS SC抗原的IgA抗体值。
图10为本发明的分别用进行表面表达的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB载体转化酪乳酸杆菌菌株，并且通过ELISA鉴定出该转化菌株具有抗原部分的表面表达，该转化菌株经口服和鼻内给药后，所测定的小鼠血清中SARS NB抗原部分的IgG抗体值。
图11为本发明的分别用进行表面表达的pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE1LBpgsA-SARS NB载体转化酪乳酸杆菌菌株，并且通过ELISA鉴定出该转化菌株具有抗原部分的表面表达，该转化菌株经口服和鼻内给药后，在小鼠的洗肠液和支气管和肺泡的洗液中所测得的SARS NB抗原的IgA抗体值。
最佳实施方式通过下述实施例进一步详细说明本发明。对于本领与普通技术人员而言，显而易见，这些实施例仅用于对本发明进行具体解释说明，而本发明的范围并不局限于此。
尤其是，尽管下述实施例采用了SARS冠状病毒的刺突蛋白的抗原位点基因以及核壳蛋白的抗原位点基因，但任何抗原蛋白基因都可单独使用或作为两种或多种的复合物使用。
在下述实施例中，所采用的与聚-γ-谷氨酸的合成有关的细胞外膜蛋白的基因pgsBCA是从枯草芽孢杆菌chungkookjang变种(KCTC 0697BP)所获得。然而，根据本发明，基因包括利用pgsBCA制备的载体，其中pgsBCA是从产生poly-γ-谷氨酸的所有杆菌属菌株或被这些载体转化的微生物中获得的。例如，采用来源于其它菌株且与枯草芽孢杆菌chungkookjang变种中存在的pgsBCA基因序列有80％或更高同源性的pgsBCA基因制备用于疫苗的载体，以及载体使用的技术方案也包括在本发明的范围之内。
以下实施例中，仅基因pgsBCA的pgsA用于构建表面表达载体。然而，可以从间接实施例推断出，使用部分基因pgsBCA或者全部基因pgsBCA来构建疫苗用载体都包括在本发明的范围之内。
在以下实施例中，革兰氏阴性菌伤寒杆菌和革兰氏阳性菌乳酸菌被用作载体的宿主。然而，任何一种通过本发明方法转化的革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌都能获得相同结果，这对于本领与技术人员而言是显而易见的。
此外，在下述实施例中，仅用本发明的疫苗用载体所转化的微生物作为活疫苗来施用到活体中。然而，根据与疫苗技术领域相关的知识，当将从微生物提取的粗提物表达蛋白(SARS冠状病毒的抗原蛋白)或纯化的表达蛋白用于活体中，很自然能获得相同或相近的结果。
实施例1SARS冠状病毒的刺突蛋白的抗原位点基因的合成SARS冠状病毒的刺突蛋白是一种由1256个氨基酸构成的糖蛋白。在其它已进行大量检测的冠状病毒中，刺突蛋白大多嵌入到覆盖在病毒颗粒表面上的包膜蛋白中，而具有暴露在外面的结构。暴露位点和抗原位点已作为诱导病毒感染与预防感染的疫苗的靶抗原而被深入地研究。
因此，为了从SARS冠状病毒的刺突蛋白的1256个氨基酸中选择出能表现抗原性的位点，对其它已经研究了抗原性并合成了猪传染性胃肠炎(TGE)冠状病毒的刺突蛋白进行蛋白比较分析和结构比较分析，从而选择抗原位点。具体而言，已知猪传染性胃肠炎病毒的刺突蛋白的抗原位点为4个位点(A，B，C，D)(Enjuanes，L.，Virology，183225，1991)。根据Kyte-Doolittle方法的亲水图，Jameson-wolf方法的抗原性指数和Emini方法的表面可能性图，分析这些位点和SARS冠状病毒的刺突蛋白的关系，从SARS冠状病毒Tor2分离物的刺突蛋白的序列中选择出SARS SA，SARS SB，SARS SC和SARS SD(图1)。
首先，基于SARS冠状病毒Tor2分离物的刺突蛋白的序列(21492-25259个碱基对，1255个氨基酸)，其中全部序列都已被鉴定出，2至114氨基酸位点有望成为所选择的抗原位点，称其为SARS SA，选择的375至470氨基酸，称其为SARS SB，选择的510至596氨基酸，称其为SARS SC，选择的1117至1197氨基酸，称其为SARS SD。在这些抗原位点中，对SARS SA和SARS SC位点进行了合成。
为了合成SARS SA的113个氨基酸长度对应的基因，用SEQ ID NOs1至8为引物进行PCR，得到含有339bp的扩增的SARS SA基因。
SEQ ID NO15′-ggatcctttattttcttattatttcttactctcactagtggtagtgaccttgaccg-3′SEQ ID NO25′-tgagtgtaattaggagcttgaacatcatcaaaagtggtacaacggtcaaggtc-3′SEQ ID NO35′-aattacactcaacatacttcatctatgcgtggggtttactatcctgatgaaatttttc-3′
SEQ ID NO45′-aaaatggaagaaataaatcctgagttaaataaagagtgtctgaacgaaaaattt-3′SEQ ID NO55′-cttccattttattctaatgttactgggtttcatactattaatcatacgtttggcaac-3′SEQ ID NO65′-ggcagcaaaataaataccatccttaaaaggaatgacagggttgccaaacgtatg-5′SEQ ID NO75′-atttattttgctgccacagagaaatcaaatgttgtccgtggttgggtttttgg-3′SEQ ID NO85′-ggtaccaagcttattacacagactgtgacttgttgttcatggtagaaccaaaaaccc-3′为了合成SARS SC的87个氨基酸长度所对应的基因，用SEQ ID NOs9至14位引物进行PCR，得到含261bp的扩增的SARS SC基因。
SEQ ID NO95′-ggatccgtttgtggtccaaaattatctactgaccttattaagaaccagtgtgtcaat-3′SEQ ID NO105′-gaagaaggagttaacacaccagtaccagtgagaccattaaaattaaaattgacacact-3′SEQ ID NO115′-aactccttcttcaaagcgttttcaaccatttcaacaatttggccgtgatgtttctga-3′SEQ ID NO125′-ctaaaatttcagatgttttaggatcacgaacagaatcagtgaaatcagaaacat-3′SEQ ID NO135′-ctgaaattttagacatttcaccttgtgcttttgggggtgtaagtgtaattaca-3′SEQ ID NO145′-ggtaccaagcttattaaacagcaacttcagatgaagcatttgtaccaggtgtaattac-3′此外，通过合成获得抗原位点基因，采用来自加拿大迈克尔史密斯基因学中心(Canada′s Michael Smith Genome Science Center)的SARS刺突cDNA克隆体(SARS冠状病毒TOR2)为模板，以SEQ ID NOs15和16为引物，通过PCR扩增得到编码264至596氨基酸的含966bp的基因，将其命名为SARSSBC[该基因包括能产生中和抗体的关键位点(PNAS，1012536，2004)]。
SEQ ID NO15(SBC正义)5′-cgcggatccctcaagtatgatgaaaat-3′SEQ ID NO16(SBC反义)5′-cggggtaccttaaacagcaacttcaga-3′实施例2SARS冠状病毒的核壳蛋白的抗原位点基因的合成SARS冠状病毒的核壳蛋白是一种由422个氨基酸构成的蛋白。据报道，大多数其它冠状病毒的核壳蛋白都可作为抗原。这些抗原位点已经被深入研究，以用作预防冠状病毒感染的疫苗的靶向抗原。
因此，通过与猪传染性胃肠炎(TGE)的冠状病毒的核壳蛋白进行蛋白比较分析，选择SARS冠状病毒的核壳蛋白的氨基酸中能表现出抗原性的位点，并进行合成。
具体而言，根据Kyte-Doolittle方法的亲水图，Jameson-wolf方法的抗原性指数和Emini方法的表面可能性图，分析猪传染性胃肠炎病毒的核壳蛋白和SARS冠状病毒的核壳蛋白之间的关系，从SARS冠状病毒Tor2分离物的核壳蛋白的序列中选择出SARS NA和SARS NB(图2)。
首先，基于SARS冠状病毒Tor2分离物的核壳蛋白序列(28120-29388个碱基对，422个氨基酸)，其中全部序列都已被鉴定出，2至157氨基酸位点有望成为所选择的抗原位点，称其为SARS NA，选择的163至305氨基酸位点，称其为SARS NB。本发明合成了SARS NB位点的基因。
为了合成SARS NB的143个氨基酸长度所对应的基因，用SEQ IDNOs17至26为引物进行PCR，得到含有429bp的扩增的SARS NB基因。
SEQ ID NO175′-ggatcccctcaaggtacaacattgccaaaaggcttctacgcagagggtagccgtgg-3′SEQ ID NO185′-accacgactacgtgatgaagaacgagaagaggcttgactgccgccacggctacc-3′SEQ ID NO195′-cacgtagtcgtggtaattcacgtaattcaactcctggcagcagtcgtggtaat-3′SEQ ID NO205′-gcgagggcagtttcaccaccaccgctagccatacgagcaggagaattaccacga-3′SEQ ID NO215′-gaaactgccctcgcacttttgctgcttgaccgtttgaaccagcttgagagcaa-3′SEQ ID NO225′-tagtgacagtttgaccttgttgttgttggcctttaccagaaactttgctctcaa-3′SEQ ID NO235′-caaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcatctaaaaagcctcgtcaaaaacgt-3′SEQ ID NO245′-ggaccacgacgcccaaatgcttgagtgacgttgtactgttttgtggcagtacgtttttg-3′SEQ ID NO255′-gggcgtcgtggtccagaacaaacccaaggtaatttcggggaccaagaccttatccgt-3′SEQ ID NO265′-ggtaccaagcttattaaatttgcggccaatgtttgtaatcagtaccttgacggataagg-3′此外，通过合成获得抗原位点基因，采用来自加拿大迈克尔史密斯基因学中心的SARS核壳cDNA克隆体(SARS冠状病毒TOR2)为模板，以SEQ IDNOs27和28为引物，通过PCR扩增得到编码2至305位氨基酸的912bp的基因，将其命名为SARS N。
SEQ ID NO27(N sense)5′-cgcggatcctctgataatggtccgcaa-3′SEQ ID NO28(N anti-sense)5′-cggggtaccttaaatttgcggccaatgttt-3′实施例3表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC的构建以革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌为宿主，利用源于杆菌属菌株、并参与合成聚-γ-谷氨酸的细胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA来构建能表面表达SARS冠状病毒的刺突蛋白的抗原位点SARS SA和SC的表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC。
首先，用BamHI和KpnI消化pHCE2LBpgsA-HPVL1(KCTC 10349BP)，以将SARS冠状病毒的刺突蛋白中的抗原位点SARS SA和SARS SC导入到能在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的宿主中表达人乳突瘤病毒的L1抗原的表面表达载体上(一种载体，其含有高表达启动子HCE启动子、参与合成聚-γ-谷氨酸的细胞外膜蛋白的基因(pgsBCA)中的pgsA，以及常用于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的载体pAT中的HPV L1。)。
用限制酶BamHI和KpnI消化实施例1中合成的SARS SA和SARS SC抗原基因，然后连接到已制备的表面表达载体pHCE2LBpgsA上的参与合成聚-γ-谷氨酸的细胞外膜蛋白的基因pgsA的C末端上，根据翻译密码子制备载体pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC(图3A和3B)。用制备得到的表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC转化革兰氏阳性菌乳酸菌，检测乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARS SC质粒的存在。
实施例4表面表达载体pHCE2LBpgsASARS SBC的构建利用源于杆菌属菌株、并参与合成聚-γ-谷氨酸的细胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA来构建能表面表达SARS冠状病毒的刺突蛋白的抗原位点SARS SBC的表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS SBC。
首先，按照实施例3中的方法，制备表面表达载体pHCE2LBpgsA。根据实施例1所描述的方法，以SARS冠状病毒的SARS刺突cDNA克隆体为模板，通过PCR扩增编码264-596氨基酸位点的基因，得到含996bp的SARSSBC基因。然后将SARS SBC基因嵌入到表面表达载体pHCE2LBpgsA中，制备pHCE2LBpgsA-SARS SBC(图3C)。用制备的pHCE2LBpgsA-SARSSBC转化革兰氏阳性菌乳酸菌，检测乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS SBC质粒的存在。
实施例5表面表达载体pHCE2LBpgsASARS NB的构建利用源于杆菌属菌株、并参与合成聚-γ-谷氨酸的细胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA来构建能表面表达SARS冠状病毒的核壳蛋白的抗原位点SARS NB的表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS NB。
首先，按照实施例3中的方法，制备表面表达载体pHCE2LBpgsA。用限制酶BamHI和KpnI消化实施例2中合成的SARS NB抗原基因，然后连接到已制备的表面表达载体pHCE2LBpgsA上的参与合成聚-γ-谷氨酸的细胞外膜蛋白的基因pgsA的C末端上，根据翻译密码子制备载体pHCE2LBpgsA-SARS NB(图4A)。再用制备得到的表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS NB转化革兰氏阳性菌乳酸菌，检测乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS NB质粒的存在。
实施例6表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS N的构建利用源于杆菌属菌株、并参与合成聚-γ-谷氨酸的细胞外膜蛋白基因(pgsBCA)中的pgsA来构建能表面表达SARS冠状病毒的核壳蛋白的抗原位点SARS N的表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS N。
首先，按照实施例3中的方法，制备表面表达载体pHCE2LBpgsA。根据实施例2所描述的方法，以SARS冠状病毒的SARS核壳cDNA克隆体为模板，通过PCR扩增编码2-305氨基酸位点的基因，得到含912bp的SARS N基因。然后将SARS N基因嵌入到表面表达载体pHCE2LBpgsA上，制备pHCE2LBpgsA-SARS N(图4B)。用制备的pHCE2LBpgsA-SARS N转化革兰氏阳性菌乳酸菌，检测乳酸菌中pHCE2LBpgsA-SARS N质粒的存在。
实施例7乳酸菌上的SARS病毒刺突抗原蛋白的表面表达的确定用表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS SBC转化乳酸菌，检测各抗原蛋白的表达。用pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS SBC转化酪乳酸杆菌，转化的菌株在MRS培养基(乳酸菌MRS，Becton Dickinson and Company Sparks，USA)中培养至静止期，37℃下进行扩增，诱导与基因pgsA合成的聚-γ-谷氨酸的C末端融合的SARS病毒刺突抗原的抗原位点的表达。
通过Western免疫印迹法，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和pgsA的特异性抗体检测各刺突抗原的表达。对已被诱导表达的酪乳酸杆菌的全细胞进行变性，得到相同细胞浓度的蛋白来制备样本。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析这些蛋白，并将分离的蛋白转移至PVDF膜(聚二氟偏二乙烯膜，Bio-Rad)上。将其上带有蛋白的PVDF膜放在封闭缓冲液(50mM TrisHCl，5％脱脂乳，pH 8.0)中，振摇1个小时进行封闭，与pgsA的兔源多克隆一级抗体反应12个小时，其中该抗体已用封闭缓冲液稀释1000倍。
反应结束后，用缓冲液清洗膜，再与兔的结合生物素的二级抗体反应4小时，其中该二级抗体已用封闭缓冲液稀释了1000倍。反应结束后，用缓冲液清洗膜，再与抗生物素蛋白-生物素试剂反应1个小时，然后再清洗。用H2O2和DAB溶液处理清洗后的膜，将其用作底物，用着色剂确定pgsA的特异性抗体和融合蛋白之间的特异性结合(图5)。图5A中，泳道1是未转化的酪乳酸杆菌，泳道2，3和4是被pHCE2LBpgsA-SARS SA转化的酪乳酸杆菌。图5B中，泳道1是未转化的酪乳酸杆菌，泳道2，3，4，5和6是被pHCE2LBpgsA-SARS SC/转化的酪乳酸杆菌。图5C中，泳道1是未转化的酪乳酸杆菌，泳道2是被pHCE2LBpgsA-SARS SBC转化的酪乳酸杆菌。
如图5所示，在所有乳酸菌的细胞中检测到特异性融合蛋白[约54kDa的pgsA-SARS SA(图5A)，约51kDa的pgsA-SARS SC(图5B)和约78kDa的pgsA-SARS SBC(图5C)]。
为了确定经pHCE2LBpgsA-SARS SA和pHCE2LBpgsA-SARSSBC表面表达载体所转化的乳酸菌的表面上是否与pgsA一起表达了各抗原蛋白，通过超高速离心机将各载体转化的乳酸菌破碎成细胞壁和细胞质，通过Western blot法，使用pgsA的特异性抗体检测各融合蛋白的位置。
具体而言，收集由上述方法诱导融合蛋白质表面表达的乳酸菌，配置成与未转化的乳酸菌相同的细胞浓度。用TES缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，25％蔗糖)清洗细胞数次，将细胞悬浮于含5mg/ml溶菌酶、1mM PMSF和1mM EDTA的蒸馏水中，在-60℃下冷冻，室温下解冻几次，用DNase(0.5mg/mQ)和RNase(0.5mg/m)处理，然后进行超声处理使细胞破碎。然后，在4℃、10,000Xg下对细胞溶解物离心20分钟，使未溶解的乳酸菌细胞(颗粒；全细胞部分)和细胞碎片(上清液)分离开。在4℃、21,000Xg下对分离出的细胞碎片离心1个小时，得到上清液(溶解部分)，上清液中含有乳酸菌和颗粒的细胞质蛋白。所得颗粒悬浮于含1％SDS的TE溶液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH 7.4)中，得到乳酸菌的细胞壁蛋白质(细胞壁部分)。
利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和pgsA抗原的抗体，对上述各部分进行Western免疫印迹分析，以确定各乳酸菌部分中与细胞壁上pgsA融合的SARS病毒的刺突抗原(图6)。在图6A中，泳道1为未转化的酪乳酸杆菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS SA转化的酪乳酸杆菌的全细胞，泳道3和泳道4分别是由pHCE2LBpgsA-SARS SA转化的菌株的溶解部分和细胞壁部分。在图6B中，泳道1为未转化的酪乳酸杆菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS SBC转化的酪乳酸杆菌的全细胞，泳道3和泳道4分别是由pHCE2LBpgsA-SARS SBC转化的菌株的溶解部分和细胞壁部分。
如图6所示，在乳酸菌的全细胞和细胞壁部分识别出了与pgsA融合的约54kDa的SARS SA蛋白以及与pgsA融合的约78kDa的SARS SBC蛋白。从这些结果可以看出，与pgsA融合的各个SARS抗原蛋白被表达并被pgsA迁移到乳酸菌表面上。
通过荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术可以鉴定出，SARS病毒的刺突抗原的抗原部分通过与聚-γ-谷氨酸合成蛋白pgsA的C末端融合，而在乳酸菌的表面上表达。
进行免疫荧光染色，收集相同细胞浓度的诱导表达的乳酸菌。用缓冲液(PBS缓冲液，pH 7.4)洗涤细胞数次，再将细胞悬浮于含有1％牛血清白蛋白的1ml缓冲液中，与鼠源的SARS病毒刺突抗原的多克隆一级抗体在4℃反应12个小时，其中该抗体被稀释1000倍。反应完成后，用缓冲液清洗细胞数次，将细胞悬浮于含有1％的牛血清白蛋白的0.1ml缓冲液中，与结合生物素的二级抗体在4℃反应3个小时，其中该抗体被稀释1000倍。反应完成后，用缓冲液清洗细胞数次，将细胞悬浮于含有1％的牛血清白蛋白的0.1ml缓冲液中，与生物素特异性的链霉亲和素-R-藻红蛋白染色试剂结合，其中该染色试剂被稀释1000倍。
反应完成后，清洗乳酸菌数次，用荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术进行检测。可以看出，与未转化的乳酸菌不同，SARS病毒的SBC刺突抗原蛋白在乳酸菌表面上被表达(图6C)。在图6C中，灰色部分源于未转化的酪乳酸杆菌，而白色部分源于pHCE2LBpgsA-SARS SBC/转化的酪乳酸杆菌。如图6C所示，可清晰地看出，在由pHCE2LBpgsA-SARS SBC载体转化的乳酸菌上，表面表达出了SBC刺突抗原蛋白，而在未转化的酪乳酸杆菌中并未观察到荧光表达。
实施例8乳酸菌上的SARS病毒核壳抗原蛋白的表面表达的确定用表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS NB和pHCE2LBpgsA-SARS N转化乳酸菌，并检测各抗原蛋白的表达。
用pHCE2LBpgsA-SARS NB和pHCE2LBpgsA-SARS N分别转化酪乳酸杆菌，转化的菌株在MRS培养基(乳酸菌MRS，Becton Dickinson andCompany Sparks，USA)中培养至静止期，37℃下进行扩增，诱导分别与基因pgsA合成的聚-γ-谷氨酸的C末端融合的SARS病毒核壳抗原的抗原位点的表达。
为了确定经pHCE2LBpgsA-SARS NB和pHCE2LBpgsA-SARS N表面表达载体所转化的乳酸菌的表面上是否与pgsA一起表达了各抗原蛋白，用实施例7相同的方法，通过超高速离心机将各载体转化的乳酸菌破碎成细胞壁和细胞质，通过Western blot法，使用pgsA的特异性抗体检测各融合蛋白的位置。
结果是，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和pgsA抗原的抗体，对上述各部分进行Western免疫印迹分析，以确定各乳酸菌部分存在着与细胞壁上pgsA融合的SARS病毒的核壳抗原(图7)。在图7A中，泳道1为未转化的酪乳酸杆菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS NB转化的酪乳酸杆菌的全细胞，泳道3和泳道4分别是由pHCE2LBpgsA-SARS NB转化的菌株的溶解部分和细胞壁部分。在图7B中，泳道1为未转化的酪乳酸杆菌，泳道2是由pHCE2LBpgsA-SARS N转化的酪乳酸杆菌的全细胞，泳道3和泳道4分别是由pHCE2LBpgsA-SARS N转化的菌株的溶解部分和细胞壁部分。
如图7所示，从乳酸菌的全细胞和细胞壁部分中识别出了与pgsA融合的约57kDa的SARS NB蛋白以及与pgsA融合的约75kDa的SARS N蛋白。从这些结果可以看出，表达了与pgsA融合的各个SARS抗原蛋白，并且被pgsA迁移到了乳酸菌表面上。
实施例9具有表面表达SARS病毒的刺突抗原和核壳抗原蛋白的乳酸菌疫苗效果的分析用前述实施例中制备出的表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS NB转化革兰氏阳性菌酪乳酸杆菌，诱导酪乳酸杆菌表面上的抗原的表达。用小鼠模型检测与涉及聚-γ-谷氨酸合成的细胞外膜蛋白pgsA相融合的SARS病毒刺突抗原蛋白和核壳抗原蛋白的抗原性。
具体而言，根据本发明，用表面表达载体pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS NB转化酪乳酸杆菌。收集细胞，得到相同的细胞浓度，用缓冲液(PBS缓冲液，pH 7.4)清洗细胞数次。给4-6周BALB/c小鼠每日3次隔日口服5X109具有表面表达的抗原的乳酸菌，一周后隔日服用每日3次，两周后隔日服用每日3次，4周后隔日服用每日3次。给小鼠每日3次隔日通过鼻内给予1×109具有表面表达的抗原的乳酸菌，一周后隔日每日3次给药，两周后每两日给药每日2次，4周后每两日给药每日2次。口服和鼻内给药后，每两周取各小鼠的血清①，用ELISA检测血清中的刺突抗原蛋白和核壳抗原蛋白的IgG抗体值，并检测②清洗各小鼠肠道的悬浮液和清洗各小鼠支气管和肺泡的悬浮液中的刺突抗原蛋白和核壳抗原蛋白的IgA抗体值。
每组分有10只BALB/c小鼠(4-6周)。将分别表达SARS SA和SARS SC的乳酸菌的混合物分为一组，表达SARS NB的乳酸菌分为一组，分别表达SARS SA、SARS SC和SARS NB的乳酸菌混合物分为一组。将这三组分成口服给药组和鼻内给药组，包括对照组共8个组。
图8示出小鼠血清中SARS病毒的刺突抗原蛋白SARS SA和SARS SC抗原的IgG抗体值。图9是在清洗小鼠肠道的悬浮液和清洗小鼠支气管和肺泡的悬浮液中，用ELISA检测到的刺突抗原蛋白SARS SA和SARS SC抗原的IgA抗体值，其中A是口服组的IgA抗体值，B是鼻内给药组的IgA抗体值。
图10示出小鼠血清中SARS病毒的核壳抗原蛋白SARS NB抗原的IgG抗体值。图11是在清洗小鼠肠道的悬浮液和清洗小鼠支气管和肺泡的悬浮液中，用ELISA检测到的SARS病毒核壳抗原蛋白SARS NB抗原的IgA抗体值，其中A是口服组的IgA抗体值，B是鼻内给药组的IgA抗体值。
如图8至图11所示，可以看出，与对照组相比，单独施用或联合施用pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC和pHCE2LBpgsA-SARS NB转化的乳酸菌的BALB/c小鼠的血清、肠洗液和支气管-肺泡洗液中，SARS病毒的刺突抗原蛋白和核壳抗原蛋白的IgG抗体值和IgA抗体值明显高。
因此，根据本发明，含有表面表达SARS病毒的刺突和核壳抗原蛋白的抗原部分的微生物能有效用作活疫苗。
虽然本发明参照具体示例性实施方式进行说明与描述，但本发明并不仅限于这些实施方式，而由权利要求限定。可以理解，本领域技术人员在不背离本发明的范围和精神而改变或调整实施方式。
工业实用性如上所述，根据本发明，在表面上能表达诱导SARS的冠状病毒的抗原蛋白的转化的微生物，以及从微生物中提取和纯化的抗原蛋白可有效用作预防和治疗SARS的疫苗。尤其是，本发明使得采用表达SARS冠状病毒抗原的重组菌株来经济地制备口服疫苗成为可能。
序列表<110>生物领先公司M.D.实验室生物领先日本公司韩国生命工学研究院<120>SARS病毒抗原的细胞表面表达载体和用该载体转化的微生物<130>PCF052440C<150>KR10-2003-0035993<151>2003-06-04<160>28<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>PCR引物(N sense)<400>27cgcggatcct ctgataatgg tccgcaa 27<210>28<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
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权利要求
1.一种表面表达载体，其包括编码聚-γ-谷氨酸合成酶复合物的pgsB、pgsC和pgsA基因中的任意一种或两种或多种，以及一种编码SARS冠状病毒的刺突抗原蛋白或核壳抗原蛋白的基因。
2.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中所述的刺突抗原蛋白为SARS SA、SARS SB、SARS SC、SARS SD或SARS SBC。
3.根据权利要求1所述的表面表达载体，其中所述的核壳抗原蛋白为SARS NA、SARS NB或SARS N。
4.根据权利要求2所述的表面表达载体，其中所述的载体为pHCE2LBpgsA-SARS SA、pHCE2LBpgsA-SARS SC或pHCE2LBpgsA-SARS SBC。
5.根据权利要求3所述的表面表达载体，其中所述的载体为pHCE2LBpgsA-SARS NB或pHCE2LBpgsA-SARS N。
6.一种被权利要求1至5任意一项所述的表达载体转化的微生物。
7.根据权利要求6所述的微生物，其中所述的微生物选自下述微生物的组中大肠杆菌、伤寒杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、牛分枝杆菌、志贺菌、芽孢杆菌属、乳酸菌、葡萄球菌、李斯特氏菌和链球菌。
8.一种制备SARS冠状病毒的刺突抗原蛋白或核壳抗原蛋白的方法，其包括培养权利要求6的微生物。
9.一种预防SARS病毒的疫苗，其包括以权利要求8的方法所制备的刺突抗原蛋白或核壳抗原蛋白作为有效成分。
10.根据权利要求9所述的疫苗，其中所述的抗原蛋白为微生物表面的表达形式、粗提形式或纯化形式。
11.根据权利要求9所述的疫苗，其中所述的疫苗通过口服施用或存在于食物中。
12.根据权利要求9所述的疫苗，其中所述的疫苗用于皮下或腹膜内注射。
13.根据权利要求9所述的疫苗，其中所述的疫苗用于鼻内给药。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述的微生物为乳酸菌。
15.权利要求14所述方法制备的乳酸菌，该乳酸菌表面上表达SARS冠状病毒的刺突抗原蛋白或核壳抗原蛋白。
16.一种用于预防SARS的疫苗，其包括权利要求15的乳酸菌、从所述乳酸菌中提取的抗原蛋白、或从所述乳酸菌中纯化的抗原蛋白作为有效成分。
17.根据权利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗通过口服施用或存在于食物中。
18.根据权利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗用于皮下或腹膜内注射。
19.根据权利要求16所述的疫苗，其中所述疫苗用于鼻内给药。
全文摘要
本发明涉及一种SARS冠状病毒抗原的表面表达载体，该载体包括一种编码诱导SARS的冠状病毒的抗原的基因，以及一种或两种或多种编码聚－γ－谷氨酸合成酶复合物的pgsB，pgsC和pgsA基因，还涉及被表面表达载体转化的微生物以及包括该微生物的SARS疫苗。本发明使得采用表达SARS冠状病毒抗原的重组菌株来经济地制备预防和治疗SARS的疫苗成为可能。
文档编号C12N9/00GK1798844SQ200480015275
公开日2006年7月5日 申请日期2004年6月4日 优先权日2003年6月4日
发明者成文喜, 金哲仲, 郑昌敏, 洪承杓, 李宗洙, 催在哲, 金光, 黑田俊一, 夫夏玲 申请人:生物领先公司, M.D.实验室, 生物领先日本公司, 韩国生命工学研究院