专利名称：蛋白质生产系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用稳定的和感受态的人肝细胞系的最优化的蛋白生产系统。
背景自二十世纪早期以来在科学和医学界就已经了解治疗蛋白了，但是从组织或尿中获得的少量蛋白使得替代治疗难以进行，如果不是不可能的话。在1980年代，基因组技术上的进步已直接地促进了对负责生产大量潜在治疗蛋白(‘生物治疗药物’)的基因的鉴定、分离和表征。
重组DNA技术使得可以大规模制造和生产许多治疗蛋白质。该方法可使用原核或真核来源的细胞进行扩增。任何蛋白的功能和效率，以治疗蛋白为代表，主要依赖于基因序列；然而，几种对蛋白质的翻译后修饰在蛋白发挥最大功效的能力上可能起着极其重大的作用。
翻译后修饰(PTMs)改变了氨基酸(蛋白质的构建模块)侧链基团的性质，这样其就改变了蛋白的功能。总地说来，这些翻译后修饰对蛋白最后的结构和功能贡献很大。因此，当制备用于人的治疗蛋白时，对蛋白进行人模式的翻译后修饰被认为是很重要的。
工业例子最初在原核细胞中生产的EPO是无效的，因为细菌宿主对其转染的人的基因产物的翻译后修饰模式既不正确也不足以给药物提供合适水平的临床效用。因此，决定在哺乳动物但非人细胞中生产EPO在所述药物发展历程中写下了重要一笔。
天然的和重组的治疗蛋白之间的已知差异关于正确的PTMs在生物治疗药物的生物学活性/治疗功效方面的报道非常多，特别是在临床进展上，新的生物治疗药物分子可以用即将到来的洪水来形容。下列是一些报道的研究例子。
重组糖蛋白的糖基化(主要的PTM)可深深地影响其生物学活性，包括循环清除速率，并且正确糖基化的重组蛋白具有比非正确糖基化的结构显著更长的血清半寿期(Chitlaru T，Kronman C，Zeevi M，KamM，Harel A，Ordentlich A，Velan B，Shafferman A(1998).Modulation of circulatory residence of recombinantacetylcholinesterase through biochemical or geneticmanipulation of sialylation levels.Biochem J 1998 336647-658.)。
重要的术语天然蛋白在不存在任何操作或基因工程的情况下，在天然生理条件下由给定的组织、器官、细胞常规合成的蛋白。
重组蛋白在通过细胞或生物体的基因工程改造后获得的基因产物(蛋白)。
Misaizu T，Matsuki S，Strickland TW，Takeuchi M，Kobata A，Takasaki S((1995).Role of antennary structure of N-linkedsugar chains in renal handling of recombinant humanerythropoietin.Blood 864097-4104.)发现人重组促红细胞生成素(EPO)糖基化的本质和程度深深地影响其在体内的活性。不正确的糖基化模式使总的身体清除速率增加超过三倍并导致非常低的刺激红细胞祖先细胞的活性。
在许多情况下，天然和重组糖蛋白之间、不同细胞系表达的重组形式之间和来自不同器官的相关糖蛋白之间在糖基化上有显著不同。Landberg E，Pahlsson P，Krotkiewski H，Stromqvist M，Hansson L，Lundblad A((1997).Glycosylation of bile-salt-stimulatedlipase from human milkcomparison of native and recombinantforms.Arch Biochem Biophys 34494-102.)发现来自人奶的胆汁盐刺激的脂肪酶(BSSL)的天然和重组形式的糖基化不同。天然BSSL包含高含量的A2F家族N-聚糖而在CHO或小鼠成纤维细胞系中表达的重组形式主要具有A2家族聚糖。
Jacquinot PM，Leger D，Wieruszeski JM，Coddeville B，Montreuil J，Spik G((1994).Change in glycosylation of chickentransferrin glycans biosynthesized during embryogenesis andprimary culture of embryo hepatocytes.Glycobiology 4617-624.)研究来自鸡血清、鸡胚胎血清和来自原代培养中的鸡胚胎肝细胞的培养基中的运铁蛋白的寡糖时发现其各具有不同的糖基化模式。
Tanigawara Y，Hori R，Okumura K，Tsuji J，Shimizu N，NomaS，Suzuki J，Livingston DJ，Richards SM，Keyes LD等人((1990).Pharmacokinetics in chimpanzees of recombinant humantissue-type plasminogen activator produced in mouse C127 andChinese hamster ovary cells.Chem Pharm Bull(Tokyo)1990 Feb；38(2)517-22)证明两种具有不同糖结构的r-tPA’s(重组组织纤溶酶原激活剂)制剂显现不同的药物动力学，强烈地暗示着糖结构可影响t-PA的生物学活性，从而影响治疗功效。
为什么是天然的蛋白？缺乏正确人翻译后修饰的重组蛋白可引起中和抗体，导致功效降低。此外，重组产生的蛋白通常很快地被从循环系统中清除，需要经常的注射或聚乙二醇化以延长半寿期。生产“聚乙二醇化”蛋白非常昂贵并且可能失去其的部分生物学活性，达到相同的功效需要更高的剂量。
相反地，来自人组织的天然蛋白完全是人糖基化的，提供了具有优于目前治疗物的明显的活性/功效/安全有利方面由于在最终的蛋白产物上存在天然发生的聚糖结构和亚型以及其它翻译后修饰，导致其更好和更广泛的功效，更加满足人的治疗要求；由于更低的剂量导致显著更少的副作用；由于正确的PTMs导致在循环系统中更长的半寿期和较小的过敏反应；由于多个蛋白提取物来自单个细胞来源和生产过程导致更低的生产成本；由于使用单个永生化人细胞系和单一生产过程导致更低的调节障碍。
相对于产生于细菌的非糖基化的重组蛋白，糖基化蛋白更长的半寿期导致较少注射频率。
工业例子II型糖原贮积病(GSDII)是由于蛋白质GAA(酸性α-葡糖苷酶)(糖原降解溶酶体酶)缺陷造成的常染色体隐性疾病。
该缺陷导致在几乎所有的身体组织中普便沉积溶酶体糖原并且最终可在两岁前导致心力衰竭(因此GSDII是个威胁生命的病症)。
目前对所述疾病的治疗包括通过给患者注射重组蛋白来修复缺陷，所述重组蛋白制备自培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或分泌自兔子的奶中，所述兔子携带在奶特异性启动子控制下的生产所述蛋白的转基因。
这两种产生的重组蛋白在其被吸收入靶组织和在靶组织中所发挥的功能都极其不足。
NIH(美国国立卫生研究所)宣布了涉及肝细胞(无论培养的或体内的)在生产天然人GAA中的用途的新技术。
所述NIH方法使用人肝细胞通过正确的糖基化在细胞中产生正确翻译后修饰的酶，因此产生了能够被轻易吸收和定位在靶组织中的优良的酶。当到达靶细胞后，所述酶降解存在于溶酶体中的糖原。
由肝细胞天然产生的蛋白肝脏是最有前景的提供生产型细胞的器官/组织之一，所述生产型细胞具有广谱的递送具有治疗目的的天然蛋白的潜力，所述天然蛋白可作为直接的生物学药物或作为经证明有效的用于药物小分子开发的药物靶。事实上，该器官合成整套宿主的重要蛋白，包括酶、激素、凝血因子和免疫因子。几种通过肝合成的蛋白是正确地发挥血液功能所必需的；这些蛋白包括帮助保持正确的血液体积的结合蛋白和白蛋白。由肝产生的凝血因子包括血纤蛋白原、凝血酶原(因子II)、因子VII、VIII、IX、X和von Willebrand因子。急性期蛋白(APP)是另一套由肝响应组织破环和与损伤和/或感染性疾病相关的炎症而合成的血浆蛋白。运铁蛋白(Tf)、α-2-巨球蛋白(a2M)、血红素结合蛋白恰好是一些重要的急性期蛋白。
(请参考附录中的由肝细胞产生的蛋白的详尽列表)。。
天然肝脏蛋白方法的局限原代肝细胞不会增殖，因此从该细胞类型生产蛋白需要稳定地提供新的来自人肝活检组织的细胞制剂。这代表笨拙而昂贵的具有许多相关问题(QA，批与批之间变化、几乎没有标准化、调节紊乱)的方法。通过TGE-Corp的in-licensing策略(Multicell Technologies的单一永生化和标准化的完全感受态的人肝细胞)已经解决该问题。
对于生产用于治疗或其它用途的天然肝蛋白，剩下的限制很明显取决于以适当的产量从培养的肝细胞中获得的成套蛋白。所述附录部分列出了所有主要的蛋白，所述蛋白可以以‘天然蛋白’大量生产。
必须使用基因工程策略生产任何其它治疗蛋白候选者。然而，即使在这种情况下，这些细胞底物的人性质/来源(MCT的肝细胞系)应当保证目前可获得的最好的翻译后修饰，因而导致产生具有明显竞争优势的重组终产物，包括有利的调节前景。
附录1表达治疗蛋白质的高效、诱导型启动子-基因构建体的构建基础构建表达载体，所述表达载体允许在原核和真核细胞中通过zeocin抗生素(Cayla)的筛选来选择稳定的转染子。可从pZeoSV质粒(Invitrogen)中以限制性消化片段获得Zeocin抗性基因并且将其连接至含有细菌复制起始位点的片段上，所述片段通过pUC19(NewEngland Biolabs)的PCR扩增获得。然后将该连接混合物用于转化感受态大肠肝菌(E.coli)细胞并在含有Zeocin的细菌培养板上选择想要的重组质粒(pUC-Zeo)。获得合成的poly(A)序列(作为pGL3-Basic(Promega)降解的限制性片段)并将其连接到pUC-Zeo的HSP70B启动子上游，并且就Zeocin抗性选择想要的重组体(pUC-ZeoA)。以限制性片段的方式获得HSP70B驱动的表达盒(Hi-Hot)，所述限制性片段来自pHi&Hot-MCS(V3)(David Harris，University of Arizona)的PCR扩增片段，并且其多克隆区域中的XhoI片段已被删除。将Hi-Hot表达盒连接入pUC-ZeoA的合成poly(A)序列下游并就Zeocin抗性选择想要的重组体(pHiHot-Zeo)。可将需要在Hi-Hot系统控制下表达的基因插入来源于pHi&Hot-MCS的多克隆序列的单一XhoI和XbaI位点。所述Hi-Hot质粒构建体来源于Tsang等人，Biotechniques，2051-52，1996和Tsang等人，Biotechniques，2268的构建体。
在使用表达白细胞介素-2的Lewvis肺癌细胞系的瞬时转染实验中比较表达系统，获得下列结果Hsp70B启动子-468pg/ml白细胞介素-2CMV启动子-573pg/ml白细胞介素-2Hi-Hot启动子-18,409pg/ml白细胞介素-2HI-HOT启动子比HSP70B启动子强39.3倍，比CMV启动子强32.1倍附录2天然的肝脏蛋白候选者名单缩写 蛋白名称
附录3现存的人细胞系生产系统生物技术最初的成功(即将DNA序列转移至活细胞中并使其大规模产生治疗蛋白/肽的能力)要追溯到大约30年前。重组胰岛素的产生是第一个这种方法的例子，在1970年代通过将胰岛素基因导入细菌(可获得的最简单细胞类型)中获得重组胰岛素。然后，这些‘经基因工程改造的细菌’产生至今仍在成功地用于对抗糖尿病的胰岛素。
随着生物技术工业逐渐对更复杂的蛋白药物生产产生兴趣，需要更复杂的生产型细胞作为生产平台。在80年代早期，在哺乳动物细胞中大规模生产治疗蛋白代表了主要突破。今天，动物细胞例如啮齿类动物细胞系，特别是中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)，代表了用于生产生物治疗药物(包括一些轰动的生物技术药物)的最重要的平台。
然而，在近年来的临床实验中，特别是使用重组鼠科动物抗体的实验中，很快清楚地了解到非人抗体具有引起免疫应答的潜能，因此阻碍了治疗功效。这些观察强调了复杂蛋白产物的正确‘人类型’翻译后修饰的重要性。
PER.C6TMIntrogen b.v.(Leiden，NL)公司，即现在的Crucell，使生物生产方法从啮齿类动物向人生产平台迈进了一步。PER.C6TM是由能够产生用于人治疗使用的生物治疗药物的人细胞系组成的表达平台。PER.C6细胞系产生自人视网膜来源的原代细胞，所述细胞通过插入腺病毒E1基因而被永生化。所述细胞系以受控和完全已知的方式来源于单一的健康人细胞来源。公司已永生化所述细胞以使其能够无限地进行自我复制，这与正常人细胞不同，所述自我复制是以足以用于商业销售的量来生产重组生物治疗药物产品所必需的前提特征。
目前，为了下列目的，Crucell改进其PER.C6生产平台通过rDNA技术生产单克隆抗体；生产除了mAb以外的各种治疗蛋白；
疫苗生产；用于基因治疗应用的腺病毒载体生产；功能基因组。
为什么是PER.C6TMCrucell，即PER.C6TM拥有者公司，宣称其平台代表当今应用例如上述1-4的工业标准。其主要原因是源自下列断言“Crucell的技术保持‘人’糖基化模式。”使用PER.C6细胞生产生物药物产品的主要有利方面翻译后修饰(特别是糖基化)在半寿期、生物活性和免疫相容性方面，最佳的重组药物蛋白产品包含人聚糖结构(即糖基化模式)。哺乳动物细胞如CHO(生物技术‘生产器’)或其它已建立的非人哺乳动物细胞系给重组蛋白或抗体加上非人聚糖结构。PER.C6细胞进行人糖基化模式，导致更高的生物学活性和更长的半寿期。
调控问题随着PER.C6已发展成用于生物治疗药物的生产平台，从开始到现在已汇集了了大量关于所述细胞系产生和特征的参考资料。这些参考资料已由FDA作为生物产品主文件(BMF)保存。PER.C6已被批准用于生产用于基因治疗实验的重组腺病毒，和已被接受进行HIV疫苗的I/II期临床试验，所述疫苗被施用给健康和无免疫应答的个体。
产品产率-单克隆目前用于生产单克隆抗体的表达平台是CHO和NS/0细胞，所述细胞在最终生产过程中总共具有平均大约0.5g/l的表达产率。PER.C6在非最优化的系统中产生类似的抗体水平并且预期在最优化的补料分批培养系统中产率会有显著增加。
知识产权Crucell，Leiden，NL，完全拥有与PER.C6相关的技术和实际知识，其具有明晰的专利状况，这与所有其它用于生物治疗药物的生产平台的情况大不相同。
使用的灵活性所述细胞容易在无血清和无动物组分培养系统中以贴壁或悬浮培养的方式进行培养，并且可容易地从一种培养基中或培养条件下转移至另一种培养基中或培养条件下。
可量测性腺病毒E1基因的存在抑制了PER.C6细胞的衰亡，当在分批生产培养系统中培养时导致很长的寿命。PER.C6细胞容易规模化-目前将所述细胞培养在2,500L反应器中并且正进行进一步扩大规模。
稳定性用表达质粒转染PER.C6细胞是有效的，随后产生稳定的亚克隆。重要的是，在缺少基因扩增的情况下观察到重组蛋白的高表达水平，于是产生了优于使用需要扩增以获得足够蛋白表达的细胞系的可观的时间有利方面。
在2002年5月的听证会(http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/01/briefing/3750b1_01.htm)上，FDA考虑了在使用两种新的细胞底物即HEK293细胞和PER.C6细胞上的潜在风险。通过用5型腺病毒(Ad5)的转化早期区域1(E1)转化人胚胎肾细胞(293)和人胚胎视网膜细胞(PER.C6)来开发这些细胞系。由于细胞系例如293和PER.C6表达Ad5 E1区域，所以其能与缺陷型Ad5载体的生长互补，所述载体已通过删除E1被“致残”。缺陷型Ad5载体已通过基因工程改造表达外源基因例如来自人免疫缺陷病毒(HIV)、AIDS病原体的基因，并且因为其的经证明产生针对HIV的细胞介导的免疫应答的能力，这种类型的载体被认为具有用于疫苗开发的重大潜力。然而，与Ad5-转化细胞相关的调节重要性的特征是其在免疫缺陷动物例如裸鼠中形成肿瘤的能力。
考虑到与使用所谓的Designer Cell Substrates-即赘生性细胞(来源于经确定的病毒或细胞癌基因转化或经永生化细胞基因(例如端粒酶)转化的正常细胞)-相关的潜在风险，OVRR/CBER正考虑概括于“确定的风险”评估(Lewis等人，″A defined-risks approachto the regulatory assessment of the use of neoplastic cells assubstrates for viral vaccine manufacture″，In EvolvingScientific and Regulatory Perspectives on Cell Substrates forVaccine Development.Brown，Lewis，Peden，Krause(eds.)Develop.Biol.Stand.)框架内的方法，该框架意欲检查，以及如果可能的话，定量“传递”用于疫苗生产的细胞底物的致瘤性组分的潜在风险和确定所述“传递”是否可能造成风险，特别是癌基因对接种人员的风险。可影响与使用Designer Cell Substrates相关的风险的因素包括(a)已知的导致致瘤性细胞发育的细胞转化机制；(b)残余的细胞DNA；和(c)外来因子特别是致癌病毒的存在。
CRUCELLCrucell发现和发展了利用人免疫系统对抗疾病的完全的人生物治疗药物。Crucell拥有的技术平台MAbstractTM、AdVacTM和PER.C6TM使得能够发现、发展和生产新的抗原、抗体和疫苗。Crucell将其技术提供给药物和生物技术伙伴，并利用其建立Crucell自己的生产线。
PER.C6TM是人细胞生产平台，其已成为用于生产重组腺病毒载体的工业标准。PER.C6TM已被证明是用于生产抗体和疫苗的优良平台。
Crucell拥有19个其PER.C6TM技术的被许可方，包括Novartis、Pfizer、GSK、Aventis、Genzyme和Schering。
Crucell’s Press Releases中的PER.C6TM。
PER.C6TM是用于开发和生产生物治疗药物产品例如抗体、蛋白和疫苗的人细胞平台。PER.C6TM的优良的产率和可测量性以及详尽的历史和安全记录使得PER.C6成为药物工业所要求的安全、成本效率和大体积生产平台。与Merck & Co.订立了排他性许可协议，同意其使用PER.C6作为疫苗平台生产其HIV疫苗，Crucell致力于扩大其PER.C6在疫苗领域的商业业务。目前与Rhein Biotech的协议支持了该策略。
权利要求
1.用于在人细胞中生产有活性的基因产物的方法，所述方法包括下列步骤提供DNA构建体，其中编码目的蛋白的基因有效地连接至经修饰的热诱导启动子上；通过转化或转染将所述DNA构建体导入人细胞系以产生转化的或转染的宿主细胞系；使所述转化的或转染的细胞系经受短暂升温并允许在温度已回复到所述宿主细胞的正常生长温度后发生蛋白翻译，从而产生所述目的蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述经修饰的热诱导启动子是Hi-Hot启动子。
3.权利要求1的方法，其中所述人细胞系是感受态人肝细胞系。
4.权利要求3的方法，其中所述表达的基因编码治疗蛋白。
5.权利要求3的方法，其中所述表达的基因包括治疗性基因，例如干扰素、白细胞介素、凝血因子、胰岛素、生长激素、尿激酶、EPO、TPA、FSH、促生长素抑制素、抗体、DNA酶、肌红蛋白、促血管生成因子和抗血管生成因子和兽医目的的蛋白。
6.权利要求3的方法，其中所述表达的基因是天然肝脏蛋白。
全文摘要
提供了在人类细胞中生产活性基因产物的方法，该方法包括下列步骤提供DNA构建体，其中编码目的蛋白的基因有效地与修饰的热诱导启动子连接；通过转化或转染把所述DNA构建体导入人类细胞系，形成转化的或转染的宿主细胞系；使所述转化的或转染的细胞系接受短暂升温，并允许在温度回复到所述宿主细胞的正常生长温度后，实现蛋白翻译，从而实现所述目的蛋白的生产。
文档编号C12P21/00GK1809641SQ200480017078
公开日2006年7月26日 申请日期2004年6月16日 优先权日2003年6月19日
发明者彼得·布罗姆利 申请人:彼得·布罗姆利