用植物培养生产高甘露糖蛋白的制作方法

专利名称：用植物培养生产高甘露糖蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产高甘露糖蛋白的转化宿主细胞以及特别是用植物培养生产这些蛋白的方法和系统。
背景技术：
戈谢病(Gaucher′s disease)是最普遍的溶酶体贮积病。该病由隐性遗传性疾病(1号染色体q21-q31)所导致的葡糖脑苷脂酶(亦称葡萄糖神经酰胺酶)缺乏所引起，葡糖脑苷脂酶是膜结合的溶酶体酶，催化糖鞘脂葡糖脑苷脂(葡萄糖神经酰胺，GlcCer)水解成葡萄糖和神经酰胺。戈谢病是因hGCD(人葡糖脑苷脂酶)基因(GBA)的点突变所引起，导致GlcCer在巨噬细胞的溶酶体内的累积。这种特征性贮藏细胞称为戈谢细胞，存在于肝、脾和骨髓。相关的临床症状包括严重肝脾肿大、贫血、血小板减少症和骨骼退化。
编码人GCD的基因于1985年首次测序(6)。该蛋白由源自536-聚体前肽的497个氢基酸所组成。成熟的hGCD包含五个N-糖基化氨基酸的共有序列(Asn-X-Ser/Thr)。这些位点中有四个位点正常是糖基化的。第一个位点的糖基化是产生活性蛋白所必需的。已经对高甘露糖寡糖链和复合寡糖链进行了鉴定(7)。胎盘的hGCD含有7％的糖，其中的20％为高甘露糖型(8)。生化和定点诱变的研究已经提供了对于折叠、激活物相互作用和活性位点位置有重要作用的区域和残基的原始图谱(9)。
用神经氨酸苷酶处理胎盘hGCD(生成脱唾液酸酶)，导致大鼠肝细胞清除和吸收速率随着肝的酶活性的增加而增加(Furbish等，1981，Biochim.Biophys.Acta 673425-434)。这种经聚糖修饰的胎盘hGC目前用作治疗戈谢病的治疗药，生化和定点诱变的研究已经提供了对于折叠、激活物相互作用和活性位点位置有重要作用的区域和残基的原始图谱[Grace等，J.Biol.Chem.2692283-2291(1994)]。
戈谢病有三种不同的类型，均由hGC活性的水平确定。主要受该病影响的细胞是巨噬细胞，由于GlcCer的累积而高度增大，并因此称为“戈谢细胞(Gaucher cell)”。
对于GCD的缺陷是引起戈谢病的主要病因的证实，促使了开发酶替代疗法作为这种疾病的医治对策。
De Duve首先建议，用外源生物活性酶替代失去的溶酶体酶，可能是治疗溶酶体贮积病的可行方法[Fed Proc.231045(1964)]。
从那时起，各项研究都表明酶替代疗法可能有益于治疗不同的溶酶体贮积病。用从胎盘制备的外源酶(β-葡糖脑苷脂酶)(阿糖脑苷酶(Ceredase)TM)，或者，最近用重组方法制备的外源酶(β-葡糖脑苷脂酶)(重组葡糖脑苷脂酶注射剂(Cerezyme)TM)，治疗I型戈谢病的患者已显示了最好的成功。
天然的未经修饰的葡糖脑苷脂酶是带有四个糖链的糖蛋白。这种蛋白不以机体内的吞噬细胞为靶，因此治疗价值是有限的。在戈谢病的现代治疗的开发中，用三种不同的糖苷酶处理序贯去除葡糖脑苷脂酶糖链上的末端糖。这种糖苷酶处理导致生成糖蛋白，其末端糖由甘露糖残基组成。由于吞噬细胞具有甘露糖受体，该受体识别带末端为甘露糖残基的寡糖链的糖蛋白和糖肽，葡糖脑苷脂酶的糖重建模(remodeling)改进了该酶对这些细胞的靶向性[Furbish等，Biochem.Biophys.Acta 673425，(1981)]。
如本文所指出的，糖基化对于hGCD的活性起着关键作用，因此无论使用衣霉素(Sf9细胞)还是使用点突变消除所有的糖基化位点(Sf9和COS-1细胞)使细胞系中所表达的hGCD去糖基化，都导致酶活性完全丧失。此外，发现在大肠杆菌(E.coli)中所表达的hGCD是无活性的。进一步的研究表明，不同糖基化位点对于蛋白质活性的意义。除了糖基化在有效蛋白质活性中的作用以外，商业生产的酶含有聚糖序列修饰以利于特异性递药。将糖基化蛋白提取后重建模使其包括只含甘露糖的聚糖序列。
人GCD酶含有4个糖基化位点和22个赖氨酸。重组生产的酶(重组葡糖脑苷脂酶注射剂TM)不同于胎盘酶(阿糖脑苷酶TM)，其495位上的精氨酸已被组氨酸所取代。此外，重组GCD和胎盘GCD之间的寡糖组成不同，前者具有更多的岩藻糖和N-乙酰-萄糖胺残基，而后者仅保留一个高甘露糖链。如上所述，用三种不同的糖苷酶(神经氨酸酶、半乳糖苷酶和P-N乙酰-氨基葡糖苷酶)处理这两种类型的GCD以暴露末端甘露糖，从而能够靶向吞噬细胞。US 5,549,892中描述了一种包含重组生产的酶的药物制剂。应当注意的是，所有提及的参考文献都通过引用全部结合到本文中。
现有的溶酶体酶替代疗法治疗的一个缺点在于酶的体内生物活性是不合需要的低，例如由于低的吸收，降低了累积底物的特异性细胞溶酶体的靶向性，并且溶酶体中体内作用的半寿期短。
现有的GCD重组酶的另一个主要缺点是它们的费用，它们给保健制度带来了沉重的经济负担。由于复杂的纯化方案和目前治疗所需的相当大的治疗药量导致了这些重组酶的高成本。因此，迫切需要降低GCD的成本，使得这种挽救生命的治疗能向所有需要这种治疗的患者提供。
药用蛋白传统上用哺乳动物或细菌表达系统来生产。最近十年，已用植物开发出了新的表达系统。这种方法是利用土壤杆菌属(Agrobacterium)，这是一种能够将单链DNA分子(T-DNA)插入到植物基因组中的细菌。由于导入基因大量生产蛋白质和肽相对简单，因此这种方法日益流行成为可替代的蛋白表达系统(1)。
由于细菌表达系统里没有翻译后修饰，而植物的表达系统却能容易进行这些对蛋白表达和活性极为关键的修饰。哺乳动物和植物蛋白表达系统之间的一个主要差异在于蛋白质糖侧链的不同，这是由于生物合成途径的差异所致。糖基化对于蛋白质的活性、折叠、稳定性、溶解度、对蛋白酶的敏感性、血清除率和抗原潜能都具有意义深远的影响。因此，任何用植物生产的蛋白质都要考虑植物糖基化的潜在后果。
蛋白质糖基化分为两类N-联修饰和O-联修饰(2)。这两种类型的差异在于聚糖部分所连接的氨基酸——N-联连接到天冬酰胺残基上，而O-联连接到丝氨酸或苏氨酸残基上。此外，每种类型的聚糖序列都具有独特的区别特征。就这两种类型而言，N-联糖基化比较丰富，而且其对蛋白质功能的影响已进行了深入的研究。另一方面，O-联聚糖相对稀少，而且关于它们对蛋白质的影响的可利用的信息并不多。
发明概述背景技术中没有教授或建议用植物培养选择性地生产糖基化蛋白的装置、系统或方法。
背景技术：
中也没有教授或建议用植物培养生产高甘露糖蛋白的装置、系统或方法。
背景技术：
中也没有教授或建议通过内质网(ER)用植物培养生产蛋白质的装置、系统或方法。
背景技术：
中也没有教授或建议在绕过高尔基体时通过内质网用植物培养生产蛋白质的装置、系统或方法。
背景技术：
中也没有教授或建议通过使用ER信号绕过高尔基体用植物培养生产蛋白质的装置、系统或方法。
本发明克服了背景技术中的这些缺点，提供了用植物培养生产糖基化蛋白、特别是具有高甘露糖糖基化的蛋白、同时任选和优选地靶向(和/或别的操作处理)这种有ER信号的蛋白的装置、系统和方法。虽然不希望受一种假说的束缚，但认为这种靶向性使得蛋白质绕过高尔基体并因此保留所需的糖基化，特别是高甘露糖糖基化。应当注意的是，本文所用的术语“植物培养物”包括培养生长的任何类型的转基因植物细胞和/或其它基因工程植物细胞。所述基因工程可任选是永久性的或是瞬时的。优选所述培养物的特征为不会长成完整植株的细胞，因此至少有一种植物的生物学结构不存在。任选和优选地，所述培养物的特征可为许多不同类型的植物细胞，但优选所述培养物的特征为一种特殊类型的植物细胞。应当注意的是，任选特征为一种特殊类型的植物细胞的植物培养物来源于这些许多不同类型的植物细胞。
植物细胞可以根据任何类型合适的培养方法进行生长，所述培养方法包括但不限于固体表面培养(例如塑料培养容器或培养板)或悬浮培养。
本发明还涉及用转基因植物根细胞、特别是胡萝卜细胞表达和产生具酶活性的高甘露糖溶酶体酶的载体和方法。更具体地说，本发明涉及以高水平表达和大量生产生物活性高甘露糖葡糖脑苷脂酶(GCD)的宿主细胞、特别是转基因悬浮胡萝卜细胞、载体和方法。本发明还提供用于治疗溶酶体贮积病的组合物和方法。
本发明也涉及能给缺陷型细胞提供足量的生物活性溶酶体酶、特别是人GCD的装置、系统和方法。本发明也涉及包含能有效生产基因编码溶酶体酶例如GCD的新的载体组合物的宿主细胞。
因此，本发明解决了一直想要解决的生产具有特殊糖基化要求的蛋白质的经济上可行的技术难题，例如溶酶体酶如GCD的高甘露糖糖基化。本发明通过使用植物细胞培养物能够解决这个一直想要要解决的难题。
为了进一步说明本发明，现简要说明一下高甘露糖蛋白的生物合成途径。高甘露糖和复合N-联聚糖的基本生物合成途径在所有真核生物中都是高度保守的。生物合成始于内质网(ER)，通过寡糖基转移酶将聚糖前体从多萜醇脂质载体转移到蛋白质上的特定天冬酰胺残基上。然后，前体在ER中通过用糖苷酶I和II和假拟甘露糖苷酶进行修饰，产生高甘露糖结构，这类似于哺乳动物中的过程。
在高尔基体中进一步修饰聚糖序列形成复合结构和杂合结构。这样的修饰包括用α-甘露糖苷酶I去除四个甘露糖残基中的一个、添加N-乙酰萄糖胺残基，用α-甘露糖苷酶II去除另外两个甘露糖残基、添加N-乙酰萄糖胺，而且任选在此阶段，可添加木糖和岩藻糖残基，获得植物特有的N-联聚糖。将木糖和岩藻糖转移到核心后，可以通过添加末端岩藻糖和半乳糖进一步加工复合型N-聚糖。在糖蛋白转运过程中可以进行进一步修饰。
当前在
背景技术：
中常常使用的控制和精修植物中的蛋白质糖基化有几种方法，但所有这几种方法均有很多不足之处，特别是与本发明比较后。总的改进，例如糖基化的完全抑制或从肽链中去除糖基化位点是一个策略。然而，该方法可能导致结构缺陷。另一方法包括特异性糖加工酶的敲除和引入。再者，该方法比较艰难而且也可能伤害植物细胞自身。
本发明通过使用ER信号和/或通过阻断从ER至高尔基体的分泌克服了背景技术方法中的不足之处。虽然不希望受一种假说的束缚，但认为如果可以阻断分泌并且使蛋白质仍能保留在ER中，那么不需要结构重塑就可以获得天然存在的高甘露糖结构，因此优选溶酶体酶的高甘露糖结构。
如上所述，蛋白质通过内膜系统首先进入内质网进行转运。这个步骤所需的转运信号由位于分子N末端的信号序列所代表，即所谓的信号肽。只要这个信号肽完成了它的功能，就将它所连接的前体蛋白插入到内质网中，将信号肽从前体蛋白中通过蛋白酶解作用切割下来。在所有的活细胞的进化过程中，无论是细菌、酵母、真菌、动物还是植物，这种类型的信号肽序列凭借其特异性功能是高度保守的。
凭借信号肽将很多植物蛋白插入内质网，不在ER中滞留，而从内质网转运至高尔体并且继续从高尔体运输至液泡。这种运输滞留类信号中的一类分拣信号，是在前体蛋白的C端部分滞留的信号[Neuhaus和Rogers，(1998)Plant Mol.Biol.38127-144]。含有插入内质网的N端信号肽和C端液泡靶向信号的蛋白预期含有复合聚糖，其在高尔基体中与它们连接[Lerouge等，(1998)Plant Mol.Biol.3831-48]。这种C端分拣信号的性质变化多端。US 6,054,637描述了从烟草碱性壳多糖酶区中所获得的肽片段，该壳多糖酶是作为液泡靶向肽的液泡蛋白。含有C端靶向信号和复合聚糖的液泡蛋白的一个实例是得自豆籽的菜豆蛋白贮藏蛋白[Frigerio等，(1998)Plant Cell 101031-1042；Frigerio等，(2001)Plant Cell 131109-1126]。
范例是，所有真核细胞中的液泡蛋白在它们的最终目的地液泡内汇集之前都要经过ER和高尔基体。令人惊奇的是，本发明的转化植物根细胞能产生一种意想不到的高甘露糖GCD。有利的是，发现这种高甘露糖产物具有生物活性，因此无需进一步活化它。虽然不希望受一种假说的束缚，但认为使用以植物细胞培养物产生的重组蛋白的ER信号似乎能够克服至高尔基体的转运，并因此保留所需的高甘露糖糖基化。任选能够产生高甘露糖糖基化的任何类型的机制，包括可绕过高尔基体的任何类型的机制，可以根据本发明进行使用。
第一方面，本发明涉及产生目标高甘露糖重组蛋白的宿主细胞。该细胞可以用编码目标蛋白的重组核酸分子或者用包含所述核酸分子的表达载体转化或转染。这种核酸分子包含编码目标蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列与编码液泡靶向信号肽的第二核酸序列操作性连接。第一核酸序列还可以任选与编码ER(内质网)靶向信号肽的第三核酸序列操作性连接。本发明的宿主细胞的特征在于目标蛋白由细胞以高度甘露糖基化的形式产生。
本发明的宿主细胞可以是真核细胞或是原核细胞。
在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是原核细胞，优选细菌细胞，最优选根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。如下所述，这些细胞用来感染优选的植物宿主细胞。
在另一个优选的实施方案中，本发明的宿主细胞可以是真核细胞，优选植物细胞，最优选植物根细胞，选自发根土壤杆菌(Agrobacterium rihzogenes)转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。
在一个优选的实施方案中，所述植物根细胞是胡萝卜细胞。应当注意的是，本发明的转化胡萝卜细胞进行悬浮培养。如上所述及实施例中所述，这些细胞用根癌土壤杆菌细胞转化。
在另一个实施方案中，包含在本发明的宿主细胞中的重组核酸分子，包含编码溶酶体酶的第一核酸序列，所述第一核酸序列与编码源自碱性烟草壳多糖酶A基因的液泡靶向信号肽编码溶酶体酶的第二核酸序列操作性连接。这种液泡信号肽具有由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列。第一核酸序列还可以任选与第三核酸序列操作性连接，所述第三核酸序列编码ER(内质网)靶向信号肽，如SEQ ID NO1所示。在一个实施方案中，包含在本发明的宿主细胞中的重组核酸分子还包含在植物细胞内起作用的启动子。这种启动子应该与本发明的重组分子操作性连接。
在另一个实施方案中，这种重组核酸分子还可以任选包含优选在植物细胞内起作用的操作性连接的终止子。本发明的重组核酸分子还可以任选包含另外的控制、启动和调节元件和/或选择标记。应当注意的是，这些调节元件与所述重组分子操作性连接。
在一个优选的实施方案中，由本发明宿主细胞产生的目标高甘露糖蛋白可以是具有暴露的甘露糖末端残基的高甘露糖糖蛋白。
根据另一个优选的实施方案，这种高甘露糖蛋白可以是选自以下的溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。在一个优选的实施方案中，所述溶酶体酶可以是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。除非另有说明，否则在下文中的重组GCD、rGCD、rhGCD全都是指各种形式的重组人GCD。
如前所述，戈谢病，最常见的溶酶体贮积病，由hGCD(人葡糖脑苷脂酶)基因(GBA)中的点突变引起，导致了GlcCer在巨噬细胞溶酶体中的累积。对于GCD缺乏是引起戈谢病的主要病因的证实，促使开发酶替代疗法作为这种疾病的医疗对策。然而，糖基化对于靶细胞的hGCD活性和吸收起着关键性作用。
因此，根据本发明的其它优选实施方案，优选通过控制植物细胞培养物中的hGCD的表达，任选和更优选地通过提供ER信号和/或任选和更优选地通过阻断至高尔基体的转运来提供合适的糖基化hGCD。
任选和优选地，hGCD至少具有一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链，因而可用于治疗或预防戈谢病。
再者，在一个具体的实施方案中，这种优选的宿主细胞被重组核酸分子转化或转染，该重组核酸分子还包含来自花椰菜花叶病毒的35S启动子、根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子和TMV(烟草花叶病毒)Ω翻译增强子元件。根据一个优选的实施方案中，这种重组核酸分子包含基本上如SEQ ID NO13所示的核酸序列，并且编码其氨基酸序列基本上如SEQ ID NO14所示的高甘露糖GCD。
应当了解的是，本发明还提供包含编码生物活性溶酶体酶的核酸分子的表达载体。
在一个优选的实施方案中，本发明的表达载体包含编码生物活性高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)的核酸分子。优选这种优选的表达载体包含重组核酸分子，其核酸序列基本上如SEQ ID NO13所示。
第二方面，本发明涉及由本发明宿主细胞产生的重组高甘露糖蛋白。
在一个优选的实施方案中，这种高甘露糖蛋白可以是选自以下的生物活性高甘露糖溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最优选这种溶酶体酶可以是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
再者，本发明提供重组生物活性高甘露糖溶酶体酶，其具有至少一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链。
根据一个优选的实施方案，本发明的重组溶酶体酶可以与靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。优选这个部位可以是在患了溶酶体贮积病的患者体内。
应当注意的是，所述重组溶酶体酶对于靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于靶细胞的相应亲和力大。在一个具体的实施方案中，靶部位的靶细胞可以是患者肝内的枯否细胞(Kupffer cell)。
在一个优选的实施方案中，所述重组溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
最优选这种重组溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
第三方面，本发明涉及高甘露糖蛋白的制备方法。因此，本发明的方法包括下述步骤(a)制备重组宿主细胞的培养物，该细胞用编码目标重组蛋白的重组核酸分子或者用包含所述重组核酸分子的表达载体转化或转染；(b)在允许蛋白表达的条件下，培养步骤(a)制备的这些宿主细胞培养物，其中所述宿主细胞产生高度甘露糖基化形式的蛋白；(c)从细胞中回收蛋白并从步骤(a)提供的培养物中收获细胞；(d)用合适的蛋白质纯化方法纯化步骤(c)的蛋白。
根据一个优选的实施方案，这种方法所用的宿主细胞是本发明的宿主细胞。
在另一个优选的实施方案中，通过本发明的方法产生的高甘露糖蛋白可以是生物活性高甘露糖溶酶体酶，其具有至少一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链。
这种重组酶可以与靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。更具体地说，通过本发明的方法产生的重组酶对于靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于靶细胞的相应亲和力大。因此，靶部位的靶细胞可以是患者肝内的枯否细胞。
在一个具体的实施方案中，这种溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最优选这种溶酶体酶可以是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
在另一个优选的实施方案中，本发明方法所使用的宿主细胞可以是选自以下的植物根细胞发根土壤杆菌转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。最优选植物根细胞是胡萝卜细胞。应当特别注意的是，在本发明的方法中，所述转化宿主胡萝卜细胞进行悬浮培养。
再一方面，本发明涉及用外源重组溶酶体酶治疗患有溶酶体贮积病的患者的方法，所述方法包括(a)提供重组生物活性形式的溶酶体酶，所述溶酶体酶从转化植物根细胞中纯化而来并且能够有效靶向异常缺乏溶酶体酶的细胞，这种重组生物活性酶在附着的寡糖上有暴露的末端甘露糖残基；(b)给予所述患者治疗有效量的重组生物活性溶酶体酶。在一个优选的实施方案中，本发明方法所使用的重组高甘露糖溶酶体酶可以由本发明的宿主细胞产生。优选这种宿主细胞是胡萝卜细胞。
在另一个优选的实施方案中，本发明方法所使用的溶酶体酶可以是包含至少一个具有暴露甘露糖残基的寡糖链的高甘露糖酶。这种重组酶可以与患者体内的靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。更优选这种重组溶酶体酶对于这些靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于靶细胞的相应亲和力大。
更准确地讲，本发明方法所使用的溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。优选这种溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
根据一个优选的实施方案，本发明方法用于治疗溶酶体贮积病，特别是戈谢病。
在这种情况下，靶部位的靶细胞可以是患者肝内的枯否细胞。
本发明还提供用于治疗溶酶体贮积病的药物组合物，所述组合物包含作为活性成分的如本发明所限定的重组生物活性高甘露糖溶酶体酶。本发明的组合物可任选还包括药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物用于治疗戈谢病。所述组合物可优选包含作为有效成分的如本发明所限定的生物活性高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
本发明还涉及本发明重组生物活性高甘露糖溶酶体酶在制备用于治疗或预防溶酶体贮积病的药物中的用途。更准确地讲，该病可以是戈谢病。
因此，这种生物活性溶酶体酶是如本发明所限定的生物活性高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
根据本发明，提供产生高甘露糖重组蛋白的宿主细胞，所述宿主细胞包含编码重组蛋白和使产生的重组蛋白作为高甘露糖蛋白的信号的多核苷酸。优选所述多核苷酸包含编码目标蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列与编码信号肽的第二核酸序列操作性连接。任选信号肽包含ER(内质网)靶向信号肽。优选所述多核苷酸还包含编码液泡靶向信号肽的第三核酸序列。
优选所述信号使重组蛋白靶向ER。更优选所述信号包含使重组蛋白靶向ER的信号肽。最优选所述多核苷酸包含编码信号肽的核酸区段。
任选和优选地，所述信号使重组蛋白绕过高尔基体。优选所述信号包含使重组蛋白不靶向高尔基体的信号肽。更优选所述多核苷酸包含编码信号肽的核酸区段。
任选和优选地，所述宿主细胞是任一种真核细胞和原核细胞。任选原核细胞是细菌细胞，优选是根癌土壤杆菌细胞。优选真核细胞是植物细胞。更优选植物细胞是选自以下的植物根细胞发根土壤杆菌转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。最优选植物根细胞是胡萝卜细胞。
优选所述重组多核苷酸包含编码目标蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列与编码源自碱性烟草壳多糖酶A基因的液泡靶向信号肽的第二核酸序列操作性连接，该液泡信号肽具有由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列，其中第一核酸序列还任选与第三核酸序列操作性连接，所述第三核酸序列编码ER(内质网)靶向信号肽，如SEQ IDNO1所示。
更优选重组多核苷酸还包含在植物细胞内起作用的启动子，其中启动子与重组分子操作性连接。
最优选重组多核苷酸还包含在植物细胞内起作用的终止子，其中终止子与重组分子操作性连接。
最最优选重组多核苷酸任选还包含另外的控制、启动和调节元件和/或选择标记，其中调节元件与重组分子操作性连接。
优选高甘露糖蛋白是糖基化的、有至少一个暴露甘露糖残基的高甘露糖糖蛋白。更优选高甘露糖蛋白是选自以下的生物活性高甘露糖溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
最优选溶酶体酶是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
优选GCD包含基本上如SEQ ID NO8所示的氨基酸序列，该氨基酸序列由如SEQ ID NO7所示的核酸序列编码。
更优选所述细胞用重组多核苷酸或用包含所述分子的表达载体转化或转染，该重组多核苷酸还包含来自花椰菜花叶病毒的35S启动子、根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子，调节元件是TMV(烟草花叶病毒)Ω翻译增强子元件，具有基本上如SEQ ID NO13所示的核酸序列，并且编码其氨基酸序列基本上如SEQ ID NO14所示的GCD。
根据优选的实施方案，提供由上述宿主细胞产生的重组高甘露糖蛋白。
优选高甘露糖蛋白是选自以下的生物活性高甘露糖溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
更优选溶酶体酶是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
根据本发明的其它优选实施方案，提供重组生物活性高甘露糖溶酶体酶，其具有至少一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链。
根据再一些优选的实施方案，提供重组蛋白，其包含具有信号肽活性的第一部分和具有溶酶体酶活性的第二部分，第一部分使第二部分在植物细胞内被加工成具有至少一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链。
优选溶酶体酶包含用于治疗或预防戈谢病的蛋白。
更优选所述蛋白包括hGCD。
优选第一部分包含植物细胞ER靶向信号肽。更优选重组酶可以与溶酶体贮积病患者体内的靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。最优选重组溶酶体酶对于靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于靶细胞的相应亲和力大。
最最优选重组溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
优选重组溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
还优选靶部位的靶细胞是患者肝内的枯否细胞。
根据再一些优选的实施方案，提供植物细胞培养物中产生的重组高甘露糖蛋白。优选所述蛋白的特征为使蛋白靶向ER的植物信号肽。
更优选植物信号肽包含使蛋白靶向根植物细胞培养物中的ER的肽。最优选根植物细胞培养物包含胡萝卜细胞。
根据又一些优选的实施方案，提供用植物细胞培养生产的重组高甘露糖hGCD蛋白。
根据再一些优选的实施方案，提供植物细胞培养在生产高甘露糖蛋白中的用途。
根据其它优选的实施方案，提供高甘露糖蛋白的制备方法，所述方法包括制备用编码重组蛋白的重组多核苷酸转化或转染的重组宿主细胞的培养物；在允许蛋白表达的条件下，培养宿主细胞培养物，其中所述宿主细胞产生高度甘露糖基化形式的蛋白。
优选悬浮培养所述宿主细胞培养物。更优选所述方法还包括纯化所述蛋白。
根据其它优选的实施方案，所述方法用如前所述的宿主细胞来实施。优选高甘露糖蛋白是生物活性高甘露糖溶酶体酶，其具有至少一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链。更优选重组酶与靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。最优选重组酶对于靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于靶细胞的相应亲和力大。
优选溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
更优选溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。最优选靶部位的靶细胞是患者肝内的枯否细胞。
优选宿主细胞是选自以下的植物根细胞发根土壤杆菌转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。
更优选植物根细胞是胡萝卜细胞。
最优选悬浮培养所述转化宿主胡萝卜细胞。
根据再一些优选的实施方案，提供使用外源重组溶酶体酶治疗溶酶体贮积病患者的方法，所述方法包括提供重组生物活性形式的溶酶体酶，所述溶酶体酶从转化植物根细胞中纯化而来并且能够有效靶向异常缺乏溶酶体酶的细胞，其中所述重组生物活性酶在附着的寡糖上具有暴露末端甘露糖残基；给予所述患者治疗有效量的重组生物活性溶酶体酶。该方法可以任选用如上所述的任何宿主细胞和/或蛋白来实施。
优选重组酶可以与患者体内的靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。更优选重组溶酶体酶对于靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于靶细胞的相应亲和力大。最优选溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。最最优选溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
最最优选溶酶体贮积病是戈谢病。最最优选靶部位的靶细胞是患者肝内的枯否细胞。
根据再一些优选的实施方案，提供用于治疗溶酶体贮积病的药物组合物，所述组合物包含作为活性成分的如上所述的重组生物活性高甘露溶酶体酶，所述组合物任选还包含药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂。优选溶酶体贮积病是戈谢病。更优选重组溶酶体酶是生物活性高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
根据再一些优选的实施方案，提供如上所述的重组生物活性高甘露糖溶酶体酶在制备用于治疗或预防溶酶体贮积病的药物中的用途。优选该病是戈谢病。更优选生物活性溶酶体酶是生物活性高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
本发明用以下附图简述作进一步说明，


仅是说明性的，而不是对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求书的限定。
附图简述本发明通过实施例并参考附图进行说明，附图中图1A-1B图1A显示所得到的表达盒，其包含来自花椰菜花叶病毒的35S启动子、TMV(烟草花叶病毒)Ω翻译增强子元件、ER靶向信号、人GCD序列(也用SEQ ID NO7表示)、液泡信号和来自根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子序列。
图1B显示pGreenII质粒骨架的示意图。
图2显示，用抗hGCD特异性抗体进行hGCD转化细胞提取物的蛋白质印迹分析。用标准重组葡糖脑苷脂酶注射剂(泳道1)作为阳性对照，用未转化的愈伤组织作为阴性对照(泳道2)，各种所选择的愈伤组织提取物见泳道3-8。
图3A-3C显示用装在XK柱(2.6×20cm)里的强阳离子交换树脂(Macro-Prep high-S support，Bio-Rad)来纯化rhGCD的第一个步骤。将柱子与AKTA主系统(Amershanm Pharmacia Biotech)连成一体，使能监测电导率、pH和280nm的吸光度。用含有600mM NaCl的平衡缓冲液洗脱rh-GCD。图3A表示该纯化步骤的标准洗脱图。通过酶活性测定来监测洗脱过程中所收集的流分，如图3B所示，合并显示酶活性(在洗脱峰中)的试管。图3C显示已测活性的洗脱流分的考马斯蓝染色。
图3D-3F显示图3A-3C的相应图，但不包括第二个柱的。
图4A-C显示，用装在XK柱(2.6×20cm)中的疏水作用树脂(TSK凝胶，Toyopearl Phenyl-650C，Tosoh Corp.)对重组hGCD实施的最后一个纯化步骤。将柱子与AKTA主系统(Amersham Pharmacia Biotech)连成一体，使能监测电导率、pH和280nm的吸光度。将前一个柱的GCD洗脱合并液以6ml/min上样，随后用平衡缓冲液洗涤直至UV吸光度达到基线。用含有50％乙醇的10mM柠檬酸缓冲液洗脱纯GCD。
图4A表示该纯化步骤的标准洗脱图。
图4B显示通过酶活性试验监测洗脱过程中所收集的流分。
图4C显示已测活性的洗脱流分的考马斯蓝染色。
图5显示重组hGCD被腹膜巨噬细胞摄取后的活性(图5A-5C)，而图5D显示本发明重组GCD的蛋白质印迹。
图6显示本发明rGCD和重组葡糖脑苷脂酶注射剂(Cerezyme)TM的比较糖基化结构。
图7显示本发明rGCD的糖基化结构。
图8显示本发明rGCD的另外的N-聚糖糖基化结构。
发明详述传统生产药用蛋白质是用哺乳动物表达系统或细菌表达系统。在最近几年，已经在植物中发现了一种有前途的新的表达系统。由于导入新基因相对简单和大量生产蛋白质和肽的潜力，“分子制药(molecular pharmings)”作为一种蛋白表达系统变得越来越受欢迎。
哺乳动物和植物蛋白表达系统间的一个主要差异是由生物合成途径的不同所引起的蛋白质糖基化序列的不同。已经表明，糖基化对于蛋白质的活性、折叠、稳定性、溶解度、对蛋白酶的敏感性、血清除率和抗原潜能都具有意义深远的影响。因此，任何用植物生产的蛋白质都要考虑到植物糖基化的潜在后果。
糖部分是蛋白质的一种最普通的翻译后修饰。蛋白质糖基化分为两类N-联和O-联。这两种类型的差异在于蛋白质上聚糖部分所连接的氨基酸——N-联连接到天冬酰胺残基上，而O-联连接到丝氨酸或苏氨酸残基上。此外，每种类型的聚糖序列都具有独特的区别特征。就这两种类型而言，N-联糖基化比较丰富，而且其对蛋白质的影响已进行了深入的研究。另一方面，O-联聚糖相对稀少，而且关于它们对蛋白质的影响的可利用的信息并不多。对于植物中蛋白质糖基化的多数可用的数据集中于N-联聚糖，而不是O-联聚糖。
本文描述了本发明的一种以转基因植物细胞为基础的植物表达系统，优选根细胞，任选和优选地在悬液中生长。这种表达系统特别设计用来高效地生产目标高甘露糖蛋白。术语“高甘露糖”包括具有至少一个暴露甘露糖残基的糖基化。
因而，第一方面，本发明涉及生产目标高甘露糖重组蛋白的宿主细胞。优选重组蛋白的特征为ER(内质网)信号肽，更优选ER靶向信号肽。或者或此外，重组蛋白的特征为使蛋白质绕过高尔基体的信号。该信号的特征优选使重组蛋白能够高甘露糖糖基化，更优选保留这种糖基化，最优选靶向ER和/或绕过高尔基体。如本文更详细描述，优选将这种信号作为信号肽使用，其更优选形成蛋白质序列部分，任选和更优选地通过蛋白质工程改造使信号肽成为蛋白质的组成部分。应当注意的是，信号可任选是靶向信号、保留信号、回避(绕过)信号或这些信号的任意组合，或任何能够提供所需的高甘露糖糖基化结构的其它类型的信号。
虽然不希望受一种假说的束缚，但认为应用ER靶向信号和用植物细胞培养物生产的重组蛋白似乎能克服至高尔基体的转运，并因此保留所需的高甘露糖糖基化。任选能够产生高甘露糖糖基化的任何类型的机制，包括绕过高尔基体的任何类型的机制，都可以根据本发明进行使用。ER靶向信号肽为本领域通晓；它们是N端信号肽。任选任何合适的ER靶向信号肽可以根据本发明进行使用。
本发明的宿主细胞可以任选用编码目标蛋白的重组核酸分子或者用包含核酸分子的表达载体(永久地和/或瞬时地)转化或转染。这种核酸分子包含编码目标蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列任选和优选与编码液泡靶向信号肽的第二核酸序列操作性连接。应当注意的是，本文所用的术语“操作性”连接不一定是指物理连接。第一核酸序列还可以任选和优选地与编码ER(内质网)靶向信号肽的第三核酸序列操作性连接。本发明的宿主细胞的特征在于，目标蛋白由细胞产生，其形式包括至少一个暴露甘露糖残基，但优选是高甘露糖基化形式。
“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文中是可互换使用的术语。人们知道，这些术语不仅指具体的主题细胞而且指这种细胞的子代或可能的子代。由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中出现，因此这样的子代事实上与亲代细胞可能不完全相同，但仍然包括在如本文所用的术语范围内。本文所用的“宿主细胞”是指可用裸DNA或重组DNA技术构建的表达载体重组转化的细胞。本文所用的术语“转染”是指将核酸，例如裸DNA或表达载体通过核酸-介导的基因转移导入受体细胞中。本文所用的“转化”是指细胞基因型改变是细胞摄取外源DNA或RNA的结果，例如，转化细胞表达重组形式的所需蛋白。
应该了解的是，抗药性或其它选择标记将部分地使选择转化体变得容易。此外，选择标记的存在，例如抗药性标记的存在可用于避免污染微生物在培养基中繁殖。在诱导的表型存活所要求的条件下，通过培养细胞获得这种转化宿主细胞的纯培养物。
如上所述，本发明的宿主细胞可以用核酸分子转染或转化。本文所用的术语“核酸”是指多核苷酸例如脱氧核糖核酸(DNA)，适当的时候是指核糖核酸(RNA)。该术语也应该理解为包括由核苷酸类似物构成的RNA或DNA的类似物，以及可适用于所描述的实施方案的单链(例如有义链或反义链)和双链多核苷酸。
在又一个实施方案中，本发明的宿主细胞可以用包含所述重组核酸分子的表达载体转染或转化。本文所用的“表达载体”，包括载体例如质粒、病毒、噬菌体、整合型DNA片段和其它载体，它们能够将DNA片段整合到宿主基因组中。表达载体是典型的自我复制的DNA或RNA构建体，该构建体含有所需的基因或其片段，并且操作性连接遗传控制元件，该控制元件可被合适的宿主细胞识别且影响所需基因的表达。这些控制元件能够在合适的宿主中影响表达。通常，遗传控制元件可以包括原核启动子系统或真核启动子表达控制系统。这个系统典型地包括转录启动子、任选控制转录开始的操纵基因、提高RNA表达水平的转录增强子、编码合适的核糖体结合位点的序列、RNA剪接点、终止转录和翻译的序列等等。表达载体通常含有复制起点使得载体在宿主细胞中独立地复制。
质粒是最常用的载体类型，但有同等功能又为本领域所知或渐知的其它载体类型也适合本文引用。参见例如Pouwels等，CloningVectorsa Laboratory Manual(1985及附录)，Elsevier，N.Y.；和Rodriquez等(编著)Vectorsa Survey of Molecular Cloning Vectors andtheir Uses，Buttersworth，Boston，Mass(1988)，所有这些文献都通过引用结合到本文中。
此外，通常这种载体还含有特异性基因，该基因能够提供转化细胞的表型选择。也考虑了用原核和真核病毒表达载体来表达编码本发明多肽的基因。
任选载体可以是一般的植物载体(如以下实施例所述)。或者，载体可以任选是根细胞特异性的载体。
在一个优选的实施方案中，本发明的宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。
在一个具体的实施方案中，本发明的宿主细胞是原核细胞，优选细菌细胞，最优选根癌土壤杆菌细胞。这些细胞用来感染如下所述的优选的植物宿主细胞。
在另一个优选的实施方案中，本发明的宿主细胞可以是真核细胞，优选植物细胞，最优选植物根细胞，选自发根土壤杆菌转化的植物根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。
在一个优选的实施方案中，植物根细胞是胡萝卜细胞。应当注意的是，悬浮培养本发明的转化胡萝卜细胞。如上所述及实施例中所述，这些细胞用本发明的根癌土壤杆菌细胞转化。
根据本领域技术人员已知的方法，可将用于转染或转化本发明的宿主细胞的表达载体或重组核酸分子做进一步修饰，以添加、去除或者修饰肽信号序列以改变信号肽切割或通过植物内膜系统增加或改变已表达溶酶体的靶向。例如但不限于可以将表达构建体进行特殊的工程改造以靶向溶酶体酶分泌或液泡定位或内质网(ER)保留。
在一个实施方案中，可以将表达载体或重组核酸分子进行工程改造，以把编码靶向溶酶体酶的信号的核苷酸序列掺入植物液泡中。例如但不限于此，包含在本发明宿主细胞内的重组核酸分子，包含编码溶酶体酶的第一核酸序列，所述第一核酸序列与编码源自碱性烟草壳多糖酶A基因的液泡靶向信号肽的第二核酸序列操作性连接。这种液泡信号肽具有由SEQ ID NO2表示的氨基酸序列。第一核酸序列还可以任选以操作性连接方式与编码由SEQ ID NO1表示的ER(内质网)靶向信号肽的第三核酸序列连接。在一个实施方案中，包含在本发明的宿主细胞内的重组核酸分子还包含在植物细胞内起作用的启动子。这种启动子应该与本发明的重组分子操作性连接。
本文所用的术语“操作性连接”是指，当第一核酸序列与第二个核酸序处于功能关系时，则第一核酸序列与第二核酸序列操作性连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列操作性连接。任选和优选地，操作性连接的DNA序列是毗连的(例如物理连接的)，必要时在同一读框内连接两个蛋白质-编码区。因此，当合适的分子(例如转录激活蛋白质)与调节序列结合时，DNA序列和调节序列用基因能够表达的方式相连接。
在另一个实施方案中，该重组核酸分子还可以任选包含操作性连接的终止子，优选在植物细胞内起作用的终止子。本发明的重组核酸分子还可以任选包含另外的控制、启动和调节元件和/或选择标记。应当注意的是，这些调节元件与所述重组分子操作性连接。
可用于表达构建体中的调节元件包括启动子，其对于植物细胞而言可以是异源的或是同源的。启动子可以是植物启动子或非植物启动子，其能够驱动植物细胞和植物里的连接的序列高水平转录。可以有效地用来实践本发明的植物启动子的非限制性实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S、rbcS、叶绿素a/b结合蛋白的启动子、AdhI、NOS和HMG2或其修饰物或衍生物。启动子可以是组成型的或是诱导型的。例如但不限于在植物、植物组织或植物细胞的机械性基因激活(MGA)后，诱导型启动子可以是启动或增加溶酶体酶核苷酸序列表达的启动子。
根据本领域技术人员已知的方法，将用于转染或转化本发明宿主细胞的表达载体另外修饰，以提高或优化异源基因在植物和植物细胞中的表达。这样的修饰包括但不限于使DNA调节元件突变以增加启动子强度或改变目标蛋白。
在一个优选的实施方案中，由本发明宿主细胞产生的目标高甘露糖蛋白可以是具有至少一个暴露甘露糖残基(至少一个末端甘露糖残基)的高甘露糖糖蛋白。
根据另一个优选的实施方案，这种高甘露糖蛋白可以是选自以下的溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
本文所用的术语“溶酶体酶”，对于通过用本发明所述的植物表达系统产生的任何这种酶和产物，是指在转基因植物细胞中，由编码人或动物的溶酶体酶、经修饰的人或动物的溶酶体酶或该酶的片段、衍生物或修饰物的核苷酸序列，在转基因植物细胞中所表达的重组肽。有用的经修饰的人或动物的溶酶体酶包括但不限于具有一个或几个天然或人工导入的氨基酸添加、缺失和/或取代的人或动物的溶酶体酶。
可溶性溶酶体酶和分泌性蛋白共享起始的生物合成步骤，即在核糖体上的合成，N端信号肽与粗面内质网(ER)表面的结合，转运到ER腔内，在此信号肽被切割，并将寡糖添加到特异性天冬酰胺残基上(N-联)，接下来新生蛋白质在高尔基体中进一步修饰[von Figura和Hasilik，Annu.Rev.Biochem.55167-193(1986)]。N-联寡糖可以是复合的、多种多样的和不均一的，并且可含有高甘露糖残基。蛋白质在后ER、前高尔基体区室和顺式高尔基体内进一步加工形成依赖N-联甘露糖6-磷酸(M-6-P)寡糖的或不依赖N-联M-6-P寡糖的溶酶体定位酶的识别信号[Kornfeld & Mellman，Ann.Rev.Cell Biol.，5483-525(1989)；Kaplan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 742026(1977)]。M-6-P识别信号的存在导致酶与M-6-P受体(MPR)的结合。这些结合的酶保留在细胞中，最后被包装到溶酶体，因此与靶向分泌或质膜的蛋白分离。
在一个优选的实施方案中，溶酶体酶可以是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
再者，在一个具体的实施方案中，将这种优选的宿主细胞用重组核酸分子转化或转染，该重组核酸分子还包含来自花椰菜花叶病毒的35S启动子，优选具有由SEQ ID NO9表示的核酸序列；根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子，优选具有由SEQ ID NO12表示的核酸序列；和TMV(烟草花叶病毒)Ω翻译增强子元件。根据一个优选实施方案，这种重组核酸分子包含基本上如SEQ ID NO13所示的核酸序列并编码有着基本上如SEQ ID NO14所示的氨基酸序列的高甘露糖GCD。
应该了解的是，本发明还提供包含编码生物活性高甘露糖溶酶体酶的核酸分子的表达载体。
在这方面的一个优选的实施方案中，本发明的表达载体包含编码生物活性高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)的核酸分子。优选这种优选表达载体包含具有基本上如SEQ ID NO13所示的核酸序列的重组核酸分子。根据一个具体的实施方案，如以下实施例1所述，优选的表达载体利用pGREEN II质粒。
还应当注意的是，本发明提供包含在如上所述的表达载体内的表达盒。
第二方面，本发明涉及由本发明宿主细胞产生的重组高甘露糖蛋白。
在一个优选实施方案中，这种高甘露糖蛋白可以是选自以下的生物活性高甘露糖溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最优选这种溶酶体酶可以是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
本文所用的术语“生物活性”，对于用植物表达系统产生的任何重组溶酶体酶，是指重组溶酶体酶能够以可检测的水平水解相应的人或动物溶酶体酶的天然底物或类似物或合成底物。
再者，本发明提供重组生物活性高甘露糖溶酶体酶，其具有至少一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链。
根据一个优选实施方案，本发明的重组溶酶体酶可以与靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。优选这个部位可以是在溶酶体贮积病患者的体内。
任选和更优选地，重组溶酶体酶对于靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于靶细胞的相应亲和力大。在一个具体的实施方案中，靶部位的靶细胞可以是患者肝内的枯否细胞。
在一个优选的实施方案中，重组溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
最优选这种重组溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
第三方面，本发明涉及生产高甘露糖蛋白的方法。因此，本发明的方法包括下述步骤(a)制备重组宿主细胞的培养物，该宿主细胞已用编码目标重组蛋白的重组核酸分子或用包含所述重组核酸分子的表达载体转化或转染；(b)在高甘露糖蛋白能够表达的条件下，悬浮培养步骤(a)所制备的宿主细胞培养物，其中所述宿主细胞产生高度甘露糖基化形式的蛋白；(c)从(a)步骤提供的培养物中收获细胞并且从细胞中回收蛋白；(d)通过合适的蛋白质纯化方法纯化步骤(c)的蛋白。
任选和优选地，根据本发明，可能通过在某一装置中培养植物细胞产生重组蛋白，该装置在2002年5月21日授权的美国专利第6,391,638号中有描述，该专利通过引用全部结合到本文中。用这种装置悬浮培养植物细胞的条件，参见美国专利申请″CELL/TISSUECULTURING DEVICE，SYSTEM AND METHOD″，其中一位是本发明的发明人之一，并且共同拥有本申请，该专利申请通过引用全部结合到本文中且与本申请在同一天提交。
可能会在以下的实施例中发现一个具体的和非限制性的回收和纯化用本发明方法生产的目标高甘露糖蛋白的实例。这个实例显示通过本发明生产的重组h-GCD，意想不到地与本发明的转化胡萝卜细胞的内膜结合而没有分泌到培养基中。根据本领域已知的方法例如过滤或沉淀，将可溶性rh-GCD与细胞碎片和其它不溶性组分分离。例如，冻-融循环后，细胞经过破碎而释放胞内可溶性蛋白，而h-GCD保持与不溶性膜碎片结合。将这种可溶性和不溶性膜碎片混合物再离心，去除可溶性级分从而简化纯化。然后在有温和的去污剂、蛋白酶抑制剂和中和氧化剂时，通过机械破碎使膜结合的h-GCD溶解。可以用层析技术进一步纯化可溶性酶，例如阳离子交换和疏水作用层析柱。在rh-GCD在生物反应器的生产和纯化过程中，通过一个或多个生化检测可以确定h-GCD的身份、产率、纯度和酶活性。包括但限于测试酶底物或底物类似物的水解作用、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和免疫学分析，例如ELISA和蛋白质印迹。
根据一个优选实施方案，这种方法所使用的宿主细胞包含本发明的宿主细胞。
在另一个优选实施方案中，用本发明方法所生产的高甘露糖蛋白可以是生物活性高甘露糖溶酶体酶，其具有至少一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链。
这种重组酶可以与靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。更具体地说，用本发明方法生产的重组酶对于靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于靶细胞的相应亲和力大。因此，靶部位的靶细胞可以是患者肝内的枯否细胞。
在一个具体的实施方案中，这种溶酶体酶可选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。最优选这种溶酶体酶可以是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
在另一个优选实施方案中，本发明方法所用的宿主细胞可以是选自以下的植物根细胞发根土壤杆菌转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。最优选植物根细胞是胡萝卜细胞。应当特别注意的是，悬浮培养所述转化宿主胡萝卜细胞。
再一方面，本发明涉及用外源重组溶酶体酶治疗患有溶酶体贮积病的患者、优选哺乳动物患者的方法。
根据所公开的和描述的，可以理解为，本发明不受本文公开的具体实施例、方法步骤和原料的限制，因此方法步骤和原料可能会有稍许不同。也可以理解为，由于本发明的范围只受所附权利要求书及其等同实施方案的范围的限制，因此本文所用的术语仅用于描述具体的实施方案，而无意限制。
在本发明说明书和所附权利要求书的全文中，除非上下文另有要求，否则用语“包括”和类似的说法如“包含”和“含有”可以理解为意味着包括指出的整数、步骤或整数群，但并不排除任何其它整数、步骤或整数群或步骤群。
下面的实施例是发明人实施本发明各方面所用技术的代表。应该理解为，如果这些技术是实践本发明的示例性的优选实施方案，那么根据本文记载的内容，本领域技术人员将会认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种修改。
实施例实验程序质粒载体*CE-T——是由得自Galili教授[美国专利第5,367,110号，1994年11月22日]的质粒CE构建的。质粒CE用SalI消化。
用DNA聚合酶I的大片段将SalI黏端做成平端。然后质粒用PstI消化，连接到DNA片段上，该片段编码碱性内切壳多糖酶基因[拟南芥(Arabidopsis thaliana)]ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCACTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC的ER靶向信号，来自烟草壳多糖酶AGATCTTTTAGTCGATACTATG的液泡靶向信号用SmaI和PstI消化。
*pGREENII——得自P.Mullineaux博士[Roger P.Hellens等，(2000)Plant Mol.Bio.42819-832]。pGREENII载体的表达处于花椰菜花叶病毒的35S启动子、TMV(烟草花叶病毒)Ω翻译增强子元件和根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子序列的控制之下。cDNAhGCD——得自ATCC(保藏号65696)，GC-2.2[GCS-2kb；λ-EZZ-γ3，智人(Homo sapiens)]，含有葡糖苷酶β酸性[葡糖脑苷脂酶]。插入片段长度(kb)2.20；组织成纤维细胞WI-38细胞。
表达质粒的构建用正向引物5′CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3′和反向引物5′CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3′扩增编码hGCD(ATTC克隆号65696)的cDNA。纯化的PCR DNA产物用内切核酸酶EcoRI和BglII(参见引物中加下划线的识别序列)消化，连接到用相同酶消化的表达盒E-T的中间载体。表达盒用限制酶SmaI和XbaI切割并与中间载体经冼脱分开，再连接到双元载体pGREENII，形成最终的表达载体。与pGREEN载体(图1B)一起获得的nos启动子驱动的NPTII基因赋予卡那霉素抗性。所获得的表达盒见图1A。
用下列测序引物5′35S启动子5′CTCAGAAGACCAGAGGGC3′和3′终止子5′CAAAGCGGCCATCGTGC 3′，将所获得的质粒测序以保证信号正确的符合读框的融合。
胡萝卜愈伤组织及细胞悬浮培养物的建立如上所述，按Torres K.C.(《园艺作物的组织培养技术(Tissueculture techniques for horticular crops)》，第111、169页)建立胡萝卜愈伤组织和细胞悬浮培养物。
胡萝卜细胞的转化及转化细胞的分离用经修改的前述方法[Wurtele，E.S.和Bulka，K.Plant Sci.61253-262(1989)]，用土壤杆菌转化胡萝卜细胞。在整个过程中，用液体培养基培养的细胞代替愈伤组织。培养和生长时间都要适应细胞在液体培养物中的转化。概括地说，按照电穿孔法[den Dulk-Ra，A.和Hooykaas，P.J.(1995)Methods Mol.Biol.5563-72]，土壤杆菌用pGREENII载体转化，然后用30mg/ml巴龙霉素抗生素进行选择。胡萝卜细胞用土壤杆菌转化，然后在液体培养基中用60mg/ml巴龙霉素抗生素进行选择。
筛选转化的胡萝卜细胞以分离出高水平表达GCD的愈伤组织转化后14天，将培养物中的细胞以稀释度为3％收集细胞体积接种到固体培养基上，以从单个细胞簇形成愈伤组织。当各个愈伤组织直径达到1-2cm时，用SDS样品缓冲液将细胞制成匀浆，将所得的蛋白提取物在SDS-PAGE上进行分离[Laemmli U.，(1970)Nature227680-685]，转移到硝酸纤维素膜(hybond C硝酸纤维素，0.45微米，产品目录号RPN203C，Amersham Life Science)上。用多克隆抗hGCD抗体(本文下面描述)进行蛋白质印迹法以检测GCD。将表达显著水平GCD的愈伤组织扩展和转移到液体培养基中生长，以便进行扩大培养、蛋白质纯化和分析。
多克隆抗体的制备将75微克重组GCD(重组葡糖脑苷脂酶注射剂TM)悬浮在3ml弗氏完全佐剂中，给两只兔子注射。两周后给每只兔子加强注射。加强注射后约10天，从两只兔子抽血，以后每隔一周抽血直至抗体滴度开始下降。去除血块后，将血清分成等份并贮藏于-20℃。
用生物反应器扩大培养将含有rh-GCD基因经遗传修饰的胡萝卜细胞的约1cm(直径)的愈伤组织接种到Murashige和Skoog(MS)9cm直径琼脂培养板上，该板中装有4.4g/L MSD培养基(Duchefa)、9.9mg/L盐酸硫胺素(Duchefa)、0.5mg叶酸(Sigma)、0.5mg/L生物素(Duchefa)、0.8g/L酪蛋白水解产物(Ducifa)、糖30g/L和激素2-4D(Sigma)。愈伤组织于25℃培养14天。
通过在MSD液体培养基(含有0.2mg/L 2，4-二氯乙酸，Murashige& Skoog(1962))中传代培养转化的愈伤组织来制备悬浮细胞培养物，这是本领域众所周知的。将悬浮细胞在250ml锥形瓶(工作体积开始为25ml，7天后增加到50ml)中以60rpm的摇动速度于25℃进行培养。接着，在相同条件下，由于将工作体积增加到300ml，因此细胞培养物的量有所增加因而转入1L的锥形瓶中。用两个1L锥形瓶中培养了7天的400ml悬浮细胞，作为有4L MSD培养基的小生物反应器(10L)[参见WO98/13469]的接种物。以1Lpm的气流于25℃培养1周后，将MDS培养基增加至10L，并且在相同条件下继续培养。再培养5天后，用80μ的网过滤细胞培养基收获和收集绝大部分细胞。挤出多余的培养基，将压紧细胞决贮藏于-70℃。
于2002年5月21日授权的美国专利第6,391,638号中，可以发现有关生物反应器装置的详细内容，该专利通过引用结合到本文。
蛋白质纯化为了将培养基与不溶性GCD分开，将含有约100g湿重细胞的冷冻细胞块解冻，接下来，将解冻的细胞在4℃以17000xg离心20分钟。将不溶性材料和完整的细胞通过重悬浮在100ml洗涤缓冲液(20mM磷酸钠pH 7.2、20mM EDTA)中进行洗涤，然后在4℃以17000xg离心20分钟使其沉淀。用200ml提取缓冲液(20mM磷酸钠pH 7.2、20mM EDTA、1mM PMSF、20mM抗坏血酸、3.8g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、1mM DTT和1％Triton-X-100)，将沉淀制成匀浆以提取和溶解rh-GCD(重组人GCD)。然后于室温将匀浆振荡30分钟，在4℃以17000xg离心20分钟使其澄清。弃沉淀，并通过加入浓柠檬酸，将上清液的pH调至pH5.5。在上述相同条件下，通过离心使pH调整后生成的浑浊物澄清。
通过层析柱方法如下进一步纯化将200ml澄清的培养基加到20ml强阳离子交换树脂(Macro-Prep high-S support，Bio-Rad)上，该树脂已用25mM柠檬酸钠缓冲液平衡并装在XK柱(2.6×20cm)里。将柱子与AKTA主系统(Amersham Pharmacia Biotech)连成一体，以便监测电导率、pH和280nm的吸光度。样品以20ml/min的速度上样，然后用平衡缓冲液(25mM柠檬酸钠缓冲液pH 5.5)以12ml/min流速洗涤柱子直到UV吸光度达到基线。用含有200mM NaCl的平衡缓冲液初步洗脱rh-GCD，并用含有600mM NaCl的平衡缓冲液获得洗脱液。通过酶活性测定来监测在洗脱过程中所收集的流分，将显示酶活性(在冼脱峰中)的试管合并。合并的样品用含5％乙醇的水稀释(1∶5)，并用NaOH将pH调至6.0。将含有rh-GCD的样品加到第二个XK柱(1.6×20cm)上，第二个柱子中装有10ml和前一个柱中相同的树脂。将该柱中的树脂用含有5％乙醇的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)平衡。将样品加到柱子上后，柱子用平衡缓冲液洗涤，然后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)、5％乙醇和1M NaCl)从柱子中洗脱出GCD。将洗脱步骤中的各吸收峰流分合并，加到第三个柱子上。
在装有8ml疏水作用树脂(TSK凝胶，Toyopearl Phenyl-650C，Tosoh Corp.)的XK柱(1.6×20cm)上，进行最后的纯化步骤。树脂用含有5％乙醇的10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡。从前面柱子洗脱的GCD以6ml/min的速度上样，随后用平衡缓冲液洗涤直到UV吸光度达到基线。纯GCD用含有50％乙醇的10mM柠檬酸缓冲液洗脱，合并并贮藏于-20℃。
蛋白质浓度的测定使用牛血清白蛋白标准品(流分V Sigma)，通过Lowry/Bradford方法(Bio Rad蛋白质分析)[Bradford，M.，Anal.Biochem.(1976)72248]，测定细胞提取物和流分中的蛋白质浓度。或者，用280nm的吸光度、lmg/ml＝1.4 O.D280来测定均匀的蛋白质样品浓度。用280/260nm比值求出纯度。
GCD酶活性测定用对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷(Sigma)作为底物，测定GCD的酶活性。测定缓冲液中含有60mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH＝6、4mMβ-巯基乙醇、1.3mM EDTA、0.15％Trion X-100、0.125％牛磺胆酸钠。在96孔ELISA板中进行测定，将0-50微升样品与250微升测定缓冲液一起孵育，加入底物至最终浓度为4mM。反应物于37℃孵育60分钟。通过405nm的吸光度可检测产物(对硝基苯基；pNP)形成。在t＝0和终点监测405nm的吸光度。60分钟后，向各孔中加入6微升5NNaOH，并再次监测405nm的吸光度。用平行测定的参照标准曲线，对试验样品中的GCD浓度进行定量[Friedman等，(1999)Blood，93(9)2807-16]。
生化分析凝胶蛋白水解分析和质谱法分析用干净的薄刀片将染色的蛋白条带切下，凝胶中的蛋白用10mMDTT还原并用含100mM碘乙酰胺的10mM碳酸氢铵进行修饰。用含50％乙腈的10mM碳酸氢铵处理凝胶条以除去蛋白质中的染料，随后干燥凝胶条。用含10％乙腈的10mM碳酸氢铵将干燥的凝胶条再水化，每份样品中含有约0.1μg胰蛋白酶。将凝胶条于37℃保温过夜，用60％乙腈、0.1％三氟乙酸盐回收所得肽。
用本身填装了多孔R2(Persepective)的0.1×300mm熔凝硅石毛细管(J&W，100微米ID)，通过反相色谱解析胰蛋白酶消化肽。以约1μ/min的流速，使用含5-95％乙腈/0.1％乙酸水溶液的80min线性梯度洗脱肽。将柱中的液体电喷雾到离子阱质谱仪(LCQ，Finnegan，SanJose，CA)中。以正离子方式用重复全长MS扫描进行质谱分析，接着用选自第一次MS扫描的大多数显性离子通过碰撞诱导解离(CID)进行分析。用Sequest软件[J.Eng和J.Yates，University of Washington andFinnegan，San Jose]，将质谱数据与NR-NCBI数据库中蛋白质的模拟蛋白酶解和CID进行比较。
根据生产商的说明书，用肽测序仪494A(Perkin Elmer)测定蛋白质氨基端的序列。
腹膜巨噬细胞的GCD摄取已经知道巨噬细胞的GCD的靶向和摄取是由甘露糖/N-乙酰葡糖胺受体介导的，并可用得自小鼠的硫代乙醇酸盐诱发的腹膜巨噬细胞来确定，如Stahl P.和Gordon S.[J.Cell Biol.(1982)93(1)49-56]中所述。简要地说，给小鼠(雌性，品系C57-B6)腹膜内注射2.5ml的2.4％Bacto-硫代乙醇酸盐培养基w/o葡萄糖(Difco，产品目录号0363-17-2)。4-5天后，用颈脱位处死经处理的小鼠，用磷酸盐缓冲盐溶液冲冼腹膜腔。细胞经离心(1000xg，10min)沉淀，悬浮于含10％胎牛血清的DMEM(Beit Haemek，以色列)中。将细胞以1-2×105细胞/孔接种到96孔组织培养板中，于37℃孵育。90分钟后，未贴壁细胞用PBS洗涤三次，将贴壁巨噬细胞在含有规定量的rh-GCD的培养基中于37℃孵育90分钟，在200微升最终体积中含量介于0-40微克之间，有和没有酵母甘露聚糖(2-10，5mg/ml)皆可。孵育后，除去含有过量rGCD的培养基，细胞用PBS洗涤三次，然后用裂解缓冲液裂解(10mM TrispH＝7.3，1mM MgCl2，0.5％NP-40和蛋白酶抑制剂)。将细胞裂解物按上述方法进行体外糖苷酶活性测定以确定细胞摄取的rGCD活性。
实施例1表达质粒的构建本实施例描述示例性表达质粒的构建，并与下面相关的实施例一起使用，详述如下。
用正向引物5′CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3′(也用SEQ IDNO1表示)和反向引物5′CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3′(也用SEQ ID NO2表示)扩增编码hGCD(ATTC克隆号65696)的cDNA。
纯化的PCR DNA产物用内切核酸酶EcoRI和BglII(参见引物中加下划线的识别序列)消化并连接到具有用相同酶消化的表达盒CE-T的中间载体。CE-T包括来自碱性内切壳多糖酶基因[拟南芥]的靶向信号MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEA(也用SEQ ID NO3表示)，和来自烟草壳多糖酶A的液泡靶向信号DLLVDTM*(也用SEQ ID NO4表示)。
用限制酶SmaI和XbaI将表达盒从中间载体切下和洗脱并连接到双元载体pGREENII，形成最终的表达载体。与pGREEN载体(图1B)一起获得的nos启动子驱动的NPTII基因赋予卡那霉素抗性。所得表达盒见图1A。
用以下的测序引物将所得质粒测序以保证信号正确的符合读框的融合来自5′35S启动子的引物5′CTCAGAAGACCAGAGGGC 3′(也用SEQ ID NO5表示)和3′终止子的引物5′CAAAGCGGCCATCGTGC 3′(也用SEQ ID NO6表示)。经确证的克隆hGCD编码序列用SEQ ID NO7表示。
实施例2胡萝卜细胞的转化及筛选表达rhGCD的转化细胞本实施例描述本发明转化胡萝卜细胞的示例性方法，如以下实施例中所用。
用前面[Wurtele和Bulka(1989)，出处同上]描述的土壤杆菌转化方法来转化胡萝卜细胞。将经遗传修饰的胡萝卜细胞接种到含有抗生素的Murashige和Skoog(MS)琼脂培养基上供选出转化体用。如图2所示，使用抗hGCD抗体，通过蛋白质印迹分析，测试从愈伤组织制备的提取物的GCD的表达，并与重组葡糖脑苷脂酶注射剂标准(阳性对照)和未转化的细胞提取物(阴性对照)进行比较。从各种所测试的愈伤组织中选出一种愈伤组织(22号)进行扩大培养和蛋白质纯化。
如下进行蛋白质印迹。
关于这种试验，将所得样品的蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行分离，然后转移到硝酸纤维素上。为此，如下制备SDS聚丙烯酰胺凝胶。该SDS凝胶由浓缩胶和分离胶组成(根据Laemmli，UK1970，Cleavage of structural proteins during assembly of the head ofbacteriphage T4，Nature 227，680-685)。分离胶的组成如下12％丙烯酰胺(Bio-Rad)、每10ml凝胶溶液4微升TEMED(N，N，N′，N′-四甲基乙二胺；Sigma目录号T9281)、1％SDS、375mM Tris-HCl pH 8.8和0.1％过硫酸铵(APS)，在本文中TEMED和过硫酸铵用作聚合反应的自由基起子。从聚合反应开始后大约20分钟，将浓缩胶(3％丙烯酰胺、0.1％SDS、126mM Tris-HCl pH 6.8、0.1％APS和5微升TEMED，每5ml浓缩胶溶液)倒在分离胶上，插入12或18个空格梳制成加样孔。
将阳级槽和阴级槽装入相同的缓冲液含有SDS的Tris甘氨酸缓冲液pH 8.3(Biorad目录号161-0772)。含抗原物质用0.5倍体积的样品加样缓冲液(30ml甘油(Sigma目录号G9012)、9％SDS、15ml巯基乙醇(Sigma目录号M6250)、187.5mM Tris-HCl pH 6.8、500微升溴酚蓝，样品缓冲液每份100ml)进行处理，然后将混合物在100℃加热5分钟并加到浓缩胶上。
电泳在室温下进行适当时间，例如以13×9cm大小的凝胶为例，直流电流强度为50-70伏，45-60分钟，接着用180-200伏，45-60分钟。然后将抗原转移到硝酸纤维素(Schleicher和Schuell，Dassel)上。
基本上按本文描述的方法进行蛋白质转移。将与硝基纤维素相接的凝胶置于Whatmann 3mm滤纸、导电、0.5cm厚的多孔材料和导电用的电极(铂电极)之间。用转移缓冲液(TG缓冲液，Biorad，目录号161-0771，用甲醇和水缓冲液(20％甲醇)稀释10倍)彻底浸泡滤纸、多孔材料和硝基纤维素。在4℃以100伏转移90分钟。
转移后，用含有1％奶粉(Dairy America)和0.1％吐温20(Sigma目录号P1379)的磷酸缓冲液(Riedel deHaen，目录号30435)稀释的封闭缓冲液在4℃过夜，使硝基纤维素上分离的结合部位饱和。印迹条与抗体(用上述含有1％奶粉和0.1％吐温20的磷酸缓冲液pH 7.5进行稀释1∶6500)于37℃孵育1小时。
与抗体孵育后，用PBS(磷酸盐缓冲的磷酸钠缓冲液(RiedeldeHaen，目录号30435))洗涤印迹条3次，每次10分钟。然后将印迹条与适当的第二抗体(山羊抗兔(完整分子)HRP(Sigma目录号A-4914))于室温孵育1小时，上述抗体含有1％奶粉(Dairy America)和0.1％吐温20(Sigma目录号P1379)的磷酸缓冲液(Riedel deHaen，目录号30435))按1∶3000稀释。用PBS洗涤数次后，印迹条用ECL显色剂(Amersham RPN 2209)染色。
在印迹浸入ECL试剂后，印迹对X-射线胶片(FUJI Super RX18×24)曝光，用FUJI-ANATOMIX显影剂和定影剂(FUJI-X fix目录号FIXRTU，2选1)显影。这样处理后，可以看到抗体所结合的蛋白特有的条带。
用生物反应器扩大培养以液体培养基传代培养转化的愈伤组织获得愈伤组织22的悬浮培养物。用锥形瓶振荡培养细胞直至数量足够接种生物反应器(如实验程序所述)。遗传修饰的转基因胡萝卜细胞可培养数月，每5-7天为一个周期收获细胞(数据未显示)。在培养的第七天，当胡萝卜细胞中的rh-GCD产量达到峰值，用100目筛孔的网过滤收获细胞。值得注意的是，可用本领域已知的过滤或离心方法收获细胞。收集的细胞块是制备匀浆纯化h-GCD的原料，可冷冻保存。
实施例3从转化胡萝卜细胞纯化重组活性HGCD蛋白转化胡萝卜细胞表达的重组hGCD与细胞内膜结合而未分泌到培养基中。机械破碎细胞留下与不溶性膜碎片结合的rGCD(数据未显示)。然后，用温和的洗涤剂溶解rGCD，使其与细胞碎片和其它的不溶性组分分开。再用层析技术，包括在实验程序中描述的阳离子交换层析和疏水作用层析柱进一步纯化可溶性酶。
为了使培养基与不溶性GCD分开，将含约100g湿重细胞的冰冻细胞块解冻，然后在4℃以17000xg离心20分钟。将不溶性物质和完整细胞重悬于100ml洗涤缓冲液(20mM磷酸钠pH 7.2、20mMEDTA)而进行洗涤，并在4℃以17000xg离心20分钟使其沉淀。用200ml提取缓冲液(20mM磷酸钠pH 7.2、20mM EDTA、1mM PMSF、20mM抗坏血酸、3.8g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、1mM DTT、1％Triton-X-100(Sigma))将沉淀制成匀浆，以提取和溶解rGCD。将匀浆于室温振荡30分钟，然后在4℃以17000xg离心20分钟澄清。弃沉淀，上清液的pH用浓柠檬酸调节至pH 5.5。调节pH后产生的浑浊液，在上述相同条件下通过离心澄清。
如下用层析柱进一步纯化第一阶段，将200ml澄清的提取物加到20ml强阳离子交换树脂(Macro-Prep high-S support，Bio-Rad)上，该树脂已用25mM柠檬酸钠缓冲液pH 5.5平衡并装入XK柱(2.6×20cm)内。将柱子与AKTA主系统(Amersham Pharmacia Biotech)连成一体，使能监测电导率、pH和280nm的吸光度。以20ml/min上样，然后用平衡缓冲液(25mM柠檬酸钠缓冲液pH 5.5)以12ml/min的速率洗涤柱子直至UV吸光度达到基线。用含有200mM NaCl的平衡缓冲液预洗脱rh-GCD，然后用含有600mM NaCl的平衡缓冲液获得洗脱液。通过酶活性测定来监测洗脱过程中所收集的流分，合并显示酶活性(在洗脱峰内)的试管。合并的样品用含有5％乙醇的水稀释(1∶5)，并用NaOH调节pH至6.0。
图3A代表该纯化阶段的标准洗脱图。该洗脱过程中所收集的流分通过酶活性测定来监测，如图3B所示，而图3C显示经活性测定的洗脱流分的考马斯蓝染色。
第二纯化阶段，将含有rGCD的洗脱流分加到第二个XK柱(1.6×20cm)上，柱子内装有10ml与前述柱子相同的树脂。用含有5％乙醇的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)平衡这个柱子里的树脂。将样品加到柱子上之后，用平衡缓冲液洗涤，然后用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸盐缓冲液pH 6.0、5％乙醇和1M NaCl)从柱子中洗脱出rGCD。图3D代表该纯化阶段的标准洗脱图。该洗脱过程中所收集的流分通过酶活性测定来监测，如图3E所示，而图3F显示经活性测定的洗脱流分的考马斯蓝染色。
第三纯化阶段，将洗脱步骤中有吸收峰的各流分合并并加到第三个柱子上。在装有8ml疏水作用树脂(TSK凝胶，Toyopearl Phenyl-650C，Tosoh Corp.)的XK柱子(1.6×20cm)上进行第三纯化阶段。用含有5％乙醇的10mM柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)平衡树脂。前面柱子的GCD洗脱液以6ml/min速率上样，随之用平衡缓冲液洗涤直至UV吸光度达到基线。纯的GCD用含有5％乙醇的10mM柠檬酸缓冲液洗脱，合并并贮藏于-20℃。
图4A代表该纯化阶段的标准洗脱图。该洗脱过程中所收集的流分通过酶活性测定来监测(图4B)，而图4C显示经活性测定的洗脱流分的考马斯蓝染色。
经处理的细胞的分批纯化，可使rGCD蛋白纯化至纯度大于95％；如果只进行第一阶段和第三阶段，可使纯度达到约80％(结果未显示)。
生物化学分析为了鉴定纯化的rhGCD，采用质谱质谱(MSMS)分析。所得结果表明蛋白质序列的复盖范围为49％，这与根据表达盒的DNA(包括先导肽和靶向序列)所预期的氨基酸序列一致。
重组hGCD在腹膜巨噬细胞内的摄取和活性为了确定胡萝卜中产生的rhGCD是否已经正确地糖基化并可以被靶细胞摄取，从而可用于治疗戈谢病，也就检测了rhGCD与巨噬细胞结合并被它摄取的能力。靶向巨噬细胞的rhGCD受甘露糖/N-乙酰萄糖胺(Man/GlcNAc)受体的介导，因而可用硫代乙醇酸盐诱发的腹膜巨噬细胞进行测定。如图5所示，细胞高水平摄取rGCD。图5A显示，细胞所摄取的本发明的rGCD与甘露聚糖浓度有关。
图5A显示的摄取水平与重组葡糖脑苷脂酶注射剂TM相近(此制剂只用上述纯化工艺的第一和第三阶段，80％的纯度)。
图5B和图5C显示rGCD的摄取高于重组葡糖脑苷脂酶注射剂TM，用上述纯化工艺的所有三个阶段纯化制剂纯度都大于95％。
对于图5C，本发明的GCD(rGCD或重组人GCD)受4mg/ml甘露聚糖抑制的比活与总活性的百分比明显高于市场上现有的下述产物GCD(CB-mixl，是本发明的rGCD)-75％重组葡糖脑苷脂酶注射剂-65％。
此外，如附图所示，添加甘露聚糖明显抑制细胞结合rGCD。甘露聚糖浓度为2mg/ml时，rGCD的结合被抑制50％。
这些结果表明，即使聚糖结构没有重塑，转化胡萝卜细胞所表达并经纯化的rhGCD通过Man/GlcNAc受体特异性地摄取到靶巨噬细胞。此外，这种重组rhGCD有酶催化活性。
图5D显示，用蛋白质印迹法，rhGCD为抗GCD抗体所识别；rGCD是指本发明的蛋白，而GCD标准品(每泳道约5ng、10ng和25ng)是市售的GCD(重组葡糖脑苷脂酶注射剂)。
实施例4毒理学试验按照标准毒理学试验方案(Guidance for Industry on Single DoseAcute Toxicity Testing for Pharmaceuticals，Center for Drug Evaluationand Research(CDER)PT 1(61FR 43934，1996年8月26日)并通过ICHM3(M)Non-clinical Safety Studies for the Conduct of Human ClinicalTrials for Pharmaceuticals CPMP/ICH/286/95modification，Nov 16 2000)检验用上述纯化方法获得的物质。
对小鼠作如下注射。初始剂量1.8mg/kg(临床剂量)，随后剂量为9mg/kg和18mg/kg。试验组的6只小鼠(ICR CD-1；雌雄各3只)接受本发明的rGCD(液体载体中含有25mM柠檬酸盐缓冲液、150mMNaCl、0.01％吐温80、5％乙醇)，而另外6只小鼠单用载体处理作为对照组。然后观察小鼠14天并实施安乐死。在实施安乐死前并没有小鼠死亡。没有小鼠显示处理的明显影响。没有找到任何小鼠有显著的病理学发现和/或体重改变。
实施例5糖基化分析对按前述实施例所描述的方法所得rGCD上的聚糖结构进行了分析。就如下面更详尽的描述，结果表明大多数聚糖含有末端甘露糖残基以及高甘露糖结构。有利的是，这种高甘露糖产物具有生物活性，因而无需进一步的活化步骤。
采用下述方法测定按上述已知实施例所得的重组hGCD的糖基化结构。简要地说，用水解和GC-MS方法测定N-聚糖和O-聚糖两者的单糖键。这种方法测定糖与肽的键合类型以及糖蛋白一般的单糖组成。根据先前的知识和不同单糖间的比例，这种方法可以提示糖蛋白上聚糖的类型。这些信息对于测定蛋白质上可能的聚糖结构是重要的。
另一方法是N-聚糖群体的寡糖分析为特色。要进行FAB-MS和MALDI-TOF MS，随后用胰蛋白酶和肽N-糖苷酶F(PNGaseF)消化等份的样品以及聚糖的全甲基化。这个方法用来从酶消化糖蛋白分开和分离N-联糖。测定分离的聚糖混合液内的聚糖群体的质量，并将它们的质量和那些数据库和按单糖组成分析中已知结构的质量进行比较。所建议的结构还要以来源生物的糖基化模型作基础。
另一方法包括分析O-聚糖群体，继之还原消除胰蛋白酶和PNGase F处理的糖肽，脱盐和全甲基化。PNGase F不会释放O-聚糖，因此依然与肽连接的聚糖更像O-联聚糖。然后通过还原消除反应释放这些聚糖并分析它们的质量。
单糖组成分析(概述如下)显示植物糖基化的己糖、己糖胺和戊糖的特征性分布。GlcNac和甘露糖的比例显示特征性的N-联结构是主要的聚糖群体。
如上所述制备的hGCD的N-聚糖的质谱分析表明主要的N-聚糖群体的单糖组成为Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2。
材料与方法用气相色谱-质谱联用(GC-MS)、快速原子轰击-质谱法(FAB-MS)和延迟萃取-衬质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(DE-MALDI-TOF MS)，进行分析。
对于寡糖分析，用FAB-MS和MALDI-TOF MS分析N-聚糖群体，继之用胰蛋白酶和肽N-葡糖苷酶F(PNGaseF)消化等份的样品以及聚糖的全甲基化。经分析的O-聚糖群体继之还原消除胰蛋白酶和PNGase F处理的糖肽，脱盐和全甲基化。
N-聚糖和O-聚糖两者的单糖键都用水解、衍生化GC-MS策略进行测定。
实验描述样品给样品瓶如下编排独特的样品号(表1)表1

将样品置于-10℃和-30℃保存，备用。
蛋白质化学透析完整样品将一小瓶(装有1ml蛋白，其浓度为0.8mg/ml)注入Slide-A-Lyzer透析夹(截留分子量10kDa)内，在4℃对水透析24小时，换水3次。透析后从透析夹取出样品并冻干。
胰蛋白酶消化完整样品供寡糖筛选用将已透析的冻干样品重悬于50mM碳酸氢铵缓冲液中，用10％氨水调至pH 8.4，并按SOPs B001和B003用TPCK处理的胰蛋白酶在37℃消化4小时。置于加热器内95℃下加热2分钟后终止反应随后冻干。
糖化学肽N-糖苷酶A的消化将胰蛋白酶分解的糖蛋白样品中的肽/糖肽混合物用含于醋酸铵缓冲液pH 5.5中肽N-糖苷酶A(PNGaseA)在37℃处理15小时。冻干终止反应。用C18Sep-Pak柱纯化所得产物。
还原消除反应将含有潜在的O-联糖肽的Sep-Pak流分溶于含10mg/ml硼氢化物的0.05M氢氧化钠溶液中，在45℃保温16小时。加冰醋酸终止反应。
还原消除反应物质的脱盐用Dowex珠按SOP B022进行脱盐。将样品上样并用4ml 5％的醋酸水溶液冼脱。将所收集的流分冻干。
释放的糖的全甲基化对洗脱在5％醋酸水溶液Sep-Pak流分中的N-联糖和还原消除反应所释放的潜在的O-联聚糖，用氢氧化钠(NaOH)/甲基碘(MeI)方法(SOP B018)进行全甲基化。全甲基化N-联聚糖混合物的一部分用FAB-MS和MALDI-TOF MS分析，其余部分作键合分析。
N-联糖的键合分析衍生化将胰蛋白酶和PNGase A消化或还原消除反应所得的全甲基化聚糖样品混合物进行水解(2M TFA，120℃ 2小时)和还原(硼氘化钠(NaBD4)/2M NH4OH，室温2小时，SOP B025)。加入3次甲醇冰醋酸(90∶10)混合物以除去硼氘化物分解产生的硼酸盐，随后冻干。再用乙酸酐使样品乙酰化(100℃1小时)。用氯仿萃取纯化乙酰化样品。然后用气相色谱/质谱联用(GC/MS)检查部分甲基化糖醇乙酸酯。部分甲基化糖醇乙酸酯的标准混合物以及空白也在同样条件下测试。
气液色谱/质谱联用(GC/MS)对溶于己烷的等份的(1μl)衍生糖样品，采用配有Autosystem XL的气相色谱仪和Dell数据系统的Perkin Elmer Turbomass Gold质谱仪在下述条件进行GC/MS分析气相色谱法柱子DB5注射柱上注射器温度40℃程序40℃1分钟，然后70℃/分钟至100℃，100℃保持1分钟，然后8℃/分钟至290℃，最后290℃保持5分钟。
载气氦气质谱法电离电压70eV取数方式扫描质量范围35-450道尔顿MS分辨率单位完整葡糖脑苷脂酶的糖分析衍生化冻干等分为500μg的葡糖脑苷脂酶，以10μg阿糖醇作为内标。然后在80℃过夜甲醇分解，在氮气氛下干燥。用甲醇、吡啶和乙酸酐溶液使释放出单糖再N-乙酰化，在氮气氛下再次干燥，按照SOPB023使其转化为三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物。将TMS衍生物在氮气下大量还原，溶于2ml己烷并超声处理3分钟。置样品在4℃平衡过夜。平行制备含10μg阿糖醇的空白和标准单糖混合物，其中含岩藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰氨基半乳糖、N-乙酰萄糖胺、N-乙酰神经氨酸和阿糖醇各10μg。然后用气相色谱/质谱联用(GC/MS)检查TMS衍生物。
气液色谱/质谱联用(GC/MS)对溶于己烷的等份(1μl)衍生糖样品采用配有Autosystem XL的气相色谱仪和Dell数据系统的Perkin Elmer Turbomass Gold质谱仪在下述条件进行GC/MS分析气相色谱法柱子DB5注射柱上注射器温度40℃程序90℃1分钟，然后25℃/分钟至140℃，5℃/分钟至220℃，最后10℃/分钟至300℃，300℃保持5分钟。
载气氦气质谱法电离电压70eV取数方式扫描质量范围50-620道尔顿MS分辨率单位延迟萃取衬质辅助激光解吸电离质谱(DE-MALDI-MS)和快速原子轰击-质谱(FAB-MS)MALDI-TOF质谱法是用Voyager STR生物光谱测定研究站激光-解吸质谱仪，与延迟萃取(DE)相偶联。
将无水全甲基化聚糖再溶于甲醇∶水(80∶20)中，用2，5-二羟基苯甲酸基质进行分析。缓激肽、血管紧张肽和ACTH用作外部校正。
用M-Scan′s VG AutoSpecE质谱仪，在Vacc＝8kV，质量范围4500，分辨率约2500，以最大敏感度进行正离子快速原子轰出质谱分析。用铯离子枪在30kV下操作产生质谱。用Opus软件将质谱记录在VAX数据系统3100M76上。
将无水全甲基化聚糖溶于甲醇中，加到靶上，在插入源之前已预先用2-4μl硫甘油作为基质将靶涂抹。
结果与讨论葡糖脑苷脂酶的TMS糖分析N-联寡糖的筛选完整糖蛋白透析后用胰蛋白酶消化，而冻干产物用PNGase A消化，再用C18Sep-Pak纯化。对5％乙酸水溶液(含N-联寡糖)流分全甲基化，用低质量范围碎片离子的衍生寡糖部分获得FAB质谱，而用高质量范围的分子离子的衍生寡糖部分获得DE-MALDI-TOF质谱。
葡糖脑苷脂酶的N-聚糖分析表1列出了FAB谱中的主要碎片离子和MALDI谱中的分子离子。分子离子区(见附录III)有主信号m/z 1505.8(与组成结构Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2的[M+Na]+的准分子离子一致)。也检测了低强准分子离子的范围与复合结构和高甘露糖结构一致。所测高甘露糖结构的大小范围从Hex5.HexNAc2m/z 1579.8至Hex8.HexNAc2m/z 2193.0。复杂信号例如得自低强处理的N-聚糖m/z 1331.7(与组成结构为Pent.Hex3.HexNAc2)的[M+Na]+准分子离子一致，或者得自较大N-聚糖例如m/z 1751.0(与具有组成结构Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc3的[M+Na]+准分子离子一致)，m/z 2375.4(与具有组成结构Pent.DeoxyHex2.Hex4.HexNAc4的[M+Na]+准分子离子一致)，m/z 2753.6(与具有组成结构Pent.DeoxyHex3.Hex5.HexNAc4的[M+Na]+准分子离子一致)。
FAB质谱提供凭借低质量质谱区的碎片离子的天然结构的信息，所测得的信号证实己糖(m/z 219)和HexNAc(m/z 260)为N-聚糖中非还原末端单糖。
表2胰蛋白酶和肽N-糖苷酶A消化的葡糖脑苷脂酶(参考号62996)全甲基化后在质谱中所观测的质量


除非另有说明，否则柱1中的所有质量全是单种同位素的。质量数不一定与原始数据直接相关，因为软件常将质量数归于13C同位素峰，特别是对高于1700Da的质量而言。
葡糖脑苷脂酶的N-聚糖的键合分析对PNGase A消化、Sep-Pak纯化和全甲基化后释放的N-联糖进行了键合分析。
获得的复合物色谱图带有源自衍生化试剂的某些杂质峰。将保留时间和质谱与标准混合物进行比较得出含糖峰的假定排布，列于表3。
表3胰蛋白酶和肽N-糖苷酶A消化后，在对葡糖脑苷脂酶(参考号62996)进行的GC-MS分析中，所测得的作为它们的部分甲基化糖醇乙酸酯的各种连接的单糖的保留时间

4.3O-联寡糖的筛选用胰蛋白酶和PNGase A消化后，从Sep-Pak纯化的葡糖脑苷脂酶的60％2-丙醇流分(可能的O-联糖肽流分)进行还原消除反应。终止反应后对样品脱盐，除去硼酸盐后全甲基化。用部分低质量范围内的碎片离子衍生的寡糖部分获得FAB质谱，而用高质量范围内的分子离子衍生的寡糖部分获得DE-MALDI-TOF质谱。未观测到O-联聚糖存在的信号(数据未显示)。
葡糖脑苷脂酶的O-聚糖的键合分析对全甲基化后还原消除反应的产物进行键合分析。未观测到典型的O-联聚糖存在的信号(数据未显示)。
图6显示一些示例性聚糖结构，将得自哺乳动物细胞的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞的GCD(重组葡糖脑苷脂酶注射剂TM)，与本发明的得自胡萝卜细胞的GCD作比较。如其所示，这些结构的重塑需要为重组葡糖脑苷脂酶注射剂TM获得暴露的甘露糖残基。相反，按照本发明，这种暴露甘露糖残基可直接从得自植物细胞的GCD获得，无需进一步操作，例如使用糖基化酶。
图7代表rGCD发现中的主要聚糖结构。图7显示所提出的结构属于a)在胡萝卜细胞悬液中表达的hGC上占主要的寡糖群体(1505.7m/z)；b)典型的N-联核心；c)岩藻糖基化植物N-联核心。N-联聚糖经由天冬酰胺并通过示意图右侧的GlcNac(GN)残基的还原末端与蛋白质偶联。N植物糖基化模式，岩藻糖残基可能是核心结构的组成部分，用α(1-3)糖苷键与第一个GlcNac结合，而哺乳动物的结构通常用α(1-6)糖苷键。
图8A-8D显示按本发明所测得的rGCD蛋白的N-聚糖的所有可能的结构。
经确认的主要聚糖结构是核心聚糖结构，从豌豆、水稻、玉米和其它食用植物的绝大多数植物糖蛋白中都可发现这种结构。这种结构含一个核心木糖残基以及一个核心α-(1，3)-岩藻糖。Bardor等(33)所完成的工作指出，在他们的血清中50％非变应性血供体有核心木糖的特异性抗体，25％有核心α-(1，3)-岩藻糖的特异性抗体。然而，仍然有待研究的是这样的抗体是否可能导致限制植物源性生物药物糖蛋白的应用。
上述生成的hGCD的次要聚糖群体主要是高甘露糖结构Hex4HexNAc2至Hex8HexNAc2。在复杂结构中显示有结构如Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc3和Pent.deoxyHex3.Hex5.HexNAc3。已检测极少数群体有结构如Pent.Hex3.HexNAc2。
主要末端单糖是己糖(甘露糖或半乳糖)以及N-乙酰己糖胺，这与有高甘露糖结构和部分加工的复杂结构一致。
对于O-联寡糖筛选，未观测到与典型O-联聚糖一致的信号。本领域周知GCD没有O-联寡糖，所以这些结果与源自其它细胞系统的GCD的已知的糖基化一致，包括天然GCD和哺乳动物培养系统所生产的重组GCD。然而，在单糖组成内，检测有与阿拉伯糖一致的信号。
关于本发明重要的一点在于hGCD蛋白N-聚糖的组成分析表明多数N-聚糖末端为甘露糖残基。这点符合需要甘露糖为末端N-聚糖以促进巨噬细胞甘露糖受体摄取治疗用hGCD。然而，无论是天然的GCD还是哺乳动物细胞产生的重组GCD都不是高甘露糖。因此本发明克服了商业生产的hGCD蛋白的重大缺点，这些蛋白质经修饰末端是甘露糖，不同于上述产生的蛋白。
实施例6本发明的治疗用途按本发明生产的重组蛋白优选包含用植物细胞培养生产的适当糖基化蛋白，例如优选溶酶体酶和/或高甘露糖糖基化蛋白。
按照本文的优选的实施方案，根据本发明所生产的蛋白适于治疗溶酶体相关疾病，例如溶酶体贮积病。
治疗方法任选和优选包括(a)提供重组生物活性形式的溶酶体酶，该溶酶体酶是从转化植物根细胞中纯化的并能够有效靶向异常缺乏溶酶体酶的细胞，在附着的寡糖上，重组生物活性酶有暴露的末端甘露糖；(b)给予患者治疗有效量的重组生物活性溶酶体酶或包含它们的组合物。在一个优选的实施方案中，本发明的方法所用的重组高甘露糖溶酶体酶也可以用本发明的宿主细胞生产。优选这种宿主细胞是胡萝卜细胞。
“哺乳动物受治疗者”或“哺乳动物患者”是指需要基因治疗的任何哺乳动物，包括人、牛、马、狗和猫患者，最优选人患者。
应当注意的是，术语“治疗”也包括病理疾病和/或其中的一个或多个症状的改善或减轻，这种疾病的治愈或预防。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法所用的溶酶体酶也可以是高甘露糖酶，其包含至少一个具有暴露甘露糖残基的寡糖链。这种重组酶可与患者体内的靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。更优选这种重组溶酶体酶对这些靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对靶细胞的相应亲和力大。因此，每剂取决于异常缺乏GCD的细胞的有效靶向，并且每剂这种类型的GCD基本上小于天然存在的GCD的剂量，在其他方面都是以类似的方式达到治疗效果。
根据本发明的优选的实施方案，所述蛋白适合治疗溶酶体酶贮积病，因此本发明也包含治疗这种病的方法。溶酶体贮积病包括40多种失调症状，是由于编码能分解细胞溶酶体中的糖脂或多糖废物的酶的基因有缺陷所致。酶产物例如糖和脂质然后再利用生成新的产物。每一种失调都是由于遗传性常染色体或X-连锁隐性性状所引起的，它影响溶酶体内酶的水平。通常受影响的个体的细胞和组织内受影响的酶没有生物学活性或功能活性。在这些疾病中，酶功能的缺乏造成体内细胞的溶酶体内的脂质或糖底物的进行性系统性沉积，最终引起器官功能的丧失和死亡。溶酶体贮积病的遗传病因学、临床表现、分子生物学或可能性详见Scriver等[Scriver等(编著)，TheMetabolic and Molecular Basis of Inherited Disease，第7版，第II卷，McGraw Hill，(1995)]。
溶酶体贮积病(及其相关缺陷型酶)的实例包括但不限于法布莱病(Fabry disease)(α-半乳糖苷酶缺乏)、法伯病(Faber disease)(神经酰胺酶缺乏)、戈谢病(葡糖脑苷脂酶缺乏)、Gm1神经节苷脂沉积症(β-半乳糖苷酶缺乏)、泰-萨病(Tay-Sachs disease)(β-氨基己糖苷酶缺乏)、尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)(神经鞘磷脂酶缺乏)、Schindler病(α-N-乙酰半乳糖苷酶缺乏)、亨特综合征(Hunter syndrome)(艾杜糖醛酸酯-2-硫酸酯酶缺乏)、斯赖综合征(Sly syndrome)(β-葡糖醛酸糖苷酶缺乏)、胡尔勒和胡尔勒/沙伊综合征(Hurler and Hurler/Scheiesyndrome)(艾杜糖苷酸酶缺乏)和I-Cell/San Filipo综合征(甘露糖6-磷酸酯转运蛋白缺乏)。
戈谢病是人类最常见的溶酶体贮积病，在Ashkenazi犹太族人群中发病率最高。在美国大约有5,000-10,000人患有此病[Grabowski，Adv.Hum.Genet.21377-441(1993)]。戈谢病是因缺乏葡糖脑苷脂酶(hGCD，葡萄糖神经酰胺酶)所引起。这种缺乏导致骨髓、脾、肝的网状内皮细胞内酶底物葡糖脑苷脂的累积，引起严重的骨骼并发症如骨髓膨胀和骨质退化，以及脾机能亢进、肝肿大、血小板减少、贫血和肺并发症[Grabowski，(1993)出处同上；Lee，Prog.Clin.Biol.Res.95177-217(1982)]。
更准确地讲，本发明方法所用的溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。在治疗戈谢病时，本发明方法所用的溶酶体酶优选是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
可用本发明的蛋白生产药物组合物。因此，按照本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述组合物包含作为活性成分的蛋白以及药物可按受的载体。本文所用的“药物组合物”是指在此描述的一种或多种活性成分如重组蛋白与其它化学组分如传统药物、生理上合适的载体和赋形剂所组成的制剂。药物组合物的目的在于将蛋白或细胞方便地给予生物体。本发明的药物组合物可用本领域众所周知的方法制备，例如用常规的混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包胶囊、包埋或冻干等方法。
在一个优选的实施方案中，术语“药物可接受的”是指为联邦或州政府法定机构所批准的或列入动物、尤其是人用的美国药典或其他公认的药典。在下文中，短语“生理上适合的载体”和“药物可接受的载体”可互换使用，是指已批准的对生物体不造成明显的刺激也不会消除所给缀合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。
术语“载体”是指给予治疗药时所用的稀释剂、辅料、赋形剂或溶媒。这些药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括源自石油、动物、植物或合成的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉给予药物组合物时，水是优选的载体。也可以使用盐溶液和葡萄糖溶液以及甘油溶液作为液体载体，尤其是用作注射液时。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要，所述组合物也可含少量湿润剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以为溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等形式。也可用传统的粘合剂和载体例如甘油三酯将组合物制成栓剂。口服制剂可包括标准载体例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在E.W.Martin的″Remington′sPharmaceutical Sciences″中描述了合适药用载体的一些实例。这些组合物将含有治疗有效量的蛋白，优选纯化形式的蛋白，以及适量的载体，以便给患者提供适当给药的形式。这种制剂应当适合于给药方式。
术语“赋形剂”是指加到药物组合物中使活性成分加工与给药更有利的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、不同规格的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
活性成分配制和给药的其它技术可参见″Remington′sPharmaceutical Sciences，″Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版本，该文献通过引用全部结合到本文中。
本文描述的药物组合物也包括合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。
合适的给药途径可包括例如口服、直肠、经粘膜、透皮、小肠或肠胃外给药，包括肌内、皮下和髓内注射，以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
因此，按照本发明所采用的药物组合物可以使用一种或多种药物可接受的载体(包括赋形剂和助剂)按常规方式制备，以便于将活性成分加工成药用制剂。合适的制剂取决于选择的给药途径。
对于注射，本发明的活性成分可以配制在水溶液，优选生理上相容的缓冲液例如Hank氏溶液、Ringer氏溶液或生理盐水缓冲液中。对于经粘膜给药，制剂中使用渗透剂。这些渗透剂是本领域众所周知的。
对于口服给药，可通过给予产生本发明蛋白例如GCD的全细胞，任选配制活性成分。也可将活性成分和/或细胞与本领域众所周知的药物可接受的载体混合，配制活性成分。这些载体使得本发明的活性成分能制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊剂、液体制剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等，供患者口服用。可以使用固体赋形剂，任选研磨所得混合物，如果需要在添加适当的助剂后，将颗粒混合物加工成片剂或糖衣丸核心，制备口服用药物制剂。具体地说，合适的赋形剂是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制品，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解剂例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐例如藻酸钠。
给糖衣丸核心包上合适的糖衣。为此，可以使用浓缩糖溶液，其中任选含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆用溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了鉴别或鉴定活性成分剂量的不同组合的特征，也可以将染料或色素加到片剂或糖衣丸的糖衣里。
可用于口服的药物组合物包括由明胶制成的两节式(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。两节式胶囊的混合物中含有活性成分，另外的填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉、润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁以及任选的稳定剂。至于软胶囊，活性成分可溶于或悬浮于适当的液体例如脂肪油、液体石腊或液态聚乙二醇中。此外，可加入稳定剂。所有口服给药用制剂的剂量应当适合所选择的给药途径。
对于经颊给药，所述组合物可以是按常规方式制成的片剂或锭剂。
对于吸入给药，可以将本发明所用的活性成分常规地装在加压容器或喷雾器中，以气溶胶喷雾剂形式方便地递送，其中采用合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。如果是气雾剂，通过装一个递送计量阀来确定剂量单位。制备用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和注射用药筒，其中可含有活性成分和合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文描述的活性成分可制备成胃肠道外给药，例如通过快速浓注或连续输注。注射用制剂可以为任选加有防腐剂的单位剂型，例如安瓿或多剂量容器。所述组合物也可以是含有油或水性溶媒的混悬剂、溶液剂或乳剂，而且可含有配方剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
胃肠外给药用药物组合物包括水溶性活性制剂的水溶液。此外，活性成分的混悬液可制备成油性注射混悬液。合适的亲脂溶剂或载体包括脂肪油例如芝麻油、合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射混悬液可含增加混悬液粘度的物质例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选混悬液也可含合适的稳定剂或增加活性成分溶解度的物质，使能够制备高浓度溶液。
在一个优选的实施方案中，可按常规方法将组合物制成适合人体静脉给药的药物组合物。通常，静脉给药用药物组合物是无菌等渗缓冲水溶液。一般以单位剂型或分开或混合供给成分，例如以干的冻干粉或无水浓缩物密封于容器例如安瓿或小囊中，标明活性剂的含量。如用输液给予组合物，可与含无菌的药用级水或盐水的输液瓶一同配药。如注射给予组合物，可提供注射用的无菌水或盐水安瓿，给药前与各成分混合。
本发明的药物组合物可配制成中性或盐型。药物可接受的盐包括与阴离子例如来自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等所形成的盐，以及与阳离子例如来自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等所形成的盐。
也可将本发明的活性成分制成直肠组合物例如栓剂或滞留型灌肠剂，例如采用常规栓剂基质例如可可脂或其它的甘油酯。
本文描述的药物组合物亦可包含适当的凝胶相载体或赋形剂的固体。这些载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。
任选采用局部途径，且可藉助于局部载体。局部载体一般适合活性成分的局部给药，包括本领域已知的任何这类材料。对局部载体进行选择便于以所需的剂型提供组合物，例如以液体或非液体载体、洗剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、散剂、软膏剂、溶剂、液体稀释剂、滴剂等等，并且也可以含有天然存在的或合成得来的物质。显然重要的是，所选择的载体不能对活性成分或局部制剂中的其它组分有不良影响，而且对局部制剂的所有组分都是稳定的。本文所用的合适的局部载体的实例包括水、醇及其它的无毒有机溶剂，甘油、矿物油、硅油、石油胶冻剂、羊毛脂、脂肪酸、植物油、对羟基苯甲酸酯类、蜡等等。本文优选的制剂是无色无味的软膏剂、液体制剂、洗剂、乳膏剂和凝胶剂。
软膏剂是半固体制剂，一般是以石油或其它石油衍生物作基质。所用的具体软膏剂基质，如本领域技术人员所知道的，是能优选递送活性成分，并且优选也能赋于其它所需特征例如润滑等。至于其它载体，软膏剂基质应是惰性的、稳定的、无刺激的和不致敏的。如Remington所解释的The Science and Practice of Pharmacy，第19版，(Easton，Pa.Mack Publishing Co.，1995)，第1399-1404页，软膏剂基质分成4类油质基质；乳化基质；乳剂基质和水溶性基质。油质软膏基质包括例如植物油、得自动物的脂肪、得自石油的半固体烃。乳化软膏基质，亦称吸收软膏基质，无水或几乎无水而且包括例如羟基硬脂精硫酸酯、无水羊毛脂和亲水石油。乳剂软膏剂的基质是油包水(W/O)乳剂或水包油(O/W)乳剂，例如包括鲸蜡醇、甘油单硬脂酸酯、羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶性软膏剂基质是由不同分子量的聚乙二醇来制备；再者，更多的信息可参考RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy。
洗剂是无磨擦的施用于皮肤表面的制剂，一般是液体或半液体制剂，其中的固体颗粒包括活性成分，存于水或醇基质中。洗剂通常是固体的悬液，也可以含水包油型液体油乳剂。因为易于使用较多的流体组合物，所以在此优选洗剂作为治疗生物体的大面积的制剂。一般需要将洗剂中的不溶物质完全分散。洗剂通常含有悬浮剂以获得较好的分散性，以及有助于维持局部活性剂与皮肤接触的活性成分例如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等等。
本领域已知的含选择的活性成分的乳膏剂是粘液或半固体乳剂，即水包油乳剂或油包水乳剂。乳膏剂的基质可水洗，且含油相、乳化剂和水相。油相有时也称为“内”相，通常由石油或脂肪醇例如鲸蜡醇和十八烷醇组成；水相，虽不必需，但其含量通常超过油相，且一般含有保湿剂。乳膏剂中的乳化剂，如Remington(出处同上)解释，一般是非离子的、阴离子的、阳离子的或两性的表面活性剂。
凝胶制剂优选用于头皮。在局部活性成分制剂领域的工作人员都了解，凝胶是半固体、悬液型系统。单相凝胶含有基本上均匀分布于载体液中的有机大分子，它一般是水性的，但还优选含有醇和任选含有油。
本领域技术人员都知道的各种添加剂，也可以包括在本发明的局部制剂中。例如溶剂也可以用于溶解某些活性成分物质。另一些任选的添加剂包括皮肤渗透增强剂、遮光剂、抗氧化剂、凝胶剂、增稠剂和稳定剂等等。
本发明的局部组合物亦可用常规表皮型贴剂或药品的皮肤递送，其中活性成分的组合物含于薄片状结构内，作为贴在皮肤上的递药装置。在这种结构内，活性成分的组合物含在上面的衬里下的层内，或“贮库(reservoir)”内。此层状结构可含一个贮库或含多个贮库。在一个实施方案中，贮库包含药物可接受的接触粘合剂物质的聚合物基质，在递送活性成分时，使系统贴在皮肤上。适当的皮肤接触粘合剂物质的实例包括但不限于聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯等等。所选择的具体聚合物粘合剂取决于具体活性成分、载体等等，而粘合剂必须与含活性成分的组合物的全部成分相容。或者含活性成分的贮库和皮肤接触粘合剂是分开的和不同的层，这样在贮库下的粘合剂或是上述的聚合物基质，或是液体或水凝胶贮库，或是某些其它类型。
这些层压材料的衬里层，作为装置的表面，是层压结构的主要结构要素，使装置具有许多适应性。应选择不透活性成分也不透含活性成分的组合物的任何其它成分的物质作衬里材料，因而能防止任何成分通过装置的上表丧失。衬里层可以是包藏的或非包藏的，取决于递送活性成分时皮肤是否为水合的。衬里优选柔软高弹体物质的层或片制成。适合作衬里层的聚合物实例包括聚乙烯、聚丙烯和聚酯。
在贮藏和使用前，层压结构含有释放衬垫。临用前，从装置移去此层露出其基础的表面，或是活性成分贮库或是分开的接触粘合剂层，使得系统贴在皮肤上。此释放衬垫应由不透活性成分/载体的物质制成。
这种装置可用本领域周知的常规技术制作，例如将粘合剂流体混合物、活性成分和载体浇注到衬里层，随之铺上释放层。同样，可将粘合剂、混合物浇注到释放层，随之铺上衬里层。或者在没有活性成分或赋形剂时制备活性成分贮库，然后通过“浸泡”在活性成分/载体混合物中来装填。
至于本发明的局部制剂，含在这些层压系统的活性成分贮库内的活性成分组合物也可以含有若干组分。某些情况下，所递送的活性成分也可以是“纯”的，即没有其它液体。然而，在多数情况下，活性成分是溶于、分散于或悬浮于适当的药物可接受的载体里，一般是溶剂或凝胶。另一些可能存在的成分包括防腐剂、稳定剂、表面活性剂等等。
应当注意的是，本发明的蛋白例如高甘露糖溶酶体酶，优选以有效量给予有需要的患者。本文所用的“有效量”是指达到所选结果所必需的量。例如，本发明组合物的有效量是选来用于治疗溶酶体贮积病。
适宜用于本发明范围的药物组合物所包括的组合物，其中所含的活性成分是达到预期目标的有效量。更具体地说，治疗有效量是指有效预防、减轻、改善疾病症状或延长受治患者的存活时间的活性成分的量。
确定治疗有效量正好在本领域技术人员的能力范围之内，尤其是可按照本文所提供的详细内容。
关于本发明方法所用的任何活性成分，从动物的活性测定可以初步确定治疗上的有效量或剂量。例如剂量的确定可通过动物模型获得循环浓度范围，它包括用活性测定所确定的IC50。
本文描述的活性成分的毒性和治疗效果可以标准药学方法用实验动物确定，例如测定患者活性成分的IC50和LD50(50％试验动物的致死剂量)。从这些活性测定中和动物研究中所得数据可用来制定人用的剂量范围。例如，适于治疗遗传病的治疗有效剂量可通过用这些疾病的动物模型的实验确定。
剂量可因所用剂型和所采用的给药途径而不同。可由各主治医师根据患者的病症选择准确的制剂、给药途径和剂量(参见例如Fingl等，1975，″The Pharmacological Basis of Therapeutics″，第1章，第1页)。
剂量与时间间隔可逐一调节使活性部分的血浆水平足以保持调节效果，称为最小有效浓度(MEC)。每个群体的MEC各不相同，但能任选从整体动物数据估计。
用MEC值也可确定剂量的间隔时间。可按给药方案任选施用制剂，维持10-90％、优选30-90％、最优选50-90％时间的血浆水平高于MEC。
根据所治疾病的严重程度和反应性，也可一次施用上述的缓释组合物，疗程数日至数周或直至完全治愈或使疾病减轻。
如果需要，本发明的组合物也可以包装或分药装置呈现，例如FDA所批准的药盒，其中含有活性成分的一个或多个单位剂型。包装，例如包括金属箔或塑料箔，例如泡眼包装。包装或分药装置也可以附有用药说明书。包装和分药器也附有与容器相关的须知，是由管理药物生产、使用或销售的政府机构以法令的形式授权的，这种须知也可以是美国食品及药物管理局所批准的处方药的标志或是所批准产品的插页。用相容的药用载体也可配制含有本发明活性成分的组合物，将其置于合适的容器内，注明所治疗的适应症。
本文所用的术语“调节”包括疾病进程基本受到抑制、减慢或逆转，疾病或病症的临床症状基本缓解，或者基本防止疾病或病症临床症状的出现。因此，“调节剂”包括可调节疾病或病症的物质。
序列表SEQ ID NO1信号肽ER的氨基酸序列MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEFSEQ ID NO2来自烟草壳多糖酶A的液泡靶向信号的氨基酸序列DLLVDTMSEQ ID NO3正向引物的核酸序列cagaattcgcccgcccctgcaSEQ ID NO4反向引物的核酸序列ctcagatcttggcgatgccacaSEQ ID NO5来自35S启动子的正向引物的核酸序列ctcagaagaccagagggctSEQ ID NO6来自终止子的反向引物的核酸序列caaagcggccatcgtgc
SEQ ID NO7用于本发明构建体的人GCD cDNA的核酸序列gcccgccc ctgcatccct aaaagcttcg gctacagctc ggtggtgtgtgtctgcaatg ccacatactg tgactccttt gaccccccga cctttcctgc ccttggtacc ttcagccgctatgagagtac acgcagtggg cgacggatgg agctgagtat ggggcccatc caggctaatc acacgggcacaggcctgcta ctgaccctgc agccagaaca gaagttccag aaagtgaagg gatttggagg ggccatgacagatgctgctg ctctcaacat ccttgccctg tcaccccctg cccaaaattt gctacttaaa tcgtacttctctgaagaagg aatcggatat aacatcatcc gggtacccat ggccagctgt gacttctcca tccgcacctacacctatgca gacacccctg atgatttcca gttgcacaac ttcagcctcc cagaggaaga taccaagctcaagatacccc tgattcaccg agccctgcag ttggcccagc gtcccgtttc actccttgcc agcccctggacatcacccac ttggctcaag accaatggag cggtgaatgg gaaggggtca ctcaagggac agcccggagacatctaccac cagacctggg ccagatactt tgtgaagttc ctggatgcct atgctgagca caagttacagttctgggcag tgacagctga aaatgagcct tctgctgggc tgttgagtgg ataccccttc cagtgcctgggcttcacccc tgaacatcag cgagacttca ttgcccgtga cctaggtcct accctcgcca acagtactcaccacaatgtc cgcctactca tgctggatga ccaacgcttg ctgctgcccc actgggcaaa ggtggtactgacagacccag aagcagctaa atatgttcat ggcattgctg tacattggta cctggacttt ctggctccagccaaagccac cctaggggag acacaccgcc tgttccccaa caccatgctc tttgcctcag aggcctgtgtgggctccaag ttctgggagc agagtgtgcg gctaggctcc tgggatcgag ggatgcagta cagccacagcatcatcacga acctcctgta ccatgtggtc ggctggaccg actggaacct tgccctgaac cccgaaggaggacccaattg ggtgcgtaac tttgtcgaca gtcccatcat tgtagacatc accaaggaca cgttttacaaacagcccatg ttctaccacc ttggccactt cagcaagttc attcctgagg gctcccagag agtggggctggttgccagtc agaagaacga cctggacgca gtggcactga tgcatcccga tggctctgct gttgtggtcgtgctaaaccg ctcctctaag gatgtgcctc ttaccatcaa ggatcctgct gtgggcttcc tggagacaatctcacctggc tactccattc acacctacct gtggcatcgc cag
SEQ ID NO8葡糖脑苷脂酶氨基酸序列A R P C I P K S F G Y S S V VC V C N A T Y C D S F D P P T F P A L G T F SR Y E S T R S G R R M E L S M G P I Q A N H TG T G L L L T L Q P E Q K F Q K V K G F G G AM T D A A A L N I L A L S P P A Q N L L L K SY F S E E G V R L L M L N D Q R L L L P H W A K VV L T D P E A A K Y V H G I A V H W Y L D F L A P A K AT L G E T H R L F P N T M L F A S E A C V G S K F W EQ S V R L G S W D R G M Q Y S H S I I T N L L Y H V VG W T D W N L A L N P E G G P N W V R N F V D S P I IV D I T K D T F Y K Q P M F Y H L G H F S K F I P E G SQ R V G L V A S Q K N D L D A V A L M H P D G S A V VV V L N R S S K D V P L T I K D P A V G F L E T I S P GY S I H T Y L W H R QSEQ ID NO935S启动子核酸序列TtttcacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctaccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggaacatcgtggaaaaagaagacgtccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacSEQ ID NO10编码ER信号肽的核酸序列atgaagactaatctttttctctttctcatcttttcacttctc ctatcattatcctcggccgaattcSEQ ID NO11编码液泡靶向序列的核酸序列gatcttttagtcgatactatg
SEQ ID NO12终止子的核酸序列taatttcatgatctgttttgttgtattcccttgcaatgcagggcctagggctatgaAtaaagttaatgtgtgaatgtgtgaatgtgtgattgtgacctgaagggatcacgactataatcgtttataataaacaaagactttgtcccaaaaaccccccccccngcagaSEQ ID NO13本发明的表达盒的核酸序列ttttcacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctaccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggaacatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacaggcttcttgagatccttcaacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattactatttacaattacagtcgagggatccaaggagatataacaatgaagactaatctttttctctttctcatcttttcacttctcctatcattatcctcggccgaattcgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtctgcaatgccacatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgcagtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgaccctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgctgctctcaacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgTacttctctgaagaaggaatcggatataacatcatccgggtacccatggccagctgtgacttctccatccgcacctacacctatgcagacacccctgatgatttccagttgcacaacttcagcctcccagaggaagataccaagctcaagatacccctgattcaccgagccctgcagttggcccagcgtcccgtttcactccttgccagcccctggacatcacccacttggctcaagaccaatggagcggtgaatgggaaggggtcactcaagggacagcccggagacatctaccaccagacctgggccagatactttgtgaagttcctggatgcctatgctgagcacaagttacagttctgggcagtgacagctgaaaatgagccttctgctgggctgttgagtggataccccttccagtgcctgggcttcacccctgaacatcagcgagacttcattgcccgtgacctaggtcctaccctcgccaacagtactcaccacaatgtccgcctactcatgctggatgaccaacgcttgctgctgccccactgggcaaaggtggtactgacagacccagaagcagctaaatatgttcatggcattgctgtacattggtacctggactttctggctccagccaaagccaccctaggggagacacaccgcctgttccccaacaccatgctctttgcctcagaggcctgtgtgggctccaagttctgggagcagagtgtgcggctaggctcctgggatcgagggatgcagtacagccacagcatcatcacgaacctcctgtaccatggtcggctggaccgactggaaccttgccctgaaccccgaaggaggacccaattgggtgcgtaactttgtcgacagtcccatcattgtagacatcaccaaggacacgttttacaaacagcccatgttctaccaccttggccacttcagcaagttcattcctgagggctcccagagagtggggctggttgccagtcagaagaacgacctggacgcagtggcactgatgcatcccgatggctctgctgttgtggtcgtgctaaaccgctcctctaaggatgtgcctcttaccatcaaggatcctgctgggcttcctggagacaatctcacctggctactccattcacacctacctgtggcatcgccaagatcttttagtcgatactatgtaatttcatgatctgttttgttgtattcccttgcaatgcagggcctagggctatgaAtaaagttaatgtgtgaatgtgtgaatgtgtgattgtgacctgaagggatcacgactataatcgtttataataaacaaagactttgtcccaaaaaccccccccccngcagaSEQ ID NO14本发明的重组蛋白的氨基酸序列M K T N L F L F L I F S L L L S L S S A E F A R P CI P K S F G Y S S V V C V C N A T Y C D S F D P P T F PA L G T F S R Y E S T R S G R R M E L S M G P I Q A NH T G T G L L L T L Q P E Q K F Q K V K G F G G A M TD A A A L N I L A L S P P A Q N L L L K S Y F S E E G I GY N I I R V P M A S C D F S I R T Y T Y A D T P D D F QL H N F S L P E E D T K L K I P L I H R A L Q L A Q R PV S L L A S P W T S P T W L K T N G A V N G K G S L K GQ P G D I Y H Q T W A R Y F V K F L D A Y A E H K L QF W A V TA E N E P S A G L L S G Y P F Q C L G F T P EH Q R D F I A R D L G P T L A N S T H H N V R L L M LD D Q R L L L P H W A K V V L T D P E A A K Y V H G IA V H W Y L D F L A P A K A T L G E T H R L F P N T ML F A S E A C V G S K F W E Q S V R L G S W D R G M QY S H S I I T N L L Y H V V G W T D W N L A L N P E G GP N W V R N F V D S P I I V D I T K D T F Y K Q P M F YH L G H F S K F I P E G S Q R V G L V A S Q K N D L DA V A L M H P D G S A V V V V L N R S S K D V P L T I KD P A V G F L E T I S P G Y S I H T Y L W H R Q D L L VD T M其他实施方案人们知道，尽管结合发明详述描述了本发明，但是前面的描述是说明性的，而不是对本发明范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改都在所附权利要求的范围之内。
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1.一种生产高甘露糖重组蛋白的宿主细胞，该细胞包含编码所述重组蛋白和使所产生的重组蛋白作为高甘露糖蛋白的信号的多核苷酸。
2.权利要求1的细胞，其中所述多核苷酸包含编码所述目标蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列与编码信号肽的第二核酸序列操作性连接。
3.权利要求2的细胞，其中所述信号肽包含内质网(ER)靶向信号肽。
4.权利要求3的细胞，其中所述多核苷酸还包含编码液泡靶向信号肽的第三核酸序列。
5.权利要求1的细胞，其中所述信号使所述重组蛋白靶向ER。
6.权利要求5的细胞，其中所述信号包含使所述重组蛋白靶向ER的信号肽。
7.权利要求6的细胞，其中所述多核苷酸包含编码所述信号肽的核酸区段。
8.权利要求1或权利要求3-7中任一项的细胞，其中所述信号使重组蛋白绕过高尔基体。
9.权利要求8的细胞，其中所述信号包含使重组蛋白不靶向高尔基体的信号肽。
10.权利要求9的细胞，其中所述多核苷酸包含编码所述信号肽的核酸区段。
11.权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞是任一种真核细胞和原核细胞。
12.权利要求11的宿主细胞，其中所述原核细胞是细菌细胞，优选是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞。
13.权利要求12的宿主细胞，其中所述真核细胞是植物细胞。
14.权利要求13的宿主细胞，其中所述植物细胞是选自以下的植物根细胞发根土壤杆菌(Agrobacterium rihzogenes)转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。
15.权利要求14的宿主细胞，其中所述植物根细胞是胡萝卜细胞。
16.权利要求15的宿主细胞，其中所述重组多核苷酸包含编码所述目标蛋白的第一核酸序列，所述第一核酸序列与编码源自碱性烟草壳多糖酶A基因的液泡靶向信号肽的第二核酸序列操作性连接，该液泡信号肽的氨基酸序列由SEQ ID NO2表示，其中所述第一核酸序列还任选与第三核酸序列操作性连接，所述第三核酸序列编码由SEQ ID NO1表示的内质网(ER)靶向信号肽。
17.权利要求16的宿主细胞，其中所述重组多核苷酸还包含在植物细胞内起作用的启动子，其中所述启动子与所述重组分子操作性连接。
18.权利要求17的宿主细胞，其中所述重组多核苷酸还包含在植物细胞内起作用的终止子，其中所述终止子与所述重组分子操作性连接。
19.权利要求18的宿主细胞，其中所述重组多核苷酸还任选包含另外的控制、启动和调节元件和/或选择标记，其中所述调节元件与所述重组分子操作性连接。
20.权利要求19的宿主细胞，其中所述高甘露糖蛋白是具有至少一个暴露甘露糖残基糖基化的高甘露糖糖蛋白。
21.权利要求20的宿主细胞，其中所述高甘露糖蛋白是选自以下的生物活性高甘露糖溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
22.权利要求21的宿主细胞，其中所述溶酶体酶是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
23.权利要求22的宿主细胞，其中所述GCD包含基本上如SEQID NO8所示的氨基酸序列，该氨基酸序列由SEQ ID NO7所示的核酸序列编码。
24.权利要求23的宿主细胞，其中所述细胞用重组多核苷酸或包含所述分子的表达载体转化或转染，该重组多核苷酸还包含花椰菜花叶病毒的35S启动子、根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶终止子，调节元件是烟草花叶病毒(TMV)Ω翻译增强子元件，具有基本上如SEQ IDNO13所示的核酸序列，其编码的GCD具有基本上如SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。
25.由权利要求1-24中任一项的宿主细胞产生的重组高甘露糖蛋白。
26.权利要求25的重组高甘露糖蛋白，其中所述高甘露糖蛋白是选自以下的生物活性高甘露糖溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
27.权利要求26的重组蛋白，其中所述溶酶体酶是人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
28.一种重组生物活性高甘露糖溶酶体酶，其具有至少一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链。
29.一种重组蛋白，该蛋白包含具有信号肽活性的第一部分和具有溶酶体酶活性的第二部分，所述第一部分使所述第二部分在植物细胞中被加工成具有至少一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链。
30.权利要求29的蛋白，其中所述溶酶体酶包含用于治疗或预防戈谢病的蛋白。
31.权利要求29或30的蛋白，其中所述蛋白包含人葡糖脑苷脂酶(hGCD)。
32.权利要求29-31中任一项的蛋白，其中所述第一部分包含植物细胞ER靶向信号肽。
33.权利要求29的重组溶酶体酶，其中所述重组酶能与溶酶体贮积病患者体内的靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。
34.权利要求33的重组溶酶体酶，其中所述重组溶酶体酶对于所述靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于所述靶细胞的相应亲和力大。
35.权利要求34的重组溶酶体酶，其中所述重组溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
36.权利要求35的重组溶酶体酶，其中所述重组溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
37.权利要求36的重组溶酶体酶，其中所述靶部位的靶细胞是所述患者肝内的枯否细胞。
38.一种用植物细胞培养生产的重组高甘露糖蛋白。
39.权利要求38的重组高甘露糖蛋白，该蛋白包含使蛋白靶向ER的植物信号肽。
40.权利要求39的蛋白，其中所述植物信号肽包含使所述蛋白靶向根植物细胞培养物中的ER的肽。
41.权利要求40的蛋白，其中所述根植物细胞培养物包含胡萝卜细胞。
42.一种用植物细胞培养生产的重组高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(hGCD)蛋白。
43.植物细胞培养物在生产高甘露糖蛋白中的用途。
44.一种生产高甘露糖蛋白的方法，所述方法包括制备用编码重组蛋白的重组多核苷酸转化或转染的重组宿主细胞的培养物；在允许所述蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞培养物，其中所述宿主细胞产生所述高甘露糖基化形式的蛋白。
45.权利要求44的方法，其中悬浮培养所述宿主细胞培养物。
46.权利要求45的方法，所述方法还包括纯化所述蛋白。
47.权利要求45的方法，其中所述宿主细胞如权利要求1-15中任一项所限定。
48.权利要求46或47中任一项的方法，其中所述高甘露糖蛋白是生物活性高甘露糖溶酶体酶，其具有至少一个包含暴露甘露糖残基的寡糖链。
49.权利要求48的方法，其中所述重组酶与靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。
50.权利要求49的方法，其中所述重组酶对于所述靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于所述靶细胞的相应亲和力大。
51.权利要求50的方法，其中所述溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶和唾液酸酶。
52.权利要求51的方法，其中所述溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
53.权利要求52的方法，其中所述靶部位的靶细胞是所述患者肝内的枯否细胞。
54.权利要求53的方法，其中所述宿主细胞是选自以下的植物根细胞发根土壤杆菌转化的根细胞、芹菜细胞、姜细胞、辣根细胞和胡萝卜细胞。
55.权利要求54的方法，其中所述植物根细胞是胡萝卜细胞。
56.权利要求55的方法，其中让所述转化宿主胡萝卜细胞在悬液中生长。
57.一种用外源重组溶酶体酶治疗溶酶体酶贮积病患者的方法，所述方法包括(a)提供重组生物活性形式的溶酶体酶，所述溶酶体酶从转化植物根细胞纯化并且能够有效靶向异常缺乏所述溶酶体酶的细胞，其中所述重组生物活性酶在附着的寡糖上有暴露的末端甘露糖残基；(b)给予所述患者治疗有效量的所述重组生物活性溶酶体酶。
58.权利要求57的方法，其中所述宿主细胞如权利要求1-24中任一项所限定。
59.权利要求58的方法，其中所述宿主细胞是胡萝卜细胞。
60.权利要求59的方法，其中所述溶酶体酶是高甘露糖酶，其包含至少一个具有暴露甘露糖残基的寡糖链。
61.权利要求60的方法，其中所述重组酶能与患者靶部位的靶细胞上的甘露糖受体结合。
62.权利要求61的方法，其中所述重组溶酶体酶对于所述靶细胞的亲和力比天然存在的溶酶体酶对于所述靶细胞的相应亲和力大。
63.权利要求62的方法，其中所述溶酶体酶选自葡糖脑苷脂酶(GCD)、酸性鞘磷脂酶、氨基己糖苷酶、α-N-乙酰半乳糖苷酶、酸性脂肪酶、α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、α-甘露糖苷酶或唾液酸酶。
64.权利要求63的方法，其中所述溶酶体酶是葡糖脑苷脂酶(GCD)。
65.权利要求64的方法，其中所述溶酶体酶贮积病是戈谢病。
66.权利要求65的方法，其中所述靶部位的靶细胞是所述患者肝内的枯否细胞。
67.一种治疗溶酶体贮积病的药物组合物，所述组合物包含作为活性成分的如权利要求25-42中任一项限定的重组生物活性高甘露糖溶酶体酶，所述组合物还任选包含药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
68.权利要求67的组合物，其中所述溶酶体贮积病是戈谢病。
69.权利要求68的组合物，其中所述重组溶酶体酶是生物活性高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
70.权利要求25-42中任一项限定的重组生物活性高甘露糖溶酶体酶在制备用于治疗或预防溶酶体贮积病的药物中的用途。
71.权利要求70的用途，其中所述疾病是戈谢病。
72.权利要求71的用途，其中所述生物活性溶酶体酶是生物活性高甘露糖人葡糖脑苷脂酶(GCD)。
全文摘要
用植物培养生产糖基化蛋白、特别是具有高甘露糖糖基化、同时靶向具有ER信号和/或绕过高尔基体的蛋白的装置、系统和方法。本发明还涉及应用转基因植物根细胞、特别是胡萝卜细胞表达和生产有酶活性的高甘露糖溶酶体酶的载体和方法。更具体地说，本发明涉及高水平表达和大量生产生物活性高甘露糖葡糖脑苷脂酶(GCD)的宿主细胞、特别是转基因悬浮胡萝卜细胞、载体和方法。本发明还提供了用于治疗溶酶体贮积病的组合物和方法。
文档编号C12N1/20GK1875111SQ200480017916
公开日2006年12月6日 申请日期2004年2月24日 优先权日2003年4月27日
发明者Y·沙亚迪伊, G·鲍姆, D·巴特费德, S·哈斯穆里, A·勒科维茨 申请人:普罗塔里克斯有限公司