专利名称：赋予植物再分化能力的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及赋予植物再生能力的基因的分离和鉴定，以及应用这些基因提高再生能力和选择转化细胞的方法。本发明可使得植物的培养特性得到改良并可基于安全性方面的特别考虑而开发转化方法。
背景技术：
在适当的条件下，分化的植物组织去分化并在经过细胞分裂后形成愈伤组织(去分化细胞群)。依赖于所述的条件，愈伤组织可以进一步再分化以再生为完整的植物体。这种分化细胞或去分化细胞再生为个体的能力被称为分化全能性，在1930-1950年代对烟草、番茄等的培养研究中最初证实了这一点。组织培养技术是基于这一分化全能性，且已被广泛应用，尤其是在植物育种方面。例如，组织培养技术已经被用于通过细胞融合和胚珠培养生产新品种、缩短育种年限和固定遗传特性。近年来，组织培养技术作为以基因功能分析为目的的人工基因转移(转化方法)中的关键技术已成为分子育种和植物的基础研究所必需的。
分化全能性通常被认为是所有植物都拥有的能力。事实上，已知对于某些植物来说展示这一能力是容易的，对于其它植物来说则是困难的，这取决于植物种类、品种或器官。与双子叶植物相比，单子叶植物包括主要农作物例如水稻、小麦和玉米的组织培养和再生是困难的，因此对于培养包括转化方法的分析而言，再三反复实验是必需的。在水稻中，已经利用特定品种的成熟种子确立了一个相对简单的培养系统，但是具有足够的再生能力的品种是有限的。特别地，可食品种例如Koshihikari和Sasanishiki，以及在热带地区广泛栽培的IR品系品种的再生能力低且通过组织培养再生为植物体困难。提高这些品种的再生能力将不仅对于选择育种和基因特性的研究有用，而且还有可能阐明再生过程的机制。此外，其它不可培养的植物种和品种的再生能力也可能得到提高。
此外，近年来已开发了大量经遗传修饰的农产品(GMO)，且它们的栽培面积正逐年增加。同时，许多消费者担心这些农产品的安全性。在GMO的安全性问题的讨论中最主要的问题是它们掺入了抗生素抗性基因。因此，开发不使用抗生素抗性基因的转化方法将减轻目前消费者对GMO的担忧，同时作为无需昂贵的抗生素的简单转化方法对于研究人员可能也是有利的。
发明内容
再生能力取决于作为数量性状(QTL数量性状基因座)的众多基因间的相互作用，但是迄今为止未有关于从那样的基因的基因座成功分离出具有再生能力的基因的报道。本发明的一个目的是分离和鉴定与植物的再生能力有关的基因、提供应用这些基因改良植物的方法以及应用这些基因作为选择标记的转化方法。
在繁殖用于检测具有再生能力的QTL的杂种群体之前，本发明人选择了将用做该杂种群体的亲本的品种。本发明人选择了在再生能力上有明显差异的两个品种日本水稻(japonica rice)“Koshihikari”和印度水稻(indica rice)“Kasalath”(图1)。将这两个栽培种杂交产生F1个体，然后用Koshihikari作为回归亲本对它们进行回交，并进行自体受精。生成了BCF1群体的99个品系，并收集BC1F2种子。用每一品系的20粒BC1F2种子在诱导培养基中培养愈伤组织30天后，将生长的愈伤组织转移到再生培养基中并再培养30天。30天之后，测量每粒种子的愈伤组织重量和苗数，用每一品系的20粒种子测定平均值。该平均值被当作再生能力(图1)。采用262个PCR标记得出每一品系的基因型。当基于这些数据进行关于再生能力的QTL分析时，检出了4个具有再生能力增加效应的QTL(图2)。在其中一个QTL中，靠近1号染色体的短臂上的TGS2451标记(PSR1；苗再生启动子1)处，成功地发现Kasalath基因组在Koshihikari的再生能力上具有很大的增加效应(图2)。其次，为了鉴定出PSR1基因的大致基因座，从BC2F1群体中选择出其PSR1区域已被Kasalath的PSR1区域取代的30株个体，用来自这些个体的每一株的10粒种子(BC2F2种子)诱导产生愈伤组织。从生长的愈伤组织提取DNA以利用分子标记测定基因型，通过研究再生能力进行连锁分析。此外，为了对该基因座进行详细说明，采用分子标记对大约3,800粒其中PSR1被隔离的BC3F2种子进行基因型调查，并进行高分辨连锁分析。结果，发现PSR1定位于分子标记3132和P182间的大约50.8kb的区域(图3)。在该区域的基因预测表明在该区域存在4个基因，包括一假定的蛋白质。为了测定这些基因中的哪一个是具有再生能力的基因，构建了Kasalath BAC文库(平均长度120kb)，通过PCR筛选分离出了一个包含PSR1区域(BHAL15)的BAC克隆。将位于BHAL15克隆中的合适的限制性酶切位点用以制备包含每一候选基因区域的Kasalath基因组片段，并将它们导入到Koshihikari中。结果发现仅当导入了包含被认为编码铁氧还蛋白亚硝酸还原酶(NiR)的基因的Kasalath基因组片段(图3中的3F)时，Koshihikari的再生能力才提高(图4)。铁氧还蛋白亚硝酸还原酶是一种亚硝酸还原酶，其利用铁氧还蛋白作为电子供体发挥功能，并具备将亚硝酸盐转换为氨的作用。测定了被认为是铁氧还蛋白亚硝酸还原酶基因的遗传区域及其大约2kb的上游区的核苷酸序列并与Kasalath和Koshihikari进行比较，在该核苷酸序列内发现了许多的突变(图5)此外，当通过半定量RT-PCR和实时定量PCR对位于愈伤组织中的这一基因的mRNA表达水平进行测定时，Kasalath中的mRNA的量大约是Koshihikari中的该量的2.5倍(图6中左侧照片的顶部和中部和右侧照片)。使用特异于NiR蛋白的抗体进行的Western印迹分析也表明该NiR蛋白在Kasalath中的储存量比在Koshihikari中的储存量更大(图6中左侧照片的底部)。此外，使用萘乙二胺法和在E.coli中表达的NiR重组蛋白比较每单位蛋白的NiR酶活性，Kasalath的NiR酶活性显示出高于Koshihikari的NiR酶活性大约1.6倍(图7)。上述结果表明Koshihikari和Kasalath之间在再生能力上的差异首先归因于两者在NiR基因的转录调节水平上的差异，其次归因于每分子该合成蛋白在活性上的差异。
将Kasalath PSR1基因的基因组区域导入中赋予了不能再生的Koshihikari以再生能力。这表明当转化Koshihikari时Kasalath PSR1基因可以被用做一个选择标记。更特别地，当将已同时插入了KasalathPSR1基因和一靶基因的载体导入到Koshihikari中时，仅已被导入了PSR1基因的那些细胞将获得再生能力，因此再生的植物体将同时具有被掺入的靶基因。为了证明这一观点，构建了携带有于pBI101二元载体的T-DNA区域中的Kasalath NiR基因组+35S启动子GUS、Kasalath NiR启动子∷NiR cDNA∷NiR终止子+35S启动子GUS、水稻Actin1启动子∷NiR cDNA∷NiR终止子+35S启动子GUS的载体和未携带NiR基因的载体，并将其导入到Koshihikari中。当导入3种类型的包含NiR基因的载体时，在所有情况下都获得了大量的再生个体，且在这些再生个体自其衍生而来的愈伤组织中观察到由于GUS基因所产生的着色(图8)。此外，NiR基因具有代谢对植物有毒性的亚硝酸的特性，应用这一特性也使得NiR基因能被用作高再生性品种的转化标记。更特别地，位于肌动蛋白启动子(该启动子是水稻中的一个高表达启动子)控制下的过表达NiR基因的载体被导入到一个高再生性的Kasalath品种中，并在添加有亚硝酸的培养基中进行培养，所添加的亚硝酸的浓度能抑制普通野生型的生长。只有被转化的细胞由于过表达的NiR基因的效应而生长，且GUS染色仅在这些生长的细胞中被观测到(图9)。这一选择方法的使用使得生产不使用衍生自微生物的抗生素抗性基因(转化细胞的选择标记)的更安全的重组植物成为可能，这被认为是传统的遗传修饰的农产品中的问题所在。此外，因为昂贵的抗生素是不必要的，开发转化体的费用被降低。
更特别地，本发明涉及提高植物再生能力的基因的分离和鉴定和通过应用这些基因提高植物的培养特性，以及使用这些基因作为选择标记的转化。本发明提供了下述[1]-[22]个方面[1]涉及植物的再生能力的DNA，其中所述DNA是(a)-(d)中的任一个(a)编码一种包含SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白质的DNA；(b)包含SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的编码区的DNA；(c)编码包含SEQ ID NO3的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的蛋白质的DNA；和(d)在严格条件下与包含SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的DNA杂交的DNA；[2]编码包含SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白质的部分肽的DNA；[3]包含SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的启动子区域的DNA；[4]包含[1]或[2]的DNA的载体；[5]包含[3]的DNA的载体；[6]携带[4]的载体的宿主细胞；[7]携带[4]的载体的植物细胞；[8]包含[7]的植物细胞的植物转化体；[9]是[8]的植物转化体的后代或克隆的植物转化体；[10][8]或[9]的植物转化体的繁殖材料；[11]一种用于制备植物转化体的方法，该方法包括将[1]或[2]的DNA导入植物细胞和从所述植物细胞再生植物的步骤；[12]由[1]或[2]的DNA所编码的蛋白质；[13]一种用于制备[12]的蛋白质的方法，该方法包括培养[6]所述的宿主细胞并从所述细胞或其培养物上清收集重组蛋白质的步骤；[14]与[12]的蛋白质结合的抗体；[15]包含至少15个与SEQ ID NO1或2的核苷酸序列互补的连续核苷酸的多核苷酸，或与其互补的序列；[16]一种用于提高植物的再生能力的方法，该方法包括在植物的细胞中表达[1]或[2]的DNA的步骤；[17]一种用于改变植物的再生能力的制剂，该制剂包含[1]或[2]的DNA或[4]的载体做为活性成分；[18]一种用于测定植物细胞的再生能力的方法，该方法包括检测[1]的DNA或[12]的蛋白质在植物细胞中的表达的步骤；[19]一种用于测定植物细胞的再生能力的方法，该方法包括检测[12]的蛋白质在植物细胞中的活性的步骤；[20]一种用于提高植物的再生能力的方法，该方法包括调节[12]的内源蛋白在该植物中的活性的步骤；[21]一种用于选择转化的植物细胞的方法，该方法包括以下步骤(a)将包含用做选择标记的[1]或[2]的DNA的载体导入植物细胞中；和(b)培养所述植物细胞并选择已经获得再生能力的植物细胞；和[22]一种用于改变植物的再生能力的方法，该方法包括通过杂交取代植物中的[1]或[2]的内源DNA的步骤。
本发明提供了编码水稻来源的NiR蛋白的DNA。“Kasalath”的基因组DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO1中，“Kasalath”的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO2中，由该DNA所编码的蛋白质的氨基酸序列示与SEQ ID NO3中。“Koshihikari”的基因组DNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO4中，“Koshihikari”的cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO5中，由该DNA所编码的蛋白质的氨基酸序列示与SEQ ID NO6中。
本发明表明了植物的再生能力可以通过调节PSR1基因在植物中的表达或活性而提高。这使得不可培养品种例如Koshihikari的培养成为可能，并使得生产稳定且高再生性的品种成为可能。
术语“再生能力的提高”在本发明中仅指在培养条件下植物的再生能力被提高，且再生个体的形式未改变。这一在再生能力上的提高使得可以将所期望的品种用于各种培养试验中，结果使得新品种和基因的功能性分析得到有效的发展。
在本发明中，术语“植物的PSR1基因”指编码植物的铁氧还蛋白亚硝酸还原酶的NiR基因。“植物的PSR1基因”包含水稻的PSR1基因(图5)和来源于其他植物的PSR1基因。编码本发明的PSR1蛋白的DNA包括基因组DNA、cDNA和化学合成的DNA。基因组DNA和cDNA可以根据本领域技术人员所熟知的常规方法制备。更特别的，基因组DNA可以例如按照如下制备(1)从具有PSR1基因的水稻品种(例如Koshihikari)提取基因组DNA；(2)构建一个基因组文库(应用载体例如质粒、噬菌体、粘粒、BAC和PAC)；(3)发展所述文库；和(4)用基于编码本发明的蛋白质的DNA(例如SEQID NO1或2)制备的探针进行克隆杂交或噬菌斑杂交。或者，可以通过使用特异于编码本发明的蛋白质的DNA(例如SEQ ID NO1或2)的引物进行PCR植被基因组DNA。另一方面，可以例如按照如下制备cDNA(1)基于从具有PSR1基因的水稻品种(例如Koshihikari)提取的mRNA合成cDNA；(2)通过将该合成的cDNA插入到载体例如λZAP中制备一个cDNA文库；(3)发展所述cDNA文库；和(4)如上述进行克隆杂交或噬菌斑杂交。或者，也可以通过PCR制备cDNA。
本发明包括编码SEQ ID NO3的PSR1蛋白的功能性等价物的蛋白(Kasalath)的DNA。在本申请中，术语“PSR1蛋白的功能性等价物”是指对目标蛋白的表达或活性的修饰使得再生能力提高。
这样的DNA的例子包括编码突变体、衍生物、等位基因、变异体和包含SEQ ID NO3中一个或多个氨基酸被取代、删除、添加和/或插入的氨基酸序列的同源物的那些DNA。
本领域技术人员所熟知的用于制备编码包含被改变的氨基酸的DNA的方法的例子包括定点诱变(Kramer，W.和Fritz，H.-J.，(1987)“Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplexDNA.”Methods in Enzymology，154350-367)。蛋白质的氨基酸序列也可以在自然界中由于核苷酸序列的突变发生突变。编码其中具有一个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加的天然PSR1蛋白的氨基酸序列的蛋白质的DNA也包括在本发明的DNA中，只要它们编码与天然PSR1蛋白(SEQ ID NO3)功能性等价的蛋白质。此外，不增加蛋白质的氨基酸序列的改变的核苷酸突变体(退行性突变体)也包括在本发明的DNA的范围内。
编码与SEQ ID NO3中所述的PSR1蛋白的功能性等价性蛋白的DNA可以通过例如本领域技术人员所熟知的方法来制备，包括使用杂交技术的方法(Southern，E.M.，Journal of Molecular Biology，Vol.98，503，1975.)和聚合酶链式反应(PCR)技术(Saiki，R.K.et al.Science，vol.230，1350-1354，1985；Saiki，R.K.et al.Science，vol.239，487-491，1988)。也就是说，通过使用PSR1基因的核苷酸序列(SEQID NO2)或其一部分作为探针，并使用与PSR1基因的核苷酸序列(SEQ ID NO2)特异性杂交的寡核苷酸作为引物，从水稻和其他植物分离出与PSR1基因具有高度同源性的DNA对于本领域技术人员来说是很常规的。这样的可通过杂交技术或PCR技术获得的编码与PSR1蛋白功能性等价的蛋白质的DNA也包括在本发明的DNA的范围内。
优选在严格条件下进行杂交反应以分离这样的DNA。本发明的严格杂交条件包括例如6M尿素、0.4％SDS和0.5x SSC这样的条件，和那些产生相似的严格性的条件。期望当在具备较高的严格性的条件下，例如6M尿素、0.4％SDS、和0.1x SSC的条件下进行杂交时获得具有较高同源性的DNA。在这种条件下分离出的那些DNA被期望编码与PSR1蛋白(SEQ ID NO3或6)具有高水平的氨基酸同源性蛋白质。在本申请中，高同源性的意思是在整个氨基酸序列上具有至少50％或更高的同一性，更优选70％或更高，更加优选90％或更高(例如95％、96％、97％、98％、99％或更高)。一条氨基酸序或核苷酸序列与另一条氨基酸序列或者核苷酸序列的同源性的程度可以遵循由Karlin和Altschul建立的BLAST算法进行测定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873，1993)。基于BLAST算法开发了例如BLASTN和BLASTX这样的程序(Altschul SF，et al.J.Mol.Biol.215403，1990)。为了根据BLASTN对核苷酸序列进行测定，参数被设置为例如得分＝100和字长＝12。另一方面，用于通过BLASTX对氨基酸序列进行分析的参数包括例如得分＝50和字长＝3。当应用BLAST和缺口BLAST程序时，使用每一程序的缺省值。用于这种分析的特定技术是本领域中已知的。
可以按照如下评估某一特定的DNA是否编码与植物的再生能力有关的蛋白质。最为常规的方法包括检测DNA的功能，然后进行培养并对再生的能力进行调查。更特别低，所述方法包括在维持了DNA的功能的条件下和在DNA失去功能的条件下进行培养，并比较结果产生的再生能力。如果再生能力不发生变化或几乎相同，则该DNA与再生能力无关。当DNA与再生能力相关时，再生率被进一步提高，这一差别被认为是再生能力的程度。
本发明的DNA可以被用于例如制备重组蛋白和生产再生能力被改变的植物转化体。通常通过以下步骤制备重组蛋白将编码本发明的蛋白质的DNA插入到一合适的表达载体中；将该载体导入到一合适的细胞中；培养该转化细胞；使得所述细胞能够表达所述重组蛋白并纯化所表达的蛋白质。重组蛋白可以与其他蛋白质一起作为融合蛋白被表达以使得能够容易地被纯化，例如作为与麦芽糖结合蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)中的融合蛋白(New England Biolabs，USA，Pmal载体系列)、作为与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白(Amersham Pharmacia Biotech，pGEX载体系列)或用组氨酸标签(Novagen，pET系列)。对宿主细胞没有限制，只要该细胞适于表达该重组蛋白即可。有可能利用酵母或各种动物、植物或昆虫细胞以及上述的大肠杆菌。可以通过多种本领域技术人员已知的方法将载体导入到宿主细胞当中。例如，利用钙离子的转化方法可以被用于将载体导入E.coli中(Mandel，M.和Higa，A.(1970)Journal of MolecularBiology，53，158-162，Hanahan，D.(1983)Journal of Molecular Biology，166，557-580)。在宿主细胞中表达的重组蛋白可以通过已知的方法进行纯化并从宿主细胞或其培养物上清进行回收。当重组蛋白作为与麦芽糖结合蛋白或其他配偶体(partner)的融合蛋白被表达时，所述重组蛋白能够通过亲合层析容易地被纯化。本发明的蛋白质可以从按照下述通过将本发明的DNA导入到植物中所产生的转化植物来制备。因此，如下述，本发明的转化植物不仅包括导入了本发明的DNA以改变其再生能力的植物，而且包括了导入了本发明的DNA以制备本发明的蛋白质的植物。
所得蛋白质可以用于制备与所述蛋白质结合的抗体。例如，可以通过用本发明的纯化蛋白或其一部分对免疫动物例如兔进行免疫、在一定时期后采集血液并除去血液凝块来制备多克隆抗体。可以通过将骨髓瘤细胞与被上述蛋白质或其一部分免疫的动物的抗体生成细胞相融合、分离表达所需抗体的单克隆细胞(杂交瘤)并从所述细胞除去回收所述抗体来制备单克隆抗体。所获得的抗体可以被用于纯化或检测本发明的蛋白质。因此，本发明包括了与本发明的蛋白质相结合的抗体。这些抗体的使用使得可以将与植物体的再生能力相关的蛋白质的表达位点区分出来，或能够测定某一植物种是否表达与再生能力相关的蛋白质。
当应用本发明的DNA来制备再生能力被提高的转化植物时，将编码本发明的蛋白质的DNA被插入到一合适的载体中，随后将该载体导入到植物细胞中。通过这些步骤所获得的转化的植物细胞随后被再生。导入了所述载体的植物细胞优选具有本发明的DNA的低表达的植物细胞。因此，术语“植物细胞”包括各种形式的植物细胞，例如悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片(leaf sections)和愈伤组织。
对用于植物细胞转化的载体没有特别的限制，只要它们能在细胞中表达被插入的基因即可。实例包括“pBI121”、“pBI221”和“pBI101”质粒(全部来自Clontech)。
本发明的载体可以包含一个用于组成型或诱导型表达本发明的蛋白质的启动子。用于组成型表达的启动子的例子包括花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell et al.1985 Nature 313810)，水稻的肌动蛋白启动子(Zhang et al.1991 Plant Cell 31155)和玉米的遍在蛋白启动子(Comejo et al.1993 Plant Mol.Biol.23567)。
用于诱导型表达的启动子的实例包括已知的由于外因启动表达的启动子，例如丝状真菌、细菌和病毒的感染和入侵、低温、高温、干燥、紫外线照射和特殊化合物的喷射。这样的启动子的实例包括通过丝状真菌、细菌和病毒的感染和入侵导入的几丁质基因启动子(Xuet al.1996 Plant Mol.Biol.30387)和烟草PR蛋白基因启动子(Ohshima et al.1990 Plant Cell 295)、低温所诱导的水稻“lip19”基因启动子(Aguan et al.1993 Mol.Gen Genet.2401)、高温所诱导的水稻″hsp 80″基因和″hsp 72″基因启动子(Van Breusegem et al.1994 Planta19357)、干燥所诱导的拟南芥″rab 16″基因启动子(Nundy et al.，1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871406)、紫外线照射所诱导的查耳酮合酶基因启动子(Schulze-Lefert et al.1989EMBO J.8651)和厌氧条件所诱导的玉米乙醇脱氢酶基因启动子(Walker et al.，1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846624)。此外，水稻的几丁质基因启动子和烟草的PR蛋白基因启动子也能被特定的化合物例如水杨酸所诱导，″rab 16″也能通过喷射脱落酸，一种植物激素被诱导。
此外，所述载体可以包含编码本发明的蛋白质的DNA的启动子。编码本发明的蛋白质的DNA的启动子区域可以通过例如用包含SEQID NO1或2的核苷酸序列或其一部分的DNA作为探针对基因组文库进行筛选获得。
此外，本发明提供了导入了本发明的载体的转化细胞。除了上述用于制备重组蛋白的细胞外，导入了本发明的载体的细胞包括用于制备转化植物的植物细胞。对于所述植物细胞的类型没有特殊的限制，其实例有拟南芥、水稻、玉米、马铃薯和烟草的细胞。除培养的细胞外，本发明的植物细胞包括植物中的细胞以及原生质体、shootprimordia、multiple shoots和发根(hairy root)中的细胞。可以通过已知的方法将载体导入植物细胞中，例如聚乙烯乙二醇方法、电穿孔、农杆菌介导的转移和微粒轰击。根据植物细胞的类型，可以通过已知的方法从转化的植物细胞再生植物(Toki et al.，(1995)Plant Physiol.1001503-1507)。例如，用于水稻类植物的转化和再生方法包括(1)用聚乙烯乙二醇将基因导入原生质体中并再生植物体(适于indica水稻品种)(Datta，S.K.(1995)in“Gene Transfer To Plants”，Potrykus Iand Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)用电脉冲将基因导入原生质体中并再生植物体(适于japonica水稻品种)(Toki et al.(1992)Plant Physiol.100，1503-1507)；(3)通过微粒轰击直接将基因导入细胞中并再生植物体(Christou et al.(1991)Bio/Technology，9957-962)；和(4)用农杆菌将基因导入并再生植物体(Hiei et al.(1994)Plant J.6271-282)。这些方法是现有技术中已经建立起来的方法并被广泛地应用于本发明所属的技术领域中。这样的方法可以被适当地用于本发明。
已经获得了在其基因组中含有本发明的DNA的转化植物，因而有可能通过有性繁殖或无性繁殖获得该植物的后代。也有可能从所述植物或其后代或克隆获得繁殖材料(例如种子、果实、穗、块茎、块茎状的根、残株、愈伤组织、和原生质体)以基于这样的材料大量生产所述植物。因此，本发明包括导入了本发明的DNA的植物细胞、含有这些细胞的植物、这些植物的后代或克隆以及该植物及其后代和克隆的繁殖材料。
以这种方式制备的其再生能力被修饰的植物相对于野生型植物其再生能力和产量发生变化。例如，其中导入了位于水稻肌动蛋白启动子控制下的编码PSR1蛋白的DNA的植物被期望在其再生能力上有所提高。本发明的方法的使用可以提高水稻的再生能力，这对于农作物而言是有益的。本发明还有益于高再生型水稻品种的开发。
此外，本发明提供了包含与SEQ ID NO1或2的核苷酸序列互补的至少15个连续核苷酸的多核苷酸或其互补序列。因此，术语“互补序列”是包含A:T和G:C碱基对的双链DNA的一条链的序列相对于另一条链的序列而言。术语“互补”不限制于某一序列与至少15个连续的核苷酸完全互补的情形，还包括其中核苷酸序列同一性为至少70％、优选至少80％、更优选90％、再更优选95％或更高(例如96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高)。这些DNA作为探针有益于检测或分离本发明的DNA，和用做引物扩增所述DNA。
本发明还提供了用于测在植物中是否存在再生能力的遗传诊断方法。在本发明中，“测定在植物中是否存在再生能力”不仅对于测定迄今为止所栽培的品中是否存在再生能力是有效的，而且还包括了测定在通过杂交和遗传工程技术所制备的新品种中是否存在再生能力。这些方法对于测定japonica水稻品种中是否存在再生能力由其有效。
本发明的用于评估在植物中是否存在再生能力的方法包括检测编码PSR1蛋白的DNA和PSR1蛋白的植物表达水平。例如，如果编码PSR1的DNA或PSR1蛋白的表达水平高于在Koshihikari中的表达水平，则所检测的植物被测定为是拥有再生能力的一个品种。
本发明提供了用于在植物的转化中将PSR1基因作为选择标记的方法。先前被用作转化的植物细胞的选择标记基因的实例包括提供对抗生素潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶基因、提供对卡那霉素或庆大霉素的抗性的新霉素磷酸转移酶、提供对除草剂膦丝菌素的抗性的乙酰转移酶基因和提供对双丙氨膦(bialaphos)的抗性的双丙氨膦抗性基因。当使用这些基因时，通过在一种已知的选择培养基中进行培养获得转化的植物细胞，所述选择性培养基包含一种与选择标记基因的类型匹配的选择剂。当将PSR1基因而不是这些药物抗性基因用作选择标记时，如果待转化的植物细胞不具备再生能力，如在Koshihikari中，可以使用所获得的再生能力作为选择性状对转化体进行选择，而不使用用于选择的特殊制剂。也就是说，由于非转化体不能够再生，由于PSR1基因的效应而再生的个体被假定为转化体。此外，当使用PSR1基因作为具有再生能力的植物细胞的选择标记时，可以通过向选择培养基中添加一定浓度的亚硝酸盐对具有再生能力的转化细胞进行选择，该亚硝酸盐将抑制非转化体的生长。上述被用于选择转化体的常规药物抗性基因衍生自微生物；因此，保留了这些抗性基因的经遗传修饰的农产品(GMO)已经增加了人们对于其对生态系统和人体所产生的副作用的担忧。但是，使用本发明的PSR1基因用于选择转化体的方法在减轻此类担忧和开发廉价的遗传修饰农作物方面具有优势。
本申请中所引用的所有现有技术文献通过引用合并到本发明中。
图1是表示Koshihikari和Kasalath的基因型的一组照片。左侧的照片表示Koshihikari，右侧的照片表示Kasalath。该图将Koshihikari和Kasalath的再生能力用每克愈伤组织的再生个体数表示。
图2表示染色体上的再生能力QTL的位置。
图3表示再生能力QTL的高精度连锁图谱。
图4是表示互补测验结果的一组照片。左侧的照片表示当载体被单独插入Koshihikari中时的结果，右侧照片表示当Kasalat的3F片段被插入到Koshihikari中时发生的再生。
图5表示与Koshihikari NiR基因组序列相比Kasalath NiR基因组的突变位点。示意图中的阿拉伯数字表示插入或缺失的核苷酸数目。黑框表示编码区。垂直线表示取代位点。加外框部分表示在Koshihikari(顶部)和Kasalath(底部)中的NiR基因序列的比较。框内围住的部分表示Koshihikari和Kasalath间的不同氨基酸。粗斜体所示区域表示叶绿体转运肽结构域，虚线下划线所示区域表示铁氧还蛋白结合域，下划线部分表示4Fe-4S簇。
图6是一组照片和比较Koshihikari和Kasalath的愈伤组织中的NiR基因和NiR蛋白的表达水平的图。在左侧照片中，顶部的一行表示由半定量RT-PCR所检测到的NiR基因，中间一行表示用做表达对照组并由定量RT-PCR所检测到的水稻遍在蛋白1基因(Rubq1)，底部一行表示使用NiR蛋白抗体进行的Western印迹杂交所检测到的NiR蛋白。右侧图表示将Rubq1基因的表达水平用做内标通过实时定量RT-PCR测量NiR基因的表达水平的结果。RT-PCR引物位点示于图5中。
图7是比较Koshihikari和Kasalath NiR重组蛋白的酶活性的图。
图8是一张示意图和一组表示用于确认NiR基因作为选择标记的效力的试验结果的照片。该示意图表示用于转化的二元载体的T-DNA区域。照片表示当每一载体被导入Koshihikari中时的再生状态。表格表示再生个体中GUS-染色个体的比例。
图9是显示当由于肌动蛋白启动子而过表达NiR基因的载体被导入Kasalath中时，选择愈伤组织的结果的照片。顶部的照片表示愈伤组织选择的结果。由于亚硝酸盐被添加到培养基中，转化体“a”由于过表达的NiR基因效应而生长，而非转化体“b”的愈伤组织生长被抑制。底部的照片表示愈伤组织“a”和“b”的GUS染色结果。
具体实施例方式
本发明将用以下实施例进行详细描述，但其不应被理解为对本发明的限制。
实施例1测验材料的选择和近-同源品系的制备在培育用于QTL分析的杂种群体之前，选择用做群体亲本的品种。首先研究了水稻的几个品种和印度水稻的几个品种的平均再生能力，并选择了在再生能力上具有显著差别的两个品种日本水稻“Koshihikari”和印度水稻“Kasalath”(图1)。将日本品种“Koshihikari”和印度品种“Kasalath”杂交制备F1个体。然后用Koshihikari作为回归亲本对这些个体进行回交，并进行自体受精。生成BC1F1群体后，收集BC1F2种子。用来自每一品系的20粒BC1F2种子在诱导培养基中培养愈伤组织30天，然后将生长的愈伤组织转移至再生培养基中。转移30天之后，测量每粒种子的愈伤组织重量和苗数，用每一品系的20粒种子测定平均值。该平均值被当作再生能力(图1)。采用262个PCR标记测定出每一品系的基因型。
当基于这些数据进行关于再生能力的QTL分析时，检出了4个具有再生能力增加效应的QTL(图2)。在其中一个QTL中，靠近1号染色体的短臂上的TGS2451标记(PSR1；苗再生启动子1)处，成功地发现Kasalath基因组在Koshihikari的再生能力上具有很大的增加效应。用重复回交和MAS制备了一个PSR1近-同源品系(Nil-PSR1用靠近Kasalath染色体1的TGS2451标记的一个区域对Koshihikari染色体进行了取代的一个品系)。对Nil-PSR1和Koshihikari(对照)的再生能力进行调查，确认了QTL(PSR1)的存在。在其中靠近染色体1的短臂上的TGS2451的一个区域被Kasalath的相应区域取代的一个品系中，其再生能力平均增加了14.7倍。
实施例2 使用PSR1的隔离群体进行高精度连锁分析从BC2F1群体中选择出30个其PSR1区域已被Kasalath的相应区域取代的个体。使用每种种子(BC2F2种子)的10粒种子，并从愈伤组织提取DNA。使用分子标记阐明基因型，并通过调查再生能力进行连锁分析。此外，为了对具体基因座进行详细说明，约3,800粒其中PSR1被分离的BC3F2种子被用于使用分子标记调查基因型，并进行高精度连锁分析。结果，发现PSR1定位于分子标记3132和P182间的约50.8kb区域(图3)。在这一区域的基因预测表明存在4个基因，包括一假定的蛋白质。为了测定这些基因中的那些是再生能力型基因，构建Kasalath BAC文库(平均长度120kb)，通过PCR筛选将一包含PSR1区域(BHAL15)的BAC克隆分离出来。BHAL15克隆中合适的限制性酶切位点被用于制备含有各后选基因区域的Kasalath基因组片段，并将它们导入Koshihikari中。结果发现仅当导入了包含被认为编码了铁氧还蛋白亚硝酸还原酶(NiR)的基因的Kasalath基因组片段(图3中的3F)时，Koshihikari的再生能力才提高(图4)。测定了被认为编码了铁氧还蛋白亚硝酸还原酶的遗传区域及其约2kb的上游区的核苷酸序列并与Kasalath和Koshihikari进行比较，在该核苷酸序列内发现了许多的突变(图5)。
实施例3 提高不可栽培品种的培养特性Kasalath的PSR1基因区域(或使用基因组序列或使用cDNA序列)被导入Koshihikari中以赋予Koshihikari以再生能力，生成高再生性Koshihikari(图4、8和9)。在这种情形中，PSR启动子和一种组成型启动子例如肌动蛋白启动子作为用于表达PSR1基因的启动子是有效的。
实施例4 PSR1基因和PSR1蛋白的表达分析当通过半定量RT-PCR和实时定量PCR测定愈伤组织中的NiRmRNA表达水平时，Kasalath中的mRNA的量约为Koshihikari中的2.5倍(图6中左侧照片的顶部和中部的行及右图)。使用特异于NiR蛋白的抗体进行的Western印迹分析也表明NiR蛋白在Kasalath中的储存量较Koshihikari中的储存量更大(图6中左侧照片的底部一行)。此外，用萘基乙二胺方法和其表达由大肠杆菌所诱导的NiR重组蛋白比较每单位蛋白的NiR酶活性，Kasalath NiR蛋白显示出比Koshihikari的NiR蛋白的酶活性高约1.6倍(图7)。上述结果表明Koshihikari和Kasalath间在再生能力上的差异主要是由于在NiR基因的转录调节水平上的差异，其次是由于每分子合成蛋白在活性上的差异。
实施例5 使用再生能力作为选择性状进行转化将Kasalath PSR1基因导入Koshihikari中能够赋予不能再生的Koshihikari以再生能力。这表明当对Koshihikari进行转化时，KasalathPSR1基因可以被用做一个选择标记。更特别地，当串联插入了Kasalath PSR1基因和一靶基因的载体被导入Koshihikari中时，仅那些导入了PSR1基因的细胞将获得再生能力。因此，再生的植物体应该已经同时掺入了靶基因。为了证明这一观点，构建了携带KasalathNiR基因组+35S启动子GUS、Kasalath NiR启动子∷NiR cDNA∷NiR终止子+35S启动子GUS、水稻Actin1启动子∷NiR cDNA∷NiR终止子+位于pBI101二元载体中的T-DNA区域中的35S启动子GUS的载体和不携带NiR基因的载体，并将它们导入Koshihikari中。结果，当导入3种类型的包含NiR基因的载体时，获得了大量的再生个体，且在这些再生个体自其衍生的愈伤组织中观察到由于GUS基因所产生的着色(图8)。
此外，NiR基因具有代谢对植物有毒性的亚硝酸的特性，应用这一特性也使得NiR基因能被用作高再生性品种的转化标记。更特别地，位于肌动蛋白启动子(该启动子是水稻中的一个高表达启动子)控制下的过表达NiR基因的载体被导入到一个高再生性的Kasalath品种中，并在添加有亚硝酸的培养基中进行培养，所添加的亚硝酸的浓度能抑制普通野生型的生长。只有被转化的细胞由于过表达的NiR基因的效应而生长，且GUS染色仅在这些生长的细胞中被观测到(图9)。这一选择方法的使用相对于其中使用衍生自微生物的抗生素抗性基因作为选择标记的传统方法抗生素的费用减低。此外，该方法使得可以生产更加环保的重组植物，因为该再生植物不含有微生物基因。
工业实用性近来，应用转化方法开发有用的植物和对基因进行功能分析进展迅速。由于转化方法允许超越生理种类的界限使用基因从而可以制备新的植物，这在基于杂交和选择的传统育种中是不可能实现的。此外，由于基因组序列被接连阐明，转化方法也正被用于基因破裂、表达调节分析等以阐明每一基因的功能。通常，当制备植物转化体时，将同时包含待导入的基因和药物抗性标记基因例如抗生素抗性基因的质粒载体通过农杆菌方法或通过电穿孔导入植物细胞中，并通过药物处理选择出转化细胞。选择出来的转化细胞经过细胞生长再生为植物体。因此，为了应用这样的转化方法，必须建立组织培养技术。组织培养技术不仅在转化方法中尤其有用，而且在使用体细胞克隆变异制备突变体、使用细胞融合或胚珠培育栽培品种、遗传特性的固定、缩短育种年限等方面也尤其有用。
培育技术使用得最多的谷物是水稻，但是在品种间存在的在培育特性上的巨大差异被认为是一个问题。特别地，很难在日本培育主要的品种例如Koshihikari和Akitakomachi，以及许多在热带地区栽培的印度品种，因此这些品种不能被用做组织培养的材料。在品种之间在培育特性上的这些差异是在众多的植物中普遍观察到的现象而并非仅限于水稻，但在阐明其原因方面还没有进展。
本申请的发明人分离了与再生能力有关的基因，使得可以通过使用分子标记对高再生性性状进行有效的选择(标记选择育种)，并使得可以应用分子生物学方法提高再生能力(分子育种)。此外，将PSR1基因用做选择标记已经使得生产廉价且兼顾环境的植物转化体成为可能。
谷物例如水稻、玉米、小麦和大麦是人类的主要能量来源，也是对人类最重要的植物。这些谷物都属于Poaceae家族，且可能是从一个共同的祖先进化而来。它们相互间具有高度的遗传同源性(基因组同线性)。在这些谷物中，水稻的基因组最小，这也就是为什么水稻被用做谷物的模型植物的原因。水稻基因存在于水稻的亲缘植物例如小麦和玉米的基因组中，分离自水稻的基因可以容易地分离自小麦和玉米。此外，水稻基因可以被直接用于小麦、玉米等的培育。因此，本发明的基因不仅可以应用于水稻还可应用于多种植物品种。
序列表<110>本田技研工业株式会社<120>赋予植物再生能力的基因及其应用<130>H3-A0301P<150>US 60/491837<151>2003-07-31<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12161<212>DNA<213>Oryza sativa<220>
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260 265 270gag cac cca cac atc aac gac ctc gcg tac atg ccg gcg gtg aag ggc 10805Glu His Pro His Ile Asn Asp Leu Ala Tyr Met Pro Ala Val Lys Gly275 280 285ggc aag ttc ggg ttc aac ctc ctc gtc ggc ggg ttc ata agc ccc aag 10853Gly Lys Phe Gly Phe Asn Leu Leu Val Gly Gly Phe Ile Ser Pro Lys290 295 300agg tgg gag gag gcg ctg ccg ctc gac gcc tgg gtc ccc ggc gac gac 10901Arg Trp Glu Glu Ala Leu Pro Leu Asp Ala Trp Val Pro Gly Asp Asp305 310 315atc atc ccg gtg tgc aag gcc gtt ctc gag gcg tac cgc gac ctc ggc 10949Ile Ile Pro Val Cys Lys Ala Val Leu Glu Ala Tyr Arg Asp Leu Gly320 325 330acc agg ggc aac cgc cag aag acc cgc atg atg tgg ctc atc gac gaa 10997Thr Arg Gly Asn Arg Gln Lys Thr Arg Met Met Trp Leu Ile Asp Glu335 340 345 350ctt gtgaaccatt tttttctcca ttcatccacg ccattgactg aattacgtat 11050Leugtcccaatgt tcttatcagt taattgcggt gttggcattg cag gga atg gag gct 11105Gly Met Glu Ala355ttt cgg tcg gag gtg gag aag agg atg ccg aac ggc gtg ctg gag cgc 11153Phe Arg Ser Glu Val Glu Lys Arg Met Pro Asn Gly Val Leu Glu Arg360 365 370gcg gcg ccg gag gac ctc atc gac aag aaa tgg cag agg agg gac tac 11201Ala Ala Pro Glu Asp Leu Ile Asp Lys Lys Trp Gln Arg Arg Asp Tyr375 380 385ctc ggc gtg cac ccg cag aag cag gaa ggg atg tcc tac gtc ggc ctg 11249Leu Gly Val His Pro Gln Lys Gln Glu Gly Met Ser Tyr Val Gly Leu390 395 400cac gtg ccc gtc ggc cgg gtg cag gcg gcg gac atg ttc gag ctc gca 11297His Val Pro Val Gly Arg Val Gln Ala Ala Asp Met Phe Glu Leu Ala405 410 415cgc ctc gcc gac gag tac ggc tcc ggc gag ctc cgc ctc acc gtg gag 11345Arg Leu Ala Asp Glu Tyr Gly Ser Gly Glu Leu Arg Leu Thr Val Glu420 425 430 435cag aac atc gtg atc ccg aac gtc aag aac gag aag gtg gag gcg ctg 11393Gln Asn Ile Val Ile Pro Asn Val Lys Asn Glu Lys Val Glu Ala Leu440 445 450ctc tcc gag ccg ctg ctt cag aag ttc tcc ccg cag ccg tcg ctg ctg 11441Leu Ser Glu Pro Leu Leu Gln Lys Phe Ser Pro Gln Pro Ser Leu Leu455 460 465
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<221>CDS<222>(519)..(2309)<223>
<400>5
tatcgaacct tatctccttc tctctcgtcg ctttctgcgt ctccccgtct ctccttcgcc 60aacagccgag aagaggcaga gagagcgccg ccccccgtcc ctctctctcc ctctcgtcct120cgcccccatc cctctcgtct ttcccttgcc ggcagcagag gaggcggcag cgacggcttc180agctgctccc acgggccgga tcgggcagtg gcggtggcgt cggcggcttc cgctggcgaa240tccggcgggt ggatacaaat cagtgttccg ataggtaaaa ccctgctctc agcatctgcc300cttttgaatt cgccaagagc cagcatctgc ccttttgaat tcgccaaggg ccagcatctg360cccatttgat tttgaattcg ccaagagcca gcaacagcgc ccccgcgccc cctccctcct420ccgcaataaa cagccacacg cgccgccccc atgtccaccc tcatcgccac agcgcaccac480caccaccacc accaccacca ccaccaccgt ctccagcc atg gcc tcc tcc gcc tcc536Met Ala Ser Ser Ala Ser1 5ctg cag cgc ttc ctc ccc ccg tac ccc cac gcg gca gca tcc cgc tgc 584Leu Gln Arg Phe Leu Pro Pro Tyr Pro His Ala Ala Ala Ser Arg Cys10 15 20cgc cct ccc ggc gtc cgc gcc cgc ccc gtg cag tcg tcg acg gtg tcc 632Arg Pro Pro Gly Val Arg Ala Arg Pro Val Gln Ser Ser Thr Val Ser25 30 35gca ccg tcc tcc tcg act ccg gcg gcg gac gag gcc gtg tcg gcg gag 680Ala Pro Ser Ser Ser Thr Pro Ala Ala Asp Glu Ala Val Ser Ala Glu40 45 50cgg ctg gag ccg cgg gtg gag cag cgg gag ggc cgg tac tgg gtg ctc 728Arg Leu Glu Pro Arg Val Glu Gln Arg Glu Gly Arg Tyr Trp Val Leu55 60 65 70aag gag aag tac cgg acg ggg ctg aac ccg cag gag aag gtg aag ctg 776Lys Glu Lys Tyr Arg Thr Gly Leu Asn Pro Gln Glu Lys Val Lys Leu75 80 85ggg aag gag ccc atg tca ttg ttc atg gag ggc ggc atc aag gag ctc 824Gly Lys Glu Pro Met Ser Leu Phe Met Glu Gly Gly Ile Lys Glu Leu90 95 100gcc aag atg ccc atg gag gag atc gag gcc gac aag ctc tcc aag gag 872Ala Lys Met Pro Met Glu Glu Ile Glu Ala Asp Lys Leu Ser Lys Glu105 110 115gac atc gac gtg cgg ctc aag tgg ctc ggc ctc ttc cac cgc cgc aag 920Asp Ile Asp Val Arg Leu Lys Trp Leu Gly Leu Phe His Arg Arg Lys120 125 130cat cag tat ggg cgg ttc atg atg cgg ctg aag ctg cca aac ggt gtg 968His Gln Tyr Gly Arg Phe Met Met Arg Leu Lys Leu Pro Asn Gly Val135 140 145 150acg acg agc gag cag acg agg tac ctg gcg agc gtg atc gag gcg tac 1016Thr Thr Ser Glu Gln Thr Arg Tyr Leu Ala Ser Val Ile Glu Ala Tyr
155 160 165ggc aag gag ggc tgc gcc gac gtg aca acc cgc cag aac tgg cag atc 1064Gly Lys Glu Gly Cys Ala Asp Val Thr Thr Arg Gln Asn Trp Gln Ile170 175 180cgc ggc gtc acg ctc ccc gac gtg ccg gcc atc ctc gac ggg ctc aac 1112Arg Gly Val Thr Leu Pro Asp Val Pro Ala Ile Leu Asp Gly Leu Asn185 190 195gcc gtc ggc ctc acc agc ctc cag agc ggc atg gac aac gtc cgc aac 1160Ala Val Gly Leu Thr Ser Leu Gln Ser Gly Met Asp Asn Val Arg Asn200 205 210ccc gtc ggc aac ccg ctc gcc ggc atc gac ccc gac gag atc gtc gac 1208Pro Val Gly Asn Pro Leu Ala Gly Ile Asp Pro Asp Glu Ile Val Asp215 220 225 230acg cga tcc tac acc aac ctc ctc tcc tcc tac atc acc agc aac ttc 1256Thr Arg Ser Tyr Thr Asn Leu Leu Ser Ser Tyr Ile Thr Ser Asn Phe235 240 245cag ggc aac ccc acc atc acc aac ctg ccg agg aag tgg aac gtg tgc 1304Gln Gly Asn Pro Thr Ile Thr Asn Leu Pro Arg Lys Trp Asn Val Cys250 255 260gtg atc ggg tcg cac gat ctg tac gag cac cca cac atc aac gac ctc 1352Val Ile Gly Ser His Asp Leu Tyr Glu His Pro His Ile Asn Asp Leu265 270 275gcg tac atg ccg gcg gtg aag ggc ggc aag ttc ggg ttc aac ctc ctc 1400Ala Tyr Met Pro Ala Val Lys Gly Gly Lys Phe Gly Phe Asn Leu Leu280 285 290gtc ggc ggg ttc ata agc ccc aag agg tgg gag gag gcg ctg ccg ctc 1448Val Gly Gly Phe Ile Ser Pro Lys Arg Trp Glu Glu Ala Leu Pro Leu295 300 305 310gac gcc tgg gtc ccc ggc gac gac atc atc ccg gtg tgc aag gcc gtt 1496Asp Ala Trp Val Pro Gly Asp Asp Ile Ile Pro Val Cys Lys Ala Val315 320 325ctc gag gcg tac cgc gac ctc ggc acc agg ggc aac cgc cag aag acc 1544Leu Glu Ala Tyr Arg Asp Leu Gly Thr Arg Gly Asn Arg Gln Lys Thr330 335 340cgc atg atg tgg ctc atc gac gaa ctt gga atg gag gct ttt cgg tcg 1592Arg Met Met Trp Leu Ile Asp Glu Leu Gly Met Glu Ala Phe Arg Ser345 350 355gag gtg gag aag agg atg ccg aac ggc gtg ctg gag cgc gcg gcg ccg 1640Glu Val Glu Lys Arg Met Pro Asn Gly Val Leu Glu Arg Ala Ala Pro360 365 370gag gac ctc atc gac aag aaa tgg cag agg agg gac tac ctc ggc gtg 1688Glu Asp Leu Ile Asp Lys Lys Trp Gln Arg Arg Asp Tyr Leu Gly Val375 380 385 390
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Ala Asp Ile Leu Val Glu Arg Phe Gly Ala Val Arg Arg Glu Arg Glu580 585 590Glu Asp Glu Glu59权利要求
1.一种与植物再生能力有关的DNA，所述DNA是以下(a)-(d)中的任一种(a)编码包含SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白质的DNA；(b)包含SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的编码区的DNA；(c)编码包含在SEQ ID NO3的氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸取代、缺失、添加和/或插入的氨基酸序列的蛋白质的DNA；和(d)在严格条件下与包含SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。
2.编码包含SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白质的部分肽的DNA。
3.包含SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的启动子区域的DNA。
4.包含权利要求1或2的DNA的载体。
5.包含权利要求3的DNA的载体。
6.携带权利要求4的载体的宿主细胞。
7.携带权利要求4的载体的植物细胞。
8.包含权利要求7的植物细胞的植物转化体。
9.一种植物转化体，其是权利要求8的植物转化体的后代或克隆。
10.权利要求8或9的植物转化体的繁殖材料。
11.一种用于制备植物转化体的方法，该方法包括将权利要求1或2的DNA导入植物细胞和从所述植物细胞再生植物的步骤。
12.由权利要求1或2的DNA所编码的蛋白质。
13.一种用于制备权利要求12的蛋白质的方法，该方法包括培养权利要求6的宿主细胞并从所述细胞或其培养物上清中收集重组蛋白质的步骤。
14.与权利要求12的蛋白质结合的抗体。
15.包含与SEQ ID NO1或2的核苷酸序列互补的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，或与其互补的序列。
16.一种用于提高植物的再生能力的方法，该方法包括在植物的细胞中表达权利要求1或2的DNA的步骤。
17.一种用于改变植物的再生能力的制剂，该制剂包含权利要求1或2的DNA或权利要求4的载体作为活性成分。
18.一种用于测定植物细胞的再生能力的方法，该方法包括检测权利要求1的DNA或权利要求12的蛋白质在植物细胞中的表达的步骤。
19.一种用于测定植物细胞的再生能力的方法，该方法包括检测权利要求12的蛋白质在植物细胞中的活性的步骤。
20.一种用于提高植物的再生能力的方法，该方法包括调节该植物中的内源性的权利要求12的蛋白质的活性的步骤。
21.一种用于选择转化的植物细胞的方法，该方法包括以下步骤(a)将包含用作选择标记的权利要求1或2的DNA的载体导入植物细胞中；和(b)培养所述植物细胞并选择已经获得再生能力的植物细胞。
22.一种用于改变植物的再生能力的方法，该方法包括通过杂交取代植物中的内源性的权利要求1或2的DNA的步骤。
全文摘要
本发明应用连锁分析成功地分离并鉴定到与植物的再生能力有关的基因。此外，本发明还公开了用于培育高再生性品种的方法、用于转化不可栽培品种的方法和用于选择转化细胞的方法，这些方法都应用了这些基因。本发明在例如栽培品种改良和使用转化方法的基因分析等领域中是有用的。
文档编号C12N9/06GK1842592SQ200480022218
公开日2006年10月4日 申请日期2004年7月30日 优先权日2003年7月31日
发明者西村明日香, 松冈信, 芦苅基行 申请人:本田技研工业株式会社, 国立大学法人名古屋大学