用于分离小rna分子的方法和组合物的制作方法

专利名称：用于分离小rna分子的方法和组合物的制作方法
背景技术：
本申请要求2003年7月25日提交的美国临时申请序列号60/490,325的优先权和2003年9月19日提交的美国专利申请序列号10/667,126的优先权，所述申请被整体纳入本文作为参考。
1.发明领域本发明一般涉及分子生物学和生物技术领域。更具体说，与较大RNA或DNA分子相反，它涉及用于分离一般为100个核苷酸或更小的小RNA分子，如siRNA和miRNA的方法和组合物。分离的小RNA分子可用于后续研究或测定。
2.相关技术领域描述现在，来自许多生物各种组织以及培养细胞的小RNA-100个核苷酸级别或更小的RNA分子-是极其引人关注的领域，并且在未来很有前途。这些小RNA包括微小RNA分子(miRNA)和小干扰RNA分子(siRNA)，由于与其靶mRNA杂交，这两种分子都能有效影响基因表达。此外，可将这些步骤应用于在mRNA和rRNA加工过程中分离核内小RNA和核仁小RNA(snRNA和snoRNA)。也可采用这些步骤分离tRNA与5S和5.8S rRNA，它们都参与蛋白质翻译。
这些研究的关键是需要高效分离大小为15-100个核苷酸的RNA分子。因此，能够完成此工作的简单直接的方法很有价值。
从天然来源(组织样品、整个生物体、细胞培养物、体液)制备RNA需要去除所有其它生物分子。一旦去除了水分，细胞的主要成分通常是蛋白质，蛋白质通常占质量的四分之三。在其它主要生物分子中，脂类、碳水化合物、这些物质的互相结和蛋白，DNA是其它主要成分。抽提RNA的目的之一是去除蛋白质和DNA，因为这些物质在RNA应用中干扰最大。在去污剂的帮助下脂类和碳水化合物部分通常可以溶解。可以通过去污剂和变性剂的帮助从RNA(和DNA)上剥离掉蛋白质，但仍须从共同溶液中去除。
历史上，采用两种主要方法完成这个过程。第一种方法是用不可与水溶混的有机溶剂溶解(精确地说是化学抽提)或沉淀蛋白质，然后在去除前可通过离心分离无蛋白水相。通常，将酚和酚氯仿混合物用于此目的。第二种方法将RNA选择性固定在固体表面上，漂洗掉蛋白，然后用一定条件释放水溶液中的RNA。这称为固相抽提。两种方法均可降低DNA污染或残留，其效率随所用的精确条件而变化。
酚和酚氯仿抽提提供了核酸的极度无蛋白无脂质溶液。在该步骤中丢失了如果不是全部，也是许多(取决于样品)碳水化合物。已知酸酚氯仿能将一些DNA从水溶液中抽提出来(Chomczynski和Sacchi，1987)。然而，这种溶液含有大量变性剂，如盐酸胍、硫氰酸胍或脲，这些物质都与下游酶分析不相容，前两个也与电泳分析不相容。通常通过用乙醇或异丙醇进行选择性沉淀从这些混合物中分离RNA。该步骤对小核酸分子不怎么有效，所以对小RNA的制备而言，此步骤不理想。
固相抽提依赖于高盐或盐和醇，以降低RNA与水的亲和力并提高RNA与所用固体支持物的亲和力。采用玻璃(二氧化硅)作为固体支持物，在高浓度变性盐(美国专利5,155,018；5,990,302；6,043,354；6,110,363；5,234,809；Boom等，1990)或较低浓度的变性盐加乙醇(美国专利6,180,778)的存在下能够对大RNA起作用。然而，RNA与玻璃纤维结合的正常条件对微小RNA不起作用，而且由于不同组织的不同要求，采用粗裂解物是有问题的。
已知的许多操作规程包括分离DNA或较大mRNA，这对分离小RNA分子不甚理想，因为它们经常不能被有效捕获和洗脱。因此，需要改进技术以有效分离、检测和准确定量这些最近发现的小RNA分子。
发明概述本发明涉及从样品(包括细胞样品)中分离、抽提、纯化、表征(characterizing)、定量和/或测定小RNA分子方法和组合物。这种组合物和方法能够处理小RNA分子，在采用通常用于分离较大RNA分子的方法时这些小RNA分子常常丢失或耗竭。
因此，认为本发明涉及小RNA分子，在大多数实施方式中它们被理解为约100个核苷酸或更小的RNA分子。小RNA分子包括siRNA和miRNA分子。在本发明的一些实施方式中，小RNA分子最多有100个核苷酸或更少，最多有70个核苷酸或更少，或最多有30个核苷酸或更少，或最多有25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15个核苷酸或更少。
在一些情况下，小RNA分子是双链的。在一些情况下，小RNA分子是单链的，但它们可含有自互补区域。可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多这种区域，这些区域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多碱基对(因此碱基数是两倍)。而且，这些互补区域可以是100％互补或包含一些错配，如这些区域中碱基同一性至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或这些区域中可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的碱基错配。
具体认为，本发明方法和组合物可用于分离最长有100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、10或更少个核苷酸的小RNA分子，和从这些整数中可以引出的所有范围。而且，可分离这些分子，使样品富含存在量的小RNA分子。
本

发明内容
中列出了几种富集和/或纯化小RNA的方法。小RNA分子在样品中存在量的任何提高都在本发明范围之内。
可根据相对于总RNA质量的小RNA质量测定小RNA的富集和/或纯化。例如，通过比较将裂解物置于固体支持物之前和把RNA从固体支持物上洗脱之后，相对于总RNA分子质量的小RNA分子的质量，可使样品中的小RNA分子富集约或至少约1x、1.5x、2x、2.5x、3x、3.25x、3.5x、3.75x、4x、4.25x、4.5x、4.75x、5x、5.25x、5.5x、5.75x、6x、6.25x、6.5x、6.75x、7x、7.25x、7.5x、7.75x、8x、8.25x、8.5x、8.75x、9x、9.5x、10x、15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、55x、60x、65x、70x、75x、80x、85x、90x、95x、100x、110x、120x、130x、140x、150x、160x、170x、180x、190x、200x、210x、220x、230x、240x、250x、260x、270x、280x、290x、300x、325x、350x、375x、400x、425x、450x、475x、500x、525x、550x、575x、600x、625x、650x、675x、700x、725x、750x、775x、800x、825x、850x、875x、900x、925x、950x、975x、1000x、1100x、1200x、1300x、1400x、1500x、1600x、1700x、1800x、1900x、2000x(倍)和从其中可引出的所有范围。
可根据相对于总RNA分子数的小RNA分子数测定富集和/或(纯化)。可分离小RNA分子，从而，通过比较将裂解物置于固体支持物之前和把RNA从固体支持物上洗脱之后，相对于RNA分子总数的小RNA分子数，可使样品中小RNA分子的数目富集约或至少约2x、3x、4x、5x、10x、15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x。50x。55x、60x、65x、70x、75x、80x、85x、90x、95x、100x、110x、120x、130x、140x、150x、160x、170x、180x、190x、200x、210x、220x、230x、240x、250x、260x、270x、280x、290x、300x、325x、350x、375x、400x、425x、450x、475x、500x、525x、550x、575x、600x、625x、650x、675x、700x、725x、750x、775x、800x、825x、850x、875x、900x、925x、950x、975x、1000x、1100x、1200x、1300x、1400x、1500x、1600x、1700x、1800x、1900x、2000x(倍)和从其中可引出的所有范围。
也可根据小RNA分子相对于总RNA分子的增加来测定小RNA的富集和/或纯化。可分离小RNA分子，使小RNA分子的量相对于分离前和分离后样品中RNA的总量增加约或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。
或者，在一些实施方式中，可根据将RNA从固体支持物上洗脱后出现在样品中的大RNA分子消失来定量小RNA分子的富集和/或纯化。可富集小RNA分子，使从固体支持物上洗脱RNA后留在样品中的质量大于200个核苷酸的RNA分子的数量约不超过从固体支持物上洗脱的RNA的30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0％或其中的任何范围。
在一些实施方式中，实施该方法后，约或至少约分离了样品中10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的小RNA分子。
本发明方法包括从细胞中有效分离小RNA分子的方法，该方法包括a)用裂解液裂解细胞产生裂解物；b)向裂解物中加入醇溶液；c)将裂解物施加于固体支持物上；和d)从固体支持物上洗脱小RNA分子。
因为可有效分离了小RNA分子，本发明方法包括以下步骤e)使用或表征小RNA分子。使用或表征小RNA分子与在包括从样品中分离的其它类型的分子，如较长RNA分子或DNA分子的反应或测定中丢弃小RNA分子或认为它们是副产物或污染物是有区别的。
可用于分离小RNA分子的样品包括含有这种分子的任何样品。该样品可以是或包含细胞、组织、器官或其它生物样品。或者，该样品可以是反应混合物，如能通过酶学、合成和/或重组方法生产、产生或建立小RNA分子的混合物。
在一些实施方式中，本发明方法包括裂解含有细胞的样品。当细胞被裂解或其完整性被破坏时产生“裂解物”。在本发明的具体实施方式
中，采用裂解液裂解细胞样品，和该溶液包括离液剂或去污剂。“离液剂”指打开有序的大分子，从而使它们失去功能(因此使结合蛋白释放其靶)的物质。“去污剂”指可通过乳化作用将疏水物质(通常是脂质)分散于水的物质。离液剂在本发明溶液，具体是裂解液中的浓度约为、至多约为或至少约为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5M或更高，和其中的范围。在具体实施方式
中，胍盐(guanidinium)在裂解液中的浓度约在2.0M和4.0M之间。在一些实施方式中，离液剂是盐酸胍或异氰酸胍。在又一实施方式中，裂解液也含有去污剂和/或缓冲液。在一些实施方式中，去污剂的浓度在0.1％-约2％之间。去污剂，尤其是非变性型温和去污剂可起到溶解样品的作用。去污剂可以是离子型或非离子型。尤其认为离子型去污剂N-月桂酰肌氨酸可用于本发明溶液。去污剂在缓冲液中的浓度可以约为、至少约为、或至多约为0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％或其中任何范围。认为去垢剂的浓度可以高达保持去污剂在溶液中可溶的量。
在本发明其它实施方式中，本发明溶液包括裂解液中含有缓冲液。在具体实施方式
中，缓冲液在溶液或样品溶液中的浓度约为、至少约为或至多约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、270、275、280、285、290、295、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500mM或其中任何范围。在某些情况下，缓冲液在裂解液中的浓度约在10mM和300mM之间。而且，在其他实施方式中，缓冲液是TrisCl，但认为也可采用其它缓冲液。
在本发明实施方式中，将醇溶液加入裂解物，或与其混合或一起孵育。认为醇溶液至少含有一种醇。醇溶液可至少为、至少约为、或至多约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％的醇，或其中任何范围。在某些实施方式中，将其加入裂解物，使裂解物中的醇浓度约为、至少约为或至多约为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90％，或其中任何范围。在具体实施方式
中，加入裂解物的醇量使裂解物的醇浓度约为35％-70％，或约为50％-60％。在具体实施方式
中，加入裂解物的醇溶液量使裂解物的醇浓度为55％。醇包括但不限于乙醇、丙醇、异丙醇和甲醇。尤其认为，乙醇可用于本发明的诸方面。还认为，可在本发明方法的附加步骤中使用醇溶液沉淀RNA。
认为任何溶液、或任何溶液的缓冲液成分或任何样品溶液的pH约为4.5-10.5，但它可约为、至少约为或至多约为4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5或其中任何范围。
本发明其它方法也包括用含有非醇有机溶剂的抽提溶液从裂解物中抽提小RNA分子，然后将裂解物施加于固体支持物上。在具体实施方式
中，抽提溶液含有非醇有机溶剂如酚和/或氯仿。应理解非醇有机溶剂溶液含有至少一种非醇有机溶剂，但它也可含有醇。上述关于醇溶液的浓度可应用于具有非醇有机溶剂的溶液的浓度。在具体实施方式
中，将等量的1)裂解物和2)酚和/或氯仿混合。在具体实施方式
中，将醇溶液加入裂解物，然后用非醇有机溶剂抽提。
在其他实施方式中，在把裂解物施加于固体支持物之前，除醇以外，还将盐加入裂解物。该盐可以是任何盐，但是在某些实施方式中，该盐是胍盐或钠盐，或其组合。加入裂解物混合物的盐量(在加入醇之前)可以使一种或多种盐在该混合物中的浓度约为、至少约为或至多约为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5M或更高，或其中任何范围。在某些实施方式中，将胍盐加入裂解物中，使胍盐的浓度约为0.5-3M。结果是，在匀浆后加入裂解物的胍盐量使胍盐的浓度约为、至少约为或至多约为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0M，或由其衍生的任何范围。在其他实施方式中，在匀浆后也将钠盐，如醋酸钠或氯化钠加入裂解物，使该盐的浓度约为、至少约为或至多约为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5M或由其衍生的任何范围。
从裂解物中抽提RNA的方法包括使用固体支持物，如无机或聚合物支持物。“固体支持物”指含有与裂解物接触，但不与裂解物中的大分子，尤其是小RNA分子发生不可逆反应的材料的物理结构。在具体实施方式
中，固体支持物与小RNA分子结合；在其它情况下，它与小RNA分子结合，但不与样品中一种或多种其它类型的大分子结合。固体支持物的材料可包括矿物质或聚合物，此时支持物被称为“无机或聚合物支持物”。无机或聚合物支持物包括含有二氧化硅的支持物。在一些实施方式中，所述二氧化硅是玻璃。支持物包括但不限于珠、柱和滤纸。在其它实施方式中，无机或聚合物支持物是玻璃纤维滤纸或玻璃纤维柱。
或者，在一些实施方式中，无机或聚合物支持物可包括具有负电性基团的聚合物或非聚合物。在一些实施方式中，该材料是或含有聚丙烯酸、聚苯乙烯、乳胶聚丙烯腈、聚氯乙烯、甲基丙烯酸和/或甲基丙烯酸甲酯。尤其认为，这种支持物可用于本发明。
在本发明的一些方法中，将可能或可能不与醇或非醇有机溶剂溶液混合的裂解物施加于固体支持物上，从支持物上洗脱RNA。
将裂解物施加于或混合于固体支持物后，可用溶液洗涤该材料。在一些实施方式中，将裂解物施加于无机或聚合物支持物之后，用第一种洗涤溶液洗涤无机或聚合物支持物。在其它实施方式中，洗涤溶液包含离液剂或还原剂。离液剂是胍盐在某些洗涤溶液中的溶液。在本发明的一些实施方式中，洗涤溶液包括醇，在一些情况下，洗涤溶液含有醇和胍盐。还认为，本发明方法包括用洗涤溶液进行1、2、3、4、5或更多次洗涤。当进行多于一次的洗涤时，所用洗涤溶液可以相同或不同。在一些实施方式中，洗涤溶液具有相同成分但互相浓度不同。据通常理解，应丢弃经历了洗涤循环的材料分子。
在本发明其它方法中，从固体支持物上洗脱所需RNA分子。在某些实施方式中，在约60℃-100℃的温度下从固体支持物如无机或聚合物支持物上洗脱小RNA分子。认为洗脱RNA分子的温度约为或至少约为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100℃或更高，或其中任何范围。可用任何洗脱液洗脱分子。在一些实施方式中，洗脱液是离子型溶液，即该溶液包含离子。在具体实施方式
中，洗脱液包含至多10mM的盐。认为约含、至少约含或至多约含0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高mM的盐。在某些实施方式中，该盐包含作为阳离子的Li+、Na+、K+或NH4+和作为阴离子的Cl-、Br-、I-、乙二胺四乙酸根或柠檬酸根的组合。
其它方法步骤包括使小RNA分子通过GFF而仅结合较大RNA。在一些实施方式中，在第二个GFF上捕获穿过的小RNA分子，然后洗脱。在第二个GFF滤纸上未捕获的材料被丢弃，不用于本发明其它方法。
本发明具体方法涉及通过至少以下步骤从样品中分离miRNA或siRNAa)获得含有miRNA或siRNA的样品；b)将抽提溶液加入样品中；c)将醇溶液加入经抽提的样品中；d)将该样品施加于无机或聚合物支持物；和e)用离子型溶液从无机或聚合物支持物上洗脱含有siRNA或miRNA的RNA。在具体实施方式
中，该样品是细胞裂解物。在一些情况下，通过将含有离液剂或去污剂的裂解液加入含有miRNA或siRNA的细胞中产生细胞裂解物。在一些实施方式中，至少将洗脱样品中的miRNA和/或siRNA质量富集约10倍。
从样品中分离miRNA分子的其它方法包括a)将醇溶液加入样品中；b)将样品施加于矿物或聚合物固体支持物；c)用离子型溶液从支持物上洗脱miRNA分子；和d)使用或表征miRNA分子。
从样品中分离小RNA分子的其它方法包括a)用含胍盐的裂解液裂解样品中的细胞，其中，产生了胍盐浓度至少约为1M的裂解物；b)用含酚的抽提溶液从裂解物中抽提小RNA分子；c)将醇溶液加入裂解物中，形成裂解物/醇混合物，该混合物中醇浓度约为35％-70％；d)将裂解物/醇混合物施加于固体支持物上；e)用离子型溶液从固体支持物上洗脱小RNA分子；f)捕获小RNA分子；和，g)使用分离的小RNA分子。
抽提RNA后，可对单个或特定RNA分子和/或RNA分子库(以及分离RNA的整个群体)进行附加反应和/或测定。在一些情况下，这些反应和/或测定包括RNA或由该RNA产生的DNA分子的扩增。例如，可采用RT-PCR产生可表征的分子。
在一些实施方式中，可以定量或表征具体RNA分子或RNA群体。定量包括本领域技术人员已知的任何方法，如涉及一种或多种扩增反应或核酸酶保护测定的方法，如用核糖核酸酶区分与特定miRNA靶杂交的探针或未杂交探针的方法，如Ambion的mirVana miRNA检测试剂盒的具体实施方法。这些方法包括定量逆转录酶-PCR(qRT-PCR)。在一些实施方式中，对分离的RNA进行表征。从抽提的RNA中产生cDNA分子。认为其它表征和定量测定是本发明的一部分。本发明的方法和组合物允许定量和表征小RNA分子。用放射性、荧光或发光标记标记后，该小RNA分子也可用于测定；以产生用于测定的cDNA或作为测定中待检测靶的cDNA。其它测定包括采用分光光度法、电泳和测序。
本发明也涉及从样品尤其是细胞样品中分离小RNA分子(如miRNA和/或siRNA)的试剂盒。因此，试剂盒中可包括上述任何组合物以及上述任何其它组合物。在一些实施方式中，用于分离小RNA分子的试剂盒包括a)酸性酚-氯仿；b)裂解/结合缓冲液，c)小RNA匀浆添加物，d)一种或多种小RNA洗涤溶液，和e)洗脱液。
在优选实施方式中，试剂盒包括a)酸性酚-氯仿；b)含有4M GuSCN，0.1M β-巯基乙醇，0.5％N-月桂酰肌氨酸，25mM柠檬酸钠，pH 7.2的裂解/结合缓冲液；c)含有2M醋酸钠，pH 4非小RNA匀浆添加物，用PC抽提前加入0.1体积；d)含有1.6M GuSCN的70％乙醇溶液的洗涤溶液#1；e)含有80％乙醇，0.1M NaCl，4.5mMEDTA，10mM TrisHCl，pH 7.5的洗涤溶液#2/3；f)含有0.1mM EDTA，pH8的洗脱液；g)凝胶加样缓冲液II；h)收集管；和i)滤筒(filter cartrige)。
在一些实施方式中，本发明试剂盒在合适的容器中包括以下物质的一种或多种(与上述组合物一致)含有离液剂的裂解缓冲液；玻璃纤维滤器或柱；洗脱缓冲液；洗涤缓冲液；醇溶液；和RNA酶抑制剂。
可将试剂盒组分包装在含水介质中或制成冻干形式。试剂盒的容器通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、罐、注射器或其它容器，将一个组分，优选为合适等分的一个组分置入其中。当试剂盒中有多于一种组分时(可将它们包装在一起)，该试剂盒通常也包含第二个、第三个或其它附加容器，其中分别置入附加组分。然而，一个小瓶中可含有各种组分组合。本发明试剂盒一般也包括装RNA的容器，和禁止用于商业出售的任何其它试剂容器。这种容器可包括注射成模或吹模塑料容器，其中保留了所需小瓶。当以一种和/或多种溶液的形式提供试剂盒组分时，溶液是含水溶液，尤其优选无菌含水溶液。
然而，可以干燥粉末的形式提供试剂盒组分。当以干燥粉末的形式提供试剂和/或组分时，可通过加入合适溶剂而重建粉末。预计也可在另一容器中提供溶剂。该容器通常包括至少一个小管、试管、烧瓶、罐、注射器和/或其它容器，其中置入了核酸制剂，优选合适分装的核酸制剂。该试剂盒也可包含第二个容器，含有无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它稀释剂。
这种试剂盒也可包括保藏或维持RNA的组分或保护RNA不降解的组分。这种组分可以是不含RNA酶或抗RNA酶的组分。这种试剂盒通常包含适用于各个试剂或溶液的不同容器。
认为可根据本发明任何方法或组合物实施本文讨论的任何实施方式，反之亦然。而且，可采用本发明组合物和试剂盒完成本发明方法。
虽然本公开支持仅指替代项和“和/或”的定义，但是除非明确指出仅为替代项或替代项是互斥的，权利要求书中的术语“或”指“和/或”。整个本申请中，术语“约”指包括用于确定值的装置或方法的标准差的值。
根据专利法的长期规定，当词语“一个”和“一种”在权利要求书或说明书中与词语“包含”结合使用时，指一种或多种，除非特别注明。
通过下面的详细描述可以明显看出本发明的其它目的、特征和优点。然而应理解，虽然详述和具体实施例指出了本发明的具体实施方式
，但是仅以示范性方式给出，因为本领域技术人员从本详述中可以明显看出在本发明精神和范围内的各种改变和修改。
附图简要说明下述附图构成了本说明书的一部分，包括这些附图是为了进一步说明本发明的某些方面。通过与本文具体实施方式
的详述结合，参照这些附图的一幅或多幅，可以更好地理解本发明。


图1.以各种乙醇浓度从小鼠脑、心和肝中获得的粗抽提物中let-7miRNA的结合行为。将纯乙醇加入粗裂解物中，以获得所示最终乙醇浓度。
图2.以各种乙醇浓度从小鼠脑、心和肝中获得的酚-氯仿抽提物中let-7miRNA的结合行为。酚-氯仿抽提后将纯乙醇加入裂解物中(如标准方法中所述)，获得所示最终乙醇浓度。
图3.在存在2M GuSCN的各种乙醇浓度下，β-肌动蛋白、GAPDH、PPI、U2和let-7的结合行为，通过加入等体积的2X乙醇水溶液调节乙醇浓度。
图4.在存在2M GuSCN的各种乙醇浓度下，β-肌动蛋白、GAPDH、PPI、U2和let-7的结合行为，通过加入纯乙醇调节乙醇浓度。
图5.在存在3M GuSCN的各种乙醇浓度下，β-肌动蛋白、GAPDH、PPI、U2和let-7的结合行为，通过加入等体积的2X乙醇水溶液调节乙醇浓度。
图6.在存在3M GuSCN的各种乙醇浓度下，β-肌动蛋白、GAPDH、PPI、U2和let-7的结合行为，通过加入纯乙醇调节乙醇浓度。
图7.β-肌动蛋白、GAPDH、U2和let-7RNA的相对富集。
图8.U2和let-7RNA的相对富集。
图9.与标准酚-氯仿抽提和乙醇沉淀相比，当前方法的产率。
图10.采用当前方法(Ambion微小RNA分离试剂盒＝AMIK)与市售玻璃纤维系统(RNeasy)的三种小RNAlet-7(22nt)、U43(62nt)和U2(187nt)的绝对产率比较。
图11.从培养细胞中采用或不采用预抽提进行抽提的产率比较。测定了U2和let-7的产率。
图12.玻璃固定前，不同浓度的NaOOCH3在两种酚-氯仿抽提pH条件下对U2、U43和let-7的产率的影响。
示例性实施方式描述1.小RNA分子通常从动物和织物组织以及培养细胞中分离RNA的天然群体。然而，大部分这些方法都不关心长度范围小于100个核苷酸的小RNA的保留。实际上，已知采用醇的标准沉淀方法不能有效捕获小于约100个核苷酸的核酸。
很早以前就观察到，从生物样品中抽提的RNA中存在小RNA分子和游离核苷酸，认为它们反应了较大编码蛋白的RNA和功能性RNA的分解产物，包括参与翻译和RNA加工复合物的分子。在过去几年中，发现在几乎所有的真核有机体中都存在参与基因表达的调节的小RNA。1993年，Ambrose实验室发表了一篇报道，他们发现了导致线虫类秀丽新小杆线虫发育误时或异时、编码22-ntRNA的let-7基因(Lee等，1993)。基于与靶基因部分序列互补，这种小单链RNA(现在称为微小RNA或miRNA)通过抑制一组发育基因在翻译中的功能而影响其表达。发现这种小RNA保守地存在于许多进化分歧的种类，包括脊椎动物、海鞘类动物、半索动物、软体动物、环节动物和节肢动物中(Pasquinelli等，2000)。
2001年，几个小组采用全新的克隆方法从秀丽新小杆线虫(C.elegans)、果蝇(Drosophila)和人中分离和鉴定了各种“微小RNA”(miRNA)(Lagos-Quintana等，2001；Lau等，2001；Lee和Ambros，2001)。在织物和动物中鉴定了几百种miRNA。
迄今发现的miRNA长度约为21-22个核苷酸，它们由不编码蛋白的基因转录的较长前体产生。参见Carrington等(2003)的综述。前体形成在自身互补区域互相折叠回去的结构；然后，在动物中用核酸酶Dicer，或在植物中用核酸酶DCL1对它们进行加工。miRNA分子通过与其靶不精确的碱基配对中断翻译。
微小RNA不是真核细胞中发现的这种大小的唯一RNA。发现细胞中一条mRNA降解途径产生了小双链RNA(Fire等，1998；Zamore等，2000等等，综述Timmons，2002)。这种称为RNA干扰的加工采用这些通常来自大得多的双链中间分子的“小干扰RNA”(siRNA)靶向它们的降解位点。虽然该系统的天然功能未知，但是认为其涉及对感染物的反应。发现植物具有类似系统，也采用微小RNA进行转录后基因沉默(Hamilton和Baulcombe，1999；Tang等2003)。
II.短RNA分子的分离本发明方法包括一个或多个有效分离和/或富集短RNA分子的步骤。这些步骤包括或涉及裂解细胞和/或产生细胞裂解物；A.产生细胞裂解物认为本发明可用于帮助从生物样品中制备小RNA分子，用于评价和后续用途。在本发明的一些实施方式中，制备样品包括匀浆样品或从样品制备细胞裂解物。在本发明的实施方式中，用含有胍盐、去污剂、表面活性剂或其它变性剂的溶液完成细胞的匀浆或裂解。术语匀浆和裂解可互换使用。
胍盐是本领域技术人员熟知的，包括盐酸胍和异硫氰酸胍。在一些实施方式中，它们的浓度约为2-5M。此外，匀浆溶液可含有脲或其它变性剂如NaI。
在本发明的实施方式中，裂解液或匀浆溶液中包含缓冲液。在某些情况下，缓冲液是TrisCl。
可以在去污剂或表面活性剂型的存在下匀浆或分馏生物样品。去污剂可以起到使样品溶解的作用。去污剂可以是离子型或非离子型的。非离子型去污剂的离子包括曲通如Triton X系列(Triton X-100、Triton X-100R、Triton X-114、Triton X-450、Triton X-450R)、辛基葡糖苷、聚氧乙烯(9)十二烷基醚、洋地黄皂苷、IGEPAL CA630、正辛基-β-D-葡糖吡喃糖苷(β0G)、正十二烷基-β、C12E07、吐温20、吐温80、聚多卡醇、n-十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)、NP-40、C12E8(八乙二醇正十二烷基单醚)、六乙二醇单正十四烷基醚(C14E06)、辛基-β-硫代葡糖吡喃糖苷(辛基硫葡糖苷，OTG)、Emulgen和聚氧乙烯10月桂基醚(C12E10)。离子型(阴离子或阳离子)去污剂的例子包括脱氧胆酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌苷酸和溴化十六烷三甲基铵(CTAB)。两性离子试剂也可用于本发明的纯化方案中，如Chaps、两性离子3-14、和3-[(3-胆酰氨丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸。也认为，可与或不与另一去污剂或表面活性剂一起加入脲。
裂解或匀浆溶液还可含有其它试剂，如还原剂。这种还原剂的离子包括二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、DTE、GSH、半胱氨酸、半胱胺、三羧基乙基膦(TCEP)、或亚硫酸盐。
在本发明的一些实施方式中，裂解液包括硫氰酸胍、N-月桂酰肌苷酸和TrisHCl。当样品在该溶液中匀浆时，常常可用酚溶液或吸附性固相抽提RNA。其它方法采用变性剂/酚溶液的组合进行最初的匀浆，不需要第二次抽提。这些试剂的离子是TrizolTM(Invitrogen)或RNAwizTM(Ambion，Inc.)。然后，将其与匀浆溶液接触，可通过机械手段进一步匀浆样品。可采用机械振荡器、转子-定子匀浆器或剪切型匀浆器。
或者，可以在裂解液中匀浆组织，通过沉降、离心或过滤使组织残余物分离。然后，可用上述匀浆溶液和抽提条件处理这些残余物。
本发明方法还可包括用去污剂或表面活性剂去除脂质或其组合物的步骤。脂质可以是天然存在的或合成的(即由人设计产的)。然而，脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域熟知的，包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜、溶脂(lysolipid)、鞘糖脂、糖脂、硫苷脂、具有醚和酯连脂肪酸的脂质和可聚合脂质，及其组合。本文描述了脂质如磷脂的去除。
可用去污剂帮助匀浆或产生细胞裂解物。这些去污剂具体包括Triton X-100和CHAPS。CHAPS是两性离子去污剂3-[(3-胆酰氨丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸。
在与本申请同一天以Richard Cnrad和Emily Zeringer的姓名提交的题为“从固定样品中制备RNA的方法和组合物”(METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREPARINGRNA FROM A FIXED SAMPLE)的美国专利申请中可发现其它相关方法，包括抽提实施方式。特别将该申请纳入作为参考。特别认为，本发明可用于从固定样品中制备小RNA分子。
B.抽提小RNA分子裂解或匀浆细胞样品后，可实施额外步骤来抽提特定的RNA分子。认为如果样品包含细胞，则可认为裂解或匀浆步骤是全部抽提方法的一部分，然而，抽提RNA具体指，并被理解为从其它生物分子如脂质和蛋白中分离RNA分子。从这些其它结构中抽提RNA分子可包括含有一种或多种有机溶剂的抽提溶液。在一些情况下，有机溶剂是非醇有机溶剂如酚和/或氯仿。在其它情况下，溶液含有醇，该醇可以是用于抽提核酸的任何醇，但在某些实施方式中，该醇是乙醇。
可从各种细胞样品中抽提RNA分子。这种细胞样品可包含脑细胞、头细胞、颈细胞、胃肠道细胞、肺细胞、干细胞、胰细胞、乳腺细胞、睾丸细胞、子宫细胞、膀胱细胞、肾细胞、前列腺细胞、结肠细胞、肾细胞、皮肤细胞、卵巢细胞和心脏细胞，但不限于上述细胞。
术语“核酸”是本领域熟知的。本文所用的“核酸”通常指DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子(即一条链)，包括核碱基。核碱基包括，例如在DNA(如腺嘌啉“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(如A、G、尿嘧啶“U”或C)中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”或“RNA分子”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，它们各自是术语“核酸”的亚属。当一核酸能够根据标准的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen结合互补规则与另一核酸碱基配对时，称作核酸“互补物”或与另一核酸“互补”。本文所用“另一核酸”指单独分子或相同分子的空间上分离的序列。
本文所用术语“互补”或“互补物”也指能够与另一核酸链或双链体杂交，即使不是所有核碱基与对应核碱基碱基配对的含有连续核碱基或半连续核碱基的序列的核酸(如一个或多个核碱基部分在该分子中未出现)。在某些实施方式中，“互补”核酸所含序列中约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、至约100％，及可从其中衍生的任何范围的核碱基序列在杂交期间能够与一单链或双链核酸分子碱基配对。本领域普通技术人员应理解，在某些实施方式中，术语“互补”指可以在严谨条件下与另一核酸链或双链体杂交的核酸。
在某些实施方式中，“部分互补的”核酸包含可以在低严谨条件下与一单链或双链核酸杂交的序列，或所含序列中少于约70％的核碱基序列在杂交期间能够与一单链或双链核酸分子碱基配对。
这些定义通常指单链分子，但在具体实施方式
中也包括与一单链分子部分、基本上或完全互补的附加链。因此，核酸可包括含有一条或多条含有分子的具体序列的互补链或“互补物”的双链分子或三链分子。本文中，可用前缀“ss”指代单链核酸，可用前缀“ds”指代双链核酸，可用前缀“ts”指代三链核酸。
C.固体支持物和装置固体支持物是含有能够与核酸，尤其是小RNA分子可逆结合的材料的结构，在一些实施方式中，它不与样品中的一种或多种其它类型的大分子结合。材料可包括塑料、玻璃、硅、磁体、金属如金、碳、纤维素、乳胶、聚苯乙烯和其它合成聚合物、尼龙、纤维素、硝酸纤维素、聚丙烯酸酯、聚丙烯腈、甲基丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯，聚氯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯或任何经化学修饰的塑料。它们也可以是多孔性或非多孔性材料。该结构也可为可以分离、耗尽或分开小RNA分子的任何形状的颗粒。在一些实施方式中，它是裂解物可通过的包括任何上述材料的柱。
其它组分包括分离装置，如过滤装置，包括旋转滤器或旋转柱。它可以是球形如珠，或杆状，或平板形结构，如带有孔的板。可以离心、过滤、透析和/或分离含有所需RNA分子的结构或样品。当离心该结构时，它可以沉淀或通过可离心过滤装置。
该结构也可进行附加捕获步骤。在一些实施方式中，通过捕获结构后，再过滤样品。捕获步骤可包括用压力驱动的系统或基于重力的系统(如离心)进行过滤。可从市场上购得许多这种结构，它们可用于此处。在WO86/05815、WO90/06045、美国专利5，945，525中可发现其它离子，特别将所有这些文献纳入作为参考。
II.分离的小RNA分子的表征和定量可用各种方法分析并定量从样品中获得的小RNA分子，以对它们进行表征、定量，或用它们分析其它生物样品。本文所提供的是定量或分析RNA，或在用于涉及其它生物材料的实验中操作RNA的方法。在Sambrook等(2001)或Maniatis等(1990)中可发现定量或分析RNA的总方法。下面提供了来自样品的小RNA分子的使用的例子，但这些例子并非限制性。
A.核酸酶保护测定核酸酶保护测定(NPA)，包括核糖核酸酶保护测定(RPA)和S1核酸酶测定，它是一种在总细胞RNA的复杂混合物中检测、定量和绘制具体RNA的极敏感的方法。NPA的基础是离散大小的单链反义探针与RNA样品的溶液杂交。小体积溶液杂交比更常见的膜基杂交有效得多，可容纳多达100微克的总RNA或多聚(A)RNA。杂交后，用核酸酶混合物消化来去除任何残余的未杂交探针和样品RNA。然后，在一个步骤反应中使核酸酶失活，使剩余的探针靶杂交子沉淀。在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离这些产物，通过放射自显影法显色。如果采用非同位素探针，则通过将凝胶转移到膜上并进行第二次检测使样品显色。
这种技术是本领域普通技术人员熟知的。用于这种测定的市售试剂盒现成可用，如Ambion的Direct ProtectTM裂解物RPA试剂盒、HybSpeedTMRPA试剂盒和RPA II和RPA IIITM核糖核酸酶保护测定试剂盒。
B.变性琼脂糖凝胶电泳可用变性凝胶系统通过凝胶电泳定量从样品中分离的小RNA分子。丙烯酰胺凝胶是用于分离该大小分子的优选基质，但也可采用高浓度(～4％+)的修饰琼脂糖，如NuSieve(FMC，191Thomaston St.，Rockland，ME 04841)。凝胶上应包括阳性对照，使任何不寻常结果可归因于凝胶问题或所分析RNA的问题。可将RNA分子量标记，已知是完整的RNA样品，或二者用于此目的。包括富集步骤中所用启动RNA样品也是一个好主意。可通过将这些凝胶内容物印迹到杂交膜上并用放射性寡核苷酸(基于RNA或DNA)探针探查来测定特定小RNA的存在。
C.通过UV吸光度评价RNA产率可通过在TE(10mM Tris-HCl pH 8，1mM EDTA)或水中等分稀释制备物(通常是1∶50-1∶100的稀释度)，用分光光度计在260nm和280nm处读吸光度来测定RNA的浓度和纯度。
A260值中1等于40微克RNA/毫升。因此，用A260×稀释倍数×40微克/毫升来计算RNA浓度(微克/毫升)。下面是一个典型例子10微克总RNA的典型产量是3-5微克。如果将样品重悬于25微升，这意味着浓度将在120纳克/微升和200纳克/微升之间变化。用49微升TE以1∶50稀释一微升制备物。A260＝0.1。RNA浓度＝0.1×50×40微克/毫升＝200微克/毫升或0.2微克/微升。由于用1微升测定浓度后，剩下24微升制备物，所以剩余RNA的总量是24微升×0.2微克/微升＝4.8微克。
D.来自样品的小RNA分子的其他用途可用微阵列技术分析或在微阵列技术中使用获自样品的小RNA分子。例如，阵列，如基因阵列是将一群基因特异性探针打点到其规定位置上的固体支持物。该探针通过杂交定位于来自核酸样品如RNA样品群体的互补标记靶上。基因阵列的最常见的用途之一是比较RNA群体的整体表达模式。一般地，可采用分离自两种或多种组织样品的RNA。用标记的核苷酸和靶特异性、寡聚dT或随机引物逆转录RNA产生标记的cDNA群体。由模板RNA变性得到cDNA，并杂交于相同阵列上。检测并定量各阵列中的杂交信号。在各个群体之间比较从各基因特异性斑点发射的信号。在样品中以不同水平表达的基因产生不同量的标记cDNA，这导致阵列上的斑点产生的信号量不同。
广泛采用从RNA群体到标记cDNA的直接转化，因为它简单并基本不受酶偏差的影响。然而，为了使中等稀少的靶能够被阵列分析检测，直接标记需要大量RNA来产生足够的标记产物。大部分阵列操作程序推荐将2.5克聚A或50克总RNA用于逆转录(Duggan，1999)。对于不能从他们的样品中分离这么多RNA的工作人员而言，可采用整体扩增步骤。
这些整体扩增方案中最常引用的是反义RNA(aRNA)扩增(美国专利5,514,545和5,545,522)。反义RNA扩增包括用5’端具有转录启动子如T7RNA聚合酶共有启动子序列的寡聚dT引物逆转录RNA样品。第一条链的逆转录产生单链cDNA。第一条cDNA链合成后，与cDNA杂交的模板RNA被部分降解，产生RNA引物。然后RNA引物延伸产生具有转录启动子的双链DNA。用合适的RNA聚合酶转录该群体产生具有来自cDNA的序列的RNA群体。因为转录导致从各DNA模板产生成百上千RNA，所以基本上可实现扩增。在转录期间RNA可被标记并直接用于阵列分析，或者可用标记的dNTP逆转录未标记的aRNA，产生用于阵列杂交的cDNA群体。在另一情况下，标记靶的检测和分析是本领域熟知的。可采用的其他扩增方法包括但不限于聚合酶链反应(称为PCRTM；参见美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159，以及Innis等，1988)；和连接酶链反应(“LCR”)，公开于欧洲申请号320 308，美国专利4,883,750、5,912,148。PCT申请号PCT/US87/00880中所述的Qβ复制酶也可用作扩增方法。扩增核酸如RNA的其他方法公开于美国专利5,843,650、5,846,709、5,846,783、5,849,546、5,849,497、5,849,547、5,858,652、5,866,366、5,916,776、5,922,574、5,928,905、5,928,906、5,932,451、5,935,825、5,939,291、5,916,779和5,942,391,GB申请号2202328，PCT申请号PCT/US89/01025、PCT申请WO 89/06700、PCT申请WO 88/10315、欧洲申请号329822，Kwoh等，1989；Frohman，1994；Ohara等，1989；和Walker等，1992，各自以全文纳入本文作为参考。
也可构建cDNA文库，并用于分析抽提自样品的RNA。这种文库的构建并用这种文库分析RNA可见于Sambrook等(2001)；Maniatis等(1990)；Efstratiadis等(1976)；Higuchi等(1976)；Maniatis等(1976)；、Land等(1981)；Okayama等(1982)；Gubler等(1983)；Ko(1990)；Patanjali等(1991)；美国专利申请20030104468，各自纳入本文作为参考。
可将本方法和试剂盒用于大量筛选。可用本发明方法和组合物产生RNA文库或DNA文库。然后可将该文库用于高通量测定，包括微阵列。本发明者尤其考虑了基于芯片的核酸技术如Hacia等(1996)和Shoemaker等(1996)所述的技术。简要说，这些技术包括用于快速和准确分析大量基因的定量方法。通过用固定探针阵列，可以采用芯片技术隔离靶分子作为高密度阵列，并根据杂交筛选这些分子(也参见Pease等，1994和Fodor等，1991)。本文所用术语“阵列”指核酸的顺序排列。例如，将代表所需来源(如成年人脑)的核酸群体分成可采用所需筛选步骤检测或耗尽靶基因的最小数量的库，并可将该库分布到单个多孔板中。阵列可以是可获自所需mRNA来源的核酸群体水性悬液，包含包含多个单孔的多孔板，各单孔含有不同核酸群体内容的水性悬液。在美国专利号6,329,209、6,329,140、6,324,479、6,322,971、6,316,193、6,309,823、5,412,087、5,445,934和5,744,305中发现了阵列、它们的用途和它们的实施的例子，将其纳入本文作为参考。
微阵列是本领域已知的，它包含在已知位置上特异性杂交或结合了其序列与基因产物(如cDNA、mRNA、cRNA、多肽及其片断)相对应的探针的表面。在一个实施方式中，微阵列是其中各位置代表用于基因编码产物(如蛋白或RNA)的独立结合位点的阵列(即基质)，其中结合位点对应于生物体基因组中大部分或几乎所有基因的产物。在优选实施方式中，“结合位点”(以下称为“位点”)是可与特定同源cDNA特异性杂交的核酸或核酸类似物。结合位点的核酸或类似物可以是，例如合成寡聚物、全长cDNA、比全长短的cDNA或基因片段。
将核酸或类似物连接到可由玻璃、塑料(如聚丙烯、尼龙)、聚丙烯酰胺、硝酸纤维素或其他材料制成的固体支持物上。将核酸连接到表面上的优选方法是印刷在玻璃板上，总地由Schena等，1995a所述。也参见DeRisi等，1996；Shalon等，1996。也可采用制作微阵列地其他方法，如通过掩蔽(Maskos等，1992)制作。原则上可采用任何类型的阵列，例如尼龙杂交膜上的斑点印迹(参见Sambrook等，2001，将其全文纳入用于所有目的)。但是正如本领域技术人员所知，优选非常小的阵列，因为杂交体积会更小。
也考虑到采用生物芯片，它涉及标记分子或分子库与固定在生物芯片上的靶的杂交。
III.试剂盒在本发明的其它实施方式中，提供了从样品，具体是细胞样品中分离小RNA分子(如miRNA和siRNA)的试剂盒。试剂盒中可包含本文所述的任何组合物。在非限制性例子中，试剂盒中可包括裂解细胞、从细胞裂解物中抽提RNA和/或分析或定量所获RNA的试剂。因此，该试剂盒在合适的容器中包含本文所公开的任何试剂。它也可包括一种或多种缓冲液或溶液，如裂解缓冲液、抽提缓冲液、加入醇的溶液、洗脱液、洗涤溶液和分离所需RNA的其它组分，如捕获结构。在一些实施方式中，分离小RNA分子的试剂盒包含a)酸性酚-氯仿；b)裂解/结合缓冲液(基于GuSCN)；c)miRNA匀浆添加物(2M醋酸钠，pH 4，用PC抽提前加入0.1体积)；d)miRNA洗涤溶液#1(1.6M GuSCN的70％乙醇溶液)；e)洗涤溶液#2/3(80％乙醇，0.1M NaCl，4.5mM EDTA，10mM TrisHCl，pH 7.5)；f)洗脱液(0.1mM EDTA，pH 8)；g)凝胶加样缓冲液II；h)收集管；i)滤筒。
可将试剂盒组分包装在含水介质或冻干形式中。试剂盒的容器通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、罐、注射器或其它容器，将一个组分，优选为合适等分的一个组分置入其中。当试剂盒中组分多于一种时(可将它们包装在一起)，该试剂盒通常也包含第二个、第三个或其它附加容器，其中分别置入附加组分。然而，一个小瓶中可含有各种组分组合。本发明试剂盒一般也包括装RNA的容器，和禁止用于商业出售的任何其它试剂容器。这种容器可包括注射成模或吹模塑料容器，其中保留了所需小瓶。当以一种和/或多种溶液的形式提供试剂盒组分时，溶液是含水溶液，尤其优选无菌含水溶液。
然而，可以干燥粉末的形式提供试剂盒组分。当以干燥粉末的形式提供试剂和/或组分时，可通过加入合适溶剂而重建粉末。预计也可在另一容器中提供溶剂。该容器通常包括至少一个小管、试管、烧瓶、罐、注射器和/或其它容器，其中置入了核酸制剂，优选合适分装的核酸制剂。该试剂盒也可包含第二个容器，含有无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它稀释剂。
这种试剂盒也可包括保藏或维持RNA的组分或保护RNA不降解的组分。这种组分可以是不含RNA酶或抗RNA酶的组分。这种试剂盒通常包含适用于各个试剂或溶液的不同容器。
试剂盒也包括使用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包括的任何其它试剂的说明书。说明书可包括可实施的改变。
实施例包括以下实施例是为了说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表了本发明者发现在本发明实践中起到良好作用的技术，因此可认为这些技术构成了本发明实践的优选方式。然而，本领域技术人员根据本公开应理解，对所公开的具体实施方式
进行许多改变仍能获得相似或类似的结果，而不背离本发明精神和范围。
实施例1细胞裂解物的制备和RNA的分离以下步骤提供了本发明的基础，它在实施例中被称为Ambion miRNA分离试剂盒(AMIK)步骤。
在液氮下将冷冻组织磨碎成微细粉末。将裂解缓冲液(4M GuSCN；0.1Mβ-巯基乙醇；0.5％N-月桂酰肌氨酸；25mM柠檬酸钠，pH 7.2)加入装有该粉末的合适容器中，比例为每克组织粉末1毫升。用机械方法匀浆产生微细分散的组织裂解物。加入十分之一体积的2M醋酸钠(pH 4.0)溶液，完全混合，每毫升加入0.1毫升。然后立即处理该裂解物(无需有机抽提)或放置在冰上在15分钟内处理。
处理包括将等体积的酸性酚-氯仿(5∶1，在pH 4.5用水溶液平衡)加入悬液，然后剧烈振荡(通过涡旋或摇动)30-60秒。然后通过16,000×G离心5分钟分离酚-氯仿和水相，或直到获得清晰界面。吸除水相，避免吸出任何两相界面。此水相含有来自样品的RNA，通过加入1.22倍体积的乙醇将其制成55％乙醇溶液。
混合后立即将样品直接施加到玻璃纤维柱上，如RNAqueous kit(Ambion)所用的玻璃纤维柱。通过约12,000×G离心1分钟使样品通过滤器，然后用洗涤溶液连续洗涤滤器三次。各次洗涤之间倒空离心管；如果需要使所有液体通过的话，在约12,000×G离心1分钟或更长时间使各次洗涤溶液完全通过滤器。第一次洗涤是用0.5毫升1.6M异氰酸胍(GuSCN)/70％乙醇进行的，后两次是用80％醇/0.1M NaCl/4.5mM EDTA/10mM TrisHCl，pH 7.5进行的。最后一次洗涤液通过滤器后，再在空收集管中离心滤器以去除所有痕量的乙醇。
通过在室温下将100微升0.1mM EDTA，pH 8.0直接施加于滤器并离心到新收集管中来从滤器上洗脱样品。图1和图2显示了在不进行和进行预抽提步骤的情况下，由三种不同组织心、脑和肝制得的制备物之间的差异。在两种情况下均可看出，55％乙醇捕获了大部分let-7miRNA。
实施例2通过Northern印迹检测miRNA对各RNA样品而言，将5微升样品与5微升凝胶加样染料II(Ambion)混合。加样到变性丙烯酰胺凝胶之前，将这些样品在95℃加热2-5分钟。标准胶是15％丙烯酰胺(单体∶二聚体比例为19∶1)、7M脲、用TBE(Tris-硼酸-EDTA，Peacock和Dingman，1967)缓冲。按常规将凝胶在300-450V预跑30分钟，然后将样品加在也含有溴酚蓝和二甲苯氰追踪染料的样品缓冲液中。在300-450V电泳45-60分钟，或直到溴酚蓝追踪染料到达凝胶的下四分之一区。
电泳后，将凝胶装置拆开，将凝胶电印迹到BrightStar-Plus尼龙膜(Ambion)上。该步骤可在半干装置内进行，其中凝胶上下各堆叠三张用0.25×TBE浸透的Whatman滤纸(3MM)，将此夹心结构在200-400mA进行至少0.2A-小时。延长此时间并不损失样品。印迹后，保持膜的湿润并用市售交联装置(StratalinkerTM，Stratagene，Inc.)进行UV交联。
用5’端标记了T4多核苷酸激酶的反义探针检测膜上的特定miRNA，let-7(Pasquinelli等，2000)。
一些情况下，用反义寡脱氧核糖核苷酸同时也会检测到其它普遍存在的小RNA。这些核苷酸包括U2snRNA(登录号X07913，与187nt小鼠U2snRNA的28-42位互补)、U6snRNA(登录号V00853或J00648，与106nt小鼠RNA的83-103位互补)和U43snoRNA(登录号AJ238853，与62nt人U43RNA的20-37位互补)。所有这些核苷酸能够在小鼠和人之间容易地交叉杂交。Patterson和Guthrie(1987)的方法是预杂交、杂交和洗涤(Patterson和Guthrie，1987)。在{6×SSC，10×Denhardt溶液，0.2％SDS}中65℃预杂交印迹至少1小时，然后加入10毫升含有5’端标记的let-7、U43、U6和/或U2反义寡脱氧核苷酸探针(U43、U6、let-7最少＝400,000cpm；U2最少＝200,000cpm)并在用前过滤(0.45微米孔径)的杂交溶液{6×SSC，5×Denhardt溶液，0.2％SDS}。室温下摇动8-24小时进行杂交。杂交后，去除溶液，用洗涤溶液{6x SSC，0.2％SDS}在室温下洗涤印迹3次每次5分钟，然后用相同的洗涤溶液在42℃洗涤一次。最后一次洗涤后，将印迹封装在塑料封套中，暴露于感光成像仪屏幕(Molecular Dynamics)，按照制造商说明书对各条带呈现的信号进行定量。常常将洗脱组分中let-7的量与流出物(flow-through)相比较，提供“结合％”图，如图1、图2、图3、图4、图5和图6所示。对其它图而言，是将let-7的量与其它样品比较或表示为绝对量。参见具体实施例。
对于一些实施例，由琼脂糖凝胶系统进行第二次Northern印迹，以寻找较大RNA种类的存在。对于普遍表达的基因亲环蛋白(＝肽酰脯氨酸异构酶或PPI)、GAPDH和/或β-肌动蛋白而言，这些RNA种类是mRNA。用NorthernMax Gly试剂盒跑琼脂糖凝胶并对其进行印迹，如Ambion所述。在检测印迹时，从Ambion提供的模版(目录号7675、7431、7423)转录反义RNA探针并在Ultrahyb(Ambion)中杂交，所用所有操作程序如Ambion文献中所作的说明。
实施例3小RNA分子的富集根据以下富集小RNA的方法分别处理冷冻的小鼠脑、心、肝和肾。
在液氮下将大约半克冷冻的小鼠(Swiss-Webster品系，6-12周龄)组织在研钵中碾碎成微细粉末。用装有7毫米电动机的转子-定子匀浆器高速匀浆约30秒使该粉末进一步分散于标准裂解缓冲液(4M GuSCN；0.1M β-巯基乙醇；0.5％N-月桂酰肌氨酸；25mM柠檬酸钠，pH 7.2)中。
匀浆后，取出0.6毫升用于此研究。将60微升2M醋酸钠(pH 4.0)加入裂解物，然后立即加入0.6毫升酸性酚-氯仿。剧烈振荡30秒后，通过16,000×G离心5分钟分离水相。将该水相的四个100微升等分分别用于四次分离。将100微升40％、50％、60％和70％乙醇各自加入四等分中，然后让其通过玻璃纤维滤器，如RNAqueous步骤(Ambion)。然后通过分别加入156、133、111和88.9微升乙醇将通过这些滤器的20％、25％、30％和35％乙醇溶液(流出物)调整到55％乙醇的终浓度。将所有四个样品通过单独的玻璃纤维过滤柱。然后用0.7毫升4M异氰酸胍(GuSCN)/70％乙醇洗涤滤器，然后用0.5毫升80％醇/0.1M NaCl/4.5mM EDTA/10mM TrisHCl，pH 7.5洗涤两次。将各次洗涤溶液通过滤器，倒空并替换收集管。每次RNAqueous程序(Ambion)都用离心使各洗涤溶液通过滤器。再在空收集管中离心滤器，以去除所有微量乙醇。通过在室温下将100微升0.1mM EDTA，pH 8.0直接施加于滤器并离心到新收集管中，而从滤器上洗脱样品。用Northern印迹检测样品，如上所述，并在同一块凝胶上与另一用Ambion的TotallyRNATM试剂盒从等体积的相同裂解物制备的样品比较。
用琼脂糖和丙烯酰胺Northern印迹，测定从第一个和第二个柱中洗脱的物质中冷冻的小鼠脑、心、肝和肾中存在的β-肌动蛋白、GAPDH、U2和let-7RNA种类的水平，以确定从后者中回收的组分。结果如图7所示。从富含小RNA的组分中完全去除了较大的mRNA图8显示了用实施例3所述方法与标准RNA分离方法相比，小RNA的相对富集。这里，将四种常用的小鼠组织脑、心、肾和肝在标准裂解缓冲液中匀浆，如实施例1所述。匀浆后，从各裂解物中取两等分。对一份进行有机抽提和乙醇沉淀的标准RNA制备步骤，其中用4体积乙醇沉淀以保证完全回收小RNA种类。对另一等分进行实施例3所述的富集步骤。用260nm处的吸光度定量各最终样品中RNA的浓度。在15％变性聚丙烯酰胺凝胶上分离一微克各样品。将该凝胶电印迹，检测所产生Northern印迹中的let-7和U2，如实施例2所述。用与印迹合适区域杂交的各探针量来确定1微克样品中各RNA的相对量。富集样品的信号除以标准样品的信号得到富集因数，如图8所示。在这种情况下，质量富集了约3.5-8倍。
实施例4与标准有机抽提和乙醇沉淀的比较将冷冻储存在-80℃下的来自两块小鼠肝脏的样品在液氮下磨碎成微细粉末，在10体积(毫升/克)的标准裂解缓冲液(4M GuSCN；0.1M β-巯基乙醇；0.5％N-月桂酰肌氨酸；25mM柠檬酸钠，pH 7.2)中匀浆，然后分成四等分。用两种不同酚-氯仿溶液抽提四份中的一份两次，如Totally RNATM操作程序(Ambion)所述，对另外三分分别进行标准AMIK步骤。将由Totally RNATM步骤沉淀的RNA再溶解于100微升0.1mM EDTA，pH 8中。AMIK样品的最终洗脱是在相同体积和相同溶液中进行的。如上所述在15％丙烯酰胺和1％琼脂糖凝胶上电泳并印迹样品。如上所述检测合适印迹的β-肌动蛋白、GAPDH、U2、U43和let-7。图9的图表中小结了相对于抽提方法的各RNA的回收率。本发明产生小RNA的产率等于或大于有机抽提方法。
实施例5与标准玻璃纤维滤器纯化的比较将储存在-80℃下的冷冻小鼠肝脏和冷冻小鼠脑样品在标准裂解缓冲液中匀浆，比例为1克组织加入10毫升缓冲液。匀浆后，将所有裂解产物保存于冰上，直到施用两种加工方法之一。
以六等分100微升各母体裂解物开始，用Qiagen的RNeasy方法加工2个样品，加入250微升试剂盒中提供的组织裂解缓冲液(TLB)后立即进行它们的最小步骤。用前述AMIK方法制备各组织的最终四等分。将所有样品洗脱在100微升水中。分析时，通过将5微升各样品在15％丙烯酰胺凝胶上电泳和印迹，检测印迹的let-7、U43和U2来进行分析。用感光成像仪定量条带后，对不同方法产生的各小RNA的信号水平作以比较。这些结果如图10所示。本发明在捕获所有小RNA方面比标准玻璃纤维滤器方法有效得多。不能用标准方法捕获小分子在某种程度上也受组织类型的影响，因为从肝裂解物进行捕获似乎更有效。此观察结果与我们用粗裂解物观察到的结果一致(图1)。
实施例6在三种不同组织中从粗裂解物中回收小RNA的效率将小鼠(Swiss-Webster品系，6-12周龄)的冷冻心脏、肝脏和脑样品各自在液氮下研磨成粉末。对该冷冻粉末称重，每克组织中加入10毫升裂解缓冲液(重量范围是200-500毫克)。加入后立即用转子-定子匀浆器将样品匀浆，然后在冰上分成8×100微升等分。向这些等分中加入53.9、66.7、81.8、100、122.2、150、185.7和233.3微升纯乙醇，使乙醇的最终浓度为35、40、45、50、55、60、65和70％。将这些等分各自通过玻璃纤维过滤柱，如RNAqueous试剂盒(Ambion)中发现的过滤柱，收集流出物。用酚-氯仿抽提并用4倍体积的乙醇沉淀流出物中的RNA，以保证小RNA的沉淀。16,000×G离心30分钟沉淀RNA后，用80％乙醇洗涤沉淀一次，然后再溶解于60微升0.5mM EDTA，pH 8.0中。洗涤滤器三次，一次是用0.7毫升4M异氰酸胍(GuSCN)/70％乙醇洗涤，然后两次是用0.5毫升80％醇/0.1M NaCl/4.5mMEDTA/10mM TrisHCl，pH 7.5洗涤。如上所述进行各次洗涤，即12,000×G离心1分钟或足够让所有液体通过滤器的时间，每次洗涤后倒空收集管。通过将30微升0.1mM EDTA，pH 8.0预热到95℃后直接施加于滤器单独进行2次来洗脱样品，各次均离心到相同的新收集管中。通过Northern印迹分析等量(5微升)的滤器结合和洗脱物和流出物，如上所述。因为结合物和流出物在相同印迹上，所以可对各组织各乙醇浓度计算结合的let-7RNA量。此数据绘制在图1和图2中。显然各组织的结合行为随着将所有let-7RNA固定在玻璃纤维滤器上所需的乙醇浓度而不同。然而，对于所有组织而言似乎55％乙醇能够实现最大固定。
实施例7从培养细胞中纯化用胰蛋白酶从培养烧瓶中收集两种细胞系HEK-293(衍生自人胚肾)或HeLa(人宫颈)的细胞。计数后，将这些细胞加入两个2毫升微量离心管中，每管约一百万个细胞，离心沉淀。去除上清，将各管中沉淀的内容物重悬于700微升裂解缓冲液中，如标准方法中所述(实施例1)。通过剧烈摇动该管30秒，而不是用匀浆装置来裂解细胞。对各组而言，通过加入860微升纯乙醇使一组的乙醇浓度立即达到约55％。如标准方法中所述地处理另一等分通过加入70微升缓冲到pH 4的2M醋酸钠使其酸化，然后用700微升酸性酚-氯仿抽提，然后将860微升乙醇加入回收的上相中。使二样品通过玻璃纤维滤器，洗涤三次，并用100微升0.1mM EDTA，pH 8洗脱，如上所述。在15％丙烯酰胺凝胶上电泳5微升各洗脱物，并对U2和let-7进行Northern印迹。用印迹感光成像所测定的各样品的水平见图11所示。由所有方法回收小RNA的表现良好，但预抽提方法可提高从Hela细胞的回收。
实施例8用不同盐条件预抽提将冷冻小鼠肝脏加入1.1X正常浓度减去柠檬酸钠的裂解缓冲液(4.4M GuSCN；0.11M β-巯基乙醇；0.55％N-月桂酰肌氨酸)进行匀浆。匀浆后，立即从该裂解物中取出两个1.8毫升等分，将200微升pH 7.2或4.5的0.25M柠檬酸钠加入各等分。从这些2毫升部分中取出四个400微升等分，将40微升的水，1M、2M或3M NaOOCCH3(醋酸钠，pH 4.5)加入各等分，使最终[NaOOCCH3]为零和约0.1、0.2和0.3M。用440微升酸性酚-氯仿抽提各样品，回收300微升上相。通过加入纯乙醇使其乙醇浓度为55％，在玻璃纤维滤器柱上纯化，如标准方法中所述。将各样品施加于15％丙烯酰胺凝胶，进行印迹和探针检测，如上所述。各自测得的U2、U43和let-7水平显示在图12的图表中。两种pH条件下的产率似乎基本相等(虽然U43可变)，但是在两种pH条件下的最佳产率似乎出现在存在0.2M NaOOCCH3的情况下。
实施例9在不同胍盐和乙醇浓度下小RNA分子的结合在标准裂解缓冲液中匀浆小鼠肝，用酸性酚-氯仿抽提。将抽提的裂解物分成两部分。向各部分中加入等体积的不含胍盐的裂解缓冲液(0.1M β-巯基乙醇；0.5％N-月桂酰肌氨酸；25mM柠檬酸钠，pH 7.2)或含有2M GuSCN的裂解缓冲液(2M GuSCN；0.1M β-巯基乙醇；0.5％N-月桂酰肌氨酸；25mM柠檬酸钠，pH 7.2)，分别形成最终[GuSCN]为2M和3M的溶液。然后再分成18等分，每份200微升，通过以下两种方式之一加入乙醇。第一种方法是加入22.2、35.3、50、66.7、85.7、107.7、133.3和200微升纯乙醇。这样产生的最终乙醇浓度为10、15、20、25、30、35、40、45和50％，相应的胍盐浓度随乙醇浓度升高而降低。(对3M起始浓度而言是2.7、2.55、2.4、2.25、2.1、1.95、1.8、1.65和1.5M；对2M起始浓度而言是1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、和1.0M)。第二种方法加入等体积的20-100％的乙醇水溶液，产生相同的最终乙醇浓度，但各系列中胍盐浓度一致，均为1.5或1M。加入乙醇后，将这些样品各自与玻璃纤维滤器结合，然后进行标准方法。在丙烯酰胺和琼脂糖凝胶上跑这些样品，测定β-肌动蛋白、GAPDH、PPI(亲环蛋白)、U2和let-7的存在。在图3、图4、图5和图6中绘制了这四个系列随乙醇浓度增加各种类的结合行为。从这些系列中，证明大小不同的RNA种类的行为存在着不同，使得可通过操作盐和乙醇浓度来实现大小范围相当受限的RNA分子的结合，说明可进行更精确的大小区分方法。
实施例10
用小RNA探查微阵列用实施例3或9所述方法富集的小RNA可用于说明书中所述的微阵列技术。在一个例子中，附着于微阵列的探针可含有为捕获已知miRNA或siRNA特别设计的序列。或者，附着于微阵列的探针可以是mRNA序列，用于寻找潜在的miRNA或siRNA的体内生物靶点。小RNA分子群体可以是放射性标记的，或者用对光有反应的标记或能够结合能够与光起反应第二分子的标记来标记。可以通过本领域技术人员熟知的酶方法连接这些直接或间接标记，例如用磷酸酶去除5’磷酸，然后用多核苷酸激酶加入修饰的磷酸；或用RNA连接酶或聚合酶如多聚A聚合酶将一个或多个标记的核苷酸加入3’端。
* * * * * * * *根据本公开，无需进行额外实验即可制成和实施本文所公开和要求权利的所有组合物和方法。虽然按照优选实施方式描述本发明组合物和方法，但是本领域技术人员能够明显看出，可对本文所述组合物和方法以及方法中的步骤或步骤顺序进行改变，而不背离本发明概念、精神和范围。更具体说，显然可用某些化学和生理学相关的试剂替代本文所述的试剂，而实现相同或相似的结果。本领域技术人员明白，所有这种相似替代和修饰注定在如所附权利要求书所限定的本发明精神、范围和概念内。
参考文献特别将下述参考文献纳入本文作为参考。
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Zamore等，Cell，101(1)25-33，2000。
权利要求
1.一种从细胞中分离小RNA分子的方法，所述方法包括a)用裂解液裂解细胞以产生裂解物；b)在裂解物中加入醇溶液；c)将裂解物施加到固体支持物上；d)从固体支持物上洗脱小RNA分子；和e)使用或表征所述小RNA分子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小RNA分子包括miRNA、siRNA、snRNA、snoRNA和/或tRNA分子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小RNA分子是miRNA分子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，至少20％来自细胞的小RNA分子是分离的。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，至少50％来自细胞的小RNA分子是分离的。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液含有离液剂或去污剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解液含有离液剂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述离液剂在裂解液中的浓度至少约为2.0M。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述裂解液含有胍盐。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述胍盐的浓度至少约为2.0M。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述裂解液还含有去污剂和缓冲液。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述去污剂的浓度约为0.1％-2％。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述去污剂是N-月桂酰肌氨酸。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度约为10mM-300mM。
15.如权利要求1所述的方法，其还包括用含有有机溶剂的抽提溶液从裂解物中抽提小RNA分子，然后将裂解物施加于固体支持物上。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抽提溶液含有酚。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述抽提溶液还含有氯仿。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加入裂解物的醇溶液量使裂解物含醇约20％-70％。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，加入裂解物的醇溶液量使裂解物含醇约50％-60％。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，将所述醇溶液加入裂解物后用有机溶剂抽提。
21.如权利要求1所述的方法，其还包括将裂解物施加于固体支持物后，用第一洗涤溶液洗涤固体支持物。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述第一洗涤溶液含有离液剂。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述离液剂是胍盐，且所述第一洗涤溶液还含有醇。
24.如权利要求21所述的方法，其还包括在用第一洗涤溶液洗涤之后，用第二洗涤溶液洗涤固体支持物。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述第二洗涤溶液含有醇。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在约为60℃-100℃的温度下从固体支持物上洗脱小RNA分子。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用低离子强度的溶液从固体支持物上洗脱小RNA分子。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述离子型溶液含有至多10mM的盐。
29.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体支持物是无机支持物或聚合物支持物。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述无机支持物或聚合物支持物是含有二氧化硅的柱子。
31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述无机或聚合物支持物是一组由吸附性聚合物制成的珠。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，该组珠是通过离心、过滤或磁性捕获收集的。
33.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述二氧化硅是玻璃纤维。
34.如权利要求1所述的方法，其还包括通过离心或气体压力使裂解物通过所述柱。
35.如权利要求1所述的方法，其还包括捕获洗脱的小RNA分子。
36.如权利要求33所述的方法，其特征在于，在滤器上捕获洗脱的小RNA分子，然后收集。
37.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小RNA分子是单链的。
38.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小RNA分子是双链的。
39.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小RNA分子至多有100个核苷酸或更少。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述小RNA分子至多有70个核苷酸或更少。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述小RNA分子至多有30个核苷酸或更少。
42.一种从样品中分离miRNA或siRNA的方法，所述方法包括a)获得含有miRNA或siRNA的样品；b)将醇溶液加入样品中；c)将抽提溶液加入样品中；d)将该样品施加于无机或聚合物支持物上；和e)用离子型溶液从无机或聚合物支持物上洗脱siRNA或miRNA。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述样品是细胞裂解物。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，将含有离液剂或去污剂的裂解液加入含有miRNA或siRNA的细胞来制造所述细胞裂解物。
45.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述经洗脱的样品富集了至少约10倍质量的miRNA或siRNA。
46.一种从样品中分离miRNA分子的方法，所述方法包括a)将醇溶液加入样品中；b)将样品施加于无机或聚合物支持物上；c)用离子型溶液从支持物上洗脱miRNA分子；和d)使用或定性所述miRNA分子。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述样品是细胞裂解物。
48.一种从样品中分离小RNA分子的方法，所述方法包括a)用含有胍盐的裂解液裂解样品中的细胞，其中，产生了胍盐浓度至少约为1M的裂解物；b)用含有酚的抽提溶液从裂解物中抽提小RNA分子；c)将醇溶液加入裂解物中以形成裂解物/醇混合物，其中，该混合物中的醇浓度约为35％-70％；d)将裂解物/醇混合物施加于无机或聚合物支持物上；e)用离子型溶液从无机或聚合物支持物上洗脱小RNA分子；f)捕获小RNA分子；和g)使用分离的小RNA分子。
49.一种分离小RNA分子的试剂盒，所述试剂盒包含a)酸性酚-氯仿；b)裂解/结合缓冲液；c)匀浆添加物；d)洗涤溶液；e)洗脱液；和f)滤筒。
50.一种从样品中分离小RNA分子的方法，所述方法包括a)在裂解液中裂解细胞，以产生裂解物；b)用含酚的抽提溶液从裂解物中抽提小RNA分子；c)将醇溶液加入裂解物中，以形成裂解物/醇混合物；d)将裂解物/醇混合物施加于第一固体支持物上；e)收集流出的裂解物/醇混合物；f)将醇溶液加入流出的裂解物/醇混合物中；g)将裂解物/醇混合物施加于第二固体支持物上；和h)用离子型溶液从固体支持物上洗脱小RNA分子。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，施加于所述第一固体支持物的所述裂解物/醇混合物含醇约20％-35％。
52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，施加于所述第二固体支持物的所述裂解物/醇混合物含醇约35％-70％。
53.如权利要求50所述的方法，其还包括使用或表征小RNA分子。
全文摘要
本发明涉及分离小RNA分子(100个核苷酸或更小)，如微小RNA和siRNA分子的方法和组合物的用途。在通常采用的分离方法中这些分子一般会丢失，因此本发明允许在更高水平上富集或分离这些小RNA分子。
文档编号C12N15/10GK1882688SQ200480025190
公开日2006年12月20日 申请日期2004年7月26日 优先权日2003年7月25日
发明者R·C·康拉德 申请人:安比恩股份有限公司