专利名称：从发酵液中纯化琥珀酸的方法
技术领域：
本发明涉及从积累琥珀酸的盐的发酵液中纯化琥珀酸的技术。
背景技术：
近年来，琥珀酸作为生物可降解聚合物的原料而引起人们的注意。而且，琥珀酸作为4-碳中间体被广泛用作特殊化学产品的原料。为了使用琥珀酸作为生物可降解聚合物和特殊化学产品的原料，需要以低成本产生高纯度的琥珀酸。这是因为原料琥珀酸中含有的杂质可抑制由琥珀酸产生最终产品的反应或降低所述最终产品的质量。
因此，为了通过发酵或酶法产生琥珀酸用作聚合物或特殊化学产品的原料，需要有效地从含有大量杂质的发酵液或酶反应混合物中除去杂质并以低成本产生琥珀酸。
在通过发酵或酶法产生琥珀酸的过程中，通常将反荷离子(counter ion)加入培养基或酶反应溶液以保持最适pH。因此，琥珀酸常常以盐的形式存在于积累琥珀酸的培养液或酶反应混合物中。因此，为了产生高纯度的琥珀酸，必须除去加入所述发酵培养基或酶反应溶液的反荷离子。此外，所述发酵液含有大量的杂质如其他有机酸和氨基酸，而这些杂质也需要被有效地去除。
作为产生高纯度琥珀酸的方法，到目前为止已经报道了使用离子交换树脂的方法，使用琥珀酸的难溶盐的方法，使用电渗析(electrodialysis)的方法等等。
使用离子交换树脂的方法概略地分类为使用阴离子交换树脂的方法和使用弱酸性阳离子交换树脂的方法。
作为使用阴离子交换树脂的方法，已经报道了包括将含有琥珀酸的盐的原料液体与阴离子交换树脂进行接触以允许所述树脂吸附琥珀酸，然后用有机溶剂，氨水等洗脱琥珀酸的方法(参考专利文献1和2)。然而，在此方法中，必须除去并收集所述洗脱物中包含的有机溶剂或碱如氨，而这使所述过程变得复杂。
此外，已经报道了包括使阳离子交换树脂吸附琥珀酸的反荷离子并收集琥珀酸作为通流溶液(through-flow solution)的方法(参考专利文献3)。然而，此方法遇到这样的问题，由于所使用的离子交换树脂是弱酸性的阳离子交换树脂，所述原料液体中琥珀酸的反荷离子限制为氨，该方法不能应用于具有其他反荷离子的琥珀酸的盐。
作为使用琥珀酸的难溶盐的方法，已知包括将钙离子加入含有琥珀酸的盐的原料液体和收集琥珀酸钙作为沉淀的方法(专利文献4)。然而，此方法遇到这样的问题，在从所述沉淀中除去钙时产生的副-产物钙盐的去除是复杂的。
专利文献5和6公开了使用电渗析的方法。然而，这些方法遇到这样的问题，难以除去所述原料液体中包含的其他有机酸(乙酸)，因为它显示与琥珀酸相同的行为。
同时，作为从含有有机酸的水溶液中收集有机酸如琥珀酸的方法，已经报道了通过使用H-型离子交换树脂将水溶液中氢离子浓度调节到结合有机酸的阴离子所需的水平或更高的方法(专利文献7)。该文献描述了在此方法中，当将氢离子的浓度调节到结合有机酸的阴离子所需的水平时，优选比所述相当物浓度高1％至大约10％的浓度。然而，即使将氢离子的浓度调节到这样的浓度，也难以基本上完全地除去发酵液中含有的作为琥珀酸的反荷离子的阳离子，并因此出现琥珀酸纯度降低的问题。
JP 62-238231A[专利文献2]美国专利No.5,132,456[专利文献3]JP 62-238232A[专利文献4]JP 62-294090A[专利文献5]JP 02-283289A[专利文献6]JP 03-151884A[专利文献7]WO01/66508发明内容本发明的目的是提供从积累琥珀酸的盐的发酵液或酶反应混合物中以高收率纯化高纯度的琥珀酸的方法。
为了实现上述的目的，本发明的发明人进行了勤勉的研究。结果，他们发现含琥珀酸的液体中的杂质可通过将使用一定量或更多的H-型强酸性阳离子交换树脂的离子交换与琥珀酸的结晶相结合而有效地去除，并由此能以高纯度和良好的收率产生琥珀酸，并由此完成了本发明。
即，本发明提供了下列各项。
(1)从含琥珀酸的液体中纯化琥珀酸的方法，所述含琥珀酸的液体中含有通过发酵或酶法获得的阳离子，该方法包括将所述含琥珀酸的液体与H-型强酸性阳离子交换树脂进行接触，所述树脂的量等于或大于含琥珀酸的液体中包含的除氢离子之外的阳离子的量，和从得到的经离子交换处理的液体中沉淀琥珀酸的晶体以得到纯化的琥珀酸。
(2)(1)的方法，其中所述含琥珀酸的液体含有琥珀酸的盐。
(3)(2)的方法，其中所述琥珀酸的盐选自琥珀酸钠、琥珀酸钾、琥珀酸镁、琥珀酸钙和琥珀酸铵。
(4)(3)的方法，其中所述含琥珀酸的液体含有碳酸的盐，并将酸加入所述含琥珀酸的液体以调节为pH 5.0或更低，然后与所述H-型强酸性阳离子交换树脂进行接触。
(5)(4)的方法，其中所述经离子交换处理的液体用作所述的酸。
(6)(4)的方法，其中已经去除沉淀的琥珀酸的经离子交换处理的液体用作所述的酸。
(7)产生琥珀酸的方法，其包括将微生物细胞或经过处理的细菌细胞作用于含水反应溶液中的有机原料以获得含琥珀酸的液体，将所述含琥珀酸的液体与H-型强酸性阳离子交换树脂进行接触，所述树脂的量等于或大于含琥珀酸的液体中包含的除氢离子之外的阳离子的量，和从得到的经离子交换处理的液体中沉淀琥珀酸的晶体以得到纯化的琥珀酸。
(8)(7)的方法，其中所述含水反应溶液用碳酸镁或氢氧化镁进行中和。
具体实施例方式
本发明的方法是从含琥珀酸的液体中纯化琥珀酸的方法，所述含琥珀酸的液体含有通过发酵或酶法得到的阳离子，所述方法包括使所述含琥珀酸的液体与H-型强酸性阳离子交换树脂进行接触，所述树脂的量等于或大于含琥珀酸的液体中包含的除氢离子之外的阳离子的量，和从得到的经离子交换处理的液体中沉淀琥珀酸的晶体以得到纯化的琥珀酸。
以下，对本发明进行详细的说明。
<1>制备含琥珀酸的液体对本发明应用的含琥珀酸的液体无具体的限制，所述含琥珀酸的液体含有通过发酵或酶法得到的阳离子，只要它含有琥珀酸和除氢离子以外的阳离子。其具体实例包括含琥珀酸的发酵液和通过使用催化反应以由碳源或琥珀酸合成的原料或中间体产生琥珀酸的细菌、经过处理的细菌细胞和酶等等得到的反应混合物。
所述含琥珀酸的液体优选含有琥珀酸的盐，优选琥珀酸的中性盐。所述盐的具体实例包括琥珀酸钠、琥珀酸钾、琥珀酸镁、琥珀酸钙、琥珀酸铵等等。
对用于产生本发明的含琥珀酸的液体的方法无具体的限制，并例如，可应用JP 05-68576A和JP11-196888A中描述的方法。具体地，含琥珀酸的液体可通过使属于短杆菌属(Brevibacterium)并具有琥珀酸-产生能力的细菌细胞或经过处理的细菌细胞作用于含有有机原料如延胡索酸或其盐的反应水溶液来获得。
上述的微生物的实例包括需氧的棒状杆菌细菌如黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)MJ-233菌株、黄色短杆菌MJ-233-AB-41菌株等等。
所述黄色短杆菌MJ-233已于1975年4月28日保藏在国立生命科学和人体技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology)，工业科技机构(Agency of Industrial Science and Technology)，国际贸易与工业部(Ministry of International Trade and Industry)(Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，日本)，并给以登记入藏号(accession number)FERM P-3068。然后在1981年5月1日根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定转为国际保藏物(intemational deposition)，并给以登记入藏号FERMBP-1497。所述MJ-233-AB-41菌株于1976年11月17日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，工业科技机构，国际贸易与工业部(Central 6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，日本)，并给以登记入藏号FERMP-3812。然后，在1981年5月1日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏物，并给以登记入藏号FERM BP-1498。
用于本发明的微生物不具体地局限于属于短杆菌属的细菌，只要它产生琥珀酸。这样的微生物的实例包括属于假丝酵母属(genus Candida)的微生物(JP 56-17077B)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)等。
可将还原的和/或氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide)加入上述的反应溶液。加入的浓度为0.1至50mM，优选1至40mM。
可修饰所述微生物如需氧的棒状杆菌细菌以使细胞内的丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)(PC)活性增加。例如，所述PC活性可通过用编码PC的基因转化微生物来增加。使用的所述PC基因的实例包括源自微生物、动物或植物的基因，而且更具体地，源自人、小鼠、大鼠、酵母或属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、根瘤菌属(Rhizobium)或埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物的基因。获取PC基因和导入所述PC基因的琥珀酸-产生细菌在JP 11-196888A中描述。此外，也预期所述的琥珀酸-产生能力通过增强微生物的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenol pyruvatecarboxylase)活性来提高(JP 07-83714B、JP 09-121872A)。
所述的PC基因和含有该基因的质粒的具体实例包括pPC-PYC2和此质粒中含有的PC基因(PYC2)，其源自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)如JP11-196888A中所述。也可以使用源自酿酒酵母的其他PC基因(PYC1)。
当使用需氧的棒状杆菌细菌，尤其是，导入所述PC基因的细菌，而且允许这样的细菌或其经过处理的细胞作用于含有有机原料的含水反应溶液时，所述反应溶液优选含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气。此外，此反应更优选在厌氧条件下进行。
为了将需氧的棒状杆菌细菌用于本发明的方法中，可在通常的需氧条件下培养之后使用细菌细胞。作为用于培养的培养基，可采用用于微生物常规培养的培养基。例如，可以使用通过将天然营养物如肉浸出物、酵母提取物和蛋白胨加入包含无机盐如硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁的组合物得到的普通培养基。
培养之后，通过离心、膜分离等收集细菌细胞，并作为原样或作为经过处理的细菌细胞用于下述的反应。本文中使用的术语“经过处理的细菌细胞”指，例如，用丙烯酰胺、角叉菜胶(carrageenan)等固定的细菌细胞、破坏的细胞、其离心上清或通过用硫酸铵等进行处理来部分纯化所述上清而得到的具有PC活性的级分。
对于反应溶液而言，使用水、缓冲液、培养基等，而且含有合适的无机盐的培养基是特别优选的。
用于本发明的有机原料无具体的限制，只要它能在发酵中被转化为琥珀酸，而且所述有机原料可选择普通的有机原料。具体地，优选使用葡萄糖和乙醇，它们价廉并提供琥珀酸的高产生速率。在此情况中，加入的葡萄糖的浓度优选为0.5至500g/L，而乙醇的浓度优选为0.5至30g/L。
此外，用于酶法的有机原料的实例包括延胡索酸或其盐，如延胡索酸钠和延胡索酸铵。
当将活的微生物细胞用于产生含琥珀酸的液体时，难以严格地区分琥珀酸是通过发酵产生的，还是通过酶反应产生的。只要能得到含有阳离子和琥珀酸的液体作为结果，在本发明中琥珀酸是通过发酵产生还是通过酶反应产生不是问题。
通常优选加入阳离子作为琥珀酸的反荷离子以保持反应溶液的最适pH。然而，这样的反荷离子可以不是必需添加的。所述琥珀酸的反荷离子无具体的限制，只要所述阳离子不抑制发酵或酶反应。作为琥珀酸的反荷离子，通常使用钠离子、钾离子、镁离子、钙离子、铵离子或其组合，并优选使用钠离子、钾离子、镁离子、铵离子或其组合。
所述反应溶液优选用碳酸镁和/或氢氧化镁进行中和，因为能提高琥珀酸的产生速率和收率。所述反应溶液优选保持在pH 5至10，更优选pH 6至9.5。
当含有碳酸根离子或碳酸氢根离子或二氧化碳气的反应溶液用于制备所述含琥珀酸的液体时，碳酸根离子或碳酸氢根离子以1至500mM，优选2至300mM，更优选3至200mM的浓度加入。当含有二氧化碳气时，每1L所述溶液中含有50mg至25g，优选100mg至15g，更优选150mg至10g的二氧化碳气。
此外，上述提及的厌氧条件指在进行所述反应的同时，在所述溶液中保持低浓度的溶氧。所述反应优选在0至2ppm，更优选0至1ppm，还更优选0至0.5ppm的溶氧浓度进行。上述反应的方法的实例包括在密闭容器中无通风的条件下的反应，供应惰性气体如氮气的反应，使用含有二氧化碳气的惰性气体通风的方法等等。
所述反应通常在15至45℃，优选25至37℃的温度进行。所述反应在5至9，优选6至8的pH范围进行。所述反应通常进行5至120小时。用于所述反应的细菌细胞的量无具体的限制，而且它们以1至700g/L，优选10至500g/L，更优选20至400g/L的量使用。当使用经过处理的细菌细胞时，它们优选以对应于上述细菌细胞量的量使用。
前面提及的经过处理的细菌细胞的实例包括用丙烯酰胺、角叉菜胶等固定的细菌细胞、破坏的细菌细胞、其离心上清，通过用硫酸铵等进行处理来纯化所述上清而得到的级分，等等。
如上所述得到的含琥珀酸的液体通常含有阳离子作为琥珀酸的反荷离子、除琥珀酸外的有机酸、氨基酸、无机盐、蛋白质、糖类、脂质、细菌细胞，等等。
<2>离子交换在本发明中，将如上所述得到的含琥珀酸的液体与H-型强酸性阳离子交换树脂以等于或大于含琥珀酸的液体中包含的除氢离子之外的阳离子的量进行接触，并从得到的经离子交换处理的液体中沉淀琥珀酸的晶体以得到纯化的琥珀酸。
在离子交换或结晶过程之前，优选从发酵液或酶反应混合物中分离细菌细胞或经过处理的细菌细胞。通常优选在所述离子交换之前进行此步骤，但它可以在所述离子交换之后和所述结晶过程之前进行。从所述含琥珀酸的液体中分离细菌细胞或经过处理的细菌细胞的方法无具体的限制，而且可以使用通常用于分离细菌细胞的任何方法，如过滤、离心和其组合。
此外，如果将含有碳酸根离子、碳酸氢根离子或二氧化碳气的含琥珀酸的液体与H-型强酸性离子交换树脂接触，作为氢离子和阳离子的交换的结果，所述液体的pH降低，而且碳酸根离子和碳酸氢根离子接受氢离子并作为二氧化碳被释放。因为所述液体在此时可强烈地起泡(sparkle)，离子交换的过程可变得非常困难。因此，优选将酸在所述离子交换之前加入所述含琥珀酸的液体以使该液体呈酸性，并由此引起脱羰作用(decarbonylation)。
上述的酸性条件优选为pH 5.0或更低，更优选为pH 4.8或更低。虽然加入的酸无具体的限制，但通常使用廉价的酸如氢氯酸和硫酸。此外，作为待加入的酸，可以使用如下文所述的离子交换操作之后的含琥珀酸的液体(经离子交换处理的液体)，或其中已除去沉淀的琥珀酸的经离子交换处理的液体(除去结晶的琥珀酸后的母液(mother liquor))。由于这些经离子交换处理的液体和母液具有低pH，它们有效地降低了发酵液的pH。此外，因为所加入的液体能通过重复本发明方法的过程来循环利用，所以它们具有既不降低收率又不增加处理废酸的成本的优点。
将含琥珀酸的液体，优选经过细胞去除处理和(如果需要的话)脱羰处理的含琥珀酸的液体，与H-型阳离子交换树脂进行接触。通过此离子交换步骤，所述含琥珀酸的液体中的阳离子和氨基酸被吸附在所述离子交换树脂上并由此被除去。本发明的发明人发现不仅碱性氨基酸而且中性和酸性氨基酸已通过此步骤去除。发酵液通常具有大约中性的pH。在此pH区域，碱性氨基酸带正电荷，中性氨基酸不解离，而酸性氨基酸带负电荷。因此，酸性和中性氨基酸不吸附在所述阳离子交换树脂上。然而，如果将含有琥珀酸的盐的原料液体与H-型强酸性阳离子交换树脂进行接触，所述阳离子作为琥珀酸的反荷离子从所述原料液体中被去除并被氢离子代替，导致pH的降低。认为，结果是使中性和酸性氨基酸也带有正电荷，并吸附在所述阳离子交换树脂上。
用于本发明的H-型强酸性阳离子交换树脂无具体的限制，并可使用低或高的交联度的那些。此外，可以使用凝胶型或多孔型的那些。其具体实例包括，但不限于，商业上可得到的DIAION SK1B、SK104、SK110、PK212、PK216(Mitsubishi Chemical Corporation)，其他等级的这些产品等等。
在本发明中，使用之前必须将强酸性离子交换树脂转化为H-型。所述转化为H-型的方法无具体的限制，并可使用通常采用的方法。可以使用间歇式方法(bach type method)、单柱式方法(single column type method)和多柱式方法(multiple column type)方法中的任一种(Kagaku Kogaku Binran(化学工程手册)，修订的第4版，The Society of Chemical Engineers，Japan，Maruzen编辑)。此外，将酸用于向H-型的转化，而且选择pKa低于强酸性离子交换树脂的pK的的酸。此外，所述的酸优选不具有氧化能力，其导致所述离子交换树脂的降解。本发明可使用任何酸，只要满足这些要求。通常，使用氢氯酸、稀硫酸等作为所述的酸，但并不局限于这些。
将含琥珀酸的液体与H-型强酸性离子交换树脂进行接触的方法无具体的限制，并可以使用上述的通常采用的方法。可以使用间歇式方法、单柱式方法和多柱式方法中的任一种(Kagaku Kogaku Binran，修订的第4版，TheSociety of Chemical Engineers，Japan，Maruzen编辑)。通常使用柱方法，其中将含琥珀酸的液体通过以H-型强酸性离子交换树脂填充的柱子，虽然也可以使用间歇式方法。
在本发明中，通过将含琥珀酸的液体与H-型强酸性离子交换树脂进行接触而得到的液体被定义为通流液体(through-flow liquid)。
在本发明中，H-型强酸性离子交换树脂的交换容量(exchange capacity)等于或大于含琥珀酸的液体中包含的除氢离子之外的阳离子的量是必要的。本文中使用的术语“除氢离子之外的阳离子”包括如上所述在离子交换处理的过程中带负电荷的氨基酸以及金属阳离子。可通过使用具有等于或大于阳离子量的交换容量的H-型强酸性离子交换树脂有效地除去含琥珀酸的液体中的杂质。具体地，可有效地除去离子如钠离子、钾离子、镁离子和铵离子，和氨基酸如丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸，其难以通过单独的结晶完全地去除。通流液体中除氢离子之外的阳离子的总浓度相对于琥珀酸理想地为1.0％或更低，优选0.5％或更低。
含琥珀酸的液体或通流液体中包含的除氢离子之外的阳离子中，金属阳离子的浓度可通过，例如，离子电极(ion electrode)方法、原子吸收(atomicabsorption)方法、离子色谱法(ion chromatography)等进行测量，而且氨基酸的浓度可通过使用氨基酸分析仪(Analytical Instrument Guide，9th Edition，September 5，2001，Japan Analytical Instruments Manufacturers Association)等进行测量。
<3>结晶琥珀酸的晶体从已经过离子交换的含琥珀酸的液体中沉淀。沉淀晶体的方法的实例包括浓缩(concentration)、冷却经离子交换处理的液体，或将有机溶剂加入经离子交换处理的液体，或其组合。纯化的琥珀酸可通过此步骤获得。具体地，通过此步骤有效地去除不能通过结晶、脱羰或离子交换完全去除的除琥珀酸之外的有机酸以及碳酸根离子、铵离子等等。
所述浓缩步骤的条件无具体的限制，并通常使用真空浓缩(vacuumconcentration)。然而，不限于此方法，而且也可以应用使用反渗透膜的浓缩(Kagaku Kogaku Binran，Revised 4th Edition，1978，Maruzen)，使用电渗析的浓缩(Food Membrane Technology，1999，Korin)等等。
真空浓缩优选在50kPa或更低，优选25kPa或更低，特别优选15kPa或更低的压力下进行。
为了通过浓缩步骤来沉淀琥珀酸的晶体，将所述液体浓缩至高于琥珀酸的溶解度的浓度。
琥珀酸的溶解度在，例如，Kagaku Binran Basic Part II，Revised 2nd Edition(The Chemical Society of Japan，1975，Maruzen)等中描述。
为了通过冷却来沉淀琥珀酸的晶体，进行所述的冷却以将液体冷却到该液体中琥珀酸的浓度低于琥珀酸溶解度的温度。
琥珀酸的溶解度在，例如，Kagaku Binran Basic Part II，Revised 2nd Edition(The Chemical Society of Japan，1975，Maruzen)等中描述。
为了通过加入有机溶剂来沉淀琥珀酸的晶体，加入有机溶剂，如甲醇或乙醇。
有机溶剂中琥珀酸的溶解度在，例如，Kagaku Binran Basic Part，II Revised2nd Edition(The Chemical Society of Japan，1975，Maruzen)等中描述。
琥珀酸可通过单独的浓缩、冷却或加入有机溶剂，或这些的组合来结晶。
沉淀的晶体从母液中以常规方式进行分离。所述分离方法的实例包括，但不限于，过滤、离心过滤(centrifugal filtration)、离心沉降(centrifugalsedimentation)等等。
实施例参考如下实施例对本发明进行更具体的说明。
参考实施例1构建PC基因-扩增的菌株<1>克隆含有源自酵母酿酒酵母的PC基因(PYC2)的DNA片段(A)提取酿酒酵母的总DNA将酿酒酵母W303-1A菌株(Yeast，Vol.2，pp.163-167(1986))使用白金环(platinum loop)接种于1L的酵母生长培养基(YPAD)[组成10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖，100mg腺嘌呤(adenine)和1000ml蒸馏水]，在30℃培养至对数生长后期，并收集细胞。
将得到的细胞以10mg/ml的浓度悬浮于15ml含10mg/ml溶菌酶(lysozyme)、10mM NaCl、20mM Tris缓冲液(pH 8.0)和1mM EDTA·2Na(每种组分的浓度为终浓度)的溶液。然后，将蛋白酶K以100μg/ml的终浓度加入所述悬浮液，并在37℃保温1小时。然后，将十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate(SDS))以0.5％的终浓度加入所述溶液，并在50℃保温6小时用于裂解。向此裂解物中加入等量的酚/氯仿溶液并在室温缓慢地振荡10分钟，然后离心(5,000×g，20分钟，10至12℃)以分离上清级分。将乙酸钠以0.3M的浓度加入所述上清并缓慢地加入2-倍体积的乙醇。用玻璃棒取出水层和乙醇层之间存在的DNA，以70％乙醇洗涤，并风干。将5ml的10mM Tris缓冲液(pH 7.5)/1mM EDTA·2Na溶液加入所得的DNA中，在4℃保持静置过夜并用于下面的实验。
(B)克隆含有源自酿酒酵母的PC基因(PYC2)的DNA片段和构建重组菌株通过使用上面提及的(A)中制备的染色体DNA作为模板来进行PCR。对于PCR而言，通过使用由Applied Biosystems制造的“394DNA/RNA合成仪”合成如下的引物对，并使用。
(a-1)5’-TTT CAT ATG AGC AGT AGC AAG AAA TTG-3’(SEQ ID NO1)(b-1)5’-TTT CCT GCA GGT TAA CGA GTA AAA ATT ACT TT-3’(SEQID NO2)在下列条件下通过使用由Perkin Elmer Cetus制造的“DNA热循环仪”并将重组TaqDNA聚合酶TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作为反应试剂来进行PCR。
反应混合物(10x)PCR缓冲液 10μl1.25mM dNTP混合物16μl模板DNA 10μl(DNA含量1μM或更低)上述的a-1和b-1引物 每种1μl(终浓度0.25μM)重组TaqDNA聚合酶 0.5μl灭菌的蒸馏水 61.5μl混合上述组分，并将100μl的反应混合物用于PCR。
PCR循环变性步骤94℃进行60秒退火步骤52℃进行60秒延伸步骤72℃进行120秒将上述循环作为一个循环重复25次。
使用0.8％琼脂糖凝胶将10μl由上述反应得到的反应混合物进行电泳，并由此可检测大约3.56kb的DNA片段。
<2>使用PC基因制备重组棒状杆菌细菌(A)构建穿梭载体基于在棒状杆菌细菌中稳定质粒所需的区域的序列，其存在于JP03-210184A中描述的质粒pCRY30中，通过使用由Applied Biosystems制造的“394DNA/RNA合成仪”合成如下的引物对。
(a-2)5’-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC TTG CTA CTG-3’(SEQ IDNO3)(b-2)5’-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT CAA-3’(SEQ IDNO4)所述质粒pCRY30是如下所述构建的质粒。即，质粒pBY503的DNA(此质粒的详细说明参考JP 01-95785A)提取自停滞短杆菌(brevibacteriumstationis)IFO12144，其于1988年7月18日以登记号FERM P-10136保藏在国立生命科学和人体技术研究所，工业科技机构(目前为，International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566，日本))，然后根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏物，并给以登记号FERM BP-2515。然后，所述质粒的具有大约4.0kb大小并含有负责复制的基因(复制区)的DNA片段用限制性内切酶XhoI切除，而且所述质粒的具有大约2.1kb大小并含有负责稳定的基因(稳定区)的DNA片段用限制性内切酶EcoRI和KpnI切除。通过将这两段DNA片段并入所述质粒pHSG298(Takara Shuzo)的每个EcoRI-KpnI位点和SalI位点，可制备质粒载体pCRY30。
在下列条件下通过使用由Perkin Elmer Cetus制造的“DNA热循环仪”并将重组TaqDNA聚合酶TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作为反应试剂来进行PCR。
反应混合物(10x)PCR缓冲液10μl1.25mM dNTP混合物 16μl模板DNA 10μl(DNA含量1μM或更低)上述的a-2和b-2引物每种1μl(终浓度0.25μM)
重组TaqDNA聚合酶0.5μl灭菌的蒸馏水61.5μl混合上述组分，并将100μl此反应混合物用于PCR。
PCR循环变性步骤94℃进行60秒退火步骤52℃进行60秒延伸步骤72℃进行120秒将上述循环作为一个循环重复25次。
使用0.8％琼脂糖凝胶将10μl由上述反应得到的反应混合物进行电泳，并由此可检测大约1.1kb的DNA片段。
将10μl的其中扩增产物已在上面得到确认的反应混合物，和1μl质粒pBluescriptIISK+分别用限制性内切酶EcoRI和XhoI完全消化，并在70℃处理10分钟以失活所述限制性内切酶，然后将这些混合，加入1μl T4 DNA连接酶10×缓冲液和1单位的T4 DNA连接酶，和灭菌的蒸馏水以达到10μl，并在15℃反应3小时以连接所述片段。
使用所得到的含质粒的溶液，通过氯化钙方法[Journal of MolecularBiology，53，159(1970)]转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)，并铺于含50mg氨苄青霉素的培养基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和16g琼脂溶于1L蒸馏水]。
能在此培养基上生长的菌株以常规的方法进行液体培养，并从该培养溶液中提取质粒DNA，并将该质粒用限制性内切酶(EcoRI、XhoI)消化以确认插入的片段。结果，除具有3.0kb长度的质粒pBluescriptIISK+的DNA片段之外，鉴定了具有1.1kb长度的插入的DNA片段。将此质粒命名为pBSpar。
基于在棒状杆菌细菌中复制质粒所需的区域的序列，其存在于美国专利No.5,185,262中描述的质粒pCRY31中，通过使用由Applied Biosystems制造的“394 DNA/RNA合成仪”合成如下的1对引物。
(a-3)5’-TTT GGT ACC GAC TTA GAT AAA GGT CTA-3’(SEQ ID NO5)(b-3)5’-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-3’(SEQ ID NO6)上述的质粒pCRY31是如下构建的质粒。即，通过将上述源自pBY503的复制区连接到质粒pHSG398(Takara Shuzo)而获得的质粒pCRY3(携带此质粒的黄色短杆菌MJ233 GE102于1988年1月8日作为FERM P-9802的登记号保藏在国立生命科学和人体技术研究所，工业科技机构(目前为，International Patent Organism Depositary，National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，日本))，然后在1988年1月8日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏物，并给以登记号FERM BP-2513)，用KpnI部分消化以得到DNA片段。pBY503由乳发酵短杆菌IFO12144(FERMBP-2515)制备并用KpnI完全消化以产生大约7-kb的DNA片段。通过连接上面的DNA片段和选择当用限制性内切酶消化时显示下表所述的消化模式(digestion pattern)的质粒，可得到pCRY31。
表1
在下列条件下通过使用由Perkin Elmer Cetus制造的“DNA热循环仪”，并以重组TaqDNA聚合酶TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作为反应试剂来进行PCR。
反应混合物(10×)PCR缓冲液 10μl1.25mM dNTP混合物16μl模板DNA 10μl(DNA含量1μM或更低)上述的a-3和b-3引物 每种1μl(终浓度0.25μM)重组TaqDNA聚合酶 0.5μl灭菌的蒸馏水 61.5μl混合上述组分，并将100μl此反应混合物用于PCR。
PCR循环变性步骤94℃进行60秒退火步骤52℃进行60秒延伸步骤72℃进行120秒将上述循环作为一个循环重复25次。
使用0.8％琼脂糖凝胶将10μl由上述反应得到的反应混合物进行电泳，并由此可检测大约1.8kb的DNA片段。
将10μl的其中扩增产物已在上面得到确认的反应混合物，和1μl质粒pBSpar用限制性内切酶XhoI和KpnI完全消化，并在70℃处理10分钟以失活所述限制性内切酶，然后将这些混合，加入1μl T4DNA连接酶10×缓冲液和1单位的T4DNA连接酶，和灭菌的蒸馏水以达到10μl，并在15℃反应3小时以连接所述片段。
使用所得到的含质粒的溶液，通过氯化钙方法[Journal of MolecularBiology，53，159(1970)]转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)，并铺于含50mg氨苄青霉素的培养基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和16g琼脂溶于1L蒸馏水]。
能在此培养基上生长的菌株以常规的方法进行液体培养，并从该培养溶液中提取质粒DNA，并将该质粒用限制性内切酶(XhoI、KpnI)消化以确认插入的片段。结果，除具有4.1kb长度的质粒pBSpar的DNA片段之外，鉴定了具有1.8kb长度的插入的DNA片段。将此质粒命名为pBSpar-rep。
将1μl如上所述制备的质粒pBSpar-rep和1μl pHSG298(Takara Shuzo)用限制性内切酶KpnI和EcoRI完全消化，并在70℃处理10分钟以失活所述的限制性内切酶。然后将这些混合，加入1μl T4 DNA连接酶10×缓冲液和1单位T4 DNA连接酶，和灭菌的蒸馏水以达到10μl，并在15℃反应3小时以连接所述片段。
使用所得到的含质粒的溶液，通过氯化钙方法[Journal of MolecularBiology，53，159(1970)]转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)，并铺于含50mg卡那霉素的培养基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和16g琼脂溶于1L蒸馏水]。
能在此培养基上生长的菌株以常规的方法进行液体培养，并从该培养溶液中提取质粒DNA，并将该质粒用限制性内切酶消化以确认插入的片段。结果，除具有2.6kb长度的质粒pHSG298的DNA片段之外，鉴定了具有2.9kb长度的插入的DNA片段。将此质粒命名为pHSG298par-rep。
(B)插入tac启动子为了使用含tac启动子的质粒pTrc99A(Pharmacia)作为模板通过PCR扩增tac启动子片段，通过由Applied Biosystems制造的“394 DNA/RNA合成仪”合成如下的1对引物。
(a-4)5’-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC CCC ATC CCC-3’(SEQ IDNO7)(b-4)5’-TTT GGA TCC CAA CAT ATG AAC ACC TCC TTT TTA TCCGCT CAC AAT TCC ACA CAT-3’(SEQ ID NO8)在下列条件下通过使用由Perkin Elmer Cetus制造的“DNA热循环仪”，并以重组TaqDNA聚合酶TaKaRa Taq(Takara Shuzo)作为反应试剂来进行PCR。
反应混合物(10x)PCR缓冲液10μl1.25mM dNTP混合物 16μl模板DNA 10μl(DNA含量1μM或更低)上述的a-4和b-4引物每种1μl(终浓度0.25μM)重组TaqDNA聚合酶 0.5μl灭菌的蒸馏水 61.5μl混合上述组分，并将100μl此反应混合物用于PCR。
PCR循环变性步骤94℃进行60秒退火步骤52℃进行60秒延伸步骤72℃进行120秒将上述循环作为一个循环重复25次。
使用3％琼脂糖凝胶将10μl由上述反应得到的反应混合物进行电泳，并由此可检测大约100bp的DNA片段。
将10μl的其中扩增产物已在上面得到确认的反应混合物，和5μl在上述(A)中制备的质粒pHSG298par-rep用限制性内切酶BamHI和KpnI完全消化，并在70℃处理10分钟以失活所述限制性内切酶，然后将这些混合，加入1μlT4 DNA连接酶10×缓冲液和1单位的T4 DNA连接酶，和灭菌的蒸馏水以达到10μl，并在15℃反应3小时以连接所述片段。
使用所得到的含质粒的溶液，通过氯化钙方法[Journal of MolecularBiology，53，159(1970)]转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)，并铺于含50mg卡那霉素的培养基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和16g琼脂溶于1L蒸馏水]。
能在此培养基上生长的菌株以常规的方法进行液体培养，并从该培养溶液中提取质粒DNA，并将该质粒用限制性内切酶消化以确认插入的片段。结果，除具有5.5kb长度的在上述(A)中制备的质粒的DNA片段之外，鉴定了具有0.1kb长度的插入的DNA片段。将此质粒命名为pHSG298tac。
(C)将所述PC基因插入穿梭载体将10μl的其中扩增产物已在上述(B)中得到确认的反应混合物，和5μl在上述(B)中制备的质粒pHSG298tac用限制性内切酶BglII和SseI或BamHI和SseI消化，并在70℃处理10分钟以失活所述限制性内切酶，然后将这些混合，加入1μl T4 DNA连接酶10×缓冲液和1单位的T4 DNA连接酶，和灭菌的蒸馏水以达到10μl，并在15℃反应3小时以连接所述片段。
使用所得到的含质粒的溶液，通过氯化钙方法[Journal of MolecularBiology，53，159(1970)]转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)，并铺于含50mg卡那霉素的培养基[10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCl和16g琼脂溶于1L蒸馏水]。
能在此培养基上生长的菌株以常规的方法进行液体培养，并从该培养溶液中提取质粒DNA，并将该质粒用限制性内切酶(SseI、NdeI)消化以确认插入的片段。结果，除具有5.6kb长度的在上述(B)中制备的质粒的DNA片段之外，鉴定了具有3.56kb长度的插入的DNA片段。
将此质粒命名为pPC-PYC2。
(D)转化黄色短杆菌MJ-233-AB-41菌株根据美国专利No.5,185,262中描述的方法，将上述质粒导入黄色短杆菌MJ-233-AB-41(FERM BP-1498)。
实施例1
从积累琥珀酸二铵盐的发酵液中纯化琥珀酸制备H-型强酸性阳离子交换树脂如下制备H-型阳离子交换树脂。
将1.6L的Na-型强酸性阳离子交换树脂SK1BL(Mitsubishi ChemicalCorporation)填充于柱中。将5L 1mol/L氢氯酸以1.6L/hr的流速通过所述柱子以将所述树脂转变为H-型。随后，将20L纯水通过该柱子以洗涤所述树脂，并将所述树脂用于如下的实验。
通过发酵产生琥珀酸根据如下的方法通过发酵产生琥珀酸。
制备400mL的培养基，其中每1升中含有100g葡萄糖、0.5g七水合硫酸镁、0.65g正磷酸(orthophosphoric acid)、14.3mL大豆蛋白水解溶液(总氮含量35g/L)、1.0g硫酸铵、20mg七水合硫酸亚铁、20mg水合硫酸锰、1mgD-生物素、1mg盐酸硫胺素和0.05mL消泡剂(GD-113，NOF Corporation)，用1N KOH调节到pH 6.5，将所述培养基倾倒入1-L发酵缸(jar fermenter)并通过加热在120℃灭菌20分钟。将所述培养基冷却后，将用所述质粒pPC-PYC2转化的黄色短杆菌MJ-233-AB-41菌株接种到所述培养基中，并将该培养基保持在30℃。在每分钟通气300ml和在700rpm搅拌的条件下进行20小时培养，同时用氨气将pH调节为7.6。将100ml得到的培养溶液用于如下的琥珀酸发酵。
制备79ml的糖(succharide)溶液，其每1升含有520g葡萄糖和2.6g七水合硫酸镁，并通过加热在120℃将所述糖溶液灭菌20分钟。制备221ml的培养基，其每1升含有1.21g正磷酸、5.39mL大豆蛋白水解溶液(总氮含量35g/L)、1.86g硫酸铵、37.14mg七水合硫酸亚铁、37.14mg水合硫酸锰、1.86mg的D-生物素、1.86mg盐酸硫胺素和0.09mL消泡剂(GD-113)，用1NKOH调节到pH 6.5，然后通过加热在120℃灭菌20分钟。将灭菌的糖溶液和灭菌的培养基注入1-L发酵缸，冷却，然后加入100mL上述的培养液以使总体积为400mL，然后保持在30℃。在每分钟通气20ml和在400rpm搅拌的条件下进行24小时琥珀酸发酵，同时用氨气将所述培养基调节到pH 7.6。
将上述的琥珀酸发酵进行9次以获得3.6L的培养液，其具有25g/L的琥珀酸浓度。
从积累琥珀酸的盐的发酵液中纯化琥珀酸的晶体将得到的培养液通过加热在120℃灭菌20分钟，然后在5000×g离心20分钟以得到3.5L的上清。
将得到的上清经过上述的H-型阳离子交换树脂以得到2.2L的通流液体。通过使用旋转蒸发器(rotary evaporator)将得到的通流液体浓缩直到琥珀酸的浓度为19.2％以沉淀琥珀酸的晶体并得到琥珀酸浆液。将得到的琥珀酸浆液冷却到10℃以沉淀所述的琥珀酸的晶体。分离所述晶体和所述母液。将所得到的琥珀酸的晶体重悬于饱和的琥珀酸水溶液以洗涤该晶体，该水溶液的体积为所述晶体重量的15倍，然后分离该晶体。
对比实施例1将以与实施例1同样的方式积累琥珀酸的发酵液灭菌(120℃，20分钟)，并除去所述细胞(5000×g，20分钟)。通过使用旋转蒸发器浓缩此发酵液以使琥珀酸浓度变为234g/L。通过加入硫酸将得到的浓缩的液体调节到pH 2.2并冷却到10℃以沉淀琥珀酸的晶体。然后，以如实施例1中同样的方式分离所述晶体，并通过用饱和的琥珀酸水溶液重调浆(reslurry)来洗涤以得到洗涤的晶体。
实施例1和对比实施例1中得到的琥珀酸晶体的分析值显示于表2中。
表2实施例1和对比实施例1中得到的琥珀酸晶体的分析值(单位＝重量％)
<p>
如表3所示，可以看出，供给的液体中所含的各种氨基酸中的大部分在由H-型强酸性阳离子交换树脂柱得到的通流液体中去除。这说明所述氨基酸已经通过吸附于H-型强酸性阳离子交换树脂而除去，结果，它们在作为目标产物的所述琥珀酸晶体中几乎检测不到。
实施例2从琥珀酸二钠和碳酸氢钠同时积累的发酵液中纯化琥珀酸的晶体。
制备H-型强酸性阳离子交换树脂以如实施例1中同样的方式制备4.7L的H-型强酸性阳离子交换树脂。
通过发酵产生琥珀酸二钠和碳酸氢钠根据实施例1中描述的方法进行同时积累琥珀酸二钠和碳酸钠的发酵，条件是通过使用2.5mol/L的碳酸钠水溶液代替氨来调节pH。结果，得到3.1L的培养液，其具有70g/L的琥珀酸浓度。
从发酵液中纯化琥珀酸的晶体使用MF膜组件(由Millipore制造的PELLICON-2膜组件，有效膜面积0.1m2，孔径大小0.22μm)将3.1L所得的发酵液进行错流过滤(cross flow<p>
如表4所示，即使当积累琥珀酸钠的发酵液用作原料时，可得到极高纯度的琥珀酸。因此，本发明也可应用于含有一价阳离子作为琥珀酸的反荷离子的发酵液。
对比实施例2以如实施例2中同样的方式，通过使用同时积累琥珀酸二钠和碳酸氢钠的发酵液作为原料来纯化琥珀酸的晶体。在此实施例中，将所述液体经过H-型强酸性离子交换树脂而不进行脱羰。
将所述液体加载于H-型强酸性阳离子交换树脂上从上述发酵液中去除所述细胞，将得到的已去除细胞的液体经过H-型阳离子交换树脂柱。结果，所述液体在阳离子交换树脂柱的上表面发泡，并且不能进行离子交换操作。因此，不能进行结晶过程。
实施例3从含有琥珀酸镁的发酵液中产生琥珀酸从含有琥珀酸镁作为二价金属盐的发酵液中纯化琥珀酸。
制备H-型强酸性阳离子交换树脂并通过发酵产生琥珀酸以与实施例1中相同的方式，制备4.7L的H-型强酸性阳离子交换树脂。
通过如实施例1中同样的培养方法进行琥珀酸镁发酵，条件是使用氢氧化镁代替氨作为中和剂。具体地，使用2.5mol/L氢氧化镁浆液代替氨用于pH调节。将培养基保持在pH 7.5至7.7。结果，得到1L的培养液，其具有50g/L的琥珀酸浓度。
将所得的培养液通过在120℃加热20分钟而灭菌并以5000×g离心15分钟以沉淀细菌细胞并由此得到上清。将所得的上清以如实施例1中同样的方式经过H-型强酸性阳离子交换树脂，并将得到的通流液体进行真空浓缩以得到琥珀酸的晶体。
实施例3中得到的琥珀酸晶体的分析值显示于表5中。
表5.实施例3中得到的琥珀酸晶体的分析值(单位重量％)
n.d.表示≤0.0001。
如表5所示，根据本发明，发现高纯度的琥珀酸也可以由琥珀酸的镁盐得到，所述琥珀酸的镁盐是二价阳离子的盐。因此，本发明不仅可应用于含有单价阳离子作为反荷离子的含琥珀酸的发酵液，而且可应用于含有二价阳离子作为反荷离子的含琥珀酸的发酵液。
工业实用性根据本发明，从通过发酵或酶法得到的含琥珀酸的液体中可容易地获得高纯度的琥珀酸。
序列表<110>味之素株式会社三菱化学株式会社<120>从发酵液中纯化琥珀酸的方法<130>C2880PC4140<150>JP2003-340091<151>2003-09-30<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>1tttcatatga gcagtagcaa gaaattg27<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2tttcctgcag gttaacgagt aaaaattact tt 32<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3tttctcgagc gcattacctc cttgctactg 30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4tttgaattcg atatcaagct tgcacatcaa 30<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5tttggtaccg acttagataa aggtcta 27<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6tttctcgagt gctggtaaaa caacttt 27<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7tttggtaccg atagcttact ccccatcccc 30<210>8<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8tttggatccc aacatatgaa cacctccttt ttatccgctc acaattccac acat 5
权利要求
1.从含琥珀酸的液体中纯化琥珀酸的方法，所述含琥珀酸的液体含有通过发酵或酶法获得的阳离子，该方法包括将所述含琥珀酸的液体与H-型强酸性阳离子交换树脂进行接触，所述树脂的量等于或大于含琥珀酸的液体中包含的除氢离子之外的阳离子的量，和从得到的经离子交换处理的液体中沉淀琥珀酸的晶体以得到纯化的琥珀酸。
2.权利要求1的方法，其中所述含琥珀酸的液体含有琥珀酸的盐。
3.权利要求2的方法，其中所述琥珀酸的盐选自琥珀酸钠、琥珀酸钾、琥珀酸镁、琥珀酸钙和琥珀酸铵。
4.权利要求3的方法，其中所述含琥珀酸的液体含有碳酸的盐，并将酸加入所述含琥珀酸的液体以调节为pH 5.0或更低，然后与H-型强酸性阳离子交换树脂进行接触。
5.权利要求4的方法，其中经离子交换处理的液体用作所述的酸。
6.权利要求4的方法，其中已经去除沉淀的琥珀酸的经离子交换处理的液体用作所述的酸。
7.产生琥珀酸的方法，其包括将细菌细胞或经过处理的细菌细胞作用于含水反应溶液中的有机原料以获得含琥珀酸的液体，将所述含琥珀酸的液体与H-型强酸性阳离子交换树脂进行接触，所述树脂的量等于或大于含琥珀酸的液体中包含的除氢离子之外的阳离子的量，和从得到的经离子交换处理的液体中沉淀琥珀酸的晶体以得到纯化的琥珀酸。
8.权利要求7的方法，其中所述含水反应溶液用碳酸镁或氢氧化镁进行中和。
全文摘要
通过将含琥珀酸的液体与H－型强酸性阳离子交换树脂进行接触，所述树脂的量等于或大于含琥珀酸的液体中包含的除氢离子之外的阳离子的量，并从得到的经离子交换处理的液体中沉淀琥珀酸的晶体以得到纯化的琥珀酸来产生琥珀酸，所述含琥珀酸的液体中含有琥珀酸和通过发酵或酶法获得的阳离子。
文档编号C12N15/00GK1860237SQ20048002849
公开日2006年11月8日 申请日期2004年9月30日 优先权日2003年9月30日
发明者栉来武, 藤原宪治, 佐藤武, 佐野千明 申请人:味之素株式会社, 三菱化学株式会社