专利名称：用于好气性产芽孢细菌鉴定的寡核苷酸以及使用此寡核苷酸的好气性产芽孢细菌的鉴定 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及可在用于鉴定作为鉴定对象的被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌的PCR中使用的寡核苷酸及其应用，具体地说，涉及上述寡核苷酸、通过以此寡核苷酸为引物进行PCR，检测好气性产芽孢细菌的特异性DNA片段，从而鉴定被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌的方法、及用于进行该鉴定方法的鉴定试剂盒。
背景技术：
以往，分类鉴定细菌的方法，已知的有根据生理生化性状的方法，根据醌组成、菌体脂肪酸组成、细胞壁成分等的方法，根据DNA的G+C含量的方法，根据DNA同源性的方法，使用DNA探针的方法，及进行16S核糖体RNA基因的碱基序列分析的方法等。
特别是近年来，通过以16S核糖体RNA基因的碱基序列为基础进行系统分类，把所得到的菌群(簇)作为指标进行细菌的分类·识别，已成为普遍的方法。
可是，以芽孢杆菌属(Bacillus)为首的好气性产芽孢细菌广泛分布于土壤、水、空气等的自然界中。芽孢杆菌属中，对人体显示病原性的细菌，已知有炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、引起食物中毒的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)等。而且，关于含有芽孢杆菌属的好气性产芽孢细菌的系统分类及分类体系，例如，非专利文献1[信太治，《好气性产芽孢细菌的分类与鉴定》，日本清凉饮料(Soft Drinks)技术资料2001年3号，221-227]中所述的，芽孢杆菌属以外的各属也已为人所知。这些好气性产芽孢细菌具有形成芽孢的特征，但因其芽孢的耐热性和抗药性强，所以杀菌难，且从食品工厂的制造过程中完全去除是很困难的。故而，多数情况下，可在食品工厂的工序检查等中分离出好气性产芽孢细菌。
因此，例如，在食品制造工场中，从产品及制造过程中分离细菌时，为探明污染原因，很重要的是鉴定被分离细菌是否形成芽孢。所以，特别是在食品行业中，期望能迅速鉴定从产品或制造过程中分离的细菌是否形成芽孢。
一般地，被分离的细菌是否是好气性产芽孢细菌，常用的鉴定方法是在芽孢形成培养基上培养作为鉴定对象的被鉴定菌(供试菌)，再用显微镜确认该菌体是否形成芽孢。此方法中，因必须在芽孢形成培养基上培养被鉴定菌，所以到鉴定出为止需数日到1星期的非常长的时间。在此一般的鉴定方法中，通过缩短检测鉴定时间(培养时间)，虽可某种程度上缩短时间，但此时有可能检测不出增殖速度慢的菌株，所以风险性较大。
为此，在上述一般的鉴定方法中，为能可靠地鉴定好气性产芽孢细菌，就需要长时间的培养。所以，上述鉴定方法，可以说对特别需要迅速性的食品行业出厂前的检查是不适合的。
上述一般的鉴定方法以外，鉴定属于好气性产芽孢细菌的细菌的技术，例如，专利文献1[日本国公开专利公报《日本特开平9-94100号公报》(
公开日1997年4月8日)]及非专利文献2[Shida，O et al.，Proposal forTwo New Genera，Brevibacillus gen.nov.and Aneurinibacillus gen.nov.，International Journal of Systematic Bacteriology，939-946(1996)]中所公开的方法。此技术中，把具有属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)等好气性产芽孢细菌的、细菌的16S核糖体RNA基因中存在的特异性碱基序列DNA作为引物，以从被鉴定细菌中获得的染色体DNA为模板，使用PCR法，将特定的DNA的扩增作为指标，从而进行被鉴定细菌的属水平的鉴定。
另外，已知利用16S核糖体RNA基因的芽孢杆菌属细菌的分类技术，如非专利文献3(Goto，K et al.，Application ofthe partial 16S rDNA sequence asan index for rapid identification of species in the genus Bacillus，The Journal ofGeneral and Applied Microbiology，46，1-8(2000))中公开的方法。被称作16S核糖体RNA基因的高变区[hypervariable region(HV region)]的5’侧的约275bp是种特异性区域，所以，此技术中，通过进行此区域的碱基序列分析，可进行芽孢杆菌细菌属细菌的分类。
其他，在专利文献2[日本国专利公报《日本特公平7-89956号公报》(公告日1995年10月4日、对应日本国公开专利公报《日本特开平3-49696号公报》(
公开日1991年3月4日))]中记载了通过使用来源于蜡状芽孢杆菌的、β-内酰胺酶基因检测用的引物检测出该基因，从而检测出蜡状芽孢杆菌的方法。
但是，因目前还没有迅速且包罗地鉴定是否是形成芽孢的好气性产芽孢细菌的有效方法，所以，期望开发可用于特别需要迅速性的食品行业出厂前检查等的技术。
具体地说，首先，上述专利文献1及非专利文献1中所述的方法，从一开始就不是用于食品行业出厂前检查等的技术，而是重点放在细菌鉴定的技术。因此，此方法，虽然由于PCR法检测可担保迅速性，但由于是属特异性方法，所以需采用适应各个属的引物，不仅操作繁杂，而且还会产生对于检测不出来的属的细菌不能适用的问题。
另外，上述非专利文献3中所述的方法，在鉴定芽孢杆菌属的种时有效，对其他属的细菌不适用，而上述专利文献2中所述的方法，只对蜡状芽孢杆菌的检测有效。
因此，迄今为止，虽已有比较迅速地检测(或鉴定)某一特定属的好气性产芽孢细菌的技术，但迅速且包罗地鉴定好气性产芽孢细菌的技术却还不为人所知。
发明内容
本发明鉴于上述问题点，其目的在于，提供可优选适用于能迅速且包罗地鉴定好气性产芽孢细菌的方法的寡核苷酸，及通过以该寡核苷酸为引物进行扩增反应，检测出对于好气性细菌的特异性DNA片段，从而鉴定被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌的方法，以及进行该鉴定方法的试剂盒。
本发明者等为解决上述课题，着眼于芽孢杆菌属及其近缘的好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因中比较共通的碱基序列区域，进行了锐意研究。其结果，通过将与本发明有关的寡核苷酸用于引物进行PCR扩增，发现了对于以芽孢杆菌属为首的好气性产芽孢细菌，约100bp长度的特异性DNA片段得到了扩增，使本发明得以完成。即本发明包含以下发明。(1)寡核苷酸，其含有对于好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因的特异性碱基序列或该碱基序列的互补序列，且上述特异性碱基序列是序列号1～6中所示的碱基序列的任一个。
(2)(1)中所述的寡核苷酸，其中，上述好气性产芽孢细菌属于从芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、硫胺素芽孢杆菌属、土芽孢杆菌属、环脂酸芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属、枝芽孢杆菌属、喜盐芽孢杆菌属、Gracillibacillus属、Salibacillus属、Marinibacillus属及芽孢乳杆菌属细菌中选择的至少1种的细菌。
(3)好气性产芽孢细菌的鉴定方法，其把由鉴定对象的被鉴定菌制备的核酸作为被检样本使用，把以该被检样本为模板、进行PCR反应时所得到的特定DNA片段的扩增作为指标，鉴定上述被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌，且用于PCR反应的引物，使用含有对好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因特异的碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸的至少1种，同时，上述特异性碱基序列是序列号1～6中所示的碱基序列的任一个。
(4)(3)中所述的好气性产芽孢细菌的鉴定方法，其中，上述引物中，含有序列号1或2中所述的碱基序列或其碱基序列的互补序列的寡核苷酸作为正义引物使用，同时，含有序列号3～6中任一个所示的碱基序列或其碱基序列的互补序列的寡核苷酸作为反义引物使用。
(5)(3)或(4)中所述的好气性产芽孢细菌的鉴定方法，其中上述正义引物及反义引物的至少一方，使用2种或大于2种的含有上述特异性碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸。
(6)(3)～(5)中任一项所述好气性产芽孢细菌的鉴定方法，其中，被扩增的上述特定的DNA片段具有通过凝胶电泳分离，可在0.1kb附近被检测出的长度。
(7)(3)～(6)中任一项所述好气性产芽孢细菌的鉴定方法，其中上述好气性产芽孢细菌属于从芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、硫胺素芽孢杆菌属、土芽孢杆菌属、环脂酸芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属、枝芽孢杆菌属、喜盐芽孢杆菌属、Gracillibacillus属、Salibacillus属、Marinibacillus属及芽孢乳杆菌属细菌中选择的至少1种的细菌。
(8)鉴定试剂盒，其用于进行(3)～(7)中任一项所述的好气性产芽孢细菌的鉴定方法。
(9)好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒，其把由鉴定对象的被鉴定菌制备的核酸作为被检样本使用，把以该被检样本为模板、进行PCR反应时所得到的特定DNA片段的扩增作为指标，用于鉴定上述被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌，且用于PCR反应的引物，含有对好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因特异的碱基序列或该碱基序列的互补序列，且含有该特异性碱基序列是序列号1～6中所示的碱基序列的某一个的寡核苷酸的至少1种。
(10)(9)中所述的好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒，其中，还含有用作凝胶电泳用标记物的、包含多种不同长度的指标用DNA片段的DNA片段混合物，并在该DNA片段混合物中，含有具有0.1kb长度的指标用DNA片段。
(11)(9)或(10)中所述好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒，其中，还含有由被鉴定菌制备核酸时的试剂组。
(12)(9)～(11)中任一项所述的好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒，其中，还含有用于PCR反应的试剂。
通过如下所示的说明可充分理解本发明其他的目的、特征及优点。另外，通过参照附图的如下说明也可非常明确本发明的益处。
图1是表示为获得与本发明有关的寡核苷酸，比较各种细菌的16S核糖体RNA基因的碱基序列的结果、和当作指标的特定DNA片段区域的示意图。
图2是表示在实施例1中，使用与本发明有关的寡核苷酸作为引物，以好气性产芽孢细菌及其其他的细菌的基因组DNA为模板进行PCR时、扩增产物的电泳结果的示意图。
图3是表示在实施例2中，使用与本发明有关的寡核苷酸作为引物，以从食品制造环境中分离的未鉴定细菌2株No.1及No.2的基因组DNA为模板进行PCR时、扩增产物的电泳结果的示意图。
具体实施例方式
根据图1对本发明的实施方式之一进行下述详细说明，但本发明不限于下述内容。
本发明的方式中，按与本发明有关的寡核苷酸、使用此寡核苷酸的与本发明有关的好气性产芽孢细菌的鉴定方法(以下，有时只简称为鉴定方法)、以及与本发明有关的好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒(以下，有时只简称为鉴定试剂盒)的顺序，详细说明本发明。
(1)与本发明有关的寡核苷酸与本发明有关的寡核苷酸，含有对好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因特异的碱基序列或该碱基序列的互补序列，具体地说，上述特异性碱基序列，是含有把序列号1～6中所示的碱基序列的某一个作为上述特异性碱基序列的寡核苷酸。
上述寡核苷酸只要是含有序列号1～6中任一项所示的碱基序列或该碱基序列的互补序列，均无特别限定。更具体地说，例如，可为以下6种寡核苷酸(a)～(f)。
(a)具有如下所示的碱基序列(序列号1)，含有24个碱基。
寡核苷酸(a)(5′)d-ACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGGG(3′)(b)具有如下所示的碱基序列(序列号2)，含有24个碱基。
寡核苷酸(b)(5′)d-ACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGG(3′)(c)具有如下所示的碱基序列(序列号3)，含有22个碱基。
寡核苷酸(c)(5′)d-TTGAGTTTCAGTCTTGCGAGCG(3′)(d)具有如下所示的碱基序列(序列号4)，含有22个碱基。
寡核苷酸(d)(5′)d-TTGAGTTTCAGTCTTGCGACCG(3′)(e)具有如下所示的碱基序列(序列号5)，含有22个碱基。
寡核苷酸(e)(5′)d-TTGAGTTTCACTCTTGCGAGCG(3′)(f)具有如下所示的碱基序列(序列号6)，含有22个碱基。
寡核苷酸(f)(5′)d-TTGAGTTTCACTCTTGCGACCG(3′)与本发明有关的寡核苷酸，不限于上述(a)～(f)，也可为具有序列号1～6中任一项所示的碱基序列以外的、具有其碱基序列的互补序列的物质。并且，在与本发明有关的寡核苷酸中，也可含有序列号1～6中任一项所示的碱基序列及其碱基序列的互补序列以外附加的碱基序列。特别是在与本发明有关的寡核苷酸中，也可以在序列号1～6中任一项所示的碱基序列及其碱基序列的互补序列中进行改变，使1～3个范围内的碱基被取代、缺失、插入及/或添加。
与本发明有关的寡核苷酸的获得方法无特别限定。具体地说，可用公知的方法化学合成序列号1～6中任一个碱基序列或互补序列。
与本发明有关的寡核苷酸优选作为PCR的引物使用，但其碱基序列及长度(大小)，如后述实施例所示，使用BLAST数据库测定。具体地说，首先，从数据库(BLAST)中，抽取Bacillus属及其近缘的芽孢形成细菌及非芽孢形成细菌的16S核糖体RNA基因序列。之后使用VectorNTI的AlignX基因分析软件进行比对，并选出与好气性产芽孢细菌比较共通的区域。
在这些多种的区域中，使之尽量满足适合作为如下所示的引物的各条件，并确定其碱基序列和长度。
1.适当的长度(大小)为20～25碱基。
2.G+C(鸟嘌呤+胞嘧啶)含量优选50％左右。
3.考虑到引物间的互补性，为防止二聚体形成，避开3’末端互补的引物。
4.为避免在引物内形成二级结构，不能含有自体互补序列。
5.尽量选择2种引物的Tm值接近的引物。
其结果，通过如图1所示的比对，设计了上述寡核苷酸(a)～(f)。在同一图中作为“DNA扩增区域”所示的区域相当于用于判断鉴定对象的被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌时的被当作指标的“特定的DNA片段”。且，在同一幅图的左侧，Paenib validus以上(图中线的上侧)，表示Bacillus属及其近缘的芽孢形成细菌的学名，Staphy aureus以下(图中线的下侧)表示非芽孢形成细菌的学名，网线部分表示具有同源性的碱基。另外，同图下方的箭头中，用F表示的箭头是对应于寡核苷酸(a)·(b)的区域，用R表示的箭头是对应于寡核苷酸(c)～(f)的区域。
(2)与本发明有关的好气性产芽孢细菌的鉴定方法与本发明有关的好气性产芽孢细菌的鉴定方法，是通过把(1)中说明的上述寡核苷酸(a)～(f)作为引物进行PCR反应，使特定的DNA片段扩增，从而以其为指标进行鉴定的方法。
具体地说，在与本发明有关的鉴定方法中，最好包含至少把上述寡核苷酸(a)～(f)作为引物、以进行PCR反应的“PCR过程”，和鉴定由PCR过程获得的PCR产物中，是否含有被扩增的特定DNA片段的“DNA片段扩增确认步骤”，而且还可包含“被检样本制备步骤”等的其他的步骤。
<好气性产芽孢细菌>
在本发明中当作鉴定对象的好气性产芽孢细菌，具体地说，只要是芽孢杆菌(Bacillus)属及其近缘的细菌，无特别限定，但具体地说，例如，可例举为芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、环脂酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、Gracillibacillus属、Salibacillus属、Marinibacillus属、芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)等的细菌。上述好气性产芽孢细菌，其好气性产芽孢细菌具有形成芽孢的特征。
上述各好气性产芽孢细菌，根据其分子系统等，可分类成为多个亚菌群。具体地说，例如，可例举为芽孢杆菌属的各种亚菌群；环脂酸芽孢杆菌属的亚菌群；类芽孢杆菌属的亚菌群；短芽孢杆菌属的亚菌群；硫胺素芽孢杆菌属的亚菌群；土芽孢杆菌属的亚菌群；枝芽孢杆菌属、喜盐芽孢杆菌属、Gracillibacillus属、及Salibacillus属的亚菌群；双芽孢杆菌属及芽孢乳杆菌属的亚菌群等。本发明对于鉴定上述任一个亚菌群的好气性产芽孢细菌的用途均可适用。
上述各好气性产芽孢细菌中，芽孢杆菌属的各种、类芽孢杆菌属、硫胺素芽孢杆菌属、土芽孢杆菌属、环脂酸芽孢杆菌属及短芽孢杆菌属的各亚菌群，是特别在食品关系上经常被分离的细菌，针对这些好气性产芽孢细菌的鉴定，可特别优选使用本发明。
与本发明有关的鉴定方法中，如上述寡核苷酸(a)～(f)等，把含有对好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因特异的碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸作为引物使用。因此，可包罗地鉴定被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌。
所以，与本发明有关的鉴定方法，因与特定个别属的以往的技术不同，可迅速地鉴定被鉴定菌是否是形成芽孢的菌，特别在食品行业，可作为迅速鉴定从产品或制造过程中检测出的细菌是否形成芽孢的检查方法，优选使用。
<PCR步骤>
PCR步骤是以由鉴定对象的被鉴定菌制备的核酸为被检样本，并以该被检样本为模板进行PCR反应的步骤，此时，使用与本发明有关的寡核苷酸，例如上述寡核苷酸作为引物。
在此，上述引物中，含有序列号1或2中所示的碱基序列或其碱基序列的互补序列的寡核苷酸可作为正义引物使用。具体地说，上述寡核苷酸(a)～(f)中，寡核苷酸(a)及/或(b)作为正义引物使用。另外，含有序列号3～6中任一个所示的碱基序列或其碱基序列的互补序列的寡核苷酸可作为反义引物使用。具体地说，上述寡核苷酸(a)～(f)中，寡核苷酸(c)、(d)、(e)及(f)中的至少一个可作为反义引物使用。
并且，在上述正义引物或反义引物或其任一个引物中，可以只使用1种寡核苷酸，也可以使用2种或大于2种的寡核苷酸。具体地说，作为正义引物，可以只使用寡核苷酸(a)或(b)，也可两者均使用。同样，作为反义引物，可使用寡核苷酸(c)～(f)中的任一个，也可使用4种中的2种或大于2种。
在PCR步骤中，用于PCR的试剂、装置或PCR反应的条件无特别限定，试剂可优选使用市场销售的PCR试剂盒或装置，反应温度、反应时间、循环次数等条件可对应于PCR试剂盒或装置的种类适宜设定。
<DNA片段扩增确认步骤>
只要是在上述PCR步骤中所得到的PCR产物中，鉴定是否有被扩增的特定DNA片段的步骤的DNA片段扩增确认步骤，均无特别限定。在与本发明有关的鉴定方法中，以上述特定DNA片段的扩增为指标，可鉴定当作鉴定对象的被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌。
确认上述特定DNA片段的扩增的方法，无特别限定，但一般优选使用凝胶电泳法的方法。通过凝胶电泳的方法，是在使用核酸的实验中一般被广泛使用的技术，可准确且有效地分离DNA、RNA等核酸的同时，还可通过凝胶的染色确认其大小(长度)。对于进行凝胶电泳法的装置或电泳条件无特别限制，可优选使用市场销售的电泳装置等，并用适应于该装置的条件进行电泳即可。
在DNA片段扩增确认步骤中确认的上述特定DNA片段的长度，从图1所示的“DNA扩增区域”中也可明确知道，为约100bp。换句话说，被扩增的上述特定的DNA片段，通过凝胶电泳分离，具有在0.1kb附近被检测出的长度。例如，如图1所示的实例中，101个碱基被扩增了。由于好气性产芽孢细菌的种类不同，且考虑到该区域中发生碱基的缺失或添加，所以至少具有90～110bp范围内、优选为100bp～110bp范围大小的DNA片段可被扩增。换句话说，只要在上述范围内，即可看做具有0.1kb的大小。因此，在DNA片段扩增确认步骤中，只需确认是否能检测出具有通过凝胶电泳分离而可在0.1kb附近被检测出的长度的DNA片段即可。
<其他步骤>
与本发明有关的鉴定方法中，只要包含上述PCR步骤及DNA片段扩增确认步骤即可，但也可包含其他步骤，例如被检样本制备步骤。
被检样本制备步骤，在上述PCR步骤的前段，由一定量的被鉴定菌利用公知的方法制备染色体DNA等的核酸即可。通过菌体的核酸的制备方法无特别限定，因可优选使用公知的方法，所以最好利用市场销售的DNA制备试剂盒等。
其他，也可包含、把从检查对象的产品或制造过程中的机械·装置等中分离的被鉴定菌进行一定量培养的被鉴定菌培养过程等。此时的培养基或培养条件也无特别限定，可适宜选择公知的培养基或培养条件。
(3)与本发明有关的好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒与本发明有关的好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒，只要是进行(2)中说明的上述好气性产芽孢细菌的鉴定方法的鉴定试剂盒均可。具体地说，作为用于PCR反应的引物，可例举为，至少是含有包含对好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因特异性的、序列号1～6中任一个的碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸的组成，优选为包含进行上述各步骤的试剂类等的组成。
例如，与本发明有关的鉴定试剂盒中，含有上述序列号1～6中任一个碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸，作为正义引物最好包含上述寡核苷酸(a)·(b)的至少一方，作为反义引物最好包含寡核苷酸(c)～(f)的至少任一个。上述寡核苷酸，只要能作为PCR反应的引物使用，可为任何状态，例如，也可为溶解于缓冲液的溶液状态。
与本发明有关的鉴定试剂盒，可包含用于实施上述各过程的试剂类等，此种试剂类可例举为，用于PCR反应的试剂组、用于确认DNA片段扩增的试剂组、由被鉴定菌制备核酸时的试剂组、用于培养被鉴定菌的试剂组等。这些试剂组至少含有1种为好。且此处所述的试剂组，最好含有用于上述过程实施的试剂、实验用材料、或1次性实验用具等的2种或大于2种。
用于PCR的试剂组，具体地说，可例举为dNTP、Taq聚合酶(polymerase)、及用于Taq聚合酶(polymerase)的缓冲液(Taq Buffer)等。其他，根据需要，还可添加微型离心管等的试验用材料。
用于确认DNA片段扩增的试剂组，通过凝胶电泳确认扩增时，可例举为用于制成电泳用凝胶的琼脂糖、缓冲液、凝胶电泳用标记物等。其中，凝胶电泳用标记物，虽最好含有多种不同长度的用作指标的DNA片段的DNA片段混合物，但该DNA片段混合物中，需含有具有0.1kb长度的用作指标的DNA片段。如上所述，作为鉴定指标的特定的DNA片段，因具有约100bp的大小，所以非常优选在凝胶电泳用标记物中，含有在电泳上、可明确区分出此大小的条带的指标用DNA片段。并且，用于此凝胶电泳用标记物的DNA片段的来源，无特别限定。
其他，由被鉴定菌制备核酸时的试剂组，可例举为公知的DNA制备试剂盒，用于培养被鉴定菌的试剂组，可例举为培养基或其原料。
(4)本发明的用途与本发明有关的寡核苷酸及使用其的鉴定方法、以及鉴定试剂盒的用途无特别限定，可用于鉴定好气性产芽孢细菌所需的全部用途。具体地说，例如，由于微生物污染而对质量造成很大影响的各种工业产品的制造工序中，鉴定从同工业产品或其制造环境等中分离的菌是否是好气性产芽孢细菌的场合时，可优选使用。
成为鉴定对象的被鉴定菌来源的上述工业产品，代表的可例举为食品、饮料、医药品·试剂·医药保健品、一次性医疗器具等，但无特别限定。上述食品，更具体地说，可例举为面包、日式西式点心(包含冷点心)、副食食品、乳制品、谷类早餐食品、豆腐·油炸豆腐类、面食类、盒饭类、调料、小麦粉或肉食等的农产品加工品、营养辅助食品(营养补充食品等)、可长期保存的食品(罐头、冷冻食品、高温蒸煮食品等)，但无特别限定。饮料，更具体地说可例举为各种清凉饮料、矿泉水、牛乳·乳饮料、清酒、啤酒、发泡酒等，但无特别限定。医药品·试剂·医药保健品，更具体地说，例如可为面向各种医疗机构的医药品、各种大众药、临床检查药、试验用试剂类、其他检查药的全部等，但无特别限定。一次性医疗器具更具体地说，例如，可为注射器等，但无特别限定。
工业产品的制造设备中，空中浮游菌也好、表面附着菌也好、其他菌也好，均可当作被鉴定菌。空中浮游菌的分离，可采用平板沉降法、空气浮游菌采样器法等的方法，但无特别限定。表面附着菌的分离中，可使用抹片试验法、stampagar method等的方法，但无特别限定。
且本发明并不限于以上所述的各构成，在专利要求范围所示的范围内可进行种种变更，适当组合不同的实施形态中各种被公开了的技术手段后所得到的实施形态，也包含于本发明的技术范围内。
以下，将本发明以实施例、图2及图3为基础更具体地说明，但本发明不限于此。
〔实施例1引物的好气性产芽孢细菌检测力的测定〕使用鉴别芽孢杆菌属(Bacillus属)及对其近缘的好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因特异的基因序列后设计的引物、进行PCR，并评价了是否可检测出好气性产芽孢细菌及其以外的细菌。
<被检样本制备过程>
使用与芽孢杆菌属(Bacillus属)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus属)、环脂酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus属)、及芽孢杆菌属(Bacillus属)细菌的基因序列比较类似的非芽孢形成细菌。被检样本所使用的细菌如表1所示。用对上述各菌株最适的培养条件培养的菌株，使用基因组DNA纯化试剂盒(Edge Biosystems公司制)，根据添加方案，制备了基因组DNA。
〔表1〕<Bacillus属细菌>
1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(IFO13719)
2球形芽孢杆菌(B.sphaericus)(NBRC15095)3蜡状芽孢杆菌(B.cereus)(IAM12605)4凝结芽孢杆菌(B.coagulans)(IAM12463)5巨大芽孢杆菌(B.megaterium)(JCM2506)<Bacillus属的近缘好气性产芽孢细菌>
6Paenibacillus validus(BUB75)7Paenibacillus illinoisensis(IFO15379)8Aneurinibacillus aneurinolyticus(IAM1077)9酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)(ATCC49025)10酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)(JCM5260)<非芽孢形成细菌>
11金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC9144)12头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)(ATCC27840)13唾液链球菌(Streptococcus salivarius)(SAM0180)14德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)(IAM1928)<引物的设计与合成>
从数据库(BLAST)中抽取芽孢杆菌属(Bacillus属)与其近缘的好气性产芽孢细菌[例如，类芽孢杆菌属(Paenibacillus属)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus属)、土芽孢杆菌属(Geobacillus属)、环脂酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus属)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus属)等]、及非芽孢形成细菌的16S核糖体RNA基因序列，使用VectorNTI的AlignX的基因分析软件进行比对，选出与好气性产芽孢细菌比较共同的区域。其中，选择序列号1～6的序列，化学合成与其具有同样序列的寡核苷酸，并作为引物使用。以下，将各引物分别称作寡核苷酸(a)～(f)。
<PCR步骤·DNA片段扩增确认步骤>
以上述基因组DNA为模板，使用上述寡核苷酸(a)～(f)，制备了表2所示的样品后进行PCR反应。且PCR反应使用Biometra公司制的TGRAGIENT进行，PCR条件如表3所示。PCR反应结束后，根据Agilent2100生物分析仪(Agilent Technologies公司制)中附加的方案进行分析，确认了DNA的扩增带及其扩增带的大小。
<结果>
通过生物分析仪进行电泳的结果如图2所示。图2中分别表示了泳道1是分子量marker，泳道2是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(IFO13719)的结果，泳道3是球形芽孢杆菌(B.sphaericus)(NBRC15095)的结果，泳道4是蜡状芽孢杆菌(B.cereus)(IAM12605)的结果，泳道5是凝结芽孢杆菌(B.coagulans)(IAM12463)的结果，泳道6是巨大芽孢杆菌(B.megaterium)(JCM2506)的结果，泳道7是Paenibacillus validus(BUB75)的结果，泳道8是P.illinoisensis(IFO15379)的结果，泳道9是Aneurinibacillus aneurinolyticus(IAM1077)的结果，泳道10是酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)(ATCC49025)的结果，泳道11是酸热脂环酸芽孢杆菌(A.acidocaldarius)(JCM5260)的结果，泳道12是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC9144)的结果，泳道13是头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)(ATCC27840)的结果，泳道14是唾液链球菌(Streptococcus salivarius)(SAM0180)的结果，以及泳道15是德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)(IAM1928)的结果。
图2中只有泳道2～11中所示的好气性产芽孢细菌在100bp附近检测出了扩增带，而显示了好气性产芽孢细菌以外的细菌结果的泳道12～15中，未检测出100bp附近的扩增带。因此，具有约100bp大小的DNA片段，对好气性产芽孢细菌具特异性，可以说，将此DNA片段的有无作为指标，可很容易地判断出是否是好气性产芽孢细菌。
〔实施例2从食品制造环境中分离的未鉴定细菌株的检测鉴定〕对于未鉴定细菌株，通过将有无100bp的DNA片段作为指标判断是否是好气性产芽孢细菌的结果，与该细菌的鉴定结果比较，探讨了与本发明有关的好气性产芽孢细菌的检测鉴定方法的妥当性。
<被检样本制备步骤>
把从食品制造环境中分离的未鉴定细菌2株(No.1及No.2)置于胰酪蛋白胨大豆琼脂培养基(BBL公司制)中，于35℃，好气条件下培养。挑取培养基上的菌体1个菌落，使用Genomic DNA Purification Kit(Edge<p>10B.纵向病例
No.1中，在100bp附近检测出扩增带，可判定该细菌是好气性产芽孢细菌。而且用显微镜观察时，也确认了芽孢的形成。另外，使用Api50CHB(日本Biomerieux公司制)，根据附加的方案，进行该细菌的鉴定时，鉴定出是好气性产芽孢细菌的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。因此与以100bp的扩增带为指标进行判断的结果一致。
另外，在No.2中，100bp附近未检测出扩增带，可判定其不是好气性产芽孢细菌。对于该细菌的16S核糖体RNA基因的部分碱基序列进行测序鉴定时，判明了其不是好气性产芽孢细菌，而是甲基杆菌属(Methylobacterium)细菌。因此，No.2与以100bp的扩增带为指标进行判断的结果一致，可说明将有无100bp附近的扩增带作为指标，以检测鉴定是否是好气性产芽孢细菌的方法是妥当的。
由以上结果，以与本发明有关的寡核苷酸(a)～(f)为引物、进行PCR扩增等的扩增反应时，由特异性DNA片段(约100bp)是否被扩增，可简便地鉴定被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌。也就是说，与本发明有关的鉴定方法，是好气性产芽孢细菌的有效的检测及鉴定手段。同时，也可以说，如将含有的上述寡核苷酸试剂盒化，即可提供好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒。
并且，在
具体实施方式
中举出的具体实施形态或实施例，无论如何也只不过是明确本发明技术内容的内容，而不应狭义地理解为只限于其具体实例，在本发明的精神和以下所述的权利要求的范围内，可进行各种变更。
通过以与本发明有关的寡核苷酸为引物，以从被鉴定菌中获得的染色体DNA等为模板，进行PCR扩增等的扩增反应，可扩增芽孢杆菌属及其近缘的好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因中存在的特异性DNA片段。由此，通过上述的扩增反应，由该特异性DNA片段(约0.1kb)是否被扩增，可迅速地鉴定出被鉴定菌是否是芽孢杆菌属及其近缘的好气性产芽孢细菌。另外，通过将含有的上述寡核苷酸试剂盒化，可提供好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒。
因此，根据本发明，可迅速且包罗地进行至今为止认为困难的好气性产芽孢细菌的检测，且行之有效。
迄今为止，为鉴定是否是形成芽孢的细菌(好气性产芽孢细菌)时，必须在芽孢形成培养基上培养被鉴定菌，再用显微镜确认该菌是否形成了芽孢。所以，到鉴定出为止，需要数日～1星期的非常长的时间。而根据本发明，半日左右即可鉴定出是否是好气性产芽孢细菌，使简便且迅速地鉴定出是否是好气性产芽孢细菌成为可能。
所以，本发明可利用于食品制造业、饮食行业、药品行业等的卫生管理、过程管理、质量管理。并且，万一检测出有微生物污染时，也可通过迅速鉴定该细菌是否是好气性产芽孢细菌，而可针对情况迅速采取措施。
序列表<110>三得利株式会社<120>用于好气性产芽孢细菌鉴定的寡核苷酸以及使用此寡核苷酸的好气性产芽孢细菌的鉴定方法和鉴定试剂盒<130>p03-0094<150>JP 2003-346167<151>2003-10-3<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>1acgatgagtg ctaagtgttg gggg 24<210>2<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>2acgatgagtg ctaggtgttg gggg 24<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>3ttgagtttca gtcttgcgag cg 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>4ttgagtttca gtcttgcgac cg 22<210>5<211>22<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>5ttgagtttca ctcttgcgag cg 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述人工合成的序列<400>6ttgagtttca ctcttgcgac cg 2
权利要求
1.寡核苷酸，其特征在于，含有对好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因特异的碱基序列或该碱基序列的互补序列，且上述特异性碱基序列是序列号1～6中所示的碱基序列的任一个。
2.权利要求1中所述的寡核苷酸，其特征在于，上述好气性产芽孢细菌属于从芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、硫胺素芽孢杆菌属、土芽孢杆菌属、环脂酸芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属、枝芽孢杆菌属、喜盐芽孢杆菌属、Gracillibacillus属、Salibacillus属、Marinibacillus属及芽孢乳杆菌属细菌中选择的至少1种的细菌。
3.好气性产芽孢细菌的鉴定方法，其特征在于，把由鉴定对象的被鉴定菌制备的核酸作为被检样本使用，把以该被检样本为模板进行PCR反应时所得到的特定DNA片段的扩增作为指标，鉴定上述被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌，用于PCR反应的引物，使用含有对好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因特异的碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸的至少1种，同时，上述特异性碱基序列是序列号1～6中所示的碱基序列的任一个。
4.权利要求3中所述的好气性产芽孢细菌的鉴定方法，其特征在于，上述引物中，含有序列号1或2中所示的碱基序列或其碱基序列的互补序列的寡核苷酸作为正义引物使用，同时，含有序列号3～6中任一个所示的碱基序列或其碱基序列的互补序列的寡核苷酸作为反义引物使用。
5.权利要求3或4中所述的好气性产芽孢细菌的鉴定方法，其特征在于，上述正义引物及反义引物的至少一方，使用2种或大于2种的含有上述特异性碱基序列或该碱基序列的互补序列的寡核苷酸。
6.权利要求3～5中任一项所述好气性产芽孢细菌的鉴定方法，其特征在于，被扩增的上述特定的DNA片段具有通过凝胶电泳分离，可在0.1kb附近被检测出的长度。
7.权利要求3～6中任一项所述好气性产芽孢细菌的鉴定方法，其特征在于，上述好气性产芽孢细菌属于从芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、硫胺素芽孢杆菌属、土芽孢杆菌属、环脂酸芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、双芽孢杆菌属、枝芽孢杆菌属、喜盐芽孢杆菌属、Gracillibacillus属、Salibacillus属、Marinibacillus属及芽孢乳杆菌属细菌中选择的至少1种的细菌。
8.鉴定试剂盒，其用于进行权利要求3～7中任一项所述的好气性产芽孢细菌的鉴定方法。
9.好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒，其特征在于，把由鉴定对象的被鉴定菌制备的核酸作为被检样本使用，把以该被检样本为模板进行PCR反应时所得到的特定的DNA片段的扩增作为指标，鉴定上述被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌，用于PCR反应的引物，含有对好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因特异的碱基序列或该碱基序列的互补序列，且该特异性碱基序列是序列号1～6中所示的碱基序列的某一个的寡核苷酸的至少1种。
10.权利要求9中所述的好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒，其特征在于，还含有作为凝胶电泳用标记物使用，且包含多种长度不同的用作指标的DNA片段的DNA片段混合物，且该DNA片段混合物中，含有具有0.1kb长度的用作指标的DNA片段。
11.权利要求9或10中所述好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒，其特征在于，还含有由被鉴定菌制备核酸时的试剂组。
12.权利要求9～11中任一项所述的好气性产芽孢细菌的鉴定试剂盒，其特征在于，还含有用于PCR反应的试剂组。
全文摘要
本发明涉及的寡核苷酸，含有对好气性产芽孢细菌的16S核糖体RNA基因特异的碱基序列或该碱基序列的互补序列，且上述特异性碱基序列是序列号1～6中所示的碱基序列的任一个。此寡核苷酸用作，以由鉴定对象的被鉴定菌制备的核酸为被检样本，以该被检样本为模板进行PCR反应时的引物。由此，以特定的DNA片段的扩增为指标，可鉴定被鉴定菌是否是好气性产芽孢细菌。
文档编号C12N15/11GK1863925SQ20048002880
公开日2006年11月15日 申请日期2004年9月29日 优先权日2003年10月3日
发明者山中实喜子, 村田将一 申请人:三得利株式会社