专利名称：由干细胞分化诱导心肌细胞的方法
技术领域：
本发明涉及由ES细胞等多能性干细胞选择性地且高效率地制备心肌细胞的方法，以及通过该方法得到的再生医疗用细胞。
背景技术：
一般来说，心肌细胞在出生前边进行自律搏动，边活跃地进行细胞分裂，从刚出生后就丧失了其分裂能力，另外由于不具有未分化的前体细胞，所以因暴露于心肌梗塞或心肌炎等各种压力下，一旦导致心肌细胞死亡，丧失的心肌细胞不能补充。结果残存心肌细胞通过代偿性肥大虽然能够维持心功能，但各种压力仍持续存在，一旦超过其容许范围，会进一步诱使心肌细胞疲惫、死亡，表现出心肌功能低下(即，心力衰竭)的状态。
以心力衰竭为首的心脏病已成在日本成为位居第二的死亡原因，其预后也非常差，心脏疾病患者的5年生存率为50％左右。因此，认为治疗效果好的心力衰竭治疗法的开发与医疗福利的巨大进步以及医疗经济的改善紧密相关。作为心力衰竭治疗药，以往一直使用使心肌收缩力增加的洋地黄制剂或黄嘌呤制剂等强心剂，已知这些药剂长期服用，由于心肌能量的过度消耗，会使病情恶化。而最近，虽然使用可通过交感神经系统或肾素-血管紧张素系统的亢进来减轻过度的心脏负荷的β抑制剂和ACE阻碍药进行治疗已经成为主流，这些药物不过是对症的治疗法，并不是可使受到伤害的心组织本身恢复的药物。此外，心脏移植是对于重症心力衰竭的根本治疗法，但由于脏器提供者不足以及医疗伦理、患者肉体的、经济的负担重等问题，难以将本法作为一般的治疗法经常使用。
因此，认为对衰弱的或丧失的心肌细胞进行补充性移植的方法对于心力衰竭的治疗非常有用。事实上，在使用动物的实验中，已知从胎儿取得未成熟的心肌细胞，将它移植到发育成熟心脏组织，移植细胞可作为心肌细胞起到有效作用(参照非专利文献1)。然而，难以用该方法取得大量心肌细胞，从伦理观点看，也难以应用到临床医疗。
因此，由未分化干细胞分化诱导心肌细胞，将该细胞作为移植用细胞而进行利用的方法近年来特别引人注目。目前，由于尚未发现能明确鉴定为可作为在发育成熟心脏组织中能产生心肌细胞的前体细胞或干细胞的细胞集团，为了实施上述方法，考虑使用更为未分化的而且具有多种细胞分化能力的多能性干细胞。
所谓多能性干细胞(pluripotent stem cells)被定义为通过体外培养仍保持未分化状态，几乎可进行永久或长期的细胞增殖，呈现正常的核(染色体)型，在适当的条件下，具有分化为三胚层(外胚层，中胚层和内胚层)所有谱系细胞的能力的细胞。现在，作为多能性干细胞，最熟知的有从初期胚分离的胚胎干细胞(embryonic stemcellsES细胞)、从胎儿期的原始生殖细胞分离的胚胎生殖细胞(embryonic germ cellsEG细胞)以及从发育成熟骨髓分离的成人型多能性干细胞(multipotent adult progenitor cellsMAPC)3种。
特别是ES细胞以前就知道通过体外培养可以分化诱导为心肌细胞。初期的研究几乎都是使用来自小鼠的ES细胞进行的。如果对ES细胞在单一细胞状态(通过实施酶处理等，细胞之间没有粘附的各个细胞分散的状态)下，在没有白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactorLIF)等分化抑制因子存在下进行悬浮培养，ES细胞彼此粘附、凝集，形成称为胚状体(embryoid bodyEB)的类似初期胚的结构体。已知然后，通过以悬浮状态或粘附状态培养EB，出现了具有自发搏动性的心肌细胞。
上述那样制备的来自ES细胞的心肌细胞呈现出与来自胎儿心脏的未成熟心肌细胞非常类似的特性(参照非专利文献2，3)。此外，实际上，有将来自ES细胞的心肌细胞移植到发育成熟心脏组织的动物实验例中，几乎与移植了胎儿心肌的例子没有变化，也确认表现出极高的有效性(参照专利文献1，非专利文献4)。
1995年，Thomson等人首次通过由灵长类建立ES细胞，使用来自多能性干细胞的心肌细胞的心肌再生治疗法的实际应用成为可能(参照专利文献2，非专利文献5)。接下来他们还成功地实现了从人初期胚分离、建立人ES细胞株(参照非专利文献6)。另外，Gearhart等人也由人原始生殖细胞建立了hEG细胞株(参照非专利文献7，专利文献3)。
Kehat等人(参照非专利文献8)以及Chunhui等人(参照专利文献4，非专利文献9)报告了与小鼠ES细胞同样，也可以由人ES细胞分化诱导心肌细胞。如果根据这些报告，不用说由人ES细胞分化诱导的心肌细胞具有自发搏动能力，在表达、产生肌球蛋白重链/轻链和α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I、心房性利尿肽(artial natriureticpeptide；ANP)等心肌特异性蛋白质、GATA-4或Nkx2.5、MEF-2c等心肌特异性转录因子的同时，微细解剖学的观察以及电生理学的解析也表明保持着胎儿期的未成熟心肌细胞的特性，预期可用于再生医疗。
另外，作为将来自多能性干细胞的心肌细胞用于细胞移植治疗或其它目的时的重要问题，例如使用以往方法由ES细胞或EG细胞形成的EB除了发育为心肌细胞以外，还可发育为包括血细胞、或血管细胞、神经细胞、肠细胞、骨/软骨细胞等在内的其它种类的细胞。另外，在这些分化的细胞中，心肌细胞所占比例不太高，只不过为整体的5～20％左右。
作为从混有其它种类细胞的细胞溶液中有选择性地只挑选心肌细胞的方法，例如，通过对ES细胞的基因进行人为修饰，赋予耐药性或异地表达(ectopic expression)能力，回收心肌细胞或具有作为其前体细胞特性的细胞的方法。例如，Field以及共同研究者等构建了通过将在α型肌球蛋白重链启动子调控下，可表达新霉素(G418)耐性基因的基因序列组导入小鼠ES细胞，只在该ES细胞向心肌细胞分化，并伴随分化进行α型肌球蛋白重链基因表达时，可在添加了G418的培养基中存活的体系(参照专利文献1，非专利文献4)。通过该方法作为G418耐性细胞挑选的细胞以99％以上的概率确认是心肌细胞。然而，使用该方法，虽然心肌细胞的纯度非常高，但最终得到的心肌细胞数不过为全细胞数的百分之几程度，不容易获得移植治疗所必需的心肌细胞。
最近，Chunhui等人报告了通过用5-氮杂胞(嘧啶核)苷对人ES细胞进行处理，EB中的肌钙蛋白I阳性(心肌)细胞由15％增加到44％(参照非专利文献9)，在该方法中，心肌细胞所占比例没有超过EB中的50％。另外，脱甲基化剂5-氮杂胞(嘧啶核)苷是通过使与DNA结合的甲基脱掉，使基因的表达状态变化的药剂，由于药剂直接作用于染色体，所以不合适作为制备移植用细胞的药剂。
另外，作为使由ES细胞更高效率地产生心肌细胞的方法，已知例如，在小鼠ES细胞中添加视黄酸(参照非专利文献10)或抗坏血酸(参照非专利文献11)、TGFβ、BMP-2(参照非专利文献12)，PDGF(参照非专利文献13)、Dynorphin B(参照非专利文献14)、或使细胞内的活性氧类(reactive oxigen speciesROS)(参照非专利文献15)和Ca2+(参照非专利文献16)增加的处理可起到促进心肌细胞的分化诱导作用。然而，无论使用那一种方法，心肌细胞特异的或有选择性的分化诱导都尚未成功。
分泌性蛋白质头蛋白(Noggin)和索蛋白(Chordin)当初作为非洲爪蟾胚中的神经诱导因子被鉴定(参照非专利文献17，18，专利文献5～8)。已报道通过其后的研究，头蛋白和索蛋白通过与具有抑制神经细胞的发育、分化效果的BMP(Bone Morphogenic Protein；骨形成因子)家族分子结合，阻断其信号传导，表现出神经诱导效果(参照非专利文献19～21)。实际上，即使在使用小鼠ES细胞的实验中，也表明通过对头蛋白基因或索蛋白基因进行恒定表达，可诱导向神经细胞的分化(参照非专利文献22)。
另外，据报道如果将人ES细胞用添加头蛋白的培养基进行培养，通过抑制ES细胞内因性产生的BMP-2的作用，ES细胞向胚体外内胚层细胞的分化被抑制，在ES细胞保持未分化状态的同时，通过继续在神经分化培养条件下进行培养，可促进向神经细胞的分化诱导(参照专利文献9)。
另外，据报道在使用鸡胚(参照非专利文献23)，非洲爪蟾胚(参照非专利文献24)或小鼠胚胎癌细胞(参照非专利文献25)的以往的解析中，对于心肌细胞的发育和/或分化，BMP家族分子起着促进作用，如果通过头蛋白刺激阻碍其作用，心肌细胞的发育和/或分化也就被抑制了。
因此，通过利用头蛋白、或索蛋白或其它BMP信号抑制因子，促进心肌细胞发育、分化的尝试到目前为止完全没有。
专利文献1美国专利第6015671号说明书专利文献2美国专利第5843780号说明书专利文献3美国专利第6090622号说明书专利文献4国际专利公开第03/06950号小册子专利文献5国际专利公开第94/05791号小册子专利文献6美国专利第5,679,783号说明书专利文献7美国专利第5,846,770号说明书专利文献8美国专利第5,986,056号说明书专利文献9国际专利公开第01/98463号小册子非专利文献1
Soonpaa等人，Science，26498，199非专利文献2
Maltsev等人，Mech.Dev.，4441，199非专利文献3
Maltsev等人，Circ.Res.，75233，199非专利文献4
Klug等人，J.Clin.Invest.，98216，199非专利文献5
Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927844，199非专利文献6
Thomson等人，Science，282114，1998非专利文献7
Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9513726，1998非专利文献8
Kehat等人，J.Clin.Invest.，108407，200非专利文献9
Chunhui等人，Circ.Res.，91508，200非专利文献10
Wobus等人，J.Mol.Cell.Cardiol.，291525，199非专利文献11
Takahashi等人，Circulation，1071912，200非专利文献12
Behfar等人，FASEB J.，161558，200非专利文献13
Sachinidis等人，Cardiovasc.Res.，58278，200非专利文献14
Ventura等人，Circ.Res.，92623，200非专利文献15
Sauer等人，FEBS Lett.，476218，2000非专利文献16
Li等人，J.Cell Biol.，158103，200非专利文献17
Smith & Harland，Cell，70829，199非专利文献18
Sasai等人，Cell，79779，199非专利文献19
Re′em-Kalma等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9212141，199非专利文献20
Zimmerman等人，Cell，86599，199非专利文献21
Piccolo等人，Cell，86589，199非专利文献22
Gratsch & O′Shea，Dev.Biol.，24583，200非专利文献23
Schultheiss等人，Genes Dev.，11451，199非专利文献24
Sparrow等人，Mech.Dev.，71151，1998非专利文献25
Monzen等人，Mol.Cell.Biol.，197096，1999发明内容发明要解决的课题本发明以提供将未分化的干细胞高效率而且有选择性地分化诱导为心肌细胞的方法，通过该方法得到的心肌细胞和将该细胞进行以心脏病为靶的细胞移植、注入以及在其它治疗中使用的方法等作为课题。
用于解决课题的手段本发明主要涉及到以下内容。
(1)由干细胞分化诱导心肌细胞的方法，其特征是在抑制BMP信号传导物质存在下，对干细胞进行分化诱导的培养。
(2)上述(1)所述的方法，其中，用于分化诱导的干细胞的培养包括进行悬浮凝集培养、使胚状体形成的工序。
(3)上述(1)所述的方法，其中，包括用于分化诱导的干细胞的培养与饲养细胞进行共培养的工序。
(4)上述(1)所述的方法，其中，包括用于分化诱导的干细胞的培养在培养容器上进行平面培养的工序。
(5)上述(1)～(4)任一项所述的方法，其中，只在分化诱导期的最初数日内添加抑制BMP信号传导的物质。
(6)上述(1)～(4)任一项所述的方法，其中，包括预先用抑制BMP信号传导的物质对分化诱导期前的干细胞进行处理的工序。
(7)上述(1)～(4)任一项所述的方法，其中，包括预先用抑制BMP信号传导的物质对分化诱导期前的干细胞进行处理的工序，而且只在分化诱导期的最初数日内添加抑制BMP信号传导的物质。
(8)上述(1)～(7)任一项所述的方法，其中，抑制BMP信号传导的物质是BMP拮抗剂。
(9)上述(8)所述的方法，其中，BMP拮抗剂是从头蛋白、索蛋白、胎球蛋白、抑滤泡素、sclerostin、DAN、Cerberus、gremlin、和Dante，以及它们的相关蛋白质中选出的1个或多个。
(10)上述(1)～(9)任一项所述的方法，其中，干细胞是具有在试管内培养下可向心肌细胞分化能力的来自哺乳动物的细胞。
(11)上述(10)所述的方法，其中，具有可向心肌细胞分化能力的来自哺乳动物的细胞是多能性干细胞或来自该细胞的细胞。
(12)上述(11)所述的方法，其中，多能性干细胞是胚胎干细胞、具有类似于胚胎干细胞形态的细胞、胚胎生殖细胞或成人型多能性干细胞。
(13)上述(12)所述的方法，其中，多能性干细胞是胚胎干细胞。
(14)上述(1)～(13)所述的方法，其中，干细胞来自人。
(15)包括上述(1)～(14)任一项所述的方法的心肌细胞制造方法。
(16)通过上述(1)～(14)任一项所述的方法得到的心肌细胞。
(17)心脏病的治疗方法，是在起因于心肌细胞衰弱、功能停止或死亡的心脏病治疗方法中，将上述(16)所述的心肌细胞投给(移植)到心肌细胞衰弱、功能停止或死亡的部位或其周边。
(18)筛选方法，是在起因于心肌细胞衰弱、功能停止或死亡的心脏病治疗方法中，使测试物质与上述(16)所述的心肌细胞接触，对该细胞向心肌细胞的分化效率或其细胞功能的质的或量的变化进行测定。
(19)起因于心肌细胞衰弱、功能停止或死亡的心脏病治疗用的医药组合物或支持体，作为有效成分含有上述(16)所述的心肌细胞。
本发明人等就使用多能性干细胞，特别是最频繁使用的ES细胞作为制备心肌细胞的干细胞源，向心肌细胞或其前体细胞的分化诱导条件不断进行了各种研究，结果发现通过在培养时的某一期间，向培养基中添加抑制骨形成因子(Bone Morphogenic Protein；BMP)信号传导的物质，被证实为具有搏动能力的心肌细胞的细胞比以往方法更有选择性、而且更有效发育，另外还发现如添加过量的BMP，通过抑制BMP信号传导的物质处理产生的心肌分化诱导效果明显降低，结果表明BMP信号的抑制促进诱导多能性干细胞向心肌细胞的分化，直至完成本发明。
在本发明中，所谓抑制BMP信号传导的物质指的是具有阻碍或阻断BMP的信号传导作用的物质，例如，BMP拮抗剂或抗BMP家族分子的特异的中和抗体、可溶化型(细胞膜非结合型)BMP受体分子等。另外的例子，如抑制或停止BMP家族分子或其受体基因的功能性基因产物的表达、或抑制或停止规定BMP信号传导途径的反式激活(作用)性成分的基因表达的基因表达载体、特异的反义寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反义RNA、低分子化合物等。
通过本发明的方法由多能性干细胞制备的搏动性细胞是具有“心肌细胞”特征的细胞，可以确认例如GATA-4，TEF-1，Tbx-5，MEF2和MLC-2v等心肌特异的转录因子基因表达以及作为心肌特异标志的肌节/肌球蛋白、肌钙蛋白I、α-辅肌动蛋白、ANP等蛋白表达。
另外，在本发明中，作为多能性干细胞的分化诱导法，不仅一般常用的悬浮凝集培养法，而且悬滴(hanging drop)培养法以及使用饲养细胞的共培养法中的任一种方法也都可得到同样的效果。
另外，在研究抑制BMP信号传导的物质的添加时期和期间时，使多能性干细胞分散为由单一细胞或少数细胞构成的细胞块，通过悬浮凝集培养或与饲养细胞的共培养等方法诱导分化时，如果预先将多能性干细胞用BMP拮抗剂进行预处理、或只是在刚开始进行分化诱导培养后数日间添加、或将两者组合更有效。而当在与悬浮细胞或饲养细胞共培养等实施期间使BMP拮抗剂恒定存在时，显示由多能性干细胞向心肌细胞的分化诱导效率非常低下。
即，本发明涉及以在抑制BMP信号传导的物质的短暂刺激下进行培养为特征的将多能性干细胞分化诱导为心肌细胞的方法和制备心肌细胞的方法。
本发明中所谓具有心肌分化能力的干细胞指的是在试管内培养下具有可向心肌细胞分化能力的细胞，例如，多能性干细胞、间充质干细胞、CMG细胞和SPoC细胞等。而所谓多能性干细胞指的是通过试管内培养仍保持未分化状态，几乎可进行持续不断的或长期间的细胞增殖，呈现正常的核(染色体)型，在适当条件下具有分化为三胚层(外胚层、中胚层和内胚层)所有谱系细胞的能力的细胞，例如，ES细胞、ES类似细胞、EG细胞和MAPC等。
在另外的实施方式中，本发明涉及到通过分化诱导多能性干细胞制备的表现出心肌细胞的形态学、生理学和/或免疫学上特征的细胞。对生理学和/或免疫学的特征虽然没有特别限定，但利用本发明方法制备的细胞能表达对于被识别为心肌细胞的心肌细胞特异的1个或1个以上的标志即可。
本发明涉及到为了鉴定可促进心肌细胞发育以及分化诱导、再生、存活等的新的因子或可能的化学治疗剂，使用通过本发明方法制备的细胞的筛选方法。
本发明还涉及到用于将多能性干细胞分化诱导为具有心肌前体细胞或心肌细胞形态学、生理学和/或免疫学特征的细胞的试剂盒。这样的试剂盒对于实施本发明的方法有用。
在另外的实施方式中，本发明涉及到以使用本发明方法制备的细胞为特征的治疗处于心脏病状态的心脏的方法以及以用本发明方法制备的细胞作为有效成分的心脏病治疗药。
本发明这些优点以及其它优点和特征在以下适合的实施方式的详细说明中进行了充分描述。
另外，在本发明的实施中，有关使用多能性干细胞的细胞培养和发育、细胞生物学实验的一般方法，实施者可参照该领域的标准参考书籍。其中包括Guide to Techniques in Mouse Development(Wasserman等人编，Academic Press，1993)；Embryonic Stem CellDifferentiation in vitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.，225900，1993)；Manipulating the Mouse EmbryoAlaboratory manual(Hogan等人编，Cold Spring Harbor Laborayory Press，1994)；EmbryonicStem Cells(Turksen编，Humana Press，2002)。在本说明书中可参照的用于细胞培养、发育和细胞生物学实验的试剂和试剂盒类可以从Invitrogen/GIBCO公司或Sigma公司等销售商买到。
发明的效果通过使用本发明方法，可以由干细胞有效且有选择性地生产心肌前体细胞和心肌细胞。这样制备的心肌(前体)细胞可在对心脏病治疗有效的药剂的探索、开发中利用的同时，还有可能适用于对严重心脏病的心肌移植治疗。
图1A在使用悬浮培养法的ES细胞(EB3)的心肌分化诱导系中，头蛋白(500ng/mL)的添加对搏动性EB出现的影响。
图1B在使用悬滴培养法的ES细胞(EB3)的心肌分化诱导系中，头蛋白(500ng/mL)的添加对搏动性EB出现的影响。
图2头蛋白添加浓度不同对搏动性EB出现率的影响。算出由ES细胞(EB3细胞和R1细胞)形成EB，悬浮培养后第10日的搏动性EB的出现率。
图3头蛋白添加对心肌特异标志基因表达的影响。在悬浮培养后第0、5、10、15日后回收EB(来自EB3细胞)，研究各基因的表达。TEF-1转录增强因子-1(transcription enhancer factor-1)，MEF-2c肌肉增强因子-2c(muscle enhancement factor-2c)，α-MHCα-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain)，MLC-2v肌球蛋白轻链-2v(myosin light chain-2v)，GAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceral dehyde-3-phosphate dehydrogenase)图4对从悬浮培养后第10日的头蛋白(+)组EB(来自EB3细胞)分离、回收的心肌细胞进行免疫染色的结果。a肌原纤维节和肌球蛋白，b肌钙蛋白I，cα-辅肌动蛋白，dANP图5对悬浮培养后第10日的头蛋白(+)组和头蛋白(-)组EB(来自EB3细胞)内的心肌细胞进行免疫染色的结果。a、b肌原纤维节和肌球蛋白，c、d肌钙蛋白I，e、fα-辅肌动蛋白，g、hANP图6BMP对头蛋白的心肌分化诱导作用的阻碍效果。
图7A头蛋白处理在使用饲养细胞的心肌分化诱导系中的效果。将ES细胞(R1)接种在ST2饲养细胞上，研究其心肌分化。在接种第8日使用抗肌原纤维节和肌球蛋白抗体(MF20)的染色照片。n＞5。
※对头蛋白(-)组p＜0.0图7B头蛋白处理在使用饲养细胞的心肌分化诱导系中的效果。将ES细胞(R1)接种到ST2饲养细胞上，研究其心肌分化。在接种第8日的MF20阳性集落的出现率。n＞5。※对头蛋白(-)组p＜0.0图7C头蛋白处理在使用饲养细胞的心肌分化诱导系中的效果。将ES细胞(R1)接种到ST2饲养细胞上，研究其心肌分化。接种第12日的搏动性集落的出现率。n＞5。※对头蛋白(-)组p＜0.0图8在使用悬滴培养法的ES细胞(R1)的心肌分化诱导系中，索蛋白(500ng/mL)的添加对搏动性EB出现的影响与添加头蛋白(500ng/mL)时比较的结果。培养天数为开始悬滴培养之后的天数。n＝8。※对未添加组(-)，p＜0.0图9在使用悬浮培养法的ES细胞(R1)的心肌分化诱导系中，索蛋白(500ng/mL)的添加对搏动性EB出现的影响。C添加索蛋白，N添加头蛋白(150ng/mL)，(-)没有添加。将EB形成前的处理与EB形成后的处理用“预处理”→“后处理”表示形式表示。
图10在使用悬浮培养法的ES细胞(R1)的心肌分化诱导系中，各种BMP拮抗蛋白质(各150ng/mL)的添加对搏动性EB出现的影响。
具体实施例方式
本内容中，所谓“心肌细胞”包括将来具有可成为功能性心肌细胞的能力的心肌前体细胞以及胎儿型心肌细胞、发育成熟型心肌细胞的所有分化阶段的细胞，定义为通过以下所述的至少1个、最好是多个方法能够确认至少1个、最好是多个标志或基准的细胞。
心肌细胞中特异的各种标志的表达可通过以往的生物化学或免疫化学的手法进行检测。该方法虽然没有特别限定，但最好是使用免疫组织化学的染色法或免疫电泳法那样的免疫化学的手法。在这些方法中，可以使用与心肌前体细胞或心肌细胞结合的标志特异的多克隆抗体或单克隆抗体。以各个特异的标志作为靶的抗体已经有商品销售，容易使用。心肌前体细胞或心肌细胞中特异的标志，例如肌球蛋白重链/轻链或α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c等。
或者，心肌前体细胞或心肌细胞特异的标志的表达通过称之为利用逆转录酶的聚合酶链式反应(RT-PCR)或杂交分析的用于对编码任意标志蛋白质的mRNA进行扩增、检测、解析的以往经常使用的分子生物学方法可以确认，但对其手法没有特别限制。编码心肌前体细胞或心肌细胞中特异的标志(例如，肌球蛋白重链/轻链和α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c)蛋白质的核酸序列已知，可利用基因库(GenBank)那样的公共数据库，容易决定作为引物或探针使用的必需的特异标志的序列。
另外，为了确认多能性细胞向心肌细胞的分化，也可进一步使用生理学的基准。即，来自多能性细胞的细胞具有自立的搏动性以及表达各种离子通道，能够对电生理刺激反应等都成为其有用的指标。
作为本发明使用的多能性干细胞，可举出已广泛作为培养细胞使用的来自小鼠、猴、人等哺乳动物的ES细胞、EG细胞、MAPC等。作为来自小鼠ES细胞的具体例子，可举出EB3细胞、E14细胞、D3细胞、CCE细胞、R1细胞、129SV细胞、J1细胞等。另外有关ES细胞、EG细胞、MAPC的制备、传代、保存法已经确立了标准的程序，实施者通过参照前面列举的参考书籍以及很多参考文献(Matsui等人，Cell，70841，1992；Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9513726，1998；美国专利第6090622号；Jiang等人，Nature，41841，2002；国际专利公开01/11011)，能够容易使用这些多能性干细胞。
另外，本发明中可以使用的细胞不限于上述3种，包括来自哺乳动物的胚或胎儿、脐带血、或发育成熟脏器或骨髓等发育成熟组织、血液等的所有多能性干细胞。作为具体例子，可举出毛根鞘细胞或表皮细胞经5-氮杂胞(嘧啶核)苷等药剂处理后得到的干细胞(Sharda& Zahner，国际专利公开第02/051980号)或单核球细胞经CR3/43抗体处理后得到的干细胞(Abuljadayel，Curr.Med.Res.Opinion，19355，2003)，以及来自发育成熟内耳细胞的干细胞(Li等人，NatureMed.，Advance online publication)等具有与ES细胞类似形态的干细胞。此时所谓的与ES细胞类似的形态可以根据ES细胞中具有特异的细胞生物学性质来定义，例如ES细胞中特异的表面(抗原)标志的存在、或ES细胞特异基因的表达、或具有畸胎瘤(teratoma)形成能力或具有嵌合小鼠形成能力。
另外，即使是不具有与ES细胞类似形态的细胞或不是多能性干细胞的细胞，只要是具有至少在试管内培养下可分化为具有心肌细胞那样形态的细胞性质的细胞，就可以使用本发明所述的方法。作为这样细胞的例子，如来自于骨髓细胞的骨髓间充质干细胞(Bruder等人，美国专利第5736396号；Pittenger等人，Science，284143，1999)和CMG细胞(Makino等人，J.Clin.Invest.，103697，1999；国际专利公开第01/048151号)，来自肌肉组织的Spoc细胞(国际专利公开第03/035382号)。
在本发明中，作为由多能性干细胞制备心肌细胞的培养法，只要是适合心肌细胞分化诱导的方法，可以使用任一种方法，例如使用ES细胞时，可举出悬浮凝集培养法、悬滴(hanging drop)培养法、与支持细胞的共培养法、旋转培养法、软琼脂培养法、微载体培养法等。作为具体方法的例子，例如使用悬浮凝集培养法时，将成为单一细胞状态(通过实施酶消化等，细胞之间没有粘连的各个细胞在液相中分散的状态)的ES细胞优选按照浓度为10细胞/mL～1×107细胞/mL，更优选100细胞/mL～1×106细胞/mL细胞密度那样悬浮于培养基中，接种到培养板后，4～30日，优选6～15日，于37℃、通5％的二氧化碳的CO2条件下进行培养的方法。
而作为另外的实施方式，当使用与支持细胞的共培养法时，作为支持细胞虽然没有特别限定，优选具有间充质细胞性质的细胞，更优选ST2细胞、OP9细胞、PA6细胞等具有骨髓基质细胞那样形态的细胞。通过对这些支持细胞进行高密度培养、丝裂霉素C处理、或放射线照射等方法做成饲养层，然后以悬浮的单一细胞状态将ES细胞接种于培养基，使ES细胞达到1细胞/mL～1×106细胞/mL、优选100细胞/mL～1×105细胞/mL、更优选1×103细胞/mL～1×104细胞/mL细胞密度后，于37℃、通5％的二氧化碳的CO2条件下培养4～30日、优选6～15日。
在本发明中，所谓抑制BMP信号传导的物质指的是具有阻碍或阻断BMP的信号传导的作用的物质，例如，BMP拮抗剂或抗BMP家族分子的特异的中和抗体、可溶化型(非细胞膜结合型)BMP受体分子等。作为另外的例子，如抑制或停止BMP家族分子或其受体基因的功能性基因产物的表达、或抑制或停止规定BMP信号传导途径的反式激活(作用)性成分的基因表达的基因表达载体、特异的反义寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反义RNA、低分子化合物等。
而所谓BMP拮抗剂被定义为与BMP家族分子(例如BMP-2、BMP-4、BMP-7等)结合、阻碍或抑制BMP分子与细胞表面上的BMP受体结合的物质、或通过结合BMP受体引起BMP信号传导的抑制或阻断的物质。作为本发明中优选的BMP拮抗剂，例如，可举出头蛋白和索蛋白等，另外，如与该蛋白质在氨基酸序列上具有80％以上、更优选90％以上同源性，而且具有BMP拮抗剂活性的头蛋白相关蛋白质或索蛋白相关蛋白质，另外通过由与编码头蛋白或索蛋白的碱基在严格条件(例如，2xSSC)进行杂交的碱基编码的头蛋白相关蛋白质或索蛋白相关蛋白质也同样包括在内。
本发明以在短暂抑制BMP信号的物质刺激下对多能性干细胞进行培养为特征，作为该刺激方法虽然没有特别限定，但优选如在培养基中添加纯化重组蛋白质的方法。此外，只要是表现出与将抑制BMP信号的物质作为纯化重组蛋白质添加到培养基中的方法同样效果的方法，可以使用任一种方法。例如，添加从生体组织提取、纯化的头蛋白等BMP拮抗剂的方法；将头蛋白等BMP拮抗剂的基因表达载体导入多能性干细胞自身的方法；将头蛋白等BMP拮抗剂基因表达载体导入支持细胞，该导入细胞作为共培养细胞使用的方法；或使用该导入细胞的培养上清等细胞产生物的方法等，任一种在培养基中添加了BMP拮抗剂的实施方式都包括本发明的方法中。
在本发明的实施中，使用的抑制BMP信号的物质的蛋白质和基因优选是来自与多能性干细胞来自种类同种的动物的蛋白质和基因，例如，用小鼠多能性干细胞实施本发明时，将小鼠的头蛋白cDNA与免疫球蛋白恒定(Fc)区cDNA连接的融合基因导入小鼠细胞，使其表达制备的纯化重组蛋白质(Recombinant Mouse Noggin/Fc Chimera；R&Dsystems公司，Genzyme Technology公司)在市场已有销售，可以很容易用作为来自小鼠的头蛋白。另外，也可以使用来自异种动物的头蛋白，将人的头蛋白cDNA导入大肠杆菌，使其表达制备的纯化重组蛋白质(PeproTech公司销售)作为代用。另外也可以使用来自猪、羊、马、或鸟类(例如，鸡等)、或两栖类(例如，非洲爪蟾等)的头蛋白。对于索蛋白和其它的BMP拮抗剂也同样可以使用类似的蛋白质。另外，编码这些因子的基因的碱基序列可利用美国National Centerfor Biotechnology(NCBI)等公共的DNA数据库，只要是本领域技术人员，就可以获取、使用该基因的cDNA。例如，头蛋白和索蛋白基因已经通过人或小鼠鉴定，人的头蛋白、小鼠的头蛋白、人的索蛋白、以及小鼠的索蛋白的碱基序列已经分别以access登记号NM#005450、NM#008711、NM#073411、NM#009893记录在NCBI的数据库。
作为本发明的BMP拮抗剂，只要是与BMP家族分子(例如BMP-2、BMP-4、BMP-7等)结合，阻碍或抑制BMP分子与细胞表面上的BMP受体结合的物质、或通过结合BMP受体，引起BMP信号传导的抑制或阻断的物质就可以，作为典型例子，如头蛋白(Re′em-Kalma等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9212141，1995；Zimmerman等人，Cell，86599，1996)、以及索蛋白(Piccolo等人，Cell，86589，1996；De Robertis等人，美国专利第5679783号；LaVallie等人，美国专利第5846770号；Lavallie等人，美国专利第5986056号)。作为其它的BMP拮抗剂的具体例子，已知有抑滤泡素(follistatin)、胎球蛋白(fetuin)、sclerostin、以及属于DAN/Serberus家族的分子等，作为该分子已知有DAN、cerberus、gremlin、Dante等(Balemans& Hul，Dev.Biol.，250231，2002)。或者，天然存在的BMP拮抗剂的合成或重组类似物也可用在实施本方法上。
另外在发明的实施中，作为处理多能性干细胞的方法，不限于只使用头蛋白等BMP拮抗剂的方法，只要是产生与BMP拮抗剂同样的效果，即引起BMP信号传导抑制的方法都可以使用。作为引起BMP信号传导抑制的方法的具体例子，可举出使用抗BMP家族分子的特异的中和抗体的方法、使用可溶化型(非细胞膜结合型)BMP受体分子的方法等。其它的例子，可举出将抑制或停止BMP家族分子或其受体基因的功能性基因产物的表达、或抑制或停止规定BMP信号传导途径的反式激活(作用)性成分的基因表达的基因表达载体、特异的反义寡核苷酸、核酶、RNA干涉用反义RNA、低分子化合物等导入细胞内的方法。
在本发明的实施中，对多能性干细胞使用抑制BMP信号传导的物质(例如，头蛋白、索蛋白等的BMP拮抗剂)时，使这些因子作用的期间可以分为2个时期。即，使多能性干细胞分散为由单一细胞或少数细胞构成的细胞块，进行悬浮凝集培养或与支持细胞共培养等时刻的前和后，以下，将之前的时期称为预处理期，后面的时期称为分化诱导期。
对于预处理期的多能性干细胞，使抑制BMP信号传导的物质作用的期间优选是分化诱导期开始的前1～2日，优选前3日以上。
另外，在预处理期，为了将ES细胞维持在未分化状态，最好是根据该ES细胞的动物种类，在通常使用的条件下进行培养。即，对于小鼠ES细胞，最好是在培养基中添加100～10000U/mL，优选500～2000U/mL浓度的白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factorLIF)。
作为使抑制BMP的信号传导的物质作用的期间，不需要整个培养期间都使该物质存在，例如，作为抑制BMP的信号传导的物质使用头蛋白或索蛋白等的BMP拮抗剂时，在BMP拮抗剂以具有活性状态存在的培养基中的培养优选在分化诱导期最初的5日以内，更优选3日以内。但使抑制BMP的信号传导的物质作用的期间可以根据使用的细胞来自的动物种类、使用的细胞株、使用的分化诱导以及使用的抑制BMP的信号传导的物质等条件不同来改变最适合的天数。
在本发明的实施中，作为抑制BMP信号的物质使用BMP拮抗剂(例如，头蛋白、索蛋白等)时，在将旧的培养基在无菌下除去后，最好用含有1ng/mL～2μg/ml，优选5ng/mL～1000ng/mL，更优选10ng/mL～500ng/mL浓度的头蛋白、或用索蛋白的培养基取代，再继续培养数日。使用其它的抑制BMP信号的物质时，可以根据物质种类来变更为最适合的浓度后使用。
接下来，运用上述方法从以ES细胞为首的多能性干细胞分化诱导的心肌细胞通过使用公知方法中的细胞回收、分离、纯化法，可以有效、且大量获得高纯度的心肌细胞。以下将这样得到的心肌细胞称之为根据本发明制备的心肌细胞。
心肌细胞的纯化方法可以使用任一种已公知的细胞分离纯化方法，作为具体例子，可举出流式细胞仪、磁珠、淘筛法等根据抗原-抗体反应的方法(Monoclonal Antibodiesprinciples and practice，Third Edition(Acad.Press，1993)；Antibody EngineeringAPractical Approach(IRL Press at Oxford University Press，1996)以及通过使用蔗糖、Percoll等载体的密度梯度离心的细胞分级法。而作为其它的心肌细胞筛选法，可举出在起始的ES细胞等多能性干细胞的基因上预先加上人为的修饰，通过赋予耐药性或异地性蛋白质的表达能力，回收具有作为心肌细胞形态的细胞的方法。例如，Field和共同研究者通过将在α型肌球蛋白重链启动子的调控下可表达新霉素(G418)耐性基因的基因序列组导入小鼠ES细胞，构建了该ES细胞在添加了G418培养基中可存活的体系，在该体系中ES细胞可分化为心肌细胞、同时仅伴随着分化表达α型肌球蛋白重链基因，通过该方法以99％以上概率确认选作G418耐性细胞的细胞是心肌细胞(美国专利第6015671号；J.Clin.Invest.，98216，1996)。
通过本发明制备的心肌细胞可用于各种生理活性物质(例如，药物)和功能未知的新的基因产物等药理评价和活性评价。例如，可以用于与由ES细胞等多能性干细胞向心肌细胞的分化调控有关的物质或药剂的筛选、或与心肌细胞的功能调解有关的物质或药剂的筛选、以及对心肌细胞有毒性或伤害性的物质或药剂的筛选。特别是目前现状几乎不存在人心肌细胞的筛选法，根据本发明制备的心肌细胞可成为用于实施该筛选法的有用的细胞源。在另外一种方式中，含有根据本发明制备的心肌细胞的评价试剂盒也可用于上述筛选。
作为供筛选的测试物质，只要是可添加到培养系的物质无论什么种类都可以，例如，低分子化合物、高分子化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽、基因、病毒、细胞、细胞培养液、微生物培养液等。作为将基因有效地导入培养系的方法，可举出使用逆转录病毒、腺病毒等病毒载体添加到培养系的方法、或封入到脂质体等人工的构造物后添加到培养系的方法等。
可以通过测定由ES细胞等多能性干细胞向心肌细胞的分化诱导效率以及心肌细胞功能的质的或量的变化进行测试物质的评价。例如，测试物质的心肌分化诱导效率通过对使用本发明所述方法培养的多能性干细胞，在培养开始后第5～15日，优选第7～12日时候，利用生物化学的或免疫化学的手法对在心肌细胞中特异的各种标志的表达进行检测而测定。作为生物化学的或免疫化学的手法没有特别限定，最好是使用象免疫组织化学的染色法或免疫电泳动法那样的免疫化学的手法。在这些方法中，可以使用结合心肌细胞的标志特异的多克隆抗体或单克隆抗体。以各个特异的标志为靶的抗体有销售商品，容易使用。心肌细胞中特异的标志，例如肌球蛋白重链/轻链或α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白I、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c等。
另外，作为评价测试物质的指标的心肌细胞功能，可举出心肌细胞的存活性作为一例。具体来说，将通过本发明所述的方法制备的心肌细胞以合适的细胞密度接种到培养板，用不含有血清的培养基培养时，可以诱导细胞死亡(凋亡)，而此时向培养基中添加适当量的测试物质，可以测定心肌细胞的存活率或死亡率。作为心肌细胞的存活率或死亡率的测定方法，可以使用以台盼蓝等色素掺入作为指标通过肉眼观察的方法，也可以使用以脱氢酶的活性(还原活性)作为指标的方法，以及以凋亡细胞特异的半胱天冬酶活性或膜联蛋白V的表达作为指标的方法。利用该机制的试剂盒，作为Sigma公司和Clonetech公司、Promega公司等许多丁家的利用该机制的试剂盒都有销售，可轻易使用。
通过这样的筛选方法得到的物质或药剂由于具有心肌细胞的分化诱导作用和功能调解作用，可作为例如心肌梗塞、局部缺血心脏病、充血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等心脏病予防药或治疗药使用。这些化合物可以是新的化合物，也可以是众所周知的化合物。
另外通过本发明制备的心肌细胞可作为心肌再生药或心脏疾患治疗药使用。心脏病如心肌梗塞、局部缺血心脏病、充血性心力衰竭、肥大型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎、慢性心力衰竭等。作为心肌再生药或心脏疾患治疗药，只要是含有根据本发明制备的高纯度心肌细胞的药，加工成使细胞悬浮于培养基等水性载体、将细胞包埋于生体分解性基质等支持体、或单层或多层心肌细胞层(Shimizu等人，Circ.Res.，90e40，2002)的形态等，无论什么样形状的药都可以使用。
作为将上述治疗药输送到损伤部位的方法，可举出开胸，用注射器直接注入心脏的方法、通过外科手术将心脏的一部切开之后进行移植的方法、以及通过使用导管通过血管的方法进行移植的方法等(Murry等人，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，67519，2002；Menasche，Ann.Thorac.Surg.，75S20，2003；Dowell等人，Cardiovasc.Res.，58336，2003)，没有特别限定。据报道通过这样方法，将从胎儿心脏回收的心肌细胞移植到心脏损伤动物的心脏，表现出非常好的治疗效果(Menasche，Ann.Thorac.Surg.，75S20，2003；Reffelmann等人，Heart Fali.Rev.，8201，2003)。来自ES细胞的的心肌细胞呈现出与来自胎儿心脏的心肌细胞非常类似的形态(Maltsev等人，Mech.Dev.，4441，1993；Circ.Res.，75233，1994)。另外，还确认实际上在将来自ES细胞的心肌细胞移植到发育成熟心脏的动物实验例中，与移植胎儿心肌的例子几乎没有什么变化，表现出非常高的生长率(Klug等人，J.Clin.Invest.，98216，1996)。因此，在起因于心肌细胞的破坏以及脱落的上述心脏病中，通过将根据本发明所述方法制备的心肌细胞补充性地移植到病的心脏组织，预期可以促进心脏功能的改善。
实施例以下给出实施例对本发明进行更具体的说明，以下的实施例只不过是给出的本发明的示例，对本发明的范围并没有任何限定。
(实施例1通过头蛋白处理的来自ES细胞的心肌细胞的出现增强效果)使ES细胞通过悬浮凝集培养(以下，在本申请实施例中简单记为悬浮培养)形成EB，使用分化诱导心肌细胞的实验系，在培养基中添加头蛋白对心肌细胞的出现率的影响进行研究。
在以下实验中，作为ES细胞，使用EB3细胞(丹羽仁史博士〔理科学研究所〕惠赠)、R1细胞(Andrew Nagy博士〔Mount Sinai病院；加拿大〕惠赠)、和129SV细胞(从大日本制药株式会公司购入)，总的说来，没有看到由于ES细胞种类不同导致的实验结果的差别。这些ES细胞使用在含有10％胎牛血清、0.1mM MEM非必需氨基酸液、2mML-谷氨酰胺、和0.1mM2-巯基乙醇的Glasgow Minimum EssentialMedium(GMEM；Sigma公司)培养基中添加了2000U/mL白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factorLIF)(ESGRO；Chemicon公司)的培养基，根据Manipulating the Mouse Emb ryoA Laboratory Manual(Hogan等人编，Cold Spring Harbor Laborayory Press，1994)；Embryonic Stem CellsMethods and Protocols(Turksen编，HumanaPress，2002)等所述的方法，在保持未分化形态的同时进行传代培养后供实验用。
开始悬浮培养3日前，将用上述条件培养形成集落的ES细胞用PBS清洗2次后，通过用含有1mM EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液进行处理，形成单一细胞状态，使用在含有10％胎牛血清、0.1mM MEM非必需氨基酸液、2mM L-谷氨酰胺和0.1mM 2-巯基乙醇的α-modifiedMinimum Essential Medium(αMEM；Sigma公司)培养基(以下，称为“分化培养基”)中添加了2000U/mL LIF的培养基，制备2.5×105细胞/mL的细胞悬浊液。向该悬浊液中添加、或不添加500ng/mL重组·头蛋白-Fc嵌合蛋白质(Recombinant Mouse Noggin/Fc Chimera；R&D systems公司)(以下，简单称为“头蛋白”)后，对于饲养非依赖性ES细胞株EB3细胞，接种在明胶包被的市售的细胞培养用板(T75 flask；Greiner公司制)上。另一方面，对于饲养依赖性ES细胞株R1细胞和129SV细胞，预先制备在明胶包被的板上接种了丝裂霉素处理过的初代小鼠胚成纤维细胞(大日本制药公司)的板，将细胞悬浊液接种在饲养细胞层上。
象以下那样进行由ES细胞形成EB的悬浮培养。将在添加、或没有添加头蛋白的分化培养基培养了3日的ES细胞用PBS清洗2次后，通过用含有1mM EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液进行处理，形成单一细胞状态，然后以1×102细胞/mL、或2×105细胞/mL浓度接种在用分化培养基铺满的市售的细胞粘附性弱的细菌用板(直径100mm；Valmalk公司制)上。此时，向开始悬浮培养的3日前添加了头蛋白的细胞组的培养基添加500ng/mL头蛋白。然后，细胞在保持不粘附板的状态下进行4～14日的悬浮培养。在本实验条件下从刚悬浮培养后确认ES细胞开始凝集，并形成EB，从悬浮培养后第7～8日，已经在一部分的EB中观察到自发搏动性。
另外，作为由ES细胞形成EB的其它的方法，悬滴培养如以下那样进行。将在添加、或没有添加头蛋白的分化培养基培养了3日的ES细胞用PBS清洗2次后，通过用含有1mM EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液进行处理，形成单一细胞状态。然后，制备在分化培养基15μL中含有500个细胞的液滴，将液滴滴在培养板的顶盖，培养4日。此时，在从开始悬滴培养的3日前添加了头蛋白的细胞组的培养基中添加500ng/mL头蛋白。悬滴培养后，将悬滴中形成的EB接种在用分化培养基铺满的市售细胞培养用平皿(4孔多孔平皿；Nunc公司制)上，然后进行粘附培养，诱导向心肌细胞分化。粘附培养后，每隔2日，将一半培养基换成新鲜培养基。在本实验条件下，与悬浮培养法同样，从刚悬滴培养后确认ES细胞开始凝集，并形成EB，从对回收的EB开始粘附培养的第3～4日(悬滴培养后第7～8日)时间，已经在来自一部分EB的集落观察到自发搏动性。
作为心肌细胞从ES细胞分化、发育的一个指标，对呈现自发搏动性的EB的出现率进行经时研究。作为ES细胞，使用EB3细胞，以1×102个/mL的细胞浓度进行悬浮培养时，在来自没有进行头蛋白处理的(头蛋白(-)组)ES细胞的EB中，即使在悬浮培养后第14日也几乎没有观察到搏动性(图1A)。而在来自进行了头蛋白处理的(头蛋白(+)组)ES细胞的EB中，从悬浮培养后第7日开始观察到出现搏动性的EB，在第14日，80％以上的EB可确认搏动性。在以2×105个/mL细胞浓度进行悬浮培养时也看到同样的倾向，在头蛋白(-)组EB中，最终只有在不到10％的EB中确认搏动，相反在头蛋白(+)组EB中，悬浮培养后第10日30％以上，第14日90％以上的EB表现出搏动性。另外，在头蛋白(-)组EB中，搏动的区域限定于EB的一部分，但在头蛋白(+)组EB中，令人惊奇的是能够观察到几乎遍布EB表层整个区域的细胞都在搏动。
即使在悬滴培养条件下，在头蛋白(+)组ES细胞中的心肌分化能力与头蛋白(-)组ES细胞相比也显著高，在分化诱导后第7日(粘附培养后第3日)看到40％以上，在第10日看到80％以上，而在第14日几乎在所有的来自EB的集落中都看到搏动(图1B)。另外，与在悬浮培养条件下观察同样，在头蛋白(-)组中，只在使EB粘附在培养平皿形成的集落的一部分区域的细胞看到搏动性，相反在头蛋白(+)组中，确认在来自EB的遍布整个集落的所有细胞都在搏动。
另外，在两个培养系中，在与头蛋白处理同样的条件下，将例如IGF(insulin-like growth factor)-1、FGF(fibroblast growthfactor)-2，BMP-2等各种增殖因子类或细胞因子类的重组蛋白质添加到培养基中，不能确认呈现出与头蛋白同样、或超过头蛋白的心肌诱导活性。
接下来，进行了关于头蛋白的添加浓度不同对由ES细胞向心肌细胞的分化诱导的影响的研究。图2示出了除了添加的头蛋白的浓度为0.5～1500ng/mL以外，其它完全与图1条件同样进行悬浮培养的结果。EB3细胞和R1细胞都表现出几乎同样的浓度依赖性，通过添加5ng/mL～1500ng/mL浓度的头蛋白，确认出现了比头蛋白(-)组有意义高的搏动性EB。特别是通过添加50ng/mL～150ng/mL浓度的头蛋白看到非常好的搏动性EB的出现。
(实施例2通过头蛋白处理进行分化诱导的来自ES细胞的心肌细胞的形态)就像实施例1所示那样，通过进行头蛋白处理，由ES细胞制备的EB的搏动性有意义增高，为了确认在该搏动性EB中，该搏动性细胞是心肌细胞，对各种心肌特异的标志分子的基因表达以及蛋白质产生进行了研究。
图3表示各种心肌细胞特异的标志基因在头蛋白(+)组、或头蛋白(-)组EB中的表达。对用与图1同样的悬浮培养法形成的EB进行定期回收，使用RNeasy(Qiagen公司制)制备总RNA。然后，根据常规方法，使用SUPERSCRIPT II(Invitrogen公司制)对cDNA进行逆转录，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction；PCR)检测特异的基因在心肌细胞的表达。在GATA-4、TEF-1、Tbx-5、MEF-2c、αMHC、MLC-2v、α-cardiac actin、GAPDH的各转录产物的检测中使用的引物如下。
GATA-4(正向)5′-CTGTCATCTC ACTATGGGCA-3′(SEQ ID NO1)，GATA-4(反向)5′-CCAAGTCCGA GCAGGAATTT-3′(SEQ ID NO2)；TEF-1(正向)5′-AAGACGTCAA GCCCTTTGTG-3′(SEQ ID NO3)，
TEF-1(反向)5′-AAAGGAGCAC ACTTTGGTGG-3′(SEQ ID NO4)；Tbx-5(正向)5′-GGAGCCTGAT TCCAAAGACA-3′(SEQ ID NO5)，Tbx-5(反向)5′-TTCAGCCACA GTTCACGTTC-3′(SEQ ID NO6)；MEF-2c(正向)5′-AGCAAGAATA CGATGCCATC-3′(SEQ ID NO7)，MEF-2c(反向)5′-GAAGGGGTGG TGGTACGGTC-3′(SEQ ID NO8)；αMHC(正向)5′-GGAAGAGTGA GCGGCCATCA AGG-3′(SEQ ID NO9)，αMHC(反向)5′-CTGCTGGAGA GGTTATTCCT CG-3′(SEQ ID NO10)；MLC-2v(正向)5′-GCCAAGAAGC GGATAGAAGG-3′(SEQ ID NO11)，MLC-2v(反向)5′-CTGTGGTTCA GGGCTCAGTC-3′(SEQ ID NO12)；α-cardiac actin(正向)5′-CTGAGATGTC TCTCTCTCTC TTAG-3′(SEQID NO13)，α-cardiac actin(反向)5′-ACAATGACTG ATGAGAGATG-3′(SEQ IDNO14)；GAPDH(正向)5′-TTCAACGGCA CAGTCAAGG-3′(SEQ ID NO15)，GAPDH(反向)5′-CATGGACTGT GGTCATGAG-3′(SEQ ID NO16)。
PCR使用TaKaRa Taq(宝酒造公司制)作为耐热性DNA聚合酶，用GeneAmp PCR System 9600(Perkin-Elmer公司制)进行。首先将含有cDNA的PCR反应液于94℃下加热3分钟后，反复进行94℃1分钟，-55℃1分钟，-72℃1分钟的30次加热循环，最后于72℃下加热5分钟后，在4℃下冷却。将PCR产物用3％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，用SYBR Green I(宝酒造公司制)染色，通过Molecular ImagerFX(Bio-Rad公司制)进行检测。
结果GATA-4、TEF-1、Tbx-5、MLC-2v等基因在头蛋白(-)组EB中从悬浮培养开始后第5至第10日开始看到比较弱的表达，相反在头蛋白(+)组EB，从悬浮培养开始的当日(0日)开始看到表达，之后，在第5～第15日持续强的表达。MEF-2c和心肌特异的α-肌动蛋白都是从悬浮培养后第5日开始看到表达，其表达量，头蛋白(+)组EB有意义地强。而，αMHC(肌球蛋白重链)基因，在头蛋白(+)组EB，在第10、15日看到强表达，但在头蛋白(-)组EB不能确认表达。以上结果表明通过头蛋白处理，迅速、且强烈地促进EB内的心肌细胞的分化以及发育。
另外，用免疫组织化学染色法确认在头蛋白(+)组EB中发育的搏动性细胞产生心肌细胞特异的标志蛋白质。将用图1同样的悬浮培养法形成的蛋白(+)组EB在悬浮培养后第12日回收，用含有1mM EDTA的0.25％胰蛋白酶溶液处理后使细胞分散。分散的细胞以个个细胞相互不粘连程度的低密度接种在明胶包被的盖玻片上，在铺满分化培养基的市售的细胞培养用板内进行培养。翌日，将盖玻片上的细胞用4％低聚甲醛溶液固定，依次与作为1次抗体的抗肌原纤维节和肌球蛋白抗体(MF20；American Type Culture Collection)、抗肌钙蛋白I抗体(#sc-8120；Santa Cruz Biotechnology公司)、抗α-辅肌动蛋白抗体(#sc-15335；Santa Cruz公司)、抗ANP抗体(#AB5490；Chemicon公司)反应，再与Alexa488标记2次抗体(Molecular Probes公司)依次反应后，在荧光显微镜下进行观察。
结果，作为心肌细胞中特异的标志蛋白质的肌原纤维节和肌球蛋白或肌钙蛋白I、α-辅肌动蛋白、ANP阳性细胞多数被确认(图4)，证实来自ES细胞的搏动性细胞是心肌细胞。
接下来，使用与上述同样的免疫组织化学的染色法， 对EB内的心肌细胞的分布和发生频率进行确认。将悬浮培养后第12日回收的EB用冷冻切片制备用包埋剂(OCT Compound，Sakura Finetek USAInc.)新鲜包埋，将于液氮下冷冻制备的冷冻标本用恒冷切片机(LEICACM3050-S)切成薄片(5μm)后，贴在载玻片上。使冷冻切片与上述抗心肌细胞特异标志抗体反应，用与上述同样的方法进行标志蛋白质阳性细胞的检测。
检测结果如图5所示。在头蛋白(-)组EB中，心肌细胞中特异的标志蛋白质的阳性细胞只在EB的极有限的区域观察到，而相反在头蛋白(+)组EB中，在遍布几乎整个EB表层区域都可确认心肌标志阳性细胞。本见识与在头蛋白(-)组EB中搏动域被限定在EB的一部分，相反在头蛋白(+)组EB中，搏动遍布几乎整个EB区域，与在萌发培养基中放置2-4周。将发芽的植物转移到单元包装盘(cellpack tray)的土壤中3周，以适应环境。将植物栽到温室内的10英寸罐中，评价草甘膦抗性。
为了确定表达GAT变体转基因的转基因大豆的草甘膦抗性水平，在温室中，对T0代的植物喷洒草甘膦(Roundup ULTRA MAXTM)。通过植物变色分值和植物高度测量值，评价植物抗性水平。
喷洒草甘膦后2周时的变色分值9＝无叶子/茎变色7＝较小的叶/茎变色5＝更坏的叶/茎变色3＝严重脱色的植物或者变干的植物1＝死亡植物对于各个独立的转基因事件，将1-4棵植物送到温室中。将每个事件的另外的1-2棵植物种植在控制环境的生长腔室中，用于种子生产，被喷洒草甘膦。在转移到土壤后的3-4周，对温室植物喷洒1×、2×或者4×草甘膦(1×草甘膦＝26盎司/英亩的RoundUp ULTRAMAXTM)。具有2×和4×喷洒速度的T0代的植物的变色分值分别显示在表10和表11中。
这些结果表明，如PCR分析所证明，用GAT基因变体有效地转化了大豆。表达GAT基因变体的转基因大豆抵抗具有2×和4×喷洒速度的草甘膦。在4×草甘膦喷洒速度中存活的事件的确表现出某种程度的较小的叶子变色，但是，在2周的喷洒检测中，植物恢复，并且显示出正常的叶片形态。
表10.用2×草甘膦处理后的第10天的抗性分值
另外，当使头蛋白(150ng/mL)在第5日以后也存在于培养基中时，搏动性心肌细胞的出现被显著抑制。悬浮培养后7日以上还恒定存在时，搏动性心肌细胞几乎都没有出现，与已报告论文(Gratsch &O′Shea，Dev.Biol.，24583，2002)同样，观察到神经细胞样细胞的分化诱导。
以上结果表明为了有效使ES细胞分化诱导为心肌细胞，悬浮培养前和悬浮培养开始时进行头蛋白处理是重要的，而悬浮培养后，高浓度头蛋白还恒定存在，相反具有阻碍心肌细胞发育的作用。
(实施例4BMP对心肌分化诱导作用的抑制效果)由于头蛋白处理导致的ES细胞的心肌分化诱导促进效果可以通过作为头蛋白的BMP拮抗剂的活性确认，所以与头蛋白处理同时向培养基中添加BMP-2，研究添加效果。
在与实施例1，2同样条件下进行悬浮培养，在添加头蛋白(150ng/mL)的同时使各种浓度的BMP-2共存，研究其影响的结果如图6所示。BMP-2阻碍头蛋白处理导致的ES细胞的心肌分化诱导效果与浓度有关，添加5ng/mL以上的BMP-2几乎完全看不到搏动性EB的出现。
(实施例5在使用支持细胞的心肌分化诱导系中的头蛋白处理的效果)据报道通过将ES细胞与以预先接种在培养板上的ST2细胞或OP9细胞等间质(stroma)系细胞作为支持细胞(饲养细胞)进行共培养，不需要进行悬浮培养法或悬滴培养法那样的三维培养，可以诱导向心肌细胞的分化(Yamane等人，Methods Mol.Biol.，184261，2002；Schroeder等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1004018，2003)。其中，在将ST2细胞(从理研细胞库购入)作为饲养细胞使用的分化诱导系中，研究了头蛋白处理的效果。将ST2细胞接种在市售的细胞培养用6孔板(CORNING公司制)，将在Dulbecco MEM培养基(Invitrogen/GIBCO公司制)中加有10％胎牛血清(Invitrogen/GIBCO公司制)的培养基，培养直至铺满状态的细胞作为饲养细胞使用。使用与上述同样的方法制备成单一细胞状态ES细胞的悬浊液，将饲养层用PBS清洗2次后，按照2000细胞/2mL培养基/1孔进行接种。然后，定期对搏动性心肌细胞的出现进行显微镜观察的同时，在培养后第8日，将一部分细胞用70％乙醇溶液固定，与作为1次抗体的抗肌原纤维节和肌球蛋白抗体(MF20；American TypeCulture Collection公司制)，接下来的辣根过氧化物酶标记2次抗体(Histofine Simple Stain PO(M)；Nichirei公司制)依次反应，最后使用ACE(3-amino-9-ethylcarbazole)底物液(Nichirei公司制)进行呈色反应后，在光学显微镜下进行观察。
在本培养条件下，接种在ST2细胞上的ES细胞在培养开始后数日以内形成用肉眼能观察的大的集落，在培养后第8日，已经可确认对作为心肌细胞标志的1种抗肌原纤维节和肌球蛋白抗体的阳性(以下，MF20阳性)细胞(集落)，然后，从培养第12日前后出现搏动性心肌细胞。其中，从共培养3日前将在含有头蛋白(150ng/mL)的培养基培养的ES细胞接种在ST2细胞上，再于共培养开始后2日，用含有头蛋白(150ng/mL)的培养基进行培养。结果如图7所示。接种了头蛋白(-)组ES细胞的情况，在饲养层上形成的来自ES细胞的集落的60％多都是MF20阳性，与此相反，在头蛋白(+)组90％以上的集落是阳性，然而集落中MF20阳性细胞占的比例与头蛋白(-)组相比，显著增高。另外，在头蛋白(+)组，搏动性心肌细胞出现的频率也高，在头蛋白(-)组，饲养层上形成的来自ES细胞的30％程度集落搏动，而头蛋白(+)组中在大致70％集落观察到搏动。
(实施例6由于索蛋白处理导致的来自ES细胞的心肌细胞出现的增强效果)与头蛋白同样，就已知表现出BMP拮抗剂作用的索蛋白的心肌诱导效果，与头蛋白的效果进行比较研究。作为索蛋白，使用市售的重组·索蛋白-Fc嵌合蛋白质(Recombinant Mouse Chordin/Fc Chimera；R&D systems公司)(以下，简单称为“索蛋白(蛋白质)”)。使用在添加了头蛋白(500ng/mL)\或索蛋白(500ng/mL)的培养基\或任何因子都没有添加的培养基培养了3日的ES细胞，利用与实施例1同样的方法进行悬滴培养。在悬滴培养第4日回收EB后，接种到细胞培养用平皿上，接下来通过粘附培养诱导向心肌细胞的分化。结果在索蛋白处理的ES细胞中确认出现了与头蛋白处理的ES细胞大致相同程度的搏动性心肌细胞(图8)，可以确认索蛋白对于ES细胞表现出与头蛋白同样的心肌分化诱导效果。
另外，使用其它的EB形成法/心肌分化诱导法，研究了索蛋白的效果。将在添加了头蛋白(150ng/mL)、或索蛋白(150ng/mL)的培养基、或任何因子都没有添加的培养基培养了3日的ES细胞接种在市售的悬浮培养用板(96-well multiplate；住友Bakelite公司制)后使其形成EB，诱导它向心肌细胞分化。此时，设定添加索蛋白(150ng/mL)的组和没有添加的组。
结果就像图9表示的那样，在索蛋白处理的ES细胞(图中C→C)中，与头蛋白处理的ES细胞(图中N→N)同样，确认出现显著的搏动性心肌细胞，可以再次确认索蛋白对ES细胞表现出与头蛋白同样的心肌分化诱导效果。而在EB形成前的3日间进行索蛋白处理，EB形成后不添加索蛋白的组(图中C→(-))\和EB形成前的3日间不进行索蛋白处理，EB形成后添加索蛋白的组(图中(-)→C)也呈现出比未添加组(图中(-)→(-))有意义增强的心肌分化促进效果。同样的效果在取代索蛋白使用头蛋白的情况也能看到，在该培养条件下，EB形成前的3日间进行头蛋白处理，EB形成后不添加头蛋白的组以及相反在EB形成前不进行头蛋白处理，在EB形成后添加头蛋白的组也确认比头蛋白未处理组有明显强的心肌分化促进效果。
接下来，为了研究头蛋白和索蛋白处理对人细胞的有效性，使用类似于ES细胞的胚胎癌(性)细胞(Embryonal carcinoma cells；以下，称为EC细胞)。将人EC细胞株NCCIT细胞(从American TypeCulture Collection公司购入)与上述使用小鼠ES细胞的情况同样，于添加头蛋白(15ng/mL)、或索蛋白(15ng/mL)的培养基、或任何因子都不添加的培养基培养3日。然后，接种在市售的悬浮培养用板，使其形成EB，培养14日。然后，运用与实施例2情况同样的方法，通过PCR法或免疫组织化学的染色法研究心肌细胞特异标志的基因表达或蛋白产生。结果在头蛋白或索蛋白处理的NCCIT细胞中，证实了作为心肌标志之一的肌球蛋白的表达/产生诱导。
(实施例7通过其它BMP拮抗剂处理导致来自ES细胞的心肌细胞的出现增强效果)接下来，对作为BMP拮抗剂的卵泡抑素、DAN、Caronte(鸡的Cerberus样因子)、gremlin的4种BMP拮抗剂(无论那一个都使用R&D systems公司生产的Fc嵌合型重组蛋白质)的效果进行研究。将在添加了上述各种BMP拮抗剂(150ng/mL)的培养基、以及没有添加BMP拮抗剂的培养基中培养3日的ES细胞接种在市售的悬浮培养用板(96-well multiplate；住友Bakelite公司制)后，使其形成EB，诱导它向心肌细胞分化。
结果可以确认无论哪一种因子都表现出与头蛋白和索蛋白同样、或强于它们的心肌分化诱导活性(图10)。另外，添加相当于BMP受体1A的细胞外区域，竞争性阻碍BMP家族分子与内因性受体的结合的重组蛋白质(Recombinant Mouse BMPR-1A/Fc Chimera；R&D systems公司)情况下也确认了大致同样的促进效果。
序列表<110>福田惠一<120>由干细胞分化诱导心肌细胞的方法<130>
<150>JP 2003-346248<151>2003-10-3<150>JP 2004-212255<151>2004-7-20<160>16<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增GATA-4的正向引物<400>1ctgtcatctc actatgggca 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增GATA-4的反向引物<400>2ccaagtccga gcaggaattt 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增TEF-1的正向引物<400>3aagacgtcaa gccctttgtg 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增TEF-1的反向引物<400>4aaaggagcac actttggtgg 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增Tbx-5的正向引物<400>5ggagcctgat tccaaagaca 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增Tbx-5的反向引物<400>6ttcagccaca gttcacgttc 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增MEF-2c的正向引物<400>7agcaagaata cgatgccatc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增MEF-2c的反向引物<400>8gaaggggtgg tggtacggtc 20<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增αMHC的正向引物<400>9ggaagagtga gcggccatca agg 23<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增αMHC的反向引物<400>10ctgctggaga ggttattcct cg 22<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增MLC-2v的正向引物<400>11gccaagaagc ggatagaagg 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增MLC-2v的反向引物<400>12ctgtggttca gggctcagtc 20<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增α-心脏肌动蛋白的正向引物<400>13ctgagatgtc tctctctctc ttag 24<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增α-心脏肌动蛋白的反向引物<400>14acaatgactg atgagagatg 20<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增GAPDH的正向引物<400>15ttcaacggca cagtcaagg 19<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增GAPDH的反向引物<400>16catggactgt ggtcatgag 19权利要求
1.由干细胞分化诱导心肌细胞的方法，其特征是在抑制BMP信号传导物质的存在下，对干细胞进行用于分化诱导的培养。
2.权利要求1所述的方法，其中，用于分化诱导的干细胞的培养包括进行悬浮凝集培养，使胚状体形成的工序。
3.权利要求1所述的方法，其中，用于分化诱导的干细胞的培养包括与饲养细胞进行共培养的工序。
4.权利要求1所述的方法，其中，用于分化诱导的干细胞的培养包括在培养容器上进行平面培养的工序。
5.权利要求1～4任一项所述的方法，其中，只在分化诱导期的最初数日内添加抑制BMP信号传导的物质。
6.权利要求1～4任一项所述的方法，其中，包括预先用抑制BMP信号传导的物质对分化诱导期前的干细胞进行处理的工序。
7.权利要求1～4任一项所述的方法，其中，包括预先用抑制BMP信号传导的物质对分化诱导期前的干细胞进行处理的工序，而且只在分化诱导期的最初数日内添加抑制BMP信号传导的物质。
8.权利要求1～7任一项所述的方法，其中，抑制BMP信号传导的物质是BMP拮抗剂。
9.权利要求8所述的方法，其中，BMP拮抗剂是从头蛋白、索蛋白、胎球蛋白、卵泡抑素、sclerostin、DAN、Cerberus、gremlin、和Dante、以及它们的相关蛋白质中选出的1个或多个。
10.权利要求1～9任一项所述的方法，其中，干细胞是在试管内培养下具有可向心肌细胞分化能力的来自哺乳动物的细胞。
11.权利要求10所述的方法，其中，具有可向心肌细胞分化能力的来自哺乳动物的细胞是多能性干细胞或来自该细胞的细胞。
12.权利要求11所述的方法，其中，多能性干细胞是胚胎干细胞、具有类似于胚胎干细胞形态的细胞、胚胎生殖细胞或成人型多能性干细胞。
13.权利要求12所述的方法，其中，多能性干细胞是胚胎干细胞。
14.通过权利要求1～13任一项所述的方法得到的心肌细胞。
全文摘要
本发明在由干细胞分化诱导心肌细胞的方法中，通过特征为将干细胞在抑制BMP信号传导物质的存在下进行向心肌细胞的分化诱导培养的该方法，提供高效而且有选择性地对心肌细胞进行分化诱导的方法。
文档编号C12N5/08GK1863904SQ20048002891
公开日2006年11月15日 申请日期2004年10月4日 优先权日2003年10月3日
发明者福田惠一, 汤浅慎介, 冈野荣之, 岛崎琢也, 小清水右一, 田中智文, 杉村惠二郎 申请人:福田惠一