专利名称：：抗生素fki-1778及其生产方法抗生素FKI-1778及其生产方法发明领域本发明涉及新的抗生素FKI-1778，其用于具有针对例如线虫和节肢动物的生长抑制活性的药物、动物药物、农业化学品和呈现针对癌细胞的生长抑制活性的药物，以及涉及该抗生素的生产方法。本发明中，抗生素FKI-1778意味着总的名称，包括FKI-1778A物质、FKI-1778B物质、FKI-1778C物质和FKI-1778D物质。
背景技术：
：至今，已经发现了大量通过微生物生产的抗生素，以及一些抗生素，如青霉素、链霉素、两性霉素B、泰乐菌素、莫能菌素、伊维菌素、杀稻瘟菌素S和多氧菌素，在实践中用于药物、动物药物和农业化学品领域中，或在实践中用于药物领域抗癌剂如丝裂霉素C、争光霉素、阿德里亚霉素、阿克拉霉素A和阿霉素中(UENO,Yoshio和0國RA，Satoshi编辑，"MicrobialMedicinalChemistry"，修订版第3版，179-227页，NankodoPub.，1995)。这些抗生素存在一些问题如毒性、副作用和抗性，因此强烈需要开发解决这些问题的新抗生素。
发明内容为了获得可以解决毒性、副作用和抗性角度上各种问题的抗生素，我们从微生物的培养物质研究和持续开发抗生素，并发现真菌FKI-1778菌林生产的由下式[I]表示的抗生素其中R是—CH=rC—COOH—CH=C—CH2OH一h—=ch2ohch3或其具有针对节肢动物的生长抑制活性和针对癌细胞的细胞周期Gl期的终止活性，并基于这样的认识，我们完成了本发明。本发明的目的是提供可以解决毒性、副作用和抗性多种问题的新抗生素FKI-1778，及其生产方法。我们持续专门研究微生物产生的代谢物，并发现具有生长抑制活性的物质在从土壤中新分离的微生物，FKI-1778菌林，的培养物中产生。随后，作为从培养物分离和纯化活性物质的结果，我们发现了具有下文所示式[II]、[III]、[IV]和[V]表示的化学结构的物质。由于这样的物质在之前是从未知道的，因此将这些命名为抗生素FKI-1778A、抗生素FKI-1778B、抗生素FKI-1778C和抗生素FKI-1778D。根据这样的认识已经完成了本发明，并提供由下式[n]表示的抗生素FKI-1778A:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>本发明还提供了由下式[III]表示的抗生素FKI-1778B:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>本发明进一步提供了由下式[IV]表示的抗生素FKI-1778C:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>[IV]本发明进一步提供了由下式[V]表示的抗生素FKI-1778D:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>[V]iih3gZ、ch2oh本发明进一步提供了生产抗生素FKI-1778的方法，包括培养属于真菌并具有在培养基中产生抗生素FKI-1778能力的微生物，在培养物中累积抗生素FKI-1778，并从所述培养物中分离FKI-1778。本发明进一步提供了生产抗生素FKI-1778的方法，包括培养属于真菌并具有在培养基中产生抗生素FKI-1778A和/或抗生素FKI-1778B和/或FKI-1778C和/或抗生素FKI-1778D能力的微生物，在培养物中累积抗生素FKI-1778A和/或抗生素FKI-1778B和/或FKI-1778C和/或抗生素FKI-1778D，并从所述培养物中分离FKI-1778A和/或抗生素FKI-1778B和/或FKI-1778C和/或抗生素FKI-1778D。此外，本发明提供了属于真菌并具有产生抗生素FKI-1778能力的微生物，其中所述微生物是A1bophomasp.FKI-1778FERMBP-08668。具有产生之前式[II]、[III]、[IV]和[V]所表示的抗生素FKI-1778A、抗生素FKI-1778B、FKI-1778C和抗生素FKI-1778D能力的微生物(下文中命名为"生产FKI-1778物质的微生物")属于真菌，并且是具有产生本发明物质能力的微生物，且不受限制。用于生产本发明抗生素FKI-1778的微生物菌林的优选实例是真菌FKI-1778菌林，其是由本发明者从奄美大岛，鹿儿岛，日本的土壤样本中新分离的。本发明Albophomasp.FKI-1778菌林的分类学性质如下。1.形态学特征该菌株显示出在土豆葡萄糖琼脂培养基、麦芽提取物琼脂培养基，玉米粉琼脂培养基和Miura琼脂培养基中的良好生长，还显示出分生孢子在土豆葡萄糖培养基、玉米粉琼脂培养基和Miura琼脂培养基中的良好生长。麦芽提取物琼脂培养基中，分生孢子的形成受到轻微抑制。分生孢子果的颜色是白色的且有时覆盖有气生菌丝。分生孢子果由交织的菌丝之薄网状结构組织构成并观察到没有孔口。形状是球形至近球形，在培养基上生长的大小为100-300Mm。分生孢子果中，观察到许多分生孢子具有大小为1.6-2.2pm的无色球形的形态。2.多种琼脂培养基上的培养性质土豆葡萄糖琼脂培养基、麦芽提取物培养基、玉米粉琼脂培养基和Miura琼脂培养基上25X:培养2周的肉眼观察结果显示于表1中。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.生理学性质(1)最佳生长条件菌林的最佳生长条件是pH4.0-7.0，温度15.0-28.5'C。(2)生长范围菌抹的生长范围是pH3.0-8.0，温度是7.5-34.0匸。(3)需氧或厌氧性需氧。基于菌抹FKI-1778上述的分类性质、培养性质和生理学性质，将这些性质与已知微生物菌林相比较，认为本菌株为属于Albophomasp.属的菌抹并命名为Albophomasp.FKI-1778。该菌抹以Albophomasp.FKI-1778的名称于2004年3月22日保藏于国际专利生物保藏中心，国家发展工业科学和技术研究所，日本AISTTsulubaCentral6,l-l,Higashil-Chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken，305-8566并给予永久保藏号FERMBP-08668。尽管在本发明生产抗生素FKI-1778的微生物中，将Albophomasp.FKI-1778菌林描述为优选的产生微生物菌林，公知微生物是非常容易突变的且因为微生物的一般属性，分类性质不是维持不变的，通过天然或常用的人工突变来突变更多的微生物，例如，紫外线照射或使用突变诱导剂如N-甲基-N，-硝基-N-亚硝基胍，曱磺酸乙酯等。因此，包括这样人工突变菌林和天然突变菌林的所有属于真菌并具有生产上文通式[I]所示抗生素FKI-1778能力的微生物菌林可以用于本发明中。本发明抗生素FKI-1778的生产中，将属于真菌的生产抗生素FKI-1778的菌抹在培养基中培养，并分离和纯化抗生素FKI-1778。用于生产抗生素FKI-1778的优选营养源实例是可用于真菌的营养源原料。例如，氮源(如可购得的蛋白胨、肉浸骨、玉米浆、棉花籽油、花生粉、大豆粉、酵母提取物、NZ-胺、酪蛋白水解产物、硝酸钠、硝酸铵和硫酸铵)，碳水化合物(如甘油、淀粉、葡萄糖、半乳糖和甘露糖)，碳源(如脂肪)，以及无机盐(如氯化钠、磷酸盐、碳酸钩和硫酸镁)，可以单独使用或组合使用。如果需要，可以加入微量金属盐和消泡剂如动物、植物或硅酮油。这些物质可以是通过生产微生物生产抗生素FKI-1778的底物，且可以使用用于培养真菌的所有已知原料。对于抗生素FKI-1778的大量生产，优选液体培养，且可以使用的培养温度在生产微生物生长并产生抗生素FKI-1778的范围内。可以根据使用上述条件的生产抗生素FKI-1778微生物的性质来有利地选择培养条件。可以通过与水不混溶的有机溶剂(如氯仿和乙酸乙酯)从培养液中提取抗生素FKI-1778。除了上述提取方法，用于分离亲脂物质的已知方法，例如，吸收色语、凝胶过滤色傳、从薄层色镨挖出、离心逆流色镨和高效液相色i普可以结合使用或重复使用来分离纯化的产物。抗生素FKI-1778A、抗生素FKI-1778B、抗生素FKI-1778C和抗生素FKI-1778D的物化性质如下。[I]抗生素FKI-1778A(1)性质浅黄色粉末(2)分子量501(M+H，快速原子轰击质谱)(3)分子式:C29H40O7(4)紫外线吸收光谱在曱醇中测得的UV光谱显示于图l中，并在294nm具有特定的吸收峰入max。(5)红外线吸收光镨通过KBr片测得的IR光镨显示于图2中，并在3430、2960、1687、1564、1450、1390、1259、1097、1036和806cnT1具有特定的吸收峰入max。(6)质子核磁共振光语氚化甲醇(ppra)中的化学位移和旋转耦合常数(Hz)显示如下1.89m(lH)、1.35m(lH)、1.84m(lH)、1.73m(1H)、4.87m(lH)、1.84br.d(lH,2)、1.56m(lH)、1.35m(lH)、2.47dt(1H,J=6.0,i4.0)、2.lObr.d(lH，J-14.0)、2.20m(lH)、2.78t(1H,J=12.6)、2.6idd(lH,J=4.2,12.6)、4.52m(lH)、4.25m(lH)、1.02s(3H)、0.93s(3H)、1.42m(lH)、1.26m(lH)、2.22m(lH)、2.18m(lH)、6.73t(1H,J=7.3)、1.82s(3H)、1.93s(3H)、2.21s(3H)、2.05s(3H)。s:单峰，d:双峰，t:三峰，q:四峰，m:多峰，br:宽，H:质子的数量，J:旋转耦合常数(Hz)。(7)13C核磁共振光镨氚化甲醇(ppm)中的化学位移显示如下。35.Ot、25.lt、7T.3t、41.3t、40.4d、23.8t、32.lt、149.7s、56.2d、38.6s、22,6t、110.6t、23.6q、18.6q、37.2t、23.5t、143.7d、128.7's、171.6s、12.3q、168.ls、104.0s、167.7s、108.7s、156.9s、10.4q、17.2q、172.&s、21.1q0(8)溶剂中的溶解性溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和乙腈。微溶于水和正己烷。(9)颜色反应硫酸中的颜色为褐色。[II]抗生素FKI-1778B(1)性质浅黄色粉末(2)分子量487(M+H，快速原子轰击质谱)(3)分子式C29H4206(4)紫外线吸收光谱在甲醇中测得的UV光谱显示于图3中，并在297認具有特定的吸收峰入max。(5)红外线吸收光谦通过KBr片测得的IR光镨显示于图4中并在3430、2938、2360、1725、1673、1563、1448、1388、1247、1146、1028和887cn^具有特定的吸收峰Amax。(6)质子核磁共振光i普氚化甲醇中的(ppm)化学位移和旋转耦合常数(Hz)显示如下1.85m(lH)、1.34m(lH)、1.87m(lH)、1.71m(1H)、4.87dd(lH,J=2.4，15.6)、1.85dd(lH,J=2.4,15.6)、1.56m(lH)、1.36m(lH)、2.46dt(1H,J=5.4,13.8)、2.06br.d(lH,J=13.8)、2.20m(lH)、2.77t(1H,J-12.6)、2.60dd(1H,J=4.8,12.6)、4.51m(lH)、4.23m(lH)、1.01s(3H)、0.91s(3H)、1.38m(lH)、1.22m(1H)、2.09m(lH)、2.07m(lH)、5.36t(1H,J=7.2)、3.91s(2H)、1.66s(3H)、1.93s(3H)、2.21s(3H)、2.03q(3H)。(7)13C核磁共振光镨氚化甲醇(ppm)中的化学位移显示如下。35.Ot、25.lt、77.5t、41.2t、40.4d、23.8t、32.1t、149.9s、56.2d、38.6s、22.4t、110.6t、23.6q、18.7q、38.5t、22.5t、126.8d、135.9s、69.Ot、13.6q、168.ls、104.Os、167.7s、108.7s、156.9s、10.4q、17.2q、172.6s、21.1q0(8)溶剂中的溶解性溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和乙腈。微溶于水和正己烷。(9)颜色反应硫酸中的颜色为褐色。[III]抗生素FKI-1778C(1)性质浅黄色粉末(2)分子量485(M+H，快速原子轰击质谱)(3)分子式C29H4206(4)紫外线吸收光谱在甲醇中测得的UV光谱显示于图5中，并在293nm具有特定的吸收峰入max。(5)红外线吸收光镨通过KBr片测得的IR光镨显示于图6中并在3430、2940、2327、1678、1558、1461、1390、1254、1081、1037和808cn^具有特定的吸收峰入max。(6)质子核磁共振光谱氚化曱醇(ppm)中的化学位移和旋转耦合常数(Hz)显示如下1.87br.d(lH,J=13.2)、1.34m(lH)、1.82m(1H)、1.72m(1H)、4.76m(1H)、1.77br.d(1H,J=12.6)、1.57m(lH)、1.37m(lH)、2.44dt(1H,J=5.8,14.0)、2.08br.d(1H,J=13.2)、2.17dd(lH,J=3.6，12.6)、2.77t(1H,J=12.0)、2.59dd(lH,J=3.6,12.0)、4.51m(lH)、4.23m(lH)、1.00s(3H)、0.91s(3H)、1.37m(lH)、1.13m(1H)、155m(1H)、1.49m(1H)、3.87t(1H,J=6.0)、1.69s(3H)、4.89m(lH)、4.83m(1H)、1.93s(3H)、2.20s(3H)、2.02s(3H)。(7)"C核磁共振光语氚化甲醇(ppm)中的化学位移显示如下。35.0t、25.lt、77.7t、41.5t、40.6d、23.8t、32.lt、150-0s、56.2d、38.6s、22.5t、110.6t、23.7q、18.8q、35.lt、29.3t、77.8d、148.8s、17.5q、111.9s、168.4s、104.ls、167.9s、108.7s、157.0s、10.4q、17.2q、172.7s、21(8)溶剂中的溶解性溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和乙腈。微溶于水和正己烷。(9)颜色反应硫酸中的颜色为褐色。[IV]抗生素FKI-1778DU)性质浅黄色粉末(2)分子量487(M+H，快速原子轰击质镨)(3)分子式C29H4206(4)紫外线吸收光傳在甲醇中测得的UV光镨显示于图7中，并在295mn具有特定的吸收峰入max。(5)红外线吸收光镨通过KBr片测得的IR光镨显示于图8中，并在3430、2933、2358、1677、1563、1450、1388、1257、1197、1085、1033和806cm—i具有特定的吸收峰入max。(6)质子核磁共振光谱氚化甲醇中的(ppm)化学位移和旋转耦合常数(Hz)显示如下1.82m(lH)、1.34m(lH)、1.87m(lH)、1.71m(1H)、4.86dd(lH,J=4.2,11.4)、1.82m(lH)、1.56m(lH)、1.36m(lH)、2.46dt(1H,J=4.8,13.2)、2.09br.d(lH,J=13.2)、2,19m(lH)、2.77dd(lH,J-12.0，12.6)、2.59dd(lH,J=4.2，12.6)、4.51m(lH)、4.23m(lH)、1.Ols(3H)、0.91s(3H)、1.33m(1H)、1.19m(1H)、2.1Om(lH)、2.08m(lH)、5.23t(1H,J=7.2)、4.07s(2H,J=12.0,16.2)、1.76s(3H)、1.93s(3H)、2.21s(3H)、2.03q(3H)o(7)13C核磁共振光语氚化甲醇(ppm)中的化学位移显示如下,35.Ot、25.lt、77.5t、41.2t、40.4d、23.8t、32.lt、149.9s、56.2d、38.6s、22.4t、110.6t、23.6q、18.7q、38.5t、21.8t、127.5d、134.4s、60.0t、20.3q、168.ls、104.0s、167.7s,108.7s、156.9s、10.4q、17.2q、172.6s、211q0(8)溶剂中的溶解性溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和乙腈微溶于水和正己烷。(9)颜色反应硫酸中的颜色为褐色。接着，抗生素FKI-1778A、抗生素FKI-1778B、抗生素FKI-1778C和抗生素FKI-1778D针对多种微生物的抑菌圏直径显示于表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>从表2可以看出，本发明的抗生素FKI-1778A、抗生素FKI-1778B、抗生素FKI-1778C和抗生素FKI-1778D呈现出没有针对多种微生物的生长抑制活性。接着，下文中描述了本发明的抗生素FKI-1778的抗节肢动物活性。将每种抗生素FKI-1778的甲醇溶液放入微量平板中(96孔)(CorningCorp.，U.S.)。在真空中蒸去甲醇后，加入250ul测试培养基(卵磷脂0.01%,碳酸氢钠7.5mM,氯化钾7.5mM，二水合氯化钧7.5mM和七水合硫酸镁7.5mM)并搅拌15分钟。将含有一些数量的节肢动物Artemiasalina无节幼体的50jh1緩沖溶液加入每个孔中，这些无节幼体在緩沖液中孵育(Tris20mM，氯化钠440mM，氯化镁23mM，碳酸钠1.9mM，硫酸镁53mM和氯化钩10mM)，并在2天后用显微镜观察情况。结果显示于表3中。表3_<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>从表3可以看出，本发明的抗生素FKI-1778呈现出针对节肢动物的生长抑制活性并可以用作药物如杀幼虫剂。节肢动物具有分节的身体，每节具有附肢。所有节肢动物覆盖由几丁质、多糖构成的硬外壳，节肢动物包括蜈蚣、螨虫、蜘蛛、螃蟹和虾。此外，如下解释本发明抗生素FKI-1778针对癌细胞细胞周期Gl期的终止活性。使用96孔微量平板(CorningCorp.,U.S.),将人白血病细胞菌林Jurkat细胞，5xl()S个细胞/孔，接种于200ja1RPMI1640培养基中(I區ICorp.，日本)，含有10%胎牛血清和1%青霉素(10，000单位/ml)-链霉素(10mg/ml)(InvitrogenInc.，U.S.)的混合物，并培养。向其中加入5jug抗生素FKI-1778，并将混合物在37。C5%C02大气下孵育24小时，丢弃培养物上清液。将细胞悬浮于0.1%柠檬酸钠水溶液(200jul)中，溶液中含有0.002%核糖酶A(SigmaCorp.，U.S.)，0.005%碘丙锭(SigmaCorp.，U.S.)和0.3ml/100mlIGEPAL-CA-630(SigmaCorp.,U.S.)。使细胞悬浮液静置2小时或更长时间后，使用流式细胞计数仪(FACSCalbur,Becton，DickinsonandCompany,U.S.)测量10，000个细胞中的DNA含量，然后使用软件CellQuest(Calbur,Becton，DickinsonandCompany,U.S.)测量G1期、S期和G2/M期细胞的DM含量。结果显示于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如表4中所证明的，由于抗生素FKI-1778呈现出针对人白血病细胞菌林Jurkat细胞的细胞周期Gl期的终止活性，因此可以用作抗癌剂。图1显示了本发明抗生素FKI-1778A的紫外线吸收光镨。图2显示了本发明抗生素FKI-1778A的红外线吸收光谱。图3显示了本发明抗生素FKI-1778B的紫外线吸收光i普。图4显示了本发明抗生素FKI-1778B的红外线吸收光镨。图5显示了本发明抗生素FKI-1778C的紫外线吸收光语。图6显示了本发明抗生素FKI-1778C的红外线吸收光谦。图7显示了本发明抗生素FKI-1778D的紫外线吸收光谱。图8显示了本发明抗生素FKI-1778D的红外线吸收光语。实施发明的最佳模式通过提及的实施例来解释本发明，但是不构成限制于实施例的范围内。实施例将一菌环培养于琼脂斜面上的Albophomasp.FKI-1778FERMBP-08668的菌林接种于500ml锥形烧瓶中的100ml液体培养基中(pH6.0)，培养基由葡萄糖2.0%，多聚蛋白胨(NihonSeiyakuCo.,Japan)0.5%,酵母提取物(OrientalYeastCo.，日本)0.2%，琼脂0.1%，磷酸二氢钾0.1%和七水合硫酸镁0.05%组成，并在27。C振荡培养3天。将lml培养的种子培养液体接种于每个500ml锥形烧瓶中，总共60个烧瓶，每个烧瓶含有100ffll液体培养基，培养基由甘油3.0%,麦片2.0%，干酵母1.0%，磷酸氢钾1.0%，磷酸氩二钠1.0%和七水合硫酸镁0.05%组成，并在27。C振荡培养6天。通过离心将培养物分成上清液和菌丝体，用乙酸乙酯提取上清液并真空浓缩来获得粗制物质I814mg。将该物质溶解于甲醇中并将可溶级分用作己烷-甲醇(2:1)两层系统中的上层固定床和下层移动床。将溶液装载于液体-液体分配色诤(MikiK.K.，日本)并用标准的洗脱液来洗脱。将级分在真空中浓缩来获得粗制物质FKI-1778，98.3mg。将FKI-1778接受HPLC(Xtera0DS，019x100mm，WatersInc.，U.S.)，使用40°/。乙腈的流动相并收集峰值，并将收集的级分在真空中浓缩来分离FKI-1778A，4.4mg，FKI-1778B，18.6mg，FKI-1778C，2.5mg，和FKI-1778D，3.6mg。工业应用如上所解释的，将属于真菌并具有产生抗生素FKI-1778能力的微生物在培养基中培养，并在培养基中累积抗生素FKI-1778，然后从培养物中收集抗生素FKI-1778。因此所获得的抗生素FKI-1778是新的抗生素，可用作杀虫剂或抗癌剂。从真菌FKI-1778菌林产生该抗生素，并期望用作药物、动物药物和农业化学品。权利要求1.由下式[I]表示的抗生素FKI-1778:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>其中R是<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>,或<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>2.组合物FKI-1778，包含由下式[II]表示的FKI-1778A:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>和/或由下式[III]表示的FKI-1778B:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>和/或由下式[IV]表示的FKI-1778C:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>和/或由下式[V]表示的FKI-1778D:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3.生产抗生素FKI-1778的方法，包括培养属于真菌并具有产生抗生素FKI-1778能力的微生物，在培养物中累积抗生素FKI-1778,并从所述培养物中分离抗生素FKI-1778。4.生产FKI-1778的组合物的方法，包括培养属于真菌并具有产生抗生素FKI-1778A和/或抗生素FKI-1778B和/或抗生素FKI-1778C和/或抗生素FKI-1778D能力的微生物，在培养物中累积抗生素抗生素FKI-1778A和/或抗生素FKI-1778B和/或抗生素FKI-1778C和/或抗生素FKI-1778D，并从所述培养物中分离抗生素抗生素FKI-1778A和/或抗生素FKI-1778B和/或抗生素FKI-1778C和/或抗生素FKI-1778D。5.—种微生物，其中属于真菌并具有产生抗生素FKI-1778能力的孩i生物是Albophomasp.FKI-1778FERMBP-08668，及其突变体。全文摘要本发明包括培养属于真菌并具有产生抗生素FKI-1778A和/或抗生素FKI-1778B和/或抗生素FKI-1778C和/或抗生素FKI-1778D能力的微生物，在培养物中累积抗生素抗生素FKI-1778A和/或抗生素FKI-1778B和/或抗生素FKI-1778C和/或抗生素FKI-1778D，并从所述培养物中分离抗生素抗生素FKI-1778A和/或抗生素FKI-1778B和/或抗生素FKI-1778C和/或抗生素FKI-1778D。因此期望将所获得的物质作为药物、动物药物和农业化学品，或作为具有针对癌细胞的生长抑制活性的药物。文档编号C12P17/06GK101124211SQ20048003039公开日2008年2月13日申请日期2004年3月24日优先权日2004年3月24日发明者供田洋,增间碌郎,大村智申请人:社团法人北里研究所