来自苏云金芽孢杆菌的分泌的杀虫蛋白质和基因组合物及其用途的制作方法

专利名称：：来自苏云金芽孢杆菌的分泌的杀虫蛋白质和基因组合物及其用途的制作方法来自苏云金芽孢杆菌的分泌的杀虫蛋白质和基因组合物及其用途发明背景本发明涉及编码鳞翅目-毒性蛋白质和其杀虫片段的基因的新家族。具体地，本发明涉及在本文称作TIC900、TIC402、TIC403、TIC404、TIC961、TIC962、TIC963、TIC965和TIC966的代表性蛋白质和它们的杀虫片段，它们每个由在本文中分別称作tic卯O、tic402、tic403、tic404、tic434、tic961、tic962、tic963、tic965、和tic966的代表性核苷酸编码序列编码，还涉及核苷酸序列同源物，其(l)编码杀虫蛋白质和(2)在严格杂交条件下与tic卯O、tic402、tic403、tic404、tic434、tic961、tic962、tic963、tic965、和tic966编码序列杂交。本发明还涉及用本发明的一种或多种核苷酸序列转化或者用本文给出的核苷酸序列的变体转化的宿主细胞，通过与本文给出的序列的同一性和/或相似性相关的基因，和/或其同源物，具体地，已经经修饰以在植物中提高表达的那些序列。在优选实施方案中，所转化的宿主细胞是植物细胞。几乎所有农作物、植物和商业畜牧区都易受一种或多种虫害的攻击。尤其有问题的是鞘翅目和鳞翅目害虫。例如，蔬菜和油菜作物如朝鲜蓟、大头菜、芝麻菜、韭葱、芦笋、扁豆、豆、莴苣(例如，头、叶、长叶莴苣)、甜菜、小白菜、malanga、花茎甘蓝、甜瓜(例如，香瓜、西瓜、crenshaw、honeydew、罗马甜瓜)、抱子甘蓝、巻心菜、cardoni、胡萝卜、青菜、花椰菜、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风、菊苣、豌豆、大白菜、胡椒、芥蓝菜、马铃薯、黄瓜、南瓜、葫声、小红萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、茄子、波罗门参、宽叶莴苣、青葱、菊苣、大豆、大蒜、菠菜、青葱、南瓜、greens、甜菜、甘薯、芜菁、唐莴苣、辣根、番茄、羽衣甘蓝、芜菁和多种香料对下列害虫的一种或多种的侵害敏感苜蓿尺蠖、粘虫、甜菜粘虫、朝鲜蓟羽蛾、巻心菜奸虫、巻心菜尺蠖、巻心菜结网虫、玉米earworm、芽菜leafeater、斑紋巻叶菜虫、欧洲玉米螟、菱形斑故蛾、绿色cloverworm、夕卜来的巻叶菜虫、melonworm、杂食'法leafroller、f包菜虫、rindwormcomplex、盐沼毛虫、大豆尺蠖、烟草对虫、番蒜fruitworm、番茄homworm、番茄蛲虫、velvetbean毛虫、和黄斑粘虫。同样地，牧草和干草作物如苜蓿、牧草和青贮飼料通常受到诸如粘虫、甜菜粘虫、苜蓿毛虫、欧洲弄蝶、多种尺蠖和结网虫以及黄斑粘虫的攻击。水果和蔓生作物如苹果、杏、櫻桃、油桃、桃子、梨、李子、洋李、quincealmond、栗、榛子、美洲山核桃、阿月浑子树、核桃、柑桔、黑莓、蓝莓、波森莓、酸果蔓、醋栗、罗甘莓、覆盆子、草莓、葡萄、絝梨、香蕉、猕猴桃树、柿子、石榴、菠萝、和热带水果通常易受如下害虫的攻击并脱叶葡萄蔓天蛾、amorbia、粘虫、柑桔切根虫、橡胶弄蝶、黑头荄火虫、蓝莓巻叶虫、尺蠖幼虫、樱桃fruitworm、柑桔切根虫、酸果芟天牛甲虫、东方天幕毛虫、美国白蛾、榛子巻叶虫、榛子结网虫、果树巻叶虫、葡萄蛾、葡萄leaffolder、葡萄叶skeletonize"greenfruitworm、gummosos隱batrachedracommosae、舞毒織、山胡杉匕树shuckworm、hornworms、尺獲、勝樣worm、obliquebanded巻叶虫、杂食性巻叶虫、杂食性尺蠖、桔子巻叶蛾、桔凤蝶、梨小食心虫、pandemisleafroller、桃枝蛀虫、山核桃鞘蛾、redbandedleafroller、红疾天社蛾、roughskinnedcutworm、盐泽灯蛾、尺蠖、天幕毛虫、thecla-theclabasillides、烟草对虫、巻叶蛾、tuftedapplebudmoth、杂色leafroller、胡杉^毛虫、加洲天幕毛虫和黄条粘虫。农作物如芸苔/油菜籽、月见草、meadowfoam、玉米(田野、甜的、爆玉米)、棉花、蛇麻花、加州希蒙得木、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等等)、高梁、大豆、向日葵和烟草通常是昆虫的侵袭靶标，所述昆虫包括粘虫、亚洲和其他玉米蛀虫、带紋的向日葵蛾、甜菜粘虫、棉铃虫、巻心菜尺蠖、玉米根虫(包括南部和西部品种)、棉叶perforator、菱紋背蛾、欧洲玉米蛀虫、苜蓿绿夜蛾、headmoth、headworm、夕卜来的巻叶菜虫、尺蠖(包括Anacamptodesspp.)、obliquebandedleafroller、杂食性leaftier、podworm、盐泽灯蛾、西南玉米蛀虫、大豆尺蠖、八字地老虎、向日葵螟、烟草夜蛾幼虫、烟草天蛾和藜豆认蛾。花坛植物、花、观赏植物、蔬菜和containerstock通常^t昆虫害虫宿主摄食，所迷害虫为诸如粘虫、杜鹃花蛾、甜菜粘虫、菱紋背蛾、ellomoth(天蛾)、佛罗里达蕨类毛虫、Io蛾、尺蠖、夹竹桃蛾、杂食性leafroller、杂食性尺蠖、和烟草夜蛾幼虫。森林、果树、观赏植物和结坚果的树，以及灌木和其他苗木通常易受多种昆虫的攻击，所述昆虫为诸如结草虫、黑头食心虫、browntailmoth、加州槲蛾、douglas冷杉丛蛾、榆树尺蠖、美国白蛾、果树巻叶蛾、绿条犀额蛾、舞毒蛾、短叶4^芽巻蛾、含羞草结网虫、pinebutterfly、红疣天it蛾、鞍背刺蛾、saddleprominentcaterpillar、春秋尺蠖、云杉巻叶蛾、天幕毛虫、巻叶蛾和老年毒蛾。同样地，害虫如粘虫、草地结网虫和热带草地结网虫通常攻击草皮草。因为具有商业重要性的作物通常是昆虫攻击的目标，所以在许多情况中需要环境敏感的用于控制和消灭昆虫侵袭的方法。对于农夫、园丁、种植者和商业和居住区尤其如此，他们寻求使用环境友好的组合物控制昆虫种群。苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)是革兰氏阳性细菌，其在孢子形成期间产生蛋白质性质的晶状包含体。这些苏云金晶体蛋白质通常对于特定昆虫是高度毒性的。已经从抗来自昆虫目鳞翅目(毛虫)、鞘翅目(甲虫)和双翅目(蚊子、苍蝇)的昆虫幼虫的多种苏云金芽孢杆菌菌林的结晶蛋白质鉴定了杀虫活性。个体苏云金芽孢杆菌结晶蛋白质也称作5-内毒素或者伴胞晶体或者毒素蛋白质，可以在它们的结构和杀虫活性中非常不同。这些杀虫蛋白质由通常位于在苏云金芽孢杆菌菌抹中发现的大小大于30百万道尔顿(mDa)的大质粒中的基因编码。已经克隆了许多这些苏云金芽孢杆菌毒素基因并且表征了杀虫晶体蛋白质产物的特定杀虫性质。Hofte等人(1989)和Schnepf等人(1998)提供了苏云金芽孢杆菌毒素基因和晶体蛋白质的综述。很久以来就认识到苏云金芽孢杆菌的杀虫性质，并且在40多年里，已经将苏云金芽孢杆菌菌林掺入商业生物杀虫剂产品中。商业苏云金芽孢杆菌杀虫剂制剂通常含有干燥的孢子形成的苏云金芽孢杆菌发酵培养物，其结晶蛋白质对多种昆虫物种是有毒的。常规的商业化苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂产品来自"野生型"苏云金芽孢杆菌菌林，即，从天然来源分离的苏云金芽孢杆菌菌林的纯化的培养物。较新的商业化苏云金芽孢杆菌生物杀虫剂产品基于遗传改变的苏云金芽孢杆菌菌林，如美国专利号5,080,897和4,935,353中描述的转接合子苏云金芽孢杆菌菌林。结晶蛋白质的一个特征是它们能够在苏云金芽孢杆菌母细胞中聚结而形成晶体。当母细胞裂解时，蛋白质作为晶体释放到外部环境。此外，苏云金芽孢杆菌还产生非结晶蛋白质，与结晶蛋白质不同，非结晶蛋白质由苏云金芽孢杆菌细胞作为可溶性蛋白质分泌到培养基中。苏云金芽孢杆菌的分泌的非结晶蛋白质包括磷脂酶、蛋白酶和P-内酰胺酶，它们具有很小(如果有)的杀虫活性。然而，已经报导苏云金芽孢杆菌的称作Vipl、Vip2和Vip3的三种分泌的非结晶蛋白质对鞘翅目或者鳞翅目昆虫有毒性(Estruch等人，1996;美国专利号5，866，326;W094/21795;WO96A0083)。报导苏云金芽孢杆菌的称作CryV的非结晶蛋白质对鳞翅目昆虫有毒性(Kostichka等人，1996)。许多不同研究人员已经鉴定了产生细胞外分泌的杀虫毒素蛋白质的许多苏云金芽孢杆菌分离物。此类分离物都已经表现出产生一种或多种这些VIP或CryV毒素蛋白质或者密切相关的同源物。鞘翅目抑制性分泌的BT蛋白质如TIC卯1、TIC1201、TIC407和TIC417以前已经公开但是似乎与本发明的蛋白质无关(2003年7月7日提交的美国临时专利申请号60/485,483;2004年7月6日提交的PCT/US04/21692)。本发明人公开了一类新的细胞外分泌的杀虫蛋白质毒素，其不显示出与已知的VIP或者CryV类蛋白质的同源性。苏云金芽孢杆菌的137种已知的昆虫毒性蛋白质(Crickmore等人，1998)(或多或少)没有一种与本发明的蛋白质实质性相关。实际上，在本发明的蛋白质序列和NationalCenterforGenomeResources(GenBank)，SantaFe，NM中的数千蛋白质序列的任一种之间没有发现显著同源性。发明概述在一个实施方案中，本发明涉及分离的和纯化的杀虫蛋白质，其显示出基本如SEQIDNO:4(TIC卯0)、SEQIDNO:6(TIC402)、SEQIDNO:8(TIC403)、SEQIDNO:10(TIC404)、SEQIDNO:30(TIC434)、SEQIDNO:12(TIC961)、SEQIDNO:14(TIC962)、SEQIDNO:16(TIC963)、SEQIDNO:18(TIC965)、和SEQIDNO:20(TIC966)中给出的氨基酸序列，或者其相关氨基酸序列和同源物。如本文所示，已经在生物测定中阐明了TIC900和相关蛋白质对鳞翅目昆虫的杀虫活性，所述昆虫包括玉米螟(ECB)、烟草夜蛾幼虫(TBW)和菱紋背蛾(DBM)。在另一实施方案中，本发明涉及分离并纯化的核普酸序列，即编码序列，其包含如SEQIDNO:3(tic900)、SEQIDNO:5(tic402)、SEQIDNO:7(tic403)、SEQIDNO:9(tic404)、SEQIDNO:29(tic434)、SEQID脆ll(tic961)、SEQIDNO:13(tic962)、SEQIDNO:15(tic963)、SEQIDNO:17(tic965)、或SEQIDNO:19(tic966)中给出的核苷酸序列，或者其相关序列或者同源物。如SEQIDNO:3中给出的天然tic900编码序列编码显示出如SEQIDNO:4中给出的氨基酸序列的TIC900蛋白质。产生TIC900或者相关蛋白质的生物显示出杀虫活性和/昆虫抗性性质。如SEQIDNO:5中给出的天然tic402编码序列编码显示出SEQIDNO:6中给出的氨基酸序列的TIC402蛋白质如SEQIDNO:7中给出的天然tic403编码序列编码显示出SEQIDNO:6中给出的氨基酸序列的TIC403蛋白质。如SEQIDNO:9中给出的天然tic404编码序列编码显示出SEQIDNO:10中给出的氨基酸序列的TIC404蛋白质。如SEQIDNO:29中给出的天然tic434编码序列编码显示出SEQIDNO:30中给出的氨基酸序列的TIC434蛋白质。如SEQIDNO:ll中给出的天然tic961编码序列编码显示出SEQIDNO:12中给出的氨基酸序列的TIC961蛋白质。如SEQIDNO:13中给出的天然tic962编码序列编码显示出SEQIDNO:14中给出的氨基酸序列的TIC962蛋白质。如SEQIDNO:15中给出的天然tic963编码序列编码显示出SEQIDNO:16中给出的氨基酸序列的TIC963蛋白质。如SEQIDNO:17中给出的天然tic965编码序列编码显示出SEQIDNO:18中给出的氨基酸序列的TIC965蛋白质。如SEQIDNO:19中给出的天然tic966编码序列编码显示出SEQIDNO:20中给出的氨基酸序列的TIC966蛋白质。TIC900或相关蛋白质和来自编码这些蛋白质的Bt菌林的核苷酸序列在本文中描述为相互的同源物，即，在特异杂交条件下或者严格杂交条件下与本文公开的任一序列杂交的核普酸序列编码的杀虫蛋白质或者其杀虫片段，并且特别意在包括在本发明的范围内。在另一实施方案中，本发明涉及苏云金芽孢杆菌细菌的生物纯的培养物，其用含有如SEQIDNO:3(tic900)、SEQIDNO:5(tic402)、SEQIDNO:7(tic403)、SEQIDNO:9(tic404)、SEQIDNO:29(tic434)、SEQIDNO:ll(tic961)、SEQIDNO:13(tic962)、SEQIDNO:15(tic963)、SEQIDNO:17(tic965)、或SEQIDNO:19(tic966)中给出的核苷酸序列，或者相关序列或同源物的质粒载体转化，所述培养物在发酵期间产生杀虫蛋白质并且将蛋白质分泌到细菌菌林周围的细胞外间隙。根据用于专利程序的国际承认的微生物保藏的布达佩斯条约(InternationalRecognitionoftheDepositofMicroorganismforthePurposesofPatentProcedure),在2000年4月25日已经将代表性菌抹SIC9002保藏在NorthernRegionalResearchLaboratoryofAgriculturalResearchServiceCenterCollection(NRRL)，USDA，1815NorthUniversityStreet,Peoria,IL61604并且已经分配保藏号NRRLB-30582。含有tic卯O核苷酸序列的一种质粒在本文中作为pBDl提出。在另一实施方案中，本发明还涉及称作菌林EG5438的苏云金芽孢杆菌细菌的生物学纯的培养物，其显示出对鳞翅目昆虫的杀虫活性。苏云金芽孢杆菌菌林EG5438代表野生型苏云金芽孢杆菌菌林，从其分离了tic900编码序列。根据布达佩斯条约，在2000年5月3日将该菌林保藏在NRRL，USDA,并且分配保藏号NRRLB-30584。在另一实施方案中，本发明提供了编码TIC卯0氨基酸序列(SEQIDNO:4)的如SEQIDNO:3中给出的核苷酸序列，和可以被标i己并且针的核苷酸部分。在本文中特别例证的其他相关核苷酸序列包含如SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:19中提出的序列，它们的每一个分别编码如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:30、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、和SEQIDNO:20中提出的杀虫蛋白质毒素。在再一个实施方案中，本发明提供了植物细胞和植物，其已经用编码如SEQIDNO:4中给出的TIC900或者相关蛋白质或者其杀虫片段或者其TIC900蛋白质同源物的核苷酸序列转化，所述蛋白质序列选自有SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:30、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18和SEQIDN0:20构成的组。可以由植物细胞或者在植物组织中翻译和表达所述核苷酸序列，其水平足够抑制或者杀死与表达所述蛋白质的转基因植物接触的鳞翅目害虫，尤其当所述害虫摄取所述转基因植物的部分时。单子叶植物和双子叶植物都在本发明的范围内。为了实现最大表达水平和增强含有所述序列的植物产生TIC900或者相关蛋白质的杀虫水平的能力，可能需要修饰所述序列。用本文公开的核普酸序列转化植物可以导致表达转基因，即tic卯0或其同源物的转化体的频率增加，以及产生显示出形态学上正常的生理的转化事件的更大百分数。在再一个实施方案中，本发明还提供了产生转基因植物的方法，所述转基因植物显示出编码TIC900蛋白质或者其杀虫片段或者其同源物的核苷酸序列的增加的表达水平和之后杀虫TIC900蛋白质或其同源物的增加的水平。从而，与缺少编码TIC900、TIC900的杀虫片段，或者其同源物之一的核苷酸序列的植物相比，用本文公开的核苷酸序列转化的植物显示出鳞翅目害虫抗性能力的提高和增加的水平。在完成前述目的中，提供了在植物中表达编码TIC卯O蛋白质或其同源物的核苷酸序列的方法，其包括步骤a)向植物细胞的基因组中插入核苷酸序列，其在5，到3，方向包含与优化用于植物表达的结构DNA序列可操作连接的植物功能启动子，所述结构DNA序列导致产生RNA序列，该RNA序列编码如SEQIDNO:4中给出的TIC卯0多肽序列的全部或者杀虫片段，或者其选自SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:30、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、和SEQIDNO:20构成的组的同源物，或者与SEQIDNO:4中给出的氨基酸序列有至少约80%，或者至少约85%,或者至少约90%,或者至少约95%,或者至少约99%序列同一性的序列，或者编码杀虫蛋白质的在特异或者严格杂交条件下与这些序列的任一个杂交的序列，和3，非翻译DNA序列，其在植物细胞中发挥功能导致转录终止和多腺苷酸化；b)得到含有该核酸序列的经转化的植物细胞；和c)从经转化的植物细胞产生遗传转化的植物，其表达编码TIC900或者相关蛋白质的核苷酸序列，其中经转化的植物与未转化以表达所述蛋白质的植物相比在形态上是正常的并且显示出升高或提高水平的鳞翅目害虫抗性。本发明的另一实施方案是提供特异结合仅由TIC900蛋白质或其同源物呈递的表位的抗体。抗体可以用于鉴定TIC900蛋白质或其同源物的存在、用于纯化该蛋白质或同源物，用于鉴定TIC卯O蛋白质或其同源物正从其表达的核苷酸序列，和用于试剂盒中，设计该试剂盒以允许检测TIC900蛋白质或同源物或者检测表达该蛋白质或同源物的核苷酸序列。发明人预计本文公开的蛋白质组合物将可以用作杀虫剂用于局部或者系统地应用于大田作物、草、果树和蔬菜，和观赏植物。在优选实施方案中，生物杀虫剂组合物包含细菌细胞的油流动的悬浮物，所述细菌细胞表达本文公开的新的杀虫蛋白质。优选地，所述细胞是苏云金芽孢杆菌EG5438或者SIC9002细胞，然而，预计可以使用表达此处公开的新的核酸片段并产生结晶蛋白质的任何此类细菌宿主细胞，如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtms)、大肠杆菌(E.coli)或者假单胞菌(Pseudomonasspp)。本发明的一个特定优点包含昆虫抗性处理(IRM)的改进。能够将两种或多种杀虫剂组合成一种组合物的能力，其中每种杀虫剂对相同害虫物种有毒性，并且每种杀虫剂显示出与和它组合的另一种杀虫剂不同的作用方式，给出了通过实质性减小在种群中将发生的对该杀虫组合物的抗性的可能性从而更有效控制特定害虫物种的方法。本发明的TIC900蛋白质和其杀虫片段，或者其任意同源物可以与任意数目的已知杀虫剂组合以实现特定组合物中抗性处理的水平，优选通过在植物中表达杀虫剂的组合来实现。具体地，TIC900或者相关的杀虫蛋白质组合物可以与Cryl或者Cry2氨基酸序列或者其变体组合以实现多种鳞翅目植物害虫种类的控制，或者与其他适宜的Cry蛋白质，和与来自已经显示出针对鳞翅目植物害虫种类的杀虫生物活性的Xenorhabdus和Photorhabdus细菌物种的多种细菌組合物组合。优选地，这些组合物的inplanta用途将涉及所述蛋白质在植物的部分中的表达，其中所述植物的部分显示出对鳞翅目昆虫摄食的最大的脆弱性。对于针对欧洲玉米螟(ECB)的玉米物种的保护，将优选在植物的叶子和茎干中实现最高水平的表达。对于蚜虫敏感的烟草种，将优选在植物的萌芽部分，即在植物的芽系统中实现最高水平的表达。对于针对菱紋背蛾(DBM)的十字花科植物物种的保护，将优选在植物的叶子和茎干中实现最高水平的表达。本发明的杀虫蛋白质还可以与在植物中(inplanta)表达的杀虫和/或杀真菌毒素组合以获得重组植物，其显示出对植物无益的害虫的侵袭的多重水平抗性。例如，本发明的蛋白质可以与显示出鞘翅目昆虫控制的蛋白质，和/或与显示出抗真菌活性的蛋白质或者其他试剂一起表达，以实现重组转基因植物，其显示出对鳞翅目害虫、鞘翅目害虫和真菌病害的提高的抗性。抗性水平的其他排列(permutations)是本领域技术人员已知的，如对穿刺和吮吸昆虫侵袭和线虫侵袭等的抗性的方法。本发明的杀虫蛋白质还可以与表达为一种或多种dsRNA的一种或多种核苷酸序列组合，所述dsRNA用于抑制(l)靶标害虫中一种或多种基因作为实现显示出对特定害虫侵袭的多层抗性的植物的方法；(2)植物中一种或多种基因作为实现所希望的植物性状的方法；或(3)—种或多种基因，以多种组合来实现(1)或(2)总体的所希望的性质。本文预期嵌合蛋白，其由本发明的一种或多种蛋白质的全部或部分与用于保护植物免于侵袭等的其他蛋白质融合而组成。例如，已经发现本发明的蛋白质的结构域显示出与其他Bt毒素的低水平相似性，所述其他Bt毒素为诸如Cry3Aa毒素结构域I、CrylCa毒素结构域II和CrylJa毒素结构域III(尤其，TIC900蛋白质的毒素部分的结构域I、II和III)。本发明的蛋白质可以与本领域已知的任意Cryl蛋白质的前毒素结构域融合，当在Bt或者其他芽孢杆菌菌林中表达时产生结晶毒素蛋白质。此外，在此处鉴定的本发明的蛋白质的氨基酸序列内的结构域可以与来自杀虫Bt毒素蛋白质的其他相似结构域交换以实现以前用Cryl毒素结构域交换没有观察到的提高的杀虫活性和/或宿主范围(Malvar等人，美国专利号6,017,534;Galizzi等人，PCT/EP90/0114，WO9鹿087)。另一实施方案包含分离的多核苷酸，其编码对害虫有活性的苏云金芽孢杆菌杀虫毒素或者其杀虫片段，其中所述毒素或杀虫片段具有约65,000道尔顿到约70,000道尔顿的分子量。此外，编码毒素的该核苷酸序列或者其互补序列在特异或严格杂交条件下与SEQIDNO:3杂交。所述毒素优选在控制或杀灭鳞翅目害虫，优选欧洲玉米螟(ECB)、烟草夜蛾幼虫(tobaccobudworm,TBW)和/或菱紋背蛾(DBM)中显示出生物学活性。在一个实施方案中，编码所述毒素的核苷酸序列经优化用来在植物中表达，仍然基本上编码该毒素或其杀虫片段，即编码与天然氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列。本发明的另一实施方案提供了宿主细胞，其经转化而含有编码本发明的杀虫蛋白质或者其杀虫片段的多核苷酸。优选地，修饰本发明的核苷酸序列以提高本发明的蛋白质在优选的宿主细胞中的表达。本发明的宿主细胞选自由细菌细胞、真菌细胞和植物细胞构成的组。植物细胞中的表达可以包括表达以实现在细胞质中杀虫蛋白质的积累，或者可以导致杀虫蛋白质积累到亚细胞细胞器，如质体、叶绿体或线粒体中。备选地，本发明的杀虫蛋白质或者其杀虫片段可以定位到特定宿主细胞的蛋白质分泌机制并导致在细胞外和细胞周围的细胞外间隙积累所述蛋白质。在本发明的额外实施方案中提供了控制鳞翅目昆虫物种侵袭植物的方法。优选地，在该昆虫的食物中提供了杀虫量的本发明的杀虫蛋白质或者其杀虫片段以供该害虫消耗。食物可以由昆虫通常吃的植物部分，如植物组织和植物细胞组成。杀虫蛋白质或者其杀虫片段可以在组合物中提供，将该组合物应用于植物组织的表面、植物部分和植物细胞，或者更优选地，可以由细胞的蛋白质合成机制产生并且如上述，在植物细胞内积累或者分泌到植物细胞外，只要提供的蛋白质毒素的量是足够抑制害虫进一步摄食，或者抑制害虫进一步生长和发育，或者导致害虫(insectpest)死亡的杀虫量。杀虫毒素或其片段来自核苷酸序列，由苏云金芽孢杆菌中在严格条件下与SEQIDNO:3基本上互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码。本发明还提供了检测第一种核苷酸序列的方法，所述第一种核苷酸序列与SEQIDNO:3中给出的第二种核苷酸序列杂交，其中第一种核苷酸序列编码杀虫蛋白质或者其杀虫片段并且在特异或严格杂交条件下与所述第二种核苷酸序列杂交。其他代表性的第二种核苷酸序列为SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQIDNO:ll、SEQIDN0:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:19。还预期当本发明的蛋白质在植物中(inplanta)表达时可以用于提供提高水平的保护免于昆虫侵袭表达该蛋白质或其杀虫片段的植物。因此，设想将编码单独表达或者作为嵌合体或融合蛋白表达的TIC900杀虫蛋白质或者其杀虫片段或者其同源物，或者它们的组合的一种或多种核苷酸序列导入植物细胞的基因组中，或者叶绿体或线粒体DNA中，或者导入细胞器中作为稳定的和自主复制的染色体外元件，用于表达所述TIC卯O蛋白质或者其杀虫片段或者其同源物。优选地，所述序列是非天然发生的核苷酸序列，其编码杀虫蛋白质或者其杀虫片段。在本文提供用此类序列转化的植物细胞。本发明提供了从所转化的植物细胞生长的植物。本发明还提供了来自本发明的经转化的植物的种子或者种子的后代，只要种子含有至少编码所述杀虫蛋白质或者其杀虫蛋白质片段的序列。所设想的核苷酸序列与从苏云金芽孢杆菌分离的本发明的核苷酸序列有至少约60到约85%同一性。除了涉及SEQIDNO:5和SEQIDNO:4的序列之外，本发明的代表性序列至少包括(l)如SEQIDNO:5中给出的核苷酸序列和如SEQIDNO:6给出的由SEQIDNO:5编码的氨基酸序列，其在本文也称作杀虫蛋白质TIC402;(2)如SEQIDNO:7中给出的核苷酸序列和如SEQIDNO:8给出的由SEQIDNO:7编码的氨基酸序列，其在本文也称作杀虫蛋白质TIC403;(3)如SEQIDNO:9中给出的核苷酸序列和如SEQIDNO:10给出的由SEQIDNO:9编码的氨基酸序列，其在本文也称作杀虫蛋白质TIC404;(4)如SEQIDNO:29中给出的核苷酸序列和如SEQIDNO:30给出的由SEQIDNO:29编码的氨基酸序列，其在本文也称作杀虫蛋白质TIC434;(5)如SEQIDNO:ll中给出的核苷酸序列和如SEQIDNO:12给出的由SEQIDNO:ll编码的氨基酸序列，其在本文也称作杀虫蛋白质TIC961;(6)如SEQIDNO:13中给出的核苷酸序列和如SEQIDNO:14给出的由SEQIDNO:13编码的氨基酸序列，其在本文也称作杀虫蛋白质TIC962;(7)如SEQIDNO:15中给出的核苷酸序列和如SEQIDNO:16给出的由SEQIDNO:15编码的氨基酸序列，其在本文也称作杀虫蛋白质TIC963;(8)如SEQIDNO:17中给出的核苷酸序列和如SEQIDNO:18给出的由SEQIDNO:17编码的氨基酸序列，其在本文也称作杀虫蛋白质TIC965;和(9)如SEQIDNO:19中给出的核苷酸序列和如SEQIDNO:20给出的由SEQIDNO:19编码的氨基酸序列，其在本文也称作杀虫蛋白质TIC966。这些蛋白质和编码这些蛋白质的天然Bt核苷酸序列的每一种与如本文定义的TIC900相关。例如，并且分别地，SEQIDNO:5是编码如SEQIDNO:6中给出的TIC402杀虫蛋白质的核苦酸序列。可以通过在严格条件下与SEQIDNO:3杂交鉴定本文所示的SEQIDNO:5。SEQIDNO:5编码的蛋白质显示出对鳞翅目的毒性生物学活性，显示出对欧洲玉米螟(ECB)、烟草夜蛾幼虫(TBW)和/或菱紋背蛾(DBM)的毒性。SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:19每个都能够在严格条件下相互杂交，并且每个序列都可以通过在严格条件下与SEQIDNO:3杂交来鉴定，并且每个序列可以通过使用如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22中给出的寡核苷酸引物扩增来鉴定。如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22中给出的引物可以诊断性鉴定样品中编码TIC卯O或者相关杀虫蛋白质的存在。这些寡核苷酸当在确定的扩增条件下并且在适宜的核普酸序列底物存在下一起使用时，产生扩增子，其可以诊断TIC900编码序列或者其同源物的存在。该特定反应可用于检测样品中编码对应于TIC卯O或相关蛋白质的杀虫蛋白质的B.t.基因的存在，极大地简化了对此类相关序列的搜索和鉴定。还预期用于检测本发明的核苷酸序列的存在的试剂盒。此类试剂盒含有一种或多种核苷酸序列，它们每种用作探针来检测编码本发明的杀虫蛋白质或者其片段的核苷酸序列的存在。此类试剂盒还可以或者备选地含有对结合本发明的蛋白质的一种或多种肽特异的抗体，以及与探针或抗体一起使用的试剂，该试剂盒将还含有对照样品，其用的说明书发挥功能。i行核苷酸^列或肽的鉴定^方法必需的所有试剂将与使用说明书一起包装在试剂盒中。代表性试剂盒可以含有TIC900或者编码杀虫蛋白质的相关核苷酸序列以及如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22中给出的代表性核苷酸序列扩增引物的样品，以及进行扩增反应所需的必要试剂，它们所有的都包装在试剂盒中。经转化而含有(a)编码本发明的一种或多种蛋白质的核苷酸序列，(2)本发明的一种或多种蛋白质的全部或者杀虫活性部分，或者(3)含有本发明的一种或多种蛋白质的全部或任意部分的嵌合体的植物或植物组织可以用本领域公知的任意数量的方法检测，所述方法包括但不限于基于核苷酸序列的检测方法和/或基于蛋白质的检测方法。来自此类转化植物或植物组织的物质的农艺上或商业上重要的产品和/或组合物包括但不限于，动物饲料、日用品，和玉米、大豆、棉花、芸莒、小麦、燕麦、稻、甘蔗、鹰嘴豆、豇豆产品，用作人类消费的食物或者用于旨在用于人类消费的组合物中的副产品包括但不限于面粉、粗粉、糖浆、油、淀粉、玉米花、蛋糕、含有这些作物的果实和种子的谷类和副产物，等等，如果这些产品和物质组合物含有可检测量的编码本文给出的蛋白质或者蛋白质衍生物的核苷酸序列，那么这些产品和组合物都意在本发明的范围内。可以使用方法检测生物样品中怀疑含有本发明的蛋白质或者编码该蛋白质的核苷酸的植物或植物部分，所述方法包括下列步骤将怀疑含有所述核苷酸的样品与多核苷酸探针杂交，所述探针在严格杂交条件下与所述核苷酸杂交并且在严格杂交条件下不与来自对照植物的核苷酸杂交，将所述样品和所述探针置于所述严格杂交条件，并检测所述探针与所述核苷酸的杂交。本发明的一个实施方案包括来自转基因植物、组织或者种子的生物样品，其中所述样品包含编码本发明的蛋白质的核苷酸序列或者其互补序列，并且其中可以使用核酸扩增或者核酸杂交方法在所述样品中检测到所述序列。样品可以由选自从含有所述核苷酸序列的转基因植物可得到的提取物、和可以含有编码本发明的一种或多种蛋白质的任意核苷酸序列或者它们的互补序列的提取物构成的组的样品组成。生物样品优选选自由面粉，如玉米面，粗粉，如玉米粉，糖浆，如玉米糖浆，和油，如玉米油、棉籽油、亚麻子油、大豆油或者菜籽油、红花油、向日葵油、花生油等等，淀粉，如玉米淀粉和可以完整或者部分生产以含有谷粒或者谷粒副产物的任意谷类构成的组。可以使用核酸扩增或者核酸杂交方法检测提取物中的核苷酸序列。序列简述SEQIDNO:1代表通过TIC900蛋白质的14kDa溴化氰片段的Edmund降解推导的氨基酸序列并且对应于如SEQIDNO:4中给出的氨基酸位置397-414。SEQIDNO:2代表基于如SEQIDNO:l中给出的氨基酸设计的称作WD470的杂交探针的核苷酸序列，用于检测编码TIC900和相关蛋白质的核苷酸序列。SEQIDNO:3代表由1803个连续核苷酸组成的天然苏云金芽孢杆菌核苷酸序列，其编码由如SEQIDNO:4中给出的601个氨基酸组成的TIC卯O杀虫蛋白质。SEQIDNO:4代表从SEQIDNO:3中给出的核苷酸序列推导的TIC900氨基酸序列。SEQIDNO:5代表编码称作TIC402的天然苏云金芽孢杆菌TIC900相关蛋白质的tic900同源核苷酸序列。SEQIDNO:6代表从如SEQIDNO:5给出的核苷酸序列推导的TIC402氨基酸序列。SEQIDNO:7代表编码称作TIC403的天然苏云金芽孢杆菌TIC卯O相关蛋白质的tic900同源核苷酸序列。SEQIDNO:8代表从如SEQIDNO:7给出的核苷酸序列推导的TIC402氨基酸序列。SEQIDNO:9代表编码称作TIC404的天然苏云金芽孢杆菌TIC卯O相关蛋白质的tic卯0同源核苷酸序列。SEQIDNO:10代表从如SEQIDNO:9给出的核苷酸序列推导的TIC404氨基酸序列。SEQIDNO:ll代表编码称作TIC961的天然苏云金芽孢杆菌TIC900相关蛋白质的tic卯0同源核苷酸序列。SEQIDNO:12代表从如SEQIDNO:ll给出的核苷酸序列推导的TIC961氨基酸序列。SEQIDNO:13代表编码称作TIC962的天然苏云金芽孢杆菌TIC900相关蛋白质的tic900同源核苷酸序列。SEQIDNO:14代表从如SEQIDNO:13给出的核苷酸序列推导的TIC962氨基酸序列。SEQIDNO:15代表编码称作TIC963的天然苏云金芽孢杆菌TIC900相关蛋白质的tic卯0同源核苷酸序列。SEQIDNO:16代表从如SEQIDNO:15给出的核苷酸序列推导的TIC963氨基酸序刮。SEQIDNO:17代表编码称作TIC965的天然苏云金芽孢杆菌TIC卯O相关蛋白质的tic卯0同源核苷酸序列。SEQIDNO:18代表从如SEQIDNO:17给出的核苷酸序列推导的TIC965氨基酸序列。SEQIDNO:19代表编码称作TIC966的天然苏云金芽孢杆菌TIC900相关蛋白质的tic900同源核苷酸序列。SEQIDNO:20代表从如SEQIDNO:19给出的核苷酸序列推导的TIC966氨基酸序列。SEQIDNO:21代表用作特异结合TIC900同源序列的探针的5，末端序列引物。SEQIDNO:22代表用作特异结合TIC900同源序列的探针的3，末端序列引物。SEQIDNO:23代表编码TIC109嵌合蛋白的ticl09核苷酸序列，其由与编码CrylAc前毒素结构域片段的核苷酸序列在框内连接的编码TIC900杀虫蛋白质结构域的核香酸序列组成。SEQIDNO:24代表TIC109嵌合蛋白氨基酸序列，其由与CrylAc前毒素结构域片段氨基酸序列(606-1168)连接的TIC900杀虫氨基酸序列(l-603)组成。SEQIDNO:25代表编码TIC110嵌合蛋白的ticl10核苷酸序列，其由编码CrylF毒素结构域I片段的核苷酸序列(核苷酸l-723)与编码TIC900毒素片段结构域II-III的核苷酸序列(核苷酸724-1809)和编码CrylAc前毒素结构域片段的核苷酸序列(核苷酸1810-3510)在4匡内连接组成。SEQIDNO:26代表TIC110嵌合蛋白氨基酸序列，其由CrylF毒素结构域I片段(氨基酸l-233)连接TIC900毒素结构域Il-in片段(氨基酸234-603)连接CrylAc前毒素结构域片段(氨基酸604-1170)组成。SEQIDNO:27代表编码TIC111嵌合蛋白的ticlll核苷酸序列，其由编码CrylAc毒素结构域I片段的核苷酸序列(核苷酸l-705)与编码TIC卯0毒素结构域II-III片段的核苷酸序列(核苷酸706-1815)和编码CrylAc前毒素结构域片段的核苷酸序列(核苷酸1822-3516)在框内连接组成。SEQIDNO:28代表TIC111嵌合蛋白氨基酸序列，其由CrylAc毒素结构域I片段(氨基酸l-235)连接TIC卯0毒素结构域II-III片段(氨基酸236-605)连接CrylAc前毒素结构域片段(氨基酸608-1172)组成。SEQIDNO:29代表苏云金芽孢杆菌菌林EG4611约7.5kb核苷酸序列，其含有TIC434编码序列，所述编码序列为从约核苷酸位置425到约核苷酸位置2238。SEQIDNO:30代表TIC434氨基酸序列。SEQIDNO:31代表编码TIC435氨基酸序列的嵌合序列，TIC435氨基酸序列对应于与编码Cryl前毒素氨基酸序列的序列在框内融合的TIC434氨基酸序列；所述TIC434氨基酸序列编码区对应于约核普酸位置1到约核苷酸位置1825，所述Cryl前毒素氨基酸序列编码区对应于约核苷酸位置1826到约核苷酸位置3525。SEQIDNO:32代表嵌合TIC435氨基酸序列。发明详述下面提供本发明的详细描述以帮助本领域技术人员实践本发明。即使如此，也不应将该详细描述理解成过度限制本发明，因为本领域技术人员可以对本文讨论的实施方案进行修改和改变而不背离本发明的创造性发现的精神或范围。根据本发明，已经发现了一类新的编码来自苏云金芽孢杆菌和相关芽孢杆菌菌林的杀虫蛋白质的核苷酸序列。如本文别处定义的，这些核苷酸序列在严格条件下都相互杂交。这些核苷酸序列编码的蛋白质都表现出鳞翅目物种抑制性生物学活性，因此认为它们是杀虫蛋白质。这些核苷酸序列编码的蛋白质的每一种都可以单独或者相互组合或者与其他鳞翅目抑制性杀虫剂如蛋白质、结晶蛋白质、毒素和/或经设计用来抑制一种或多种靶标害虫中的基因的害虫特异的双链RNA等等组合在植物中表达，以实现田间昆虫抗性处理(insectresistancemanagement)的方法，以前通过仅4吏用来自苏云金芽孢杆菌菌林的已知的鳞翅目杀虫蛋白质，如Cryl蛋白质和来自Bacilluslaterosporous种和球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)种的多种鳞翅目抑制性杀虫蛋白质不能实现所述昆虫抗性处理。本发明的蛋白质还可以用于植物中与其他类型的杀虫毒素联合来实现植物转化以含有控制每种常见植物害虫的一种或多种的至少一种方法，所述植物害虫选自鳞翅目害虫、鞘翅目害虫、穿刺和吮吸性害虫等等构成的組。还设想本发明的蛋白质单独或者与其他杀虫剂组合用于制剂中，作为杀虫剂局部和/或系统性应用于田间作物、草、果树和蔬菜，和观赏植物。在优选实施方案中，生物杀虫剂组合物包含表达一种或多种本发明公开的新的杀虫蛋白质的细菌细胞的油可流动的悬浮物。优选地，所述细胞是苏云金芽《包杆菌EG5438或SIC卯02细胞，然而，可以是表达本文7>开的新的核酸片段并产生结晶蛋白质的任意此类细菌宿主细胞。本发明的杀虫蛋白质还可以单独或者与其他杀虫蛋白质或者试剂组合用于组合物中用来控制昆虫侵袭植物，并且还可以单独或者与基因抑制方法組合使用。本文所用的"基因抑制"指用于抑制从基因表达蛋白质的任意公知的方法，包括转录后基因抑制和转录抑制。本文所用的"害虫抗性"性状是抵抗来自植物害虫的攻击的转基因植物的特征，所述害虫为诸如病毒、线虫、昆虫幼虫或昆虫成虫，其通常能够在祖先植物中导致作物减产。此类害虫抗性可以来自天然突变或者更通常地来自赋予害虫抗性的重组DNA的掺入。为了对转基因植物赋予昆虫抗性，此类重组DNA可以例如，编码昆虫致命蛋白质，如苏云金芽孢杆菌细菌的5内毒素，例如，如在通过商业途径可获得的棉花和玉米品种中使用的5内毒素，编码本文公开的杀虫毒素蛋白质，如TIC卯O或者相关蛋白质或者其杀虫片段，或者转录成靶向用于抑制昆虫中必需基因的双链RNA，或者这些杀虫剂的任意组合。为了阐明产生具有害虫抗性的转基因植物是本领域技术人员能力范围之内的，参考美国专利5,250,515;5,880,275和6,555,655，它们公开了表达苏云金芽孢杆菌细菌的内毒素的植物。还参见美国专利6,506,599(Fire等人)和美国专利申请公开2003/0061626Al(Plaetinck等人)和美国专利申请公开2003/0150017Al(Mesa等人)，它们公开了通过允许害虫食用转基因植物来控制无脊推动物，所述转基因植物产生抑制害虫中靶基因的双链RNA。还参见美国专利5，986,175(Jilka等人)，其公开了通过表达病毒复制酶的转基因植物控制病毒害虫。将所有上述公开用于植物中害虫控制的材料和方法的专利和申请引入本文作为参考。令人惊奇地，本发明的蛋白质似乎与本领域中迄今为止发现的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质的任一种都不相关。这里表明本发明的蛋白质被分泌到它们所来自的芽孢杆菌物种周围的细胞外间隙中。还表明这些蛋白质比本领域中以前已知的Cry蛋白质显著更小，并且在所分离和纯化的细菌细胞培养物生长的营养阶段表达。这不像Cry蛋白质的表达，Cry蛋白质通常在生长的孢子形成期表达并且在细胞的前孢子内形成多种晶体。如对于本领域技术人员将显而易见的，发明人在本文公开了编码前体TIC900蛋白质(TIC900p)的核苷酸序列tic900的分离和纯化，前体TIC900蛋白质随后经加工而释放成熟TIC900蛋白质(TIC900m)，其显示出鳞翅目物种的抑制性生物活性。发明人在本文公开了tic900序列的用途，用作鉴定也编码与TIC900相关的杀虫蛋白质的多种其他同源物和相关序列的工具。本文'>开的和编码TIC900和相关蛋白质的核苷酸序列来自含有至少一种在本文称作tic900的基因的苏云金芽孢杆菌的多种菌株，如菌林EG5438。菌林EG5438按照布达佩斯条约的规定于2002年5月3日永久保藏在NRRL，并且提供了NRRL保藏号NRRLB-30584。本文鉴定的另一种菌林含有编码TIC卯O的序列，其是与EG5438tic900等位基因相同的核苷酸序列，该菌林是苏云金芽孢杆菌菌林EG5526。本文公开的相关于tic卯O的核苷酸序列和相关于TIC卯O的氨基酸序列(包括TIC卯O的前体和成熟种类)包括但不限于tic402和至少由苏云金芽孢杆菌菌林EG3879产生并从其分离的所编码的杀虫蛋白质TIC402，tic403和至少由苏云金芽孢杆菌菌林EG4332产生并从其分离的所编码的杀虫蛋白质TIC403，tic404和至少由苏云金芽孢杆菌菌林EG4971产生并从其分离的所编码的杀虫蛋白质TlC404,tic434和至少由苏云金芽孢杆菌菌林EG4611产生并从其分离的所编码的杀虫蛋白质TIC434，tic961和至少由苏云金芽孢杆菌菌林EG4090产生并从其分离的所编码的杀虫蛋白质TIC961，tic962和至少由苏云金芽孢杆菌菌林EG4293产生并从其分离的所编码的杀虫蛋白质TIC962,tic963和至少由苏云金芽孢杆菌菌林EG4611产生并从其分离的所编码的杀虫蛋白质TIC963,tic965和至少由苏云金芽孢杆菌菌林EG5023产生并从其分离的所编码的杀虫蛋白质TIC965,tic966和至少由苏云金芽孢杆菌菌林EG4092产生并从其分离的所编码的杀虫蛋白质TIC966。预期本发明的蛋白质用于农业目的，即，保护植物免于昆虫害虫侵袭，更具体地，保护植物免于鳞翅目昆虫害虫侵袭。如本文例证的，本发明的蛋白质可以用于至少保护植物免于欧洲玉米螟(ECB)侵袭，至少保护植物免于烟草夜蛾幼虫(TBW)侵袭，至少保护植物免于菱紋背蛾(diamondbackmoth，DBM)侵袭。可以通过将含有杀虫有效量的一种或多种本发明的蛋白质的组合物局部应用于植物或植物部分，如通过应用于植物的表面，即叶子、花、茎、杆和根实现植物保护。备选地，并且优选地，可以转化植物本身以含有经修饰的核苷酸序列用来提高植物中本发明的蛋白质的表达或者该蛋白质的杀虫部分的表达。TIC900蛋白质是对诸如ECB、TBW和DBM的鳞翅目昆虫有活性的杀虫化合物。如SEQIDNO:4中给出的TIC卯0蛋白质和相关杀虫蛋白质可以用作用于控制鳞翅目昆虫的杀虫制剂中的活性成分。如本文所用的并且述及与TIC卯O有关的杀虫蛋白质，意指相关的杀虫蛋白质是鉴定为TIC900的同源物或者鉴定为由在严格条件下与编码TIC900的天然苏云金芽孢杆菌序列的全部或部分杂交的核苷酸序列编码的蛋白质或者其杀虫部分。当然，本领域技术人员将认识到由于遗传密码的冗余性，许多其他序列能够编码此类相关蛋白质，并且那些序列就它们在芽孢杆菌菌林或者植物细胞中发挥功能以表达杀虫蛋白质来说，意在由本发明包括，当然认识到许多此类冗余编码序列将在严格条件下不与编码TIC卯O的天然序列杂交。可以想象发挥功能而编码TIC或者相关蛋白质的全部或者杀虫部分而在严格条件下不杂交的编码序列。然而，此类序列来自天然序列，这是基于天然核苷酸序列能够经修饰而显示出非天然序列，其仍然编码相同或基本相同的天然氨基酸序列，或者该天然氨基酸序列能够用密码子表反翻译，允许技术人员得到编码TIC900或相关蛋白质的全部或者杀虫部分的核苷酸序列。所有这些序列都意在本发明的范围内。含有编码TIC900或相关蛋白质和其基本等同物的苏云金芽孢杆菌菌林可以使用标准的已知培养基和发酵技术培养。当完成发酵周期时，可以通过本领域公知的方法通过首先从耗尽的发酵液分离苏云金芽孢杆菌孢子和晶体收获表达TIC900或其同源物的细菌。可以将回收的苏云金芽孢杆菌孢子和晶体通过加入表面活性剂、分散剂、惰性载体和其他组分配制成可湿性粉剂、液体浓缩剂、粒剂或者其他制剂以方便处理和应用于具体靼标害虫。配制和应用方法都是本领域公知的。耗尽的培养液中的蛋白质，包括本发明的TIC900或相关蛋白质，可以通过加入表面活性剂、分散剂、惰性载体和其他组分配制成可湿性粉剂、液体浓缩剂、粒剂或者其他制剂以方便处理和应用于具体乾标害虫。含有引诱剂和苏云金芽孢杆菌分离物的孢子和晶体或者浓缩的耗尽发酵培养基或者从孢子或耗尽的发酵培养基纯化的杀虫蛋白质或者包含编码TIC卯O或者可以从本文公开的苏云金芽孢杆菌分离物得到的相关杀细菌蛋白质的核苷酸序列的重组微生物的配制的诱辨粒剂可以应用于害虫的环境中。该诱斜可以不受限制地应用，因为所述毒素不影响动物或人。还可以将产物配制成喷雾剂或粉剂。害虫在它们的足或者腹部携带所述产物并将其带回巢中，在巢中其他害虫将暴露于该毒素。表达编码本发明的TIC900或者相关蛋白质的核苷酸序列或基因的苏云金芽孢杆菌分离物或者重组宿主还可以掺入害虫的诱钾或者食物来源中。如本领域技术人员将理解的，杀虫浓度将取决于具体制剂的性质而变化很大，特别是该杀虫剂是浓缩物还是将直接使用。杀虫剂将以按重量计至少1%存在，并且可以按重量计为100%。干燥制剂将具有按重量计约1-95%杀虫剂，而液体制剂将通常含有按重量计约1-60%的液相中的固体。制剂将通常含有约102到约1(^个细胞/mg或者约5/1，000，000到约100/1，000，000活性组分杀虫蛋白质，即TIC900蛋白质、其氨基酸序列变体、其杀虫部分或片段，或者其同源物。这些制剂将以约50mg(液体或干燥的)到lkg或以上/公顷施用。可以通过喷雾、撒粉、洒水等将制剂应用于鳞翅目害虫的环境，例如，植物、土壤或者水中，并且还可以作为种子处理或者种子涂布应用于种子的表面并且可以渗透到种皮和/或子叶中。本领域技术人员将知道为了实现Bt杀虫蛋白质在植物中的提高的表达，将需要首先制备编码Bt蛋白质或者该蛋白质的活性变体或者片段的核苷酸序列。然后，将编码该蛋白质或其片段的核苷酸序列置于在植物中有功能的表达盒中，导致编码序列转录成mRNA，其随后在植物的细胞中翻译，从而在植物组织中产生杀虫有效量的杀虫蛋白质。本领域技术人员将还知道用嵌入植物功能性表达盒中的核苦酸序列转化植物细胞，优选玉米、棉花、大豆、油菜、稻、小麦、燕麦、草、饲料植物、十字花科植物、果树、观赏花卉、番茄、马铃薯、胡萝卜、羽衣甘蓝和烟草植物细胞等，并且选择含有所述序列并且正在表达杀虫有效量的杀虫蛋白质，优选TIC900或者相关蛋白质或其杀虫片段的细胞，和从此类转化的细胞产生植物。本领域4支术人员还已知使用电穿孔、浸渍、基因枪方法或者根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的方法等等将本发明的核苦酸序列或者其修饰序列导入植物细胞。关于核苷酸序列，术语"变体或修饰的"意在表示编码相同毒素或者编码具有相似杀虫活性的等同毒素的核苷酸序列，术语"等同毒素"指显示出与要求保护的天然或者参比毒素相比，对目标害虫相同、基本相同或者提高的生物活性的毒素。意在用于双子叶植物的变体或者修饰的核苷酸序列将编码与天然编码序列，即自然中发现的编码序列基本相同的氨基酸序列，但是将包含约49%到58%的总的合并的GC组成，并且将大量利用密码子偏爱和密码子使用频率，通过从来自意在用该变体或者修饰的核苷酸序列转化的一种或多种个体双子叶植物物种的一组编码序列编辑此类偏爱和使用频率可以确定密码子偏爱和密码子使用频率。意在用于单子叶植物的变体或修饰的核苷酸序列将也编码与天然氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，但是将包含约52%到59%的总的合并的GC组成，并且将也大量利用密码子偏爱和密码子使用频率，通过从来自意在用该变体或者修饰的核苷酸序列转化的一种或多种个体单子叶植物物种的一组编码序列编辑此类偏爱和使用频率可以确定密码子偏爱和密码子使用频率。密码子使用频率意在指特定密码子用于编码序列的平均次数。对于具体植物物种，意在导致向新生的氨基酸序列掺入特定氨基酸的密码子将平均以某个相对固定的频率使用。对于仅使用两种密码子的氨基酸，该频率通常为约50-50，即每个密码子被使用约一半的时间，除非一种密码子利用明显更大数目的噤呤或者嘧啶，其中所述噤呤或嘧啶通常不代表该特定植物物种的GC含量。对于芽孢杆菌种，例如，编码序列通常为约60%到约70%AT。芽孢杆菌种中密码子使用偏向于使用在特定密码子中富含A或T的密码子。因此，主要利用G或C的密码子用于天然和/或天然发生的芽孢杆菌编码序列中的频率比含有A或T的密码子的频率小得多。因此，当产生意在用于特定植物(单子叶或双子叶植物)的变体或修饰的核苷酸序列时，重要的是确保可能时对不特别富含A和T的密码子的使用给予适当注意，并且避免掺入怀疑的多腺苷酸化序列(见，例如，美国专利号5,500,365)。本文所用的编码作为本发明的杀虫毒素的苏云金芽孢杆菌TIC900蛋白质或者其同源物或衍生物的"合成的编码序列"或者"非天然发生的编码序列"为以涉及任意类型的基因分离或操作的方式制备的序列。这包括从其天然发生的状态分离编码序列，如通过修饰核苷酸编码序列(如本文描述的)来操作编码序列，使用亚磷酰胺化学等等化学合成全部或部分编码序列，或者定点诱变(如本文描述)、截短编码序列或者任意其他操作或分离方法，从而非天然发生的编码序列编码的氨基酸序列编码与天然编码序列基本相同的杀虫蛋白质并且还显示出与天然杀虫毒素蛋白质基本相同或者提高水平的杀虫生物活性。本文所用的术语"序列同一性百分数"通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列确定，其中为了两条序列的最佳比对，比较窗口中缺失(即，缺口)。通过确定在两条序列中发生相同的核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗口中位置总数并将结果乘以100得到序列同一性百分数。与参考序列相比在每个位置都相同的序列说成是与该参考序列相同或者反之亦然。第一条核苷酸序列当以5，到3，方向观察时如果显示出与第二条或参考序列的完全互补性，那么说第一条序列与以3，到5，方向观察的第二条或参考序列"互补"。如本文所用的，当以5，到3，阅读的一条序列的每个核苷酸与以3，到5，方向阅读的另一条序列的每个核苷酸互补，那么说这两条核酸序列分子显示出"完全互补性"。核苷酸序列当以5，到3'阅读时与5，到3，阅读的参考核苷酸序列比较在每个位置相同时，那么说该核苷酸序列与参考序列相同并且反之亦然。与参考核苷酸序列互补的核苷酸序列将显示出与参考核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述在本领域中明确定义并且容易被本领域技术关于核酸序列，本文所用的"显著同源性"，指核脊酸序列时指在严格条件下与如SEQIDNO:3给出的TIC900编码序列或者其互补序列杂交的核苷酸序列。在严格条件下与SEQIDNO:3或者其互补序列，尤其从核苷酸序列的约l位核苷酸到约1806位核苷酸，更具体地从核苷酸序列的约121位核苷酸到约1806位核苷酸杂交的序列含有一个和多个线性序列，其与SEQIDNO:3的一个或多个线性序列足够同一从而能够发生比对并且这两条序列能够在严格条件下与相对链上的对应碱基形成氢键，从而形成双链体分子，其在严格条件下足够稳定足够长的时间而可以使用本领域公知的方法检测。此类同源序列与如SEQIDNO:3中给出的参考核苷酸序列或者其互补序列有约67%同一性，到约70%同一性，到约80%同一性，到约85%同一性，到约90%同一性，到约95%同一性，到约99%同一性或更大同一性。此外，还设想编码可从苏云金芽孢杆菌菌林等分离的杀虫蛋白质的核普酸序列，其在严格条件下与SEQIDNO:3杂交，所述核苦酸序列显示出与参考核苷酸序列的显著同源性，所述参考核苷酸序列在严格条件下与如SEQIDNO:3中给出的tic900编码序列或者其互补序列杂交。此类核苷酸序列在本文中称作SEQIDNO:3的同源物等等并且包含SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:19，和其相关序列和同源物。关于多肽序列，术语"显著同源性"指与参考多肽序列有约70%同源性、约80%同源性、约86%同源性、约90%同源性、约95%同源性、约99%同源性的多肽。更特别地，本发明人设想显著同源物与如SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:30、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、和SEQIDNO:20中给出的参考多肽序列有约81、82、83、84、85、86、87、88、89、卯、91、92、93、94、95、96、97、98、和99%同源性。关于本申请的蛋白质，术语"变体氨基酸序列"或者"氨基酸序列变体"或者"修饰的氨基酸序列变体"意在指与本发明的氨基酸序列基本上等同的氨基酸序列。例如，为了分子操作方便通过向本发明的编码序列中引入限制性位点可以产生蛋白质，所述限制性位点的引入导致加入或者消除一个或多个密码子而不(l)破坏天然编码序列，(2)破坏天然可读框，和(3)破坏蛋白质的杀虫生物学活性，所述蛋白质将构成(a)与天然杀虫毒素相比的变体氨基酸序列，(b)与天然杀虫毒素相比氨基酸序列变体或者(c)与天然杀虫毒素相比修饰的氨基酸序列变体。本领域技术人员将认识到可以对本发明的氨基酸序列进行其他类型的修饰而不破坏蛋白质的生物活性。就所得氨基酸序列变体显示出不低于天然杀虫蛋白质的杀虫活性来说，插入、缺失和替代在本发明的范围内。特别预期本文公开的蛋白质的嵌合体、本文公开的蛋白质的融合或蛋白质的部分，和本文/>开的蛋白质的permutein。发明人设想本文公开的蛋白质組合物尤其可用作杀虫剂以局部和/或系统性应用于田间作物、草、水果和蔬菜，和观赏植物。在优选实施方案中，所述生物杀虫剂组合物包含表达本文公开的新的杀虫蛋白质的细菌细胞的油可流动的悬浮物。优选地，所述细胞是苏云金芽孢杆菌EG5438或SIC卯02细胞，然而，预计可以使用表达本文公开的新的核酸片段并产生结晶蛋白质的任意此类细菌宿主细胞，如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或者假单胞菌spp.。在另一实施方案中，所述生物杀虫剂组合物包含水可分散的粒剂。该粒剂包含表达本文公开的新的杀虫蛋白质的细菌细胞。优选的细菌细胞是苏云金芽孢杆菌EG5438或SIC卯02细胞，然而，预计可以使用用本文公开的DNA片段转化并且表达所述杀虫蛋白质的细菌，如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或者假单胞菌spp.。在第三个实施方案中，生物杀虫剂组合物包含可湿性粉剂、粉尘、小丸或者胶体浓缩物。该粉剂包含表达本文公开的新的杀虫蛋白质的细菌细胞。优选的细菌细胞是苏云金芽孢杆菌EG5438或SIC9002细胞，然而，预计可以使用用本文公开的DNA片段转化并且表达所述杀虫蛋白质的细菌，如巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或者假单胞菌spp.。可以配制杀虫组合物的此类干燥形式以在湿润时立即溶解，或者备选地，以控释、緩释或者其他依赖时间的方式溶解。在第四个实施方案中，生物杀虫剂组合物包含表达杀虫蛋白质的细菌细胞(如上述细菌细胞)的水性悬浮液。此类水性悬浮液可以作为浓缩的贮存液提供，其在应用前稀释，或者备选地，作为稀释的溶液随时应用。对于涉及细菌细胞应用的这些方法，含有杀虫蛋白质基因的细胞宿主可生长在任意方便的营养培养基中，其中DNA构建体提供了选择性优点，提供选择培养基从而基本上所有或者所有细胞都保留苏云金芽孢杆菌基因。然后根据常规方法收获这些细胞。备选地，可以在收获前处理细胞。当杀虫组合物包含表达目的蛋白质的完整苏云金芽孢杆菌细胞时，此类细菌可以以多种方法配制。它们可以通过与多种惰性物质混合用作可湿性粉剂、粒剂或者粉尘，所述惰性物质为诸如无机矿物质(phyllosilicates、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等等)或者植物材料(粉状玉米芯、米糠、胡桃壳等等)。制剂可以包括展布剂-粘着剂佐剂、稳定剂、其他杀虫添加剂或者表面活性剂。液体制剂可以是水基或者非水性的并且用作泡沫剂、混悬剂、可乳化的浓缩剂，等等。所述成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。备选地，新的TIC900或者TIC900来源的或者相关蛋白质或者其同源物可以通过天然的或者重组细菌表达系统在体外制备并且分离用于随后的田间应用。此类蛋白质可以为粗细胞裂解物、混悬剂、胶体等等，或者备选地，可以在配制成活性杀生物制剂前纯化、精制、緩冲，和/或进一步处理。同样地，在某些情况下，可能希望从表达杀虫蛋白质的细菌培养物分离某种结晶形式的蛋白质和/或者作为孢子分离并且将此类晶体和/或孢子的溶液剂、混悬剂或者胶体制备物作为活性生物杀虫剂组合物应用。不管应用的方法如何，以杀虫有效量应用活性组分的量，其将随着诸如将控制的特定鳞翅目昆虫、将处理的特定植物或者作物、环境条件和应用杀虫活性组合物的方法、速率和量的因素而不同。通过将细菌细胞、晶体和/或孢子悬浮液，或者分离的蛋白质组分用所希望的农业上可接受的载体配制可以制备所述杀虫组合物。可以在施用前以合适方法配制组合物，如冻干、冷冻干燥、干燥、或者位于水性载体、介质或者适宜的稀释剂，如盐水或者其他緩冲剂中。所配制的组合物可以为粉尘或者粒状材料，或者油中(植物油或矿物油)中的悬浮液，或者水或油/水乳液，或者作为可湿性粉剂，或者与适于农业应用的任意其他载体材料组合。适宜的农业载体可以为固体或者液体并且是本领域公知的。术语"农业上可接受的载体"包括所有佐剂，例如，通常用于杀虫制剂技术的惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等等；这些是杀虫剂制剂的技术人员公知的。这些制剂可以与一种或多种固体或者液体佐剂混合并且通过多种方法制备，例如，通过使用常规制剂技术将杀虫组合物与适宜的佐剂均匀混合、掺合和/或碾磨制备。通过常规方法，优选通过喷雾将本发明的杀虫组合物应用于靶鳞翅目昆虫的环境，通常应用在待保护的植物或作物的叶子上。将根据待处理的特定害虫，作物的特定条件和特定环境条件设置杀虫应用的强度和持续时间。活性成分与载体的比例将自然地依赖于杀虫组合物的化学性质、溶解性和稳定性，以及预计的特定制剂。其他应用4支术，例如，撒粉、喷洒、浸泡、油注射、种子包衣、幼苗包衣、喷雾、啄气、雾化、粉化等等也是可行的并且可以在某些条件下是所需的，所述条件为例如导致根或者茎干侵扰的昆虫，或者用于柔弱的植物或者观赏植物。这些应用方法是本领域技术人员公知的。本发明的杀虫组合物可以单独使用或者与其他化合物，包括但不限于其他杀虫剂组合使用用于本发明的方法中。本发明的方法还可以与其他处理，如表面活性剂、去污剂、聚合物或者定时释放制剂结合使用。可以配制本发明的杀虫组合物用于系统或者局部4吏用。用于环境、系统或者叶子应用的杀虫组合物的浓度将取决于特定制剂的性质、应用方法、环境条件和杀生物活性的程度有很大改变。通常，生物杀虫组合物将以按重量计至少约1%的浓度并且可以高达并且包括按重量计约99%的浓度存在于所应用的制剂中。组合物的干燥制剂可以按重量计为组合物的约1%到约99%或以上，而液体制剂可以通常包含按重量计约1%到约99%或者以上的活性成分。包含完整细菌细胞的制剂将通常含有约104到约10"个细胞/mg。可以根据需要在一次或多次应用中将杀虫制剂施用于特定植物或者目标区，每公顷典型的田间应用率为约50g到约500g活性成分，或者约500g到约1000g，或者约1000g到约5000g或者以上的活性成分的量级。可以对本发明的肽的结构和编码它们的DNA片段进行修饰和改变并且仍然得到编码具有所希望的特征的蛋白质或者肽的功能分子。在本发明的特定实施方案中，预计本发明的蛋白质的氨基酸序列变体可以用于增加所述蛋白质的杀虫活性，并且相应增加植物细胞中重组转基因的杀虫活性和/或表达。可以通过改变DNA序列的密码子实现氨基酸改变。基本上等同于本申请的蛋白质的蛋白质预期为生物学功能等同物。本文所用的术语"生物学功能等同物"，用于本发明的杀虫蛋白质时，是肽、多肽和蛋白质，它们含有显示出与本发明的新肽，如TIC900或者相关蛋白质或者其杀虫片段的序列相似性的序列或者部分，并且显示出与本文公开的多肽相同或相似的功能性质，包括杀虫活性。生物等同物还包括这样的肽、多肽和蛋白质，它们与针对TIC900和相关蛋白质上或内部存在的表位产生的抗体反应，即特异结合所述抗体，并且显示出相同或相似的结合或反应活性，包括单克隆和多克隆抗体。还预期本发明的蛋白质可以用于保护双子叶植物免于昆虫侵袭。此类侵袭可以是鳞翅目、鞘翅目、双翅目造成的侵袭，或者甚至是螨、粉虫、桥螬或者多种昆虫造成的侵袭，所述昆虫通过刺穿植物组织并吸取用于植物生长和发育的营养来伤害植物。对本发明的蛋白质的初级氨基酸序列的修饰可以导致显示出与天然蛋白质不同的宿主范围的蛋白质。本发明的蛋白质因为它们由芽孢杆菌菌林表达时定位到细胞外间隙，所以可以用于靶定其他蛋白质以定位到细胞外间隙。例如，技术人员将知道将通常不分泌到细胞外间隙的第一种蛋白质连接通常分泌到细胞外间隙的第二种蛋白质以便实现第一种蛋白质向细胞外间隙的定位。可以通过本领域公知的任意种方法将本发明的蛋白质与一种或多种杀虫毒素如结晶的5-内毒素融合以形成嵌合蛋白，其定向分泌到特定宿主细胞周围的细胞外间隙。甚至设想分泌事件自身可以导致两种蛋白质部分的分离从而两种分开的和不同的杀虫蛋白质释放到特定宿主细胞周围的细胞外间隙。两种蛋白质可以(l)都对相同的昆虫种有毒性但是使用不同的作用方式实现它们的杀虫活性，或(2)每种对不同的昆虫种有毒性。可以想象任意数目的杀虫蛋白质可以与本发明的蛋白质首尾相连以形成多体嵌合体，其定向到特定宿主细胞周围的细胞外间隙。在其中预期使用其他Bt杀虫蛋白质的情况中，优选与本发明的蛋白质融合的杀虫蛋白质小于全长Cryl蛋白质，更优选地仅是Cryl蛋白质、Cry2A蛋白质、Cry3蛋白质、Cry9蛋白质等等的核心杀虫毒素片段。可以想到此类"其他"蛋白质可以为绿色荧光蛋白和相关蛋白质和变体、用于调节细胞信号过程的激酶和磷酸酶、核酸酶、脂肪酶、从诸如gox、多种epsps同源物、bar和同源物等等、PhnO、NptII、Aad等等的基因表达的除草剂耐受蛋白质。所有这些蛋白质也都可以用作选择性标记，特别当连接到编码本发明的一种或多种蛋白质的基因时，用以跟踪植物或其他宿主细胞中编码本发明的一种或多种蛋白质的基因的存在。本发明的蛋白质可以定向输出到亚细胞器中。例如，编码叶绿体或质体靶定序列的第一种核苷酸序列可以与编码本发明的杀虫蛋白质的第二种核苷酸序列可操作地连接或融合以产生嵌合的前体蛋白质，其定向插入到植物细胞内的叶绿体或者质体中。此类嵌合蛋白质的表达将导致本发明的蛋白质输入到植物叶绿体或者质体中，导致杀虫毒素或者其杀虫片段定位到叶绿体或者质体中。额外地，编码本发明的一种或多种蛋白质的核苷酸序列可以定位到叶绿体或者质体中进行表达。核普酸序列向质体或者叶绿体的定位可以导致该核苦酸序列整合到叶绿体或者质体基因组，或者可以导致存在自主复制的编码本发明蛋白质的核酸序列。在任一种情况下，本发明的蛋白质都可以定位到叶绿体或者质体。因此如本文所用的术语"叶绿体或者质体定位的"指生物分子(多核苷酸或多肽)，其位于叶绿体或者质体中从而该分子从细胞质环境分离，并且在叶绿体或者质体细胞质内发挥功能以提供本发明中要求保护的有益的杀虫效果。对于多核苷酸，生物分子向叶绿体或者质体的定位可以通过人工机械方法，如电穿孔、机械微注射、或者通过多核苷酸包被的微粒轰击来进行，或者对于多肽，通过分泌或者输入方法发生，其中使用天然的、合成的或者异源的质体或叶绿体靶向肽序列，其发挥功能而将连接的多肽靶向、插入、协助或者定位到叶绿体或者质体中。在任一事件中，一种或多种杀虫蛋白质向叶绿体或者质体的定位必然意味着所得植物必须也显示出正常的形态特征，其中所述植物的细胞中的质体含有此类杀虫蛋白质或者在其中定位的蛋白质。不知道哪种(如果存在)杀虫蛋白质当定位到叶绿体或者质体中时将导致获得重组植物，该植物显示出正常的形态特征，如但不限于不存在萎黄病、不存在植物生理的发育障碍，包括但不限于比平均茎干更厚、缩短的茎干或者节间、不合适的开花、不育、减产等等。如本文所用的，术语"可操作地连接"指核酸编码片段连接在框内从而一种核酸的性质影响另一种核酸的表达。这些术语和词语组也用于指当连接到另一氨基酸序列时显示出某种功能的氨基酸序列，例如，信号肽，其当连接到目的蛋白质时称作可操作地连接目的蛋白质以将目的蛋白质定向到其中产生该蛋白质的宿主细胞的分泌器中。对于本发明，词语"基因"指含有可读框的核苷酸序列，该可读框编码TIC900蛋白质，或者其杀虫片段，或者其氨基酸序列变体，或者其相关蛋白质同源物或者杀虫片段或者其氨基酸序列变体，所述核苷酸序列至少可操作地连接到启动子序列和转录终止序列，其中该启动子和转录终止序列在产生所述蛋白质的宿主细胞中是有功能的。本文所用的"结构基因"指被表达而产生多肽的基因。本发明的结构基因除了启动子和转录终止序列外还可以含有5，非翻译序列、内含子序列和特别在植物中有功能的增强子元件，并且它们优选地来自单子叶植物如玉米植物或者来自双子叶植物如烟草植物或十字花科蔬菜植物，所述增强子元件当以正确序列与本发明的一种或多种编码序列连接时导致在特定植物组织中提高水平的表达，优选地导致在那些植物的叶子和茎干组织中的增强的表达。本发明提供的核苷酸序列信息允许制备相对短的DNA序列，在本文中称作探针或引物，能够特异杂交本文公开的所选多核苷酸的序列。基于编码本发明的杀虫多肽的所选多肽序列的考虑制备适宜长度的此类核酸探针，例如在SEQIDNO:3的所有或者探针特异部分、SEQIDNO:5的所有或者探针特异部分、SEQIDNO:7的所有或者探针特异部分、SEQIDNO:9的所有或者探针特异部分、SEQIDNO:29的所有或者探针特异部分、SEQIDNO:11的所有或者探针特异部分、SEQIDNO:13的所有或者探针特异部分、SEQIDNO:15的所有或者探针特异部分、SEQIDNO:17的所有或者探针特异部分、SEQIDNO:19的所有或者探针特异部分中显示的序列，等等。述及术语"所有或者探针特异部分"意在指核苷酸序列探针，其包含至少约15到约50个，或多或少，的连续的核苷酸，选自特定参考序列(referentsequence)中给出的核苦酸组，所述参考序列为诸如SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:19。此类核酸探针特异杂交编码杀虫多肽序列的多核苷酸序列的能力使得它们可特别用于多种实施方案中。最重要地，所述探针可以用于多种测定法以检测给定生物样品中互补序列的存在。对于术语"生物样品"的述及，预期含有可以通过如本文给出的探针序列检测的参考核普酸序列的样品是含有选自由本文给出的连续核苷酸序列构成的组的生物分子的样品，因此将该样品称作"生物样品"。在某些实施方案中，有利地是使用寡核苷酸引物。使用本发明的多核普酸设计此类引物的序列用于通过热扩增技术从苏云金芽孢杆菌或者从球形芽孢杆菌等检测、扩增或者修饰杀虫蛋白质编码序列的确定的片段。与编码本发明的杀虫多肽的多核苷酸相关的核苷酸序列的片段也可以用热扩增技术和此类引物分离和表征。为了提供根据本发明的中的某些优点，用于杂交研究或者测定或或部分的多核苷酸序列的至少14f'30个或以上的一段连续核苷酸^列互补的序列，所述多核苦酸序列如SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQID綠15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、和SEQIDNO:22中所示。至少14个核苷酸长的引物或者探针大小有助于确保片段将足够长以形成稳定且具有选择性的双链体分子。通常优选在大于14个碱基长度的节段上有互补序列的分子。为了增加杂合分子的稳定性和选择性，从而提高所得特定杂合分子的质量和程度，将通常优选设计具有tic900互补序列等的14到20个核苷酸，或者希望时甚至更长的核酸分子。通过例如，直接通过化学方法合成片段，通过应用核酸复制技术，或者通过从位于含有适宜的插入物和适宜的限制位点的质粒或者其他载体中的重组序列切除所选的DNA片段，可以容易地制备此类片段。本发明还预期包含本发明的多核苷酸的表达载体。从而，在一个实施方案中，表达栽体是分离并纯化的DNA分子，其包含可操作地连接编码本发明的多肽的编码区的启动子，所述编码区可操作地连接转录终止区，从而启动子驱动编码区的转录。编码区可以包括编码本发明的苏云金芽孢杆菌杀虫毒素的片段和编码叶绿体或质体靶向肽的片段。包含表达载体的DNA分子还可以含有位于编码序列的上游或者甚至编码序列内的功能内含子序列，并且还可以含有5，非翻译前导序列(即，UTR或者5，-UTR),其位于启动子和翻译起始点之间。如本文所用的并且关于启动子元件，术语"可操作地连接"意在表示含有启动子的核酸序列，启动子即在特定宿主细胞中发挥功能而驱动转录起始的遗传元件，所述核苷酸序列以如此方式连接编码序列使得编码区的转录受到该启动子的控制并且大体上受到该启动子的调节。将启动子可操作地连接编码区的方法是本领域公知的。在细菌中有功能的启动子是本领域公知的。苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质的代表性和优选的启动子包括sigA、sigE和sigK基因启动子。备选地，来自苏云金芽孢杆菌或者其他芽孢杆菌种的天然的、经修饰的、异源的或者重组启动子可以用于实现本发明的蛋白质在芽孢杆菌种菌抹中的表达。当编码本发明的蛋白质的全部或杀虫部分的核苷酸序列用于转化植物时，选择能够驱动所述编码序列在特定植物种中表达的启动子。在不同植物种中有功能的启动子是本领域中公知的。用于在植物中表达多肽的启动子是如Odell等人(Nature313:810-812，1985)中描述的诱导型启动子、病毒启动子、合成的启动子或者组成型启动子，和/或在时间上受调节的、在空间上受调节的和受到时空调节的启动子。优选的启动子包括增强的CaMV35S启动子、GBOX10启动子、FMV35S启动子、稻肌动蛋白启动子，和它们的变体和嵌合体。为了通过在植物中表达本发明的蛋白质以最优地控制ECB物种，例如，优选在玉米植物的叶子和茎干中实现这些蛋白质的最高水平的表达。大体上时序或空间调节指从植物可操作的启动子表达植物或植物组织内的基因。关于时序调节，启动子可以受到调节而仅在植物细胞或组织或者甚至完整植林生长和发育的特定时间表达。仅在种子发芽期间活跃地表达一种或多种基因的启动子将是时序调节的一个实例。其他实例可以包括仅在植物、植物细胞或植物组织暴露于某些光强度的时候或者在完全黑暗期间表达一种或多种基因的启动子。大体上(substantial)时序调节指启动子在某个时间活跃表达但是在其他时间可能或可能不完全受到抑制，从而仍然可以检测到表达，可以通过监视某种指示剂，如从连接这种启动子的编码序列产生的酶的存在，或者通过测量如在植物生长、分化和发育和/或应答多种环境刺激的多个时间产生的某些基因产物，如mRNA的增加或者减少来进行所述检测。大体上空间调节指连接启动子的基因的表达，仅在植物的某些细胞或组织的生长和发育期间从所述启动子进行表达。例如，绒毡层启动子是在花生长和发育期间大体上空间表达的启动子。类似地，将预计叶子特异的或者叶子增强的启动子从叶细胞或者叶组织内大体上空间表达。大体上空间调节的也指在特定组织中从特定组织特异启动子的表达的水平并且也涉及在其他组织中从该启动子或相似启动子的表达的水平，其中在不同于该启动子表达是优选的特定组织的组织中也可以检测到表达，但是表达水平明显较低，可以通过从与该启动子连接的编码序列产生的酶的产量或者通过某些可检测的基因产物的出现进行所述表达水平的测同调节的方式。特别预计包括在本发明范围内的其他启动子包括但不限于泛蛋白启动子、甘蔗杆状DNA病毒启动子、核酮糖二磷酸羧化酶基因大亚基启动子等等。用于实现非天然发生的核苷酸序列在单子叶植物中的最佳表达的优选的内含子序列也可以包括在DNA表达构建体中。此类内含子通常置于mRNA的5，附近，紧靠非翻译序列的下游或位于其之内。内含子可以从，但不限于，由玉米热休克蛋白(HSP)70内含子(美国专利5,424,412;1995)，稻Actl内含子(McElroy等人，PlantCell2:163-171，19卯)，Adh内含子1(Callis等人，Genes&Develop.1:1183-1200，1987)，或者蔗糖合酶内含子(Vasil等人，PlantPhys.91:1575-1579，1989)构成的一组内含子得到。发挥功能来调节或者调控基因表达的另一种元件是转录起始位点和编码序列起点之间的DNA序列，称作非翻译前导序列(UTL)。已经进行了前导序列的编译来预测最优或次优序列和产生"共有的"和优选的前导序列(Joshi，Nucl.AcidsRes.15:9627-9640，1987)。预计优选的前导序列包括包含预测指导所连接的结构基因的最佳表达的序列的那些前导序列，即包括增加或保持mRNA稳定性并且防止不适宜的翻译启动的优选的共有前导序列。根据本公开，此类序列的选择将是本领域技术人员已知的。将最优选来自在植物，尤其在玉米中高度表达的基因的序列。尤其有用的前导序列是矮牵牛HSP70前导序列。转录增强子或者增强子重复可以用于增加表达。通常发现这些增强子在真核细胞中发挥功能的启动子中的转录起点的5，，但是通常可以以正向或反向插入编码序列的5，或3，。增强子的实例包括来自CaMV35S启动子、章鱼碱合酶基因(Ellis等人，EMBOJournal6:11-16，1987)、稻肌动蛋白基因和来自非植物真核生物(例如，酵母；Ma等人，Nature334:631-633，1988)的启动子的元件。RNA聚合酶转录核基因组DNA编码序列，通过一个位点，在该位点发生多腺普酸化。通常，位于多腺苷酸化位点下游几百个碱基对的DNA序列用于终止转录。那些DNA序列在本文中称作转录终止区。这些区是核转录的信使RNA(mRNA)的有效多腺苷酸化所需的。对于导入叶绿体或质体，或导入叶绿体或质体基因组的编码序列，mRNA转录终止类似于细菌基因表达领域中公知的方法。例如，在多顺反子或单顺反子序列中，可以通过茎-环结构或者类似于细菌依赖rho的序列的结构终止转录。表达构建体将通常包括在本发明中例示的编码序列或者其衍生物以及作为终止转录信号的3，末端DNA序列并且，在预计用于从植物核基因组表达的构建体中，允许所得RNA转录物的3，末端多腺苷酸化。预期最优选的3，末端元件是来自根癌农杆菌的胭脂氨酸合酶基因(nos3，端)、根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子，和豌豆RUBISCO合酶E9基因(E93，)3，非翻译转录终止和多腺苷酸化序列的那些元件。这些和其他3，末端调节序列是本领域公知的。优选的植物转化载体包括来自根癌农杆菌的Ti质粒的栽体，以及例如Herrera陽Estrella(Nature303:209-213，1983)，Bevan(Nature304:184-187,1983),Klee(Bio/Technol.3:637-642，1985)公开的那些载体。本发明公开了编码来自芽孢杆菌物种，尤其是来自苏云金芽孢杆菌物种的杀虫蛋白质的分离并纯化的核苷酸序列。具体地，在本文中表明苏云金芽孢杆菌菌林EG5438、EG3879、EG4332、EG4971、EG40卯、EG4293、EG4611、EG5526、EG5023和EG4092每种都产生定位于培养上清液的一种或多种可溶性杀虫蛋白质。表1.TIC卯0相关的蛋白质和苏云金芽孢杆菌菌抹来源<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>*对显示出与tic900的同源性的基因的核苷酸序列分析后推导出的，从菌林EG5526得到的TIC964的氨基酸序列，并且确定其与从菌林EG3879所得tic402相同。#表示该菌林已经在该专利申请待决期间或者由其授权的专利期间在确保授权机构可以获得该培养物的条件下保藏。可以使用常规生长培养基和标准发酵技术培养本文描述的苏云金芽孢杆菌菌林和其他细菌菌林。含有一个或多个tic900或相关基因的苏云金芽孢杆菌菌林可以如本文描述的发酵直到所培养的苏云金芽孢杆菌细胞达到它们生长周期的阶段，在该阶段产生TIC900和/或相关蛋白质。主题培养物已经在该专利申请或者由其授权的专利待决期间在确保授权机构可以获得该培养物的条件下保藏。然而，应该理解保藏物的可得性不构成违背政府行为授予的专利权而实施主题发明的许可。在生长的营养期如本文所示产生本发明的TIC卯O和相关蛋白质并且其分泌到生长培养基中。使用本发明的菌林发酵可以继续通过孢子形成阶段，此时随着孢子形成晶体蛋白质(如果存在)。可以通过离心分离孢子和细胞碎片与上清液，并且可以将耗尽的(spent)培养基用于分离本发明的杀虫蛋白质。发明人在此处阐明硫酸铵沉淀作为浓缩和收集耗尽和澄清的培养基中存在的所有或多数蛋白质的一种方法。然而，本领域技术人员将认识到有许多其他方法可以用于纯化和分离本发明的蛋白质。凝胶过滤和大小排阻层析是用于直接从耗尽的培养基提取蛋白质的两种容易得到的方法。耗尽的培养基还可被脱盐并且滤液可用于使用离子交换柱提取蛋白质。而且，含有特异结合TIC900或相关蛋白质的抗体的亲和柱可用于直接从培养基纯化本发明的蛋白质。已经将本发明的氨基酸序列与商业途径可得到的蛋白质序列数据库中存在的氨基酸序列比较，并且没有鉴定到显著的同源性或相似性。基于该分析，TIC900蛋白质和相关序列似乎是独特的并且形成了建立新的和单独类别的芽孢杆菌杀虫蛋白质的基础，因为本发明的蛋白质不显示出与其他已知的杀虫蛋白质的任何关系。可以对本发明的多肽和编码它们的DNA片段的结构进行修饰和改变并且仍然得到编码具有所希望的特征的蛋白质或肽的功能分子。此处预期的生物功能等同肽、多肽和蛋白质应该与如SEQIDNO:4中给出的基本TIC900氨基酸序列的序列或者其内部的对应部分，或者与如SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQID隐IO、SEQIDNO:30、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、和SEQIDNO:20中给出的氨基酸序列和相关序列内的对应部分具有约70%或更大的序列相似性，或者约80%或更大的序列相似性，或者约90%或更大的序列相似性。根据本发明，对tic900基因和编码的蛋白质毒素的述及不仅包括本文公开的全长序列，而且包括这些序列的片段、包含SEQIDNO:3的tic900基因的天然变体、突变体和重组或基因工程化的衍生物。此类编码的蛋白质应该保留与包含SEQIDNO:4的TIC900蛋白质相同或者更大的特征性杀虫性质。用于本发明的蛋白质可以还包括保留与TIC900蛋白质基本上相同或更大的特征性杀虫性质的融合蛋白。在这些情况中，融合蛋白除了含有本文特别例示的蛋白质的特征性杀虫性质外，还可以含有融合配偶体的氨基酸序列贡献的另一种杀虫活性。备选地，对TIC卯O蛋白质或者其杀虫变体的结晶学分析可以提供确定该蛋白质是否是构建permutein的1矣选者的方'法，所述permutein显示出与天然TIC卯0或者相关蛋白质相同或者优选地更大的杀虫活性，并且优选地显示出与在优选的宿主细胞，如植物细胞中表达有关的改进特征。本领域技术人员显而易见的是，可以通过几种方法鉴定和得到编码鳞翅目抑制性毒素的核苷酸序列。本文例示的特定序列可以从保藏在如上述的培养物保藏机构的分离物得到。这些序列，或者其部分或变体还可以通过合成构建，例如，通过使用核苷酸序列合成仪。可以使用产生点突变的标准技术容易地构建编码序列的变异。而且，可以使用通过商业途径可获得的外切核酸酶或内切核酸酶根据标准方法可以制备这些序列的片段。例如，i者如Bal31的酶或者定点诱变可以用于从如本文例示的此类序列或者从蛋白质编码序列内系统地切除核苷酸。而且，使用多种限制酶、内切酶、热扩增方法等等可以得到编码杀虫活性蛋白质片段的核苷酸序列。蛋白酶，如蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等等可以用于直接得到这些毒素的活性片段。使用本领域提供的教导结合本文公开的核普酸序列，可以从来自苏云金芽孢杆菌、B.laterosporous、球形芽孢杆菌和相关的芽孢杆菌物种分离物得到编码与本发明的毒素和编码序列相关的其他毒素和编码此类毒素的核苷酸序列。在本文中i^为与本发明的毒素和编码序列相关的此类毒素和核苷酸序列与本发明的毒素和核苷酸序列是等同的。"等同的"指蛋白质显示出TIC卯O蛋白质的特征，包括但不限于相似的杀虫抑制性生物活性、杀虫生物活性的宿主范闺，显示出与针对TIC卯O和相关蛋白质产生的抗体交叉反应的相似的抗原表位，显示出与TIC卯O和相关蛋白质相似的大小，显示出相似的表达分布图和特征，当在苏云金芽孢杆菌或者相关细菌物种中表达时显示出隔离到细胞外环境的倾向，等等。短语"显示出隔离到细胞外环境的倾向"意在包括TIC卯0和相关蛋白质，包括但不限于TIC402、TIC403、TIC404、TIC434、TIC961、TIC962、TIC963、TIC965和TIC966，它们由细菌或者宿主细胞作为前体蛋白质产生，所述前体蛋白质含有与杀虫蛋白质连接的氨基酸序列，该氨基酸序列的功能是将杀虫蛋白质靶向细菌或者宿主细胞分泌器并且当接触分泌器时，就被信号肽酶蛋白酶切，对于革兰氏阳性微生物的情况，将成熟或者杀虫蛋白质释放到细胞外环境，对于革兰氏阴性微生物的情况，将成熟或者杀虫蛋白质至少释放到周质，对于真菌或者植物或者其他真核宿主细胞的情况，将成熟或者杀虫蛋白质释放到内质网或者分泌小泡或者释放到亚细胞器，如线粒体或者叶绿体或者plastic。有许多方法可以鉴定与本文公开的肽相关的等同杀虫毒素的存在和得到所述毒素。例如，针对本文公开和要求专利保护的杀虫毒素的抗体可用于从蛋白质混合鉴定和分离其他毒素。特别地，可以对毒素中在该新类别蛋白质内最恒定并且与其他苏云金芽孢杆菌毒素最不同的部分产生抗体。然后，这些抗体可以用于通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)或者蛋白质印迹特异鉴定具有特征活性的等同毒素。针对本文公开的毒素、或者针对等同毒素或者这些毒素的片段的抗体可以使用本领域的标准方法容易地制备。然后可以从微生物或者其他多种来源得到编码这些毒素的核普酸序列。保持所例示的毒素的杀虫活性的片段和等同物将在本发明的范围内。而且，因为遗传密码的冗余性，多种不同的DNA序列可以编码本文公开的氨基酸序列。本领域受训练的技术人员能够产生编码相同或基本上相同毒素的这些备选DNA序列。这些变异DNA序列在本发明的范围内。本领域公知某些氨基酸可以替代蛋白质结构中的其他氨基酸而不明显损失与诸如抗体的抗原结合区或者底物分子上的结合位点的结构的相互作用结合能力。因为正是蛋白质的相互作用能力和性质确定了该蛋白质的生物学功能活性，所以可以在蛋白质序列和当然，它的根本的DNA编码序列中进行某些氨基酸序列替代，并且仍然得到具有相似性质的蛋白质。从而发明人预期可以在本文/^开的组合物的肽序列，或者编码所述肽的对应的DNA序列中进行多种改变而不明显损失它们的生物学功用或者活性。此类替代在本领域中也称作保守替代。在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水性指数(hydropathicindex)。在本领域中通常理解亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质的相互作用的生物功能中的重要性(Kyte和Doolittle，1982)。'〉认氨基酸的相对亲水特征对所得蛋白质的二级结构有贡献，二级结构又限定了蛋白质与其他分子，如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等的相互作用。本领域中还理解可以基于亲水性有效进行相似氨基酸的替代。蛋白质的最大的局部平均亲水性(受到它的相邻氨基酸的亲水性的控制)与该蛋白质的生物学性质相关(美国专利4，554，101)。如上面概述的，因此氨基酸替代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的亲水性、疏水性、电荷、大小，等等。考虑多种前述特征的代表性取代是本领域技术人员公知的并且包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。与TIC卯0、TIC402、TIC403、TIC404、TIC434、TIC961、TIC962、TIC963、TIC965和TIC966生物功能等同的肽、多肽和蛋白质包括含有在SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:30、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、和SEQIDNO:20中所示的基本序列中保守氨基酸改变的氨基酸序列。在此类氨基酸序列中，将基本序列中的一个或多个氨基酸用具有与天然氨基酸相似电荷和极性的另一氨基酸替代，即保守氨基酸替代，导致沉默改变。基本多肽序列内氨基酸的替代可以选自天然发生的氨基酸所述的类别的其他成员。可以将氨基酸分成如下四组(l)酸性氨基酸；(2)碱性氨基酸；(:3)中性极性氨基酸；和(4)中性非极性氨基酸。这些不同组中代表性氨基酸包括，但不限于(l)酸性(带负电)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电的)氨基酸如精氨酸、組氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺，和谷氨酰胺；(4)中性非极性(疏水)氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。可以通过将这些组之一内的一种氨基酸用相同组内的另一种氨基酸替代来进行本发明的基本多肽序列内的保守氨基酸改变。TIC卯O和相关序列的生物学功能等同物可以有10个或更少的保守氨基酸改变，更优选地，7个或更少的保守氨基酸改变，最优选地，5个或更少的保守氨基酸改变。从而编码核苷酸序列(基因、质粒DNA、cDNA或合成的DNA)将有对应的碱基替代，允许它编码TIC卯0的生物学功能等同形式。可以通过本领域公知的方法得到TIC卯0和相关序列的氨基酸序列变体。鉴定本发明的毒素和基因的另一方法是通过使用寡核苷酸探针。这些探针基本上是在严格杂交条件下与TIC900编码序列或者与TIC900编码序列相关的序列杂交的核苷酸序列。如本领域公知的，如果探针分子和样品中的核酸序列分子通过在两个分子间形成足够强的键杂交，那么可以有理由认为这两种分子显示出显著的同源性。用本领域已知的任意方法检测探针结合，所述方法包括但不限于荧光、发光、同位素、免疫学的、表面等离子体共振光谱法，等等。此类探针分析提供了快速鉴定本发明的毒素编码基因的方法。用作根据本发明域已知的其他方法合i:这些核苷酸序列也可以用作Pck引物来扩增本发明的多核苷酸序列或者其部分。如在本文中以SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQID脆ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:19给出的tic900和相关核苷酸编码序列可以用作杂交探针从苏云金芽孢杆菌的其他菌林或者从其他微生物鉴定和分离tic900的天然变体和相关的核苷酸编码序列。本发明包括来自微生物的核苷酸序列，其中通过与本发明的芽孢杆菌核苷酸序列的全部或部分杂交可以分离所述核苷酸序列。可以对此类核苷酸序列编码的蛋白质测试杀虫活性。本发明还包含所述核苷酸序列编码的蛋白质。可以使用用于产生多克隆抗血清的标准免疫学技术产生针对本发明的TIC900或者相关蛋白质的抗体，并且如果希望，可以永生化被免疫宿主的抗体-产生细胞用作单克隆抗体生产的来源。产生针对任意目的物质的抗体的技术是公知的，如Harlow和Lane(1988)和Goding(1986)中描述。抗-TIC900抗体可以用作探针来鉴定产生tic900或者相关基因的变异体所编码的TIC卯O或相关蛋白质的变体的苏云金芽孢杆菌菌林或其他微生物。本发明包含从生物得到的蛋白质，其中所得蛋白质与针对本发明的一种或多种蛋白质产生的抗体交叉反应。本发明中产生的抗体还可以用于免疫测定中用来确定TIC900或相关蛋白质的量或存在。此类测定也可以用于含有本发明的TIC900或相关蛋白质的组合物的质量控制的生产。此外，抗体可以用于评估TIC900或相关蛋白质的重组生产的功效，以及对表达文库筛选TIC900或相关蛋白质编码序列的存在。抗体还可以用作纯化和/或分离TIC900和相关蛋白质的亲和配体。可以通过在优选宿主细胞中过表达编码TIC900或相关蛋白质的全长或部分的序列之全长或部分长度来得到TIC900和相关抗原性表位。本发明的肽主要(尽管不是唯一地)预期用于植物中，并且在某些优选实施方案中，植物中经修饰而编码本发明的蛋白质的核苷酸序列包含在一种或多种质粒载体中。此类载体可以含有多种调节元件和其他元件，这些元件预期允许在植物细胞中最佳表达本发明的蛋白质。这些额外的元件可以包括如上面概述的启动子、终止子和内含子。含有DNA构建体和任意调节元件或其他元件的栽体可以选自由酵母人工染色体、细菌人工染色体、质粒或粘粒等等构成的组。此外，表达载体自身可以为多种形式。这些形式可以由于多种原因而不同，并且将可能包含不同的元件，这取决于它们预计要转化的是单子叶植物还是双子叶植物。还设想在本发明范围内的栽体包括能够含有如上/>开的tic900或者相关核酸组分的那些载体，以及任何其他DNA构建体，所述DNA构建体还包含来自芽孢杆菌物种的其他杀虫蛋白质的植物可表达的编码区。编码TIC900杀虫蛋白质(SEQIDNO:4)或者编码相关多肽序列，如TIC402(SEQIDNO:6)、TIC403(SEQIDNO:8)、TIC404(SEQIDNO:IO)、TIC434(SEQIDNO:30)、TIC961(SEQIDNO:12)、TIC962(SEQIDNO:14)、TIC963(SEQIDNO:16)、TIC965(SEQIDNO:18)和TIC966(SEQIDNO:20)的核苷酸序列可以通过4吏用本领域中4支术人员公知的转化适宜宿主的方法，在允许所克隆基因的稳定保持和表达的条件下，不用过度实验就可以导入多种微生物宿主中(Sambrook等人，1989，MolecularCloning:ALaboratoryManual2ndEd.，ColdSpringHarborPress,NewYork)。允许表达TIC900蛋白质(SEQIDNO:4)和相关序列的适宜的宿主包括苏云金芽孢杆菌和其他芽孢杆菌物种，如枯草芽孢杆菌或者巨大芽胞杆菌。含有tic900基因(SEQIDNO:3)的经遗传改变或工程化的微生物还可以含有编码相同微生物中存在的其他毒素蛋白质的核苷酸序列；这些编码序列可以同时产生与TIC900或者相关蛋白质不同的杀虫蛋白质。具体地，将优选在宿主细胞中产生两种或多种不同的杀虫蛋白质，其中每种蛋白质对相同昆虫物种有毒性并且每种蛋白质显示出与另一种(其他)蛋白质不同的作用方式。植物建群(plant-colonizing)或者茎干建群的微生物也可以用作产生TIC900或相关蛋白质的宿主细胞。苏云金芽孢杆菌毒素基因的示例性微生物宿主包括Turner等人(1993;Endophytes:analternativegenomeforcropimprovemen"InternationalcropscienceI,InternationalCropScienceCongress,Ames，Iowa,USA,14-22July1992，pp.555-560)描述的植物建群的微生物Clavibacterxyli。可从本发明的分离物得到的编码毒素的核苷酸序列可以被导入多种微生物或植物宿主。毒素基因的表达直接或间接导致杀虫剂的细胞内产生和保持。使用适宜的微生物宿主，例如，假单胞菌，可以将微生物应用于害虫的地点，在这里它们将繁殖并且被害虫摄入。结果是对害虫的控制。备选地，可以在延长毒素活性和稳定细胞的条件下处理含有毒素基因的微生物。然后可以将处理的细胞(其保留毒性)应用于目标害虫的环境。当通过适宜的载体将tic900毒素基因或者相关核苷酸编码序列导入微生物宿主，并且将宿主以活体状态应用于环境时，有利的是使用某些微生物宿主。例如，可以选择已知占据害虫的栖息地的微生物宿主。微生物宿主还可以与特定种的害虫共生生活。选择这些微生物以便能够在特定环境与野生型微生物竟争，提供表达所述多肽杀虫剂的基因的稳定保持和表达，并且令人期望地提供使杀虫剂免于环境降解和失活的提高的保护。已知多种微生物栖息于害虫的栖息地。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。尤其重要的是微生物，如细菌，例如，芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文菌属(Erwinia)、Serratia、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、黄杆菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、；恨瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、Methylophilius、农杆菌属(Agrobacterium)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)、和产碱杆菌属(Alcaligenes);真菌，例如,Metarhizium、Bavaria、酵母属(Saccharomyces)、隐球菌属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷抱酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。多种方法可以用于在允许所述基因稳定保持和表达的条件下将编码毒素的毒素基因导入微生物宿主中。这些方法是本领域技术人员公知的并且描述于例如美国专利号5，135，867。如上面提到的，可以处理表达TIC900或相关毒素的苏云金芽孢杆菌或者重组细胞以延长毒素活性和稳定细胞。所形成的杀虫剂微囊包含已经被稳定的细胞结构内的一种或多种TIC900或相关毒素并且当微嚢应用于目标害虫的环境时将保护所述一种或多种毒素。适宜的宿主细胞可以包括原核生物或真核生物，通常局限于不产生对高级生物，如哺乳类有毒性的物质的那些细胞。然而，可以使用产生对高级生物有毒性的物质的生物，其中毒性物质是不稳定的或者应用的水平足够低而避免了对哺乳动物宿主的毒性的可能性。尤其重要的宿主是原核生物以及低级真核生物，如真菌。这些生物的细胞将通常是完整的并且当处理时基本上是增殖形式，而不是孢子形式，尽管在一些情况中可以使用孢子。此类微嚢还可以含有一种或多种TIC900或相关蛋白质以及一种或多种不相关的杀虫蛋白质组分，包括但不限于杀鳞翅目物种昆虫的5内毒素，如Cryl、Cry2和Cry9蛋白质，以及杀鞘翅目昆虫的5内毒素，如Cry3、Cry22、ET70、ET80/76、ET33/34、PS149B1、ET100/101、和ET29蛋白质等等。细胞通常将具有增强的结构稳定性，其将增强对环境条件的抗性。当杀虫剂是前形式(proform)或者前体形式时，应选择细胞处理方法以便不抑制目标害虫病原体对杀虫剂的前形式向成熟形式的加工。例如，甲醛将交联蛋白质并且可以抑制多肽杀虫剂的前形式的加工。细胞处理的方法保留毒素的至少大部分生物利用率或生物活性。如SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDN0:17、和SEQIDNO:19等等中给出的TIC900和相关编码序列可以用作构建用于导入植物细胞的修饰的核苷酸序列的基础。甚至更优选地是合成用于在植物细胞中表达的编码TIC900或者相关杀虫蛋白质或其等同物的非天然发生的核苷酸序列，基于天然蛋白质的氨基酸然发生^核苷酸序列。植^细胞中此类序列的;表达将使得包含此类细胞的植物对鳞翅目种类的昆虫攻击更具抗性。使用植物基因工程中技术人员公知的多种形式和来源的DNA分子，通过将含有编码序列的所希望的DNA导入植物组织或细胞，可以实现用编码一种或多种TIC卯O或者相关蛋白质或者相关杀虫氨基酸序列的经修饰的序列来基因改造植物。将核苷酸序列导入植物、植物细胞和植物组织的方法是本领域公知的。与植物功能启动子可操作地连接的含有编码TIC900或相关杀虫织中，所述方法包括但不限于农杆菌介导的转化、植物病毒、电穿孔、微注射、真空渗入、脂质体融合方法，和射弹方法。植物启动子可以是组成型启动子；时间、空间、化学、光合成、热、或者人工诱导型启动子；组织特异的启动子；或者从其他植物功能启动子的部分装配的嵌合或者杂合启动子。例如，启动子可以是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或者其植物功能性衍生物。天然细菌基因和编码序列通常在转基因植物细胞中弱表达。植物密码子使用更像其他高级生物而不像单细胞生物，如细菌。一些报导已经公开了改善植物中重组基因表达的方法(Murray等人，1989，NucleicAcidsResearch，Vol.l7:477國498;Diehn等人，1998(b)，PlantPhysiology,117:1433-1443;Rocher等人，1998，PlantPhys.117:1445-1461)。这些报导公开了多种方法，所述方法工程化编码序列以代表基于植物密码子频率表而更有效翻译的序列，改善密码子第三个碱基位置偏爱，使用重组序列，其避免了可疑的多腺苷酸化或富含A/T结构域或内含子剪切共有序列。尽管合成基因构建的方法是值得注意的，但是基本上根据Brown等人(美国专利号5，689，052)的方法制备在特定植物中表达的本发明的合成基因。本文描述的工作利用了通过将编码序列掺入或者定位到易感植物的核、质体或者叶绿体基因组，加强TIC卯O和相关杀虫蛋白质在植物中表达的方法，TIC900和相关杀虫蛋白质的表达赋予了对鳞翅目昆虫病原体的抗性。美国专利号5,500,365和相关专利描述了合成植物基因以实现所合成的、非天然发生的、合成的或者人工的基因编码的蛋白质的最佳表达水平。这些方法涉及天然Bt结构基因序列的修饰以产生编码序列，其更"像植物"并且因此更可能被植物，单子叶植物或者双子叶植物，翻译和表达。然而，如在Brown等人(美国专利号5，689，052)中公开的方法提供了转基因的增强的表达，优选在单子叶植物中的表达。从而，通过使用上面提到的转化方法转化植物可以增加那些植物中编码目的多肽，例如，TIC卯0或相关多肽的基因的量。具体地，叶绿体或质体转化可以导致所希望的编码序列以高达约10,000个拷贝/细胞存在于含有这些亚细胞细胞器结构的组织中(McBride等人，WO95/24492)。还可以通过利用如所描述的(Zhou等人，1983，Mol.CellBiol.，10:4529-4537;Hess，1987，Hess，InternRev.Cytol.，107:367.)向花粉中直接转移DNA的方法将编码TIC卯0和相关蛋白质的DNA导入植物中。通过如所述的(Pena等人，1987，Nature,325:274)将DNA注射到植物的繁殖器官可以得到多肽编码序列，即tic卯0等的表达。还可以如所述的(Neuhaus等人，1987,Theor.Appl.Genet.，75:30)将DNA直接注射到未成熟胚的细胞中和注射到再水化的干燥胚中。实现编码TIC900或者相关蛋白质的外源核普酸序列向受体细胞的递送后，下一步得到转基因植物的步骤通常关注鉴定用于进一步培养和植物再生的所转化的细胞，即选择转化的细胞。如本文提到的，为了提高鉴定转化子的能力，可能希望使用可选择或可筛选的标记基因作为，或者额外作为可表达的目的基因。在该情况中，将通常通过让细胞暴露于一种或多种选择试剂来测定可能转化的细胞群体，或者将筛选细胞的所希望的标记基因性状。鉴定转化的细胞的方法的代表性实施方案涉及将经转化的培养物暴露于选择性试剂，如代谢抑制剂、抗生素、杀虫剂等等。已经被转化并且已经稳定整合赋予对所用的选择试剂的抗性的标记基因的细胞将在培养中生长和分裂。敏感细胞将不能进一步培养。优选的标记基因的一个实例赋予对除草剂草甘膦的抗性。当该基因用作选择性标记时，用草甘膦处理推定的经转化的细胞培养物。当暴露于草甘膦时，含有重组的GOX酶或者重组的草甘膦不敏感的EPSPS酶的转基因细胞将可用于进一步培养，而敏感的、未转化细胞将不能进一步培养(美国专利号5,569,834)。优选的选择性标记系统的另一实例是新霉素磷酸转移酶(nptll)抗性系统，通过该系统赋予对抗生素卡那霉素的抗性，如美国专利号5,569,834中描述。再次，用该系统转化后，所转化的细胞当用卡那霉素处理时将可以进一步培养，而未转化的细胞将不能进一步培养。再一个优选的选择性标记系统涉及使用赋予巴龙霉素抗性的基因构建体。该类型的选择性标记系统的使用在美国专利号5,424,412中描述。其他选择性标记是本领域公知的，包括但不限于抗生素抗性标记，如nptll、tet、aad等等，phnO和其他多种乙酰基转移酶(美国专利号6,448,476)、多种酯酶(6，107，549)、bamase(Hartley,1988),J.Mol.Biol.202:913)、对转化的细胞赋予草甘膦氧化酶活性的细菌酶(gox)(Barry等人，1992，Inhibitorsofaminoacidbiosynthesis:Strategiesforimpartingglyphosatetolerancetocropplants.In:BiosynthesisandMolecularRegulationofAminoAcidsinPlants,pp.139-145.Singh,Flores，andShannonEds.，AmericanSocietyofPlantPhysiologists,Rockville，Md.)等等。通过利用叶绿体或者质体对壮观霉素的敏感性筒化了Transplastonomic选择(质体或者叶绿体转化事件的选择)，壮观霉素是质体或叶绿体蛋白质合成的抑制剂，但不是核基因组编码的细胞质核糖体进行的蛋白质合成的抑制剂。壮观霉素防止光合作用所需的叶绿体蛋白质积累，因此壮观霉素抗性的转化的植物细胞可以基于它们颜色的不同来区别抗性的、转化的细胞是绿色的，而由于质体蛋白质合成的抑制，敏感细胞是白色的。用适宜的细菌aad基因，或者用编码壮观霉素抗性质体或者叶绿体功能核糖体RNA的基因对叶绿体或质体的转化提供了选择和保持transplastonomic事件的方法(Maliga,1993，TrendsinBiotechnology11:101-106)。还预期可筛选的和可选择的标记的组合将可用于鉴定转化的细胞。在一些细胞或者组织类型中，选择试剂，如草甘膦或者卡那霉素，可解或者不提供足够的杀伤活性以清楚地识别转化的细胞，或者可解导致对转化体和相似的非转化体严重的非选择性抑制，从而导致选择技术不是有效的。有人提出用生长抑制性化合物，如草甘膦或者AMPA(氨基-甲基磷酸)在低于导致100°/。抑制的浓度下进行选择，然后对正生长的组织筛选选择性标记基因如卡那霉素的表达，将允许从不适于单独选择的细胞或者组织类型回收转化体。有人提出选择和筛选的组合可以使得人们鉴定更宽范围的细胞和組织类型的转化体。从单个植物原生质体或者多种外植体发育或者再生植物是本领域公知的。该再生和生长方法通常包括选择转化的细胞，培养那些个体化的细胞通过胚发育的通常阶段并通过生根小植林阶段的步骤。类似地再生转基因胚和种子。之后将所得转基因生根的苗种植在适宜的植物生长培养基，如油中。通过本领域公知的方法可以实现植物的发育或再生，其中所述植物含有通过农杆菌对叶子外植体的转化而导入植物基因组中的编码TIC900或者相关多肽的外来的、外源基因(Horsch等人，Science227:1229-1231;1985)。在该方法中，在选择试剂的存在下并且在培养基中培养转化体，所述培养基诱导如所述(Fraley等人，PNAS，USA80:4803;1983)转化的植物林系中枝条的再生。具体地，美国专利号5，349，124详述了遗传转化的莴苣细胞的产生和从所述细胞得到的植物，其表达杂合晶体蛋白质，该蛋白质赋予此类植物对鳞翅目幼虫的杀虫活性。优选地，再生的植物自花授粉以提供纯合的转基因植物，或者从再生的植物得到的花粉与农业上重要的种子生长的植物，优选近交系植物杂交。相反地，来自那些重要品系的植物的花粉用于对再生的植物授粉。使用本领域技术人员公知的方法培养含有编码所希望的TIC900或者相关多肽的核苷酸序列的本发明的转基因植物。从而本发明的转基因植物具有增加量的编码TIC卯0或相关多肽的编码区。优选的转基因植物是独立的分离子并且可以向它的后代传代该基因和其活性。更优选的转基因植物对该基因是纯合的并且通过性交配将所述基因传递到所有它的后代。来自转基因植物的种子可以生长在田间或者温室，并且所得性成熟的转基因植物自花授粉以产生真实育种的植物。来自这些植物的子代变成真实繁殖的品系，对它们评估苏云金芽孢杆菌转基因的增加的表达。为鉴定由优选的核苷酸序列表达高水平的TIC900或者相关蛋白质的转基因植物，必须筛选所选的转基因事件(Ro代)的杀虫活性和/或所述基因的表达。这可以通过本领域技术人员公知的多种方法完成，所述方法包括但不限于l)从转基因Ro植物得到小组织样品并直接测定该组织针对易感昆虫的活性，所述昆虫为例如欧洲玉米螟(ECB)、烟草夜蛾幼虫(TBW)和菱紋背蛾(DBM)，平行地测定来自非表达的阴性对照植物的组织；2)通过对TIC900或者相关蛋白质特异的酶联免疫吸附测定(ELISA)分析蛋白质提取物；或者3)逆转录酶热扩增(在本领域中也称作rtPCR)以鉴定表达编码TIC卯O或者相关蛋白质的序列。下面的实施例机进一步阐明本文公开的核苷酸序列的特征和所公开的核普酸序列编码的蛋白质的杀虫活性。此外，公开了用于实践本发明的方法和步骤。然而，本领域技术人员根据本公开将明白可以对公开的特定实施方案进行修改并且仍然得到相似或类似的结果而不背离本发明的精神和范围。实施例实施例1苏云金芽孢杆菌菌抹EG5438培养上清液的制备和生物测定苏云金芽孢杆菌菌抹EG5438在60mlPYG培养基中摇动下30"C过夜生长。PYG培养基含有下面的物质11.8g蛋白胨，23.6g酵母提取物，4ml甘油，19.4g无水K2HP04,和2.2g无水101^04。加入去离子水至l升，并对培养基高压灭菌15分钟。以l，OOOxg离心苏云金芽孢杆菌培养物30分钟，并将上清液转移到干净烧瓶中。将上清液冷却到4"C，并搅拌下向上清液緩慢加入34g錄u酸铵加上lmllMNaOH。离心混合物并将所得沉淀物溶解在2ml20mMTris-HClpH7.5中。将溶液转移到透析袋(6000MWCO)中并在4"C对20mMTris-HClpH7.5透析。将这称作经透析的上清液。如下测试经透析的上清液对菱紋背蛾(DBM)幼虫的毒性。向杯中2ml昆虫食物局部应用50pl经透析的上清液。用经透析的上清液处理共32个食物杯。作为对照，不用经透析的上清液处理64个食物杯。将一个第一龄(first-instar)的DBM幼虫置于每个食物杯中并在7天后对昆虫的死亡打分。对于未处理的对照食物上的幼虫，64只幼虫中的1只(2%)死亡。对于用经透析的上清液处理的食物上的幼虫，32只中的29只(卯％)死亡，表明菌林EG5438的经透析的上清液含有对DBM幼虫有毒的一种或多种因子。实施例2经透析的上清液中蛋白质的分级分离和蛋白质级分的生物测定最初通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分级分离经透析的上清液中的蛋白质。将30pl经透析的上清液与15jil蛋白质增溶緩冲液混合，并将混合物加热到100t:5分钟，并向聚丙烯酰胺凝胶应用25n1混合物。对凝胶应用电流以将蛋白质按大小分离到凝胶中。电泳后用考马斯染料染色而将蛋白质显色。经透析的上清液含有约20种蛋白质，它们的大小为约20kDa到约100kDa。通过DEAE离子交换层析分级分离经透析的上清液中的蛋白质。将2ml经透析的上清液应用于lmlDEAE柱。对柱子用10ml20mMTris-HCl，pH7.5洗涤，然后用20ml溶于20mMTris-HCl，pH7.5中的0到1M的NaCl梯度洗涤。收集lml的级分。每种级分对20mMTris-HCl，pH7.5透析，并对各个级分如上描述地测试对DBM幼虫的毒性。收集具有最高毒性的级分并合并起来，并将其称作DEAE库(pool)。将DEAE库应用于羧甲基纤维素(CM)离子交换柱。对柱子用10ml20mMTris國HCl，pH7.5洗涤，然后用溶于20mMTris-HCl，pH7.5中的20ml0到1M的NaCl梯度洗涤。收集1ml的级分，并对20mMTris-HCl,pH7.5透才斤。将这些级分称作CM级分。测试CM级分对DBM幼虫的毒性。该分析表明CM级分对DBM有最高的毒性并且含有约66kDa的蛋白质。该66kDa蛋白质称作5438-66蛋白质，也称作分泌的TIC卯0、TIC900s或者mTIC900(指在培养上清液中鉴定的蛋白质的成熟形式，其可以与还没有从细胞释放的任何前体TIC卯O蛋白质(pTIC卯O)不同。实施例3确定TIC卯O蛋白质的片段的N-末端序列通过DEAE和CM离子交换层析从菌林EG5438的上清液纯化mTIC900蛋白质。通过标准方法确定经纯化的mTIC卯O蛋白质的N-末端序列的尝试没有成功。为了克服该困难，通过溴化氰处理将mTIC900蛋白质片段化(Cordoba等人，J.Biochem.Biophys.Methods35:1，1997)。通过SDS-PAGE按大小分离溴化氰产生的TIC900片段，不进行考马斯染色。通过电转移将所分离的TIC900片段从SDS-PAGE转移到聚偏(二)氟乙烯(PVDF)膜。用考马斯染料对PVDF膜快速染色并用剃刀刀片切割含有TIC900蛋白的约14kDa片段的膜的部分。含有14kDa片段的切除的PVDF膜进行自动化Edmund测序，揭示了如SEQIDNO:l中所示的氨基酸序列，其中1位的Xaa氨基酸残基不能确定，只是推测它为丝氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或者组氨酸残基，但是最可能是酪氨酸残基，15位的Xaa氨基酸残基不可确定，只是它可能是脯氨酸残基，并且18位的Xaa残基不可测定，只是它可能是精氨酸残基。实施例4克隆编码TIC900蛋白质的tic900基因基于从14kDaTIC900蛋白质片段(SEQIDNO:l)得到的序列，设计了基因特异的寡核苷酸。由于遗传密码的筒并性，不可能基于基因编码的蛋白质的序列知道该基因的确切序列。因此，对于一种以上的密码子编码的氨基酸，必须猜测正确的密码子。通过苏云金芽孢杆菌基因组为约68。/oAT(腺苷和胸苷)这一事实来提高猜测的准确性。因此，对于一种以上的密码子编码的氨基酸，选择含有A和T的一种或多种密码子，对于基本上含有G/C的密码子，基于第三个碱基是A还是T核苷酸，优先选择在第三个碱基位置有简并性的那些密码子。设计了称作WD470(SEQIDNO:2)的寡核苷酸，其是可能编码SEQIDNO:l中给出的氨基酸的许多寡核普酸之一，对编码任一给定氨基酸的密码子考虑了苏云金芽孢杆菌中A/T的使用。通过标准步骤从苏云金芽孢杆菌菌林EG5438细胞纯化DNA。将EG5438DNA的样品进行HindIII或EcoRI限制酶消化并通过琼脂糖凝胶电泳按大小分级分离并使用碱性磷酸酶缀合的WD470寡核普酸探针进行DNA印迹分析。在40"C孵育约16小时后，洗涤印迹，用化学发光緩冲液处理，并对X光片膝光。WD470探针与EG5438DNA限制性片段特异杂交，所述片段长度分别为约2.5kb(HindIII)和3.0kb(EcoRI)。在CIP(小牛肠磷酸酶)处理的EcoRI消化的pIJC18质粒中构建由约3.0kbEcoRI片段组成的EG5438DNA文库。通过电穿孔将该文库转化到大肠杆菌XL1BLUE菌林并平板接种到LB-氨苄青霉素。将产生的菌落印迹到膜并用碱性磷酸酶缀合的WD470寡核苷酸探针探测。选择几个阳性克隆并从每个克隆得到质粒DNA。用EcoRI消化质粒的DNA以证实由约3.0kb组成的单个EcoRI插入片段的存在。还将质粒进行与碱性磷酸酶缀合的WD470探针的杂交以证实探针与插入的DNA的互补性。选择单个克隆用于进一步分析并命名为质粒pEG1398。对pEG1398中插入的DNA进行序列分析。得到含有由如SEQIDNO:3中给出的核苷酸位置1176到1803组成的部分可读框的序列，该序列还含有核苷酸1803外的额外的24个核普酸(数据未显示)，其含有紧靠SEQIDNO:3中给出的1801-1803位核香酸后的终止密码子。编码TIC卯0蛋白质的ORF的全部序列不存在于克隆到质粒pEG1398中的EcoRI片段内。设计对其中鉴定的序列的5，和3，末端特异的寡核苷酸引物使得能够合成标记的探针用于检测可能包含编码TIC900蛋白质的全长ORF的EG5438DNA的更大的克隆片段。使用引物和pEG1398中的插入DNA作为模板，通过扩增制备洋地黄毒苷标记的DNA探针。DIG-标记的DNA用于探测EG5438DNA的DNA印迹，所述EG5438DNA在用多种限制酶消化后已经在琼脂糖凝胶上分离。将长为约2.5kb的HindIII片段鉴定为可以含有编码TIC卯0蛋白质的全长ORF的片段。使用类似于上面对约3.0kbEcoRI的片段描述的方法克隆约2.5kb的EG5438DNA片段，除了将HindIII片段克隆到pBlueScriptKS质粒中并且所用的探针是由质粒pEG1398中3.0KbEcoRI片段内鉴定的可读框的一部分组成的DIG-标记的DNA片段。选择含有与pEG1398中存在的DIG-标记的EcoRI片段杂交的约2.5kbHindIII片段的一个质粒用于进一步分析并将所述质粒称作p5438-2.5-kb-H3。含有p5438-2.5-kb-H3的重组大肠杆菌菌林称作54382.5kbH3。测定质粒p5438-2.5-kb-H3中2.5kbHindIII插入物的DNA序列，该序列在所有6个可读框中的翻译揭示1803个核苷酸的可读框，其序列在SEQIDNO:3中给出。如SEQIDNO:3中给出的从1位核苷酸到1803位核苷酸的ORF经预测编码约68,868道尔顿的蛋白质，将其在本文中称作TIC900。从SEQIDNO:3中的可读框推导的TIC卯0蛋白质的预测的前体形式(pTIC900)的氨基酸序列在SEQIDNO:4中给出。所推导的TIC900氨基酸序列的氨基酸序列(SEQIDNO:4)与GenBank蛋白质数据库的同一性和相似性比较揭示最接近的同一性是与CrylCa蛋白质的同一性，显示约49%同一性。实施例5在重组苏云金芽孢杆菌中表达克隆的tic900基因苏云金芽孢杆菌杀虫毒素基因通常在重组大肠杆菌菌林中弱表达。苏云金芽孢杆菌菌林EG10650是acrystalliferous菌林，该菌林被设计用作受体菌林来测试所克隆的Bt基因是否编码杀虫蛋白质(EG10650,NRRL保藏号NRRLB-30217，美国专利号6,468,52)。将质粒p5438-2.5kb-H3中克隆的HindIII片段上的TIC卯0编码序列转移到苏云金芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体pEG597中的HindIII限制性位点中(Baum，J.A.;Coyle，D.M.;Gilbert,M.P.;Jany，C.S.;Gawron-Burke,C.,1990NovelcloningvectorsforBacillusthuringiensis;AppliedandEnvironmentalMicrobiology56(11):3420-3428)，从而构建质粒pMON74010，其赋予受体芽孢杆菌细胞对氯霉素的抗性。通过电穿孔将质粒pMON74010转化到acrystalliferous苏云金芽孢杆菌菌林EG10650中，得到菌林SIC9002。菌林EG10650在如实施例1中描述的PYG培养基中作为对照生长。重组菌林SIC卯02生长在添加5pg/ml氯霉素的PYG培养基中。如实施例l描述的制备培养上清液。通过标准SDS-PAGE分析分离培养上清液中的蛋白质并用考马斯亮蓝染色后显色。SDS-PAGE分析结果表明菌林EG10650和SIC9002向它们的各自培养上清液分泌相似数目和大小的蛋白质，只是菌抹SIC9002的培养上清液含有约66kDa的蛋白质，其似乎不存在于菌株EG10650的培养上清液中。该结果提示p5438-2.5kb-H3中克隆的tic900可读框编码一种蛋白质，其在SDS-PAGE凝胶中以约66kDa的质量迁移。从SEQIDNO:3中给出的ORF推导的氨基酸序列的大小(约69kDa)与通过SDS-PAGE中的迁移观察到的质量的偏差提示该蛋白质的分泌形式可能实际上大小减少约2500到3000Da。这不是出乎意料的，因为多数分泌的蛋白质在穿过任何分泌机器时显示出大小上的某种蛋白酶解减小。然而，从前体TIC900蛋白质(pTIC900)的初级氨基酸序列分析判断不存在明显的II型信号肽。实施例6从克隆的tic900编码序列产生的TIC900蛋白质的生物测定如上文描述的，将菌株EG10650和SIC卯02的培养上清液应用于昆虫食物的表面。将第一龄欧洲玉米螟(ECB)幼虫和烟草夜蛾幼虫(TBW)卯置于处理的食物上并允许发育1周。通过目测评估昆虫幼虫。和TBW幼虫显示出正常生长。相比，在用SIC9002上清液处理的食物上培养的ECB幼虫和TBW幼虫显示出明显的发育障碍(stunting)。这些结果提示从克隆的tic卯O基因表达产生的蛋白质抑制ECB和TBW幼虫的生长。实施例7含有tic900同源物的菌林的鉴定使用下面的热扩增引物制备包含tic900编码序列的完整可读框的DIG-标记的探针S'-gcgctagcatgaattcaaaggaacatgattatctaaaag-S',SEQEDNO:2L和5'-cgggctcgagctattcaacaggaataaattcaattttatcc-3，,SEQIDNO:22.来自一组Bt菌株的1到5pg之间的基因组DNA用HindIII完全消化并且所得片段在琼脂糖凝胶上分离为弥散条带。凝胶用于DNA印迹步骤中，其中将分离的DNA变性，转移到尼龙膜，固定并暴露于如上述的DIG标记的探针。在DIGEasyHybe(Roche)中42T下进行杂交(421:下DIGEasyHybe相当于用含有50%甲酰胺的杂交緩冲系统进行严格的42t:杂交)。如下进行中等严格的洗涤l)在2XSSC，0.1%SDS中25t:下一次5分钟和一次15分钟；和2)在0.5XSSC，O.l%SDS中65t:下两次，每次15分钟。鉴定了含有1到3个HindIII片段的13个菌林，所述片段与tic卯0探针杂交。来自这些菌林的每一个的DNA用作tic卯O同源物的热扩增的模板。如SEQIDNO:21和SEQIDNO:22给出的引物用于4吏用ExpandHighFidelityPCR试剂盒(Roche)扩增tic卯0同源物。热扩增反应条件由50ML体积组成，其包含200MM每种dNTP，300nM每种引物，0.1-250ng基因组DNA模板，和1x反应緩冲液中的2.6单位酶混合物(由生产商以10x浓缩试剂提供)。热扩增循环组成为1个循环的94"C2分钟；10个循环的94TC15秒，60X:30秒，和72TC2分钟；接着是25个循环的94"C15秒，60t:30秒，和721C2分钟，对最后25个循环的每个循环增加5秒；和在最后循环结束时72"C7分钟的末端延长期。13个菌林中的9林的DNA进行该热扩增反应，产生扩增产物(扩增子)，对其随后克隆并测序。所克隆的热扩增产物的5，和3，末端序列被引物的序列固定并且在通过扩增引物建立的整个序列上可能不代表天然基因的序列。无论如何，扩增子序列与用于分析杀虫活性的所表达的全长天然序列基本相同。本领域技术人员将认识到所述扩增子可以用作探针来钓出编码与TIC卯0蛋白质相关的杀虫蛋白质的全长天然序列。每种热扩增产物的可读框编码的蛋白质和每种热扩增产物所来自的菌株在上述表l中指出。变异扩增引物和多种扩增条件也用于从CRW-活性Bt菌林EG3907鉴定tic卯0同源物。通过DNA印迹对EG3907中的tic900同源物作图以方《更克隆编码该蛋白质的可读框。EG3907中的tic卯0同源物具有与来自EG5438的tic900基因不同的HindIII限制图谱。在约13kbBamHI/BglII片段上鉴定了EG3卯7同源物。将BamHI/BglII消化的EG3907DNA连接到BamHI消化的入噬菌体GEM-ll臂上。来自在发酵培养液中显示CRW活性的额外的30个Bt菌林的DNA的DNA印迹鉴定了2种菌林EG3291和EG3388,它们含有在严格条件下与tic900探针杂交的DNA。这两种菌林都显示出相同的HindIII限制图谱，但是这些与含有来自菌株EG5438的如SEQIDNO:3中所示的tic900序列的限制图i普不同，并且与含有存在于菌株EG3907中的所鉴定的同源物的限制图谱不同。将来自132Bt菌林的DNA(0.5jng)点印迹到Nytran膜并在严格条件下用tic卯0DNA探针探测。进一步分析显示出最强tic900杂交信号的来自15种菌林的DNA。对来自每种菌林的DNA用HindIII完全消化并如上述进行DNA印迹步骤。似乎在点印迹中杂交的来自一些菌林的DNA当使用DNA印迹方法时不显示出强烈杂交信号。已经用HindIIIDNA印迹分析了含有与tic卯0基因同源的序列的14种菌林。基于使用HindIII消化出现的杂交图，在这些菌林中存在至少4种不同的tic900同源物。下面的苏云金芽孢杆菌菌株显示出在严格或者特异杂交条件下与tic900探针杂交的HindIII片段EG3291、EG3388、EG3879、EG3907、EG4090、EG4092、EG4293、EG4332、EG4577、EG4611、EG4963、EG4971、EG5023、EG5438、和EG5526。这些菌林也产生细胞外蛋白质，可以评估它们的杀虫活性。根据所选的菌林，杂交的HindIII片段为约0.8kb到约6.3kb不等。测定与tic卯0探针杂交的每种片段的核苷酸序列，并从这些序列推导可读框，每种序列在本文中以SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:29、SEQIDNO:ll、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、和SEQIDNO:19给出。从这些可读框的每一种推导出与TIC900的大小相当的蛋白质的氨基酸序列，如分别在SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO、SEQIDNO:30、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、和SEQIDNO:20中给出的。将这些推导的氨基酸序列分別称作TIC402、TIC403、TIC404、TIC434、TIC961、TIC962、TIC963、TIC965、和TIC966。如表1中给出的，这些核苷酸序列分别来自下面的苏云金芽孢杆菌菌林EG3879(TIC402)、EG4332(TIC403)、EG4971EG4611(TIC963andTIC434)、EG5023(TIC965)、和EG4092(TIC966)。鉴定了显示出与tic卯0探针杂交的序列的一种额外菌林。菌株EG5526含有HindIII片段，其与鉴定为编码来自菌林EG3879的TIC402的HindIII片段在大小上显然相同。DNA序列分析揭示EG5526片段含有在序列上与tic402ORF相同的ORF(TIC964)。含有编码tic卯0的这些克隆的同源物的质粒的苏云金芽孢杆菌的acrystalliferous菌林每种都进行昆虫生物测定并且确定它们显示出杀虫生物活性。在编码本发明蛋白质的序列之间存在高度同一性。实际上，包括每种tic基因的可读框的比对揭示ORF相互之间的同一性没有一个小于约97%。每种ORF编码的氨基酸序列的比对还表明本发明的蛋白质之间存在高度同一性。TIC962和TIC963相关性最远，但是仍然很密切相关，因为它们在氨基酸序列水平上显示出大于96%的同一性。相对于基于所有这些核苷酸序列的比对建立的共有序列，对于任何ORF中任何给定的改变而言，多数对核苷酸序列的改变都是沉默的，因为它们仅影响密码子中的第三个碱基并且通常不导致所编码的氨基酸序列的修饰。含有天然TIC900基因的苏云金芽孢杆菌菌林EG5438和含有所克隆的tic900编码序列的SIC9002的传代培养物保藏在农业研究机构保藏中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection,NorthernRegionalResearchLaboratory(NRRL)，ILS.DepartmentofAgriculture(USDA)，1815NorthUniversityStreet,Peoria,IL.61604，USA)的永久保藏中。苏云金芽孢杆菌菌林SIC9002在2002年4月25日保存并提供NRRL保藏号NRRLB-30582。苏云金芽孢杆菌菌抹EG5438在2002年5月3日保藏，并提供NRRL保藏号NRRLB-30584。实施例8编码嵌合的杀虫蛋白质的基因该实施例阐明TIC900类蛋白质显示出与Cryl类Bt杀虫蛋白质的相似性并且可以从与Cryl蛋白质的全部或部分连接在框内的TIC卯O类白质的全部或部分来构建嵌合蛋白质并测试杀虫活性。本文公开的TIC900类蛋白质的任一种与其他Bt杀虫蛋白质的比较提示这些蛋白质与Cryl类蛋白质相关性最接近，尤其与Cryl蛋白质的杀虫部分最接近。TIC900类蛋白质显示出与Cryl蛋白质毒素部÷分的结构相似性，因为Cryl蛋白质显示出由称作结构域I的第一个结构域、称作结构域II的第二个结构域和称作结构域III的羧基末端结构域组成，其中结构域I由约前200个到约前240个氨基末端氨基酸组成，结构域II由约氨基酸240到约氨基酸400左右组成，结构域III由从约残基400左右直到毒素结构域末端的氨基酸组成。TIC900类蛋白质似乎显示出该类型的结构域结构，尽管TIC卯O类蛋白质通常没有多数Cryl毒素结构域长。以前已经表明Cryl毒素结构域可以与异源前毒素肽结构融合，并且该融合形成晶体，并且当在生物测定中测试得到的晶体时，通常还保留杀虫生物活性。构建融合蛋白(SEQIDNO:24，TIC109)，其中TIC900与CrylAc前毒素肽结构融合。该融合蛋白由在苏云金芽孢杆菌菌林EG10650(称作SIC1047的重组菌林)中的pMON74119中的如SEQIDNO:23给出的核苦酸序列表达。SEQIDNO:23对应于来自核苷酸位置1-1809的TIC卯0编码序列，和来自核苷酸位置1816-3504的CrylAc前毒素结构域编码序列。在SIC1047发酵中形成的嵌合蛋白TIC109产生晶状包含体，在生物测定中针对烟草夜蛾幼虫、CornEarworm、和FallArmyworm进《亍观J试。嵌合蛋白质显示出与TIC卯O所显示的相似的生物活性，但是对FallArmyworm没有生物活性。如SEQIDNO:25给出的核苷酸序列编码的TIC110(SEQIDNO:26)是连接CrylAc前毒素肽序列的CrylF/TIC卯0嵌合杀虫蛋白质。SEQIDNO:25从约核苷酸位置1-273对应于编码CrylF结构域I的序列、从约核苷酸位置724-1809对应于编码TIC900结构域II和III的序列，从约核苷酸位置1810-3510对应于CrylAc编码序列。该蛋白质可以在Bt的acrystalliferous菌林中表达并且在生物测定中测试晶状蛋白质内含物以测定对多种鳞翅目害虫物种的生物活性。TIC111(SEQIDNO:28)由如SEQIDNO:27中给出的核苷酸序列编码。TIC111对应于杀虫嵌合蛋白，其由连接TIC900结构域II和ni的CrylAc结构域I组成，其连接CrylAc前毒素结构域。可以从pMON74122表达TIC111并且晶状蛋白质内含物在生物测定中测试对多种鳞翅目害虫物种的生物活性。将pMON74122转化到acrystalliferousBt菌林EG10650中，得到转化的宿主细胞SIC1049,其表达TIClll蛋白质。收集TIClll晶体并在生物测定中测试对小地老虎(BlackCutnorm，BCW)、菱紋背蛾(DBM)、烟草夜蛾幼虫(TBW)、CornEarworm(CEW)和FallArmyworm(FAW)的生物活性。对BCW、DBM和TBW观察到杀虫生物活性，与TIC卯0的杀虫生物活性一致。总之，上面的详细描述描述了本发明。本领域技术人员将理解，不背离本发明的范围和精神，并且不用过度实验，可以在宽范围的等同参数内实施本发明。尽管结合本发明的特定实施方案描述了本发明，但是将理解可以对本发明进行进一步修改。本发明预期包括一般按照本发明的原理对本发明的任何使用、改变或者改编。下面的所有权利要求中提供的要素的多种排列和组合都是可能的并且在本发明的范围内。在权利要求书措辞或者说明书中的词语"包含"意在限定为表示"包括至少"的术语。本说明书中提到的所有出版物和专利都引入本文作为参考，就好像专门和单独陈述将每个出版物和专利引入本文作为参考一样。参考文献Capecchi,Cell,22(2):479掘，1980.Clapp,Clin.Perinatol.,20(1):155-168,1993.Crickmoreet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NO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18或SEQIDNO:20中给出的杀虫氨基酸序列的核普酸序列；和(iii)3，非翻译的核苷酸序列，其在所述植物的细胞中发挥功能而导致转录终止；(b)得到含有步骤(a)的核苷酸序列的转化的植物细胞；和(c)从所述转化的植物细胞产生植物，其在该转化的植物中表达鳞翅目活性毒素蛋白质。17.来自权利要求16的转化的植物的种子，其中所述种子包含所述核酸序列。18.权利要求17的种子的后代，其中所迷后代包含所述核苷酸序列。19.权利要求16的转化的植物，其中所述植物细胞是(a)单子叶植物细胞，包含玉米植物细胞、小麦植物细胞、稻植物细胞、燕麦植物细胞、洋葱植物细胞和草植物细胞，或(b)双子叶植物细胞，包含棉花植物细胞、油菜植物细胞、大豆植物细胞、烟草植物细胞、果树植物细胞、十字花科植物细胞、胡椒植物细胞、观赏植物细胞、向日葵植物细胞、葫，植物细胞和甜瓜植物细胞。20.来自权利要求18的植物的组织或种子的生物样品，其中所述样品包含可检测量的所述核普酸序列。全文摘要本发明涉及从苏云金芽孢杆菌和相关菌株分离和表征编码分泌到细胞外间隙的新的杀虫蛋白质的核苷酸序列。所述蛋白质从苏云金芽孢杆菌和相关菌株的培养上清液分离并显示出对包括欧洲玉米螟(ECB)、烟草夜蛾幼虫(TBW)和菱纹背蛾(DBM)的鳞翅目昆虫的杀虫活性。公开了在严格条件下与所分离和表征的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的杀虫蛋白质。公开了制备和使用包含本发明的新的核苷酸序列的转基因细胞和植物的方法。文档编号C12N15/82GK101133079SQ200480037707公开日2008年2月27日申请日期2004年12月14日优先权日2003年12月16日发明者J·多诺万,J·恩格勒曼,J·皮特金,T·马尔法,W·多诺万申请人:孟山都技术有限公司