专利名称：用于预防利什曼病的新型手段的制作方法
技术领域：
本发明涉及在动物和人中预防利什曼病的新型手段。
本发明特别旨在编码利什曼虫(Leishmania)中的毒力或致病力因子的核酸分子，及其用于产生这些因子以制造抗利什曼病的疫苗组合物的用途。
利什曼病是六种主要的寄生虫病之一，并被世界卫生组织(O.M.S.)以此理由视作优先考虑的事情。利什曼虫在载体昆虫(白蛉)的消化管内以细胞外前鞭毛体的形式存在，而在哺乳动物宿主中以细胞内无鞭毛体的形式存在。有几种分子，包括脂磷酸聚糖(lypophosphoglycane，LPG)或称为gp63的金属蛋白酶，似乎在寄生虫的感染能力和致病力方面起着重要的作用。更近些年来，一个称为前鞭毛体表面抗原(PSA)的糖蛋白家族引起了人们新的关注。PSA的特征是存在富含亮氨酸的重复基元，其能够参与蛋白质/蛋白质类型的相互作用，PSA可在小鼠中提供Th1型细胞介导的保护性免疫性。在生物体中，例如在细菌或植物中，PSA显示出牵涉诸如细胞粘附、对病原体的抗性和信号转导之类的功能。
但是，在利什曼虫中还既没有描述过也没有建议过任何生物作用。
由于所拥有的技术，发明人能够研究这一作用，该技术使得能够使用完全规定成分的培养基，即其中的成分都是确定的培养基，在无血清(asérique)和无菌的条件下培养利什曼虫的前鞭毛体和无鞭毛体，这也是以IRD的名义申请的1993年5月13日的专利FR 93 05 779的目标(ex.ORSTOM)。掌握这种方法使得能够获得没有直到那时从培养基中带来的污染物的寄生形式，和极纯的形式的抗原决定簇。
在该申请人的所述FR专利中，已经描述了在亚马逊利什曼虫(L.amazoniensis)培养物的上清液中分离和鉴定38kDa和45kDa的排出/分泌的PSA(排出/分泌型抗原，或缩写为AES)。
目前，发明人已经分离和克隆了编码这种蛋白质的cDNA，并通过调整附加的基因转换策略评价了其在寄生虫生物学中的作用。这些工作已经允许证明该PSA作为毒力和/或致病力因子而牵涉其中，和产生使得能够过表达编码该PSA的利什曼虫基因的构建体，这使得能够开发出用于获得抗利什曼病的疫苗组合物的手段。
因此，本发明的目标是提供能够编码利什曼虫的前鞭毛体形式和无鞭毛体形式的PSA的核酸序列，所述PSA构成了毒力和/或致病力的因子。
十分特别地，本发明旨在提供过表达所述PSA的载体，以及经遗传修饰的寄生虫。
此外，本发明还旨在所获得的PSA培养基上清液，以及分离并纯化的PSA，和利用它们的特性来生产抗利什曼病的疫苗组合物。
本发明的核酸序列相应于能够编码利什曼虫的前鞭毛体形式或无鞭毛体形式的PSA的分离的核酸，所述核酸相应于序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQID NO11中之一，并编码分别为序列SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的PSA。
更具体地，本发明的核酸序列是属于符合图2所图示特征的家族并且尤其含有一个SalI限制位点和两个HindIII限制位点并在第一个HindIII位点下游具有终止密码子的cDNA克隆的序列。
本发明特别旨在，在SalI和HindIII这两个位点之间或者在SalI位点的任一侧具有EcoRV和/或PstI限制位点的所述家族的cDNA克隆。
本发明还旨在分离的免疫原性蛋白质，其特征在于，所述蛋白质呈现出由如上所定义的核酸所编码的序列。特别地，本发明旨在相应于序列SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10或SEQ ID NO12的蛋白质。
这些蛋白质属于称为前鞭毛体表面抗原(缩写为PSA)的家族，并具有图3A和3B所图示的特征性区域。这些蛋白质可在翻译后进行如下修饰N-糖基化、磷酸化和GPI的锚定。这些蛋白质在羧基末端的位置上具有疏水性信号肽。
通过将如上所述的序列定向克隆在表达载体中，发明人获得了允许这些序列以有义位置进行表达的构建体。
因此，本发明旨在核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有能够编码利什曼虫的前鞭毛体形式或无鞭毛体形式的免疫原性蛋白质的、处于有义位置的、分离的核酸，这些蛋白质相应于序列SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12中之一。
本发明特别旨在这样的核酸构建体，其具有属于符合图2所图示特征的家族并且尤其含有一个SalI限制位点和两个HindIII限制位点并在第一个HindIII位点下游具有终止密码子的cDNA克隆的序列。
在SalI和HindIII这两个位点之间或者在SalI位点的任一侧具有EcoRV和/或PstI限制位点的cDNA克隆是特别优选的。
特别有利的构建体具有选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO11的序列作为核酸序列，这些序列分别编码序列SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12的蛋白质。
优选的构建体在快速增殖的质粒如pTex中含有所述的核酸序列。
本发明还旨在用这样的构建体转染的利什曼虫株系，不论是前鞭毛体形式或者是无鞭毛体形式。
考虑到所期望的疫苗应用，优选的经转染的株系是杜氏利什曼虫(L.infantum)的株系。
有利地，PSA在寄生虫中以组成性的方式大量地产生。
本发明还旨在转染利什曼虫属的寄生虫的方法，其特征在于，将具有标记的前面定义的载体引入利什曼虫属的寄生虫中，通过所述的标记而挑选出经转染的寄生虫，将这些挑选出的寄生虫在成分完全确定的无菌和无血清的培养基中进行培养，和回收培养物的上清液，该上清液含有浓度为利什曼虫母株系所产生的浓度的10-20倍的免疫原性蛋白质。
将载体引入寄生虫中例如通过电穿孔来实现。
将这些核酸插入寄生虫中使得能够增加寄生虫的感染能力它们在受感染的巨噬细胞中存活并在那里增殖的能力是未被这样的核酸转染的寄生虫的直至5倍。
所述的PSA在寄生虫培养基的上清液中大量地产生。因此，本发明还旨在所述经遗传修饰的寄生虫的培养基的上清液，以及从该上清液中分离并纯化的PSA。
因此，本发明提供了用于满足支配大量的构成利什曼虫中毒力/致病力因子的蛋白质这种工业需求的、具有很大价值的手段。
由于其免疫原性能力，因而这些蛋白质使得能够在根据常规技术免疫动物之后获得多克隆抗体，和制造单克隆抗体。因而，免疫小鼠使得能够获得抗IgG2A抗体，和免疫犬使得能够获得IgG2抗体。
因此，本发明还旨在这样的抗体，和利用它们的特性用于以工业上可输出的规模制造在人或动物中抗利什曼病的疫苗组合物。
这些抗体的诊断应用同样也是本发明的一部分。
本发明的其他特征和优点将在下面的实施例中给出，在这些实施例中将参考
图1-8，它们分别如下-图1，根据本发明的cDNA克隆的核苷酸序列3′端的比对；-图2，在免疫学筛选之后获得的cDNA克隆的核苷酸序列的概括性示意图，所述免疫学筛选使用亚马逊利什曼虫的前鞭毛体形式或无鞭毛体形式的表达文库的抗AES单克隆抗体。限制性内切酶酶切位点在每个序列上标出；-图3A，在从克隆A3B的cDNA推断出的蛋白质序列之上存在的、特征在于其特殊的氨基酸组成的不同蛋白质区域的定位，和图3B，从编码PSA的克隆A3B的cDNA推断出的蛋白质序列的示意性描绘；-图4，在前鞭毛体(P)和无鞭毛体(A)形式中通过RT-PCR的转录物的分析；-图5，通过使用抗-PSA抗体的Western-blotting所分析的蛋白质产生水平；-图6，过表达亚马逊利什曼虫的PSA对于寄生虫的感染能力的影响；-图7，分别相应于亚马逊利什曼虫前鞭毛体和无鞭毛体的克隆A3B、2C1、1A1、2G1、W2和杜氏利什曼虫前鞭毛体的克隆IJ11的核苷酸序列SEQ ID NO1-5和11，以及相应的所编码的氨基酸序列SEQID NO6-10和12；和-图8，在犬类动物巨噬细胞的体外感染过程中测定的寄生指数，该体外感染过程使用野生型株系和所挑选出的在不同孵育时间的杜氏利什曼虫前鞭毛体的克隆。
1-亚马逊利什曼虫(缩写为Lma)前鞭毛体和无鞭毛体形式的AES的主要免疫原的分子表征这种表征通过使用抗AES的主要免疫原的单克隆抗体来筛选亚马逊利什曼虫前鞭毛体形式和无鞭毛体形式的cDNA表达文库而得以实施。
-cDNA文库的特征产生了分别相应于亚马逊利什曼虫前鞭毛体形式和无鞭毛体形式的两个cDNA表达文库。这些文库的特征在表I中给出。混合指数期和稳定期的寄生虫，以便能够获得可能在寄生虫体外培养的不同阶段期间表达的不同转录物。然后，每个文库5×104个噬菌体用稀释至1/500的单克隆抗体F5通过免疫学方法进行筛选。获得这种抗体是上述FR专利中的实施例的目标。
表I
J4+J7＝在处于生长的指数期中的第4天以及在处于生长的稳定期中的第7天收获的寄生虫。
-被单克隆抗体F5识别的克隆的分离和测序前鞭毛体文库的13个克隆和无鞭毛体文库的11个克隆显示为阳性。所有这些克隆通过第二次和第三次筛选进行分离。
将全部分离的克隆的质粒DNA在经过不同的酶切消化之后进行分析，并留下经EcoRI/XhoI消化具有较大插入物的cDNA以便去除在5′端截得太短的cDNA。如在表II中所示，前鞭毛体cDNA文库的克隆1A1、1B1、2B3、2C1、2D1和2E1以及无鞭毛体文库的克隆A3B、V4A、V5、W2和W3具有较大的插入物。
通过测定事先选择的两个限制性内切酶酶切位点(HindIII和SalI)存在与否而进行的这些克隆的分析表明，它们具有高的核苷酸序列同源性。
通过HindIII/SalI双酶切，展现出三类不同的克隆，其HindIII/SalI片段的大小分别为小于400bp(克隆2G1)、500bp(2C1和A3B型的克隆)或600bp(1A1或W2型的克隆)。因此，根据其DNA的特殊特征(插入物的大小和某些限制性内切酶酶切位点的位置)而选择出的五种类型的克隆在表II中以斜体字显示。
表IILma前鞭毛体的cDNA文库
Lma无鞭毛体的cDNA文库
O＝是，位点存在；N＝否，位点不存在；/＝实现的；？＝未获得结果。
表II还给出了关于克隆表达重组蛋白的能力的结果。IPTG用作诱导剂。在抗前鞭毛体形式和/或无鞭毛体形式的AES的抗体存在下，样品通过SDS-PAGE和免疫印迹进行分析，其中所述抗体在存在大肠杆菌(E.coli)裂解物时被预先吸附。获得了等价的结果。对于目的克隆，标出了不同重组蛋白的表达，这些蛋白质的表观分子量从42.5kDa(克隆2C1)变化至43kDa(克隆A3B)或45kDa(1A1和W2)。
文件“序列表”中报告了下列克隆的测序结果-前鞭毛体文库的下述三个类型的克隆.1A1型克隆(SEQ ID NO3)，其表达分子量更大的序列SEQ IDNO8的蛋白质。1B1和2B3型克隆具有和该克隆同样的类型；.克隆2C1(SEQ ID NO2)，其表达分子量小于克隆1A1的呈现出序列SEQ ID NO7的重组蛋白；.克隆2G1(SEQ ID NO4)，其有着具有小HindIII/SalI片段的特点，其表达分子量小于克隆1A1的呈现出序列SEQ ID NO9的重组蛋白。
-无鞭毛体文库的下述两个克隆.A3B型克隆(SEQ ID NO1)，其表达大约43kDa的、具有序列SEQ ID NO6的、并具有500bp的HindIII/SalI片段的重组蛋白，克隆V5看起来是相同的。克隆V2D和V4A被认为是同一类型的截短的克隆；.克隆W2(SEQ ID NO5)，其表达45kDa的、具有序列SEQ IDNO10的、并具有600bp的HindIII/SalI片段的重组蛋白。
.五个cDNA序列的研究在图1中显示了所获得的五个cDNA序列的比对，其中这些克隆之间的差异只在于存在有5′端截短的序列和/或5′一侧的大约72个核苷酸的序列插入。因此，这些克隆呈现出一个(克隆2C1和A3B)或三个(克隆1A1和W2)插入。除了这些插入区域之外，这些克隆具有99％的序列同源性，从而可认为属于一个cDNA家族。只有克隆A3B具有起始密码子ATG，其他的克隆在5′端被截短。然而，A3B cDNA不具有编码“剪接前导序列”的39nt的序列，该序列存在于利什曼虫的所有mRNA的5′端。
克隆A3B和2C1的cDNA具有几乎完全的同源性，因而被认为是同一的，克隆2C1的cDNA相当于克隆A3B的cDNA在5′端被截短后的那一部分。
能代表这一家族的克隆A3B在两个方向上进行了完整的测序。
在图2中报告了对于每个克隆的限制性内切酶酶切位点。
序列SEQ ID NO1-5分别相应于A3B、2C1、1A1、2G1和W2的cDNA的序列。
-推断出的不同蛋白质序列的分析通过选择相应于由质粒pB-SK上的起始密码子位置所暗示的读码框的读码框，将不同的cDNA序列翻译成蛋白质序列，其中所述读码框的转录在经受IPTG诱导的基因lacZ的启动子的控制之下。
蛋白质A3B具有图3A和3B所图示的区域。在氨基末端，鉴定出了一个能够被切割的疏水性肽，其在文献中被描述成分泌途径的信号肽。然后是富含亮氨酸的重复结构域，克隆A3B有6个重复。在该结构域末端的十个左右的氨基酸中，存在富含脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的区域，下面称为poly P/T/S区域。该区域之后是富含可能牵涉形成二硫键的半胱氨酸的区域。最后，该蛋白质序列以疏水性信号肽结束。
克隆A3B和2C1的cDNA具有几乎完全的同源性，因而被认为是同一的，克隆2C1的cDNA相当于克隆A3B的cDNA在5′端被截短后的那一部分。
能代表这一家族的克隆A3B在两个方向上进行了完整的测序。
在图2中，报告了对于每个克隆的限制性内切酶酶切位点，其中Nt＝核苷酸；ATG＝起始密码子；TAG＝终止密码子。
在PROSITE数据库上的分析表明，蛋白质A3B具有位于每个富含亮氨酸的重复结构域的末端的N-糖基化位点，和12个潜在的磷酸化位点。
在服务器PSORT上的该蛋白质的定位的分析预测具有92％的细胞质定位，这表明该蛋白质是可溶的。该蛋白质可能通过糖基磷脂酰肌醇或GPI锚定在表面上。因此，所述疏水性信号肽可被切割和使得能够在天冬酰胺(D)水平上进行GPI的锚定。
克隆A3B的蛋白质的分子量与蛋白质1A1和W2相差大约2.9kDa，这与在相应的重组蛋白之间观察到的2.5kDa的差异是相一致的。这一差异是由于存在可变数目的富含亮氨酸的重复或LRR，每一个也呈现出特殊的氨基酸组成。
本发明的四种类型的PSA的表观分子量和理论分子量汇集在下面的表III中。
表III
2-经遗传修饰的寄生虫的获得将基因LaPSA 38s定向克隆进表达载体pTex中使得可以获得能够以有义位置表达基因PSA的构建体。然后，将有义方向的质粒pTex-LaPSA 38s和空的载体pTex经电穿孔而引入杜氏利什曼虫野生型株系Mon 1克隆1中，随后将这些寄生虫用遗传霉素(génétycine)进行选择。
对野生的杜氏利什曼虫物种的寄生虫(Sau)进行研究，它们中的一些用空的pTex转染(pTex)，和一些用含有目的核苷酸序列的pTex转染(Sens)。
分子表征通过Southern印迹法进行的总DNA的分析表明，有义的构建体在经转化的株系中是稳定的并被扩增。结果图示在图4中，该图给出了在两种形式即前鞭毛体(P)和无鞭毛体(A)中通过RT-PCR对转录物进行的分析。图5给出了通过使用抗-PSA抗体的Western印迹法而测得的蛋白质的产生水平(图5A组成型蛋白；图5B排出/分泌的蛋白)。
突变体的表型表征Ldi WT、Ldi pTex和Ldi Sens之间的生长动力学的比较表明，LaPSA 38s的过表达没有干扰寄生虫的生长。相对于野生株系，对于转化的株系只观察到更长的潜伏期。
还研究了对于被人补体裂解的敏感性。最近，已证明亚马逊利什曼虫的PSA具有在体外抑制补体作用的特性。“有义的”前鞭毛体对于补体是更敏感的。因此，在寄生虫表面上的过量的PSA可能导致切割以及导致更大量地形成复合物从而引起增加的裂解。
寄生虫的感染能力的研究为了研究LaPSA 38s的过表达对于寄生虫的感染能力的影响，首要的方法是将转化的株系的前鞭毛体与犬的巨噬细胞接触，犬是内脏利什曼病的天然的家庭内储存库。
图6A和6B给出了分别在与前鞭毛体接触之后2小时和在与无鞭毛体接触之后48小时所获得的结果，在这些图中，寄生指数相当于，被Sens株系感染的巨噬细胞的百分数×每个巨噬细胞的寄生虫的数目/被对照株系(pTex)感染的巨噬细胞的百分数×每个巨噬细胞的寄生虫的数目。
过表达LaPSA 38s的前鞭毛体对于犬类动物的巨噬细胞的感染能力表现出增加至2倍。此外，在吞噬之后，表达转基因的无鞭毛体在寄生泡中存活并增殖的能力显著高于被空载体感染的对照(2.5-5倍)。
2-杜氏利什曼虫前鞭毛体的AES的分子表征图7中给出了杜氏利什曼虫前鞭毛体的克隆IJ11的核苷酸序列(SEQ ID NO11)以及相应的氨基酸序列(SEQ ID NO12)。
在图8中报告了，在犬类动物的巨噬细胞被杜氏利什曼虫前鞭毛体形式的野生型株系或所选择出的不同克隆(MHON/MA/67/ITMAP-263，克隆2)体外感染的过程中，于不同的孵育时间测得的寄生指数。这些结果的检查表明，30分钟后寄生虫附着在巨噬细胞上，2小时后寄生虫穿透入巨噬细胞，和48小时后无鞭毛体在细胞内生存和增殖。
权利要求
1.核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有处于有义位置的分离的核酸，所述核酸能够编码利什曼虫的前鞭毛体形式或无鞭毛体形式的免疫原性蛋白质，所述核酸相应于序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5和SEQ ID NO11中之一。
2. 权利要求1的构建体，其特征在于，所述序列含有一个SalI限制位点和两个HindIII限制位点并在第一个HindIII位点下游具有终止密码子。
3.权利要求2的构建体，其特征在于，所述核酸序列在SalI和HindIII这两个位点之间或者在SalI位点的任一侧具有EcoRV和/或PstI限制位点。
4.权利要求1-3中任一项的构建体，其特征在于，所述核酸序列以有义位置克隆进质粒如pTex中。
5.权利要求1-4中任一项的构建体，其特征在于，所述构建体编码利什曼虫的前鞭毛体形式或无鞭毛体形式的免疫原性蛋白质，这些蛋白质相应于序列SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ IDNO9、SEQ ID NO10和SEQ ID NO12中之一。
6.分离的免疫原性蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有选自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ IDNO10或SEQ ID NO12的序列。
7.经遗传修饰的利什曼虫株系，其特征在于，它们相当于用权利要求1-5中任一项的构建体转染的利什曼虫的无鞭毛体或前鞭毛体形式。
8.权利要求7的株系，其特征在于，其是杜氏利什曼虫的株系。
9.利什曼虫属的寄生虫的转染方法，其特征在于，将具有标记的权利要求1-5中任一项的构建体引入利什曼虫属的寄生虫中，通过所述的标记而挑选出经转染的寄生虫，将这些挑选出的寄生虫在成分完全确定的无菌和无血清的培养基中进行培养，和回收培养物的上清液，该上清液含有浓度为利什曼虫母株系所产生的浓度的10-20倍的免疫原性蛋白质。
全文摘要
本发明涉及核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有处于有义位置的分离的核酸，所述核酸能够编码利什曼虫(Leishmania)的前鞭毛体形式或无鞭毛体形式的免疫原性蛋白质，所述核酸相应于序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO5和SEQ ID NO11中之一，并编码分别呈现出序列SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ ID NO10和SEQ IDNO12的蛋白质。本发明可应用于编码排出/分泌型抗原的利什曼虫基因的过表达。
文档编号C12N15/30GK1902220SQ200480039453
公开日2007年1月24日 申请日期2004年11月19日 优先权日2003年11月19日
发明者J-L·勒梅斯尔, M·卡瓦莱拉, D·塞雷诺, P·奥尔茨米勒 申请人:发育研究院