霍乱毒素b亚基的表达系统的制作方法

专利名称：霍乱毒素b亚基的表达系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生产霍乱毒素B亚基(CTB)的表达系统、生产CTB和在表达系统中用作表达载体的分离的核酸构建体的方法。
背景技术：
无毒的霍乱毒素B亚基(CTB)是有效的口服免疫试剂，在大范围的实验中，已经证明了为针对霍乱引起的腹泻和产肠毒素的大肠杆菌引起的腹泻提供保护作用(Sanchez and Holmgren 1989 PNAS 86481-485)。因而，这使得CTB与灭活的完整霍乱弧菌(V.cholerae)细胞一同成为口服霍乱疫苗的重要成分。此外，近来，CTB作为用于各种其他肽或糖抗原的免疫原性载体和作为用于下调免疫反应的免疫调节物吸引了很多的注意。这些发现提高了对于提高大规模生产CTB的产量的需求，以在某种程度上促进使用CTB的疫苗的开发。
选择用于生产CTB的表达系统取决于许多因素，包括蛋白质的蛋白水解稳定性、蛋白质是否是可分泌的和最终CTB产品的可接受的成本。现有四种主要的通常用来生产疫苗抗原的表达系统。它们是细菌、酵母、昆虫和哺乳动物表达系统。此外，转基因植物表达系统已经开始显现出利用植物来生产亚单位疫苗和通过可食用植物来进行疫苗递送的目标。举例来说，WO 99/54452公开了包含CTB编码序列和自身抗原编码序列的嵌合基因构建体，用所述嵌合基因构建体转化的植物细胞和转基因植物，和从这些植物细胞和转基因植物制备可食用疫苗的方法。
在细菌宿主细胞中表达重组基因最常见的通过将游离型自我复制元件(例如质粒)导入宿主细菌中来实现，所述游离型自我复制元件编码处在合适启动子控制下的目标蛋白质的结构基因。最常见地通过包含选择性标记基因来维持这种质粒，所述选择性标记基因编码赋予对特定抗生素(例如，氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、四环素等)的抗性的蛋白质。然后通过向培养基中添加适合的抗生素来在宿主中维持质粒。
虽然大肠杆菌是用于生产异源蛋白质的最常用的细菌，在除大肠杆菌以外的细菌系统中表达重组抗原有时可能是有益的。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、霍乱弧菌和短小芽孢杆菌(芽孢杆菌brevis)是已经用来表达用于疫苗生产目的的抗原的其他细菌的一些实例。
使用Vibrio cholerae宿主细胞来生产异源蛋白质的已知表达系统包括但不限于Sanchez和Holmgren，Proc.Natl.Acad.Sci.USA198986481-5中公开的CTB表达系统。在美国专利Nos 5268276、5834246、6043057和EP 0368819中也公开了这个表达系统的细节。在这个表达系统中，由缺失编码霍乱毒素A亚基(CTA)的霍乱弧菌基因的霍乱弧菌宿主细胞表达编码霍乱毒素B亚基的基因来获得CTB亚基。
Lebens等(1993 Biotech 11；1574-8)描述了Sanchez和Holmgren(1989如上)制备CTB的方法的改良形式。对于此，通过缺失了CT基因并经编码CTB的多拷贝质粒转染的霍乱弧菌01突变株来生产重组CTB。如所述，通过盐沉淀和层析法的组合从培养基纯化所使用的CTB。
如Sanchez和Holmgren(1989)(如上)和Lebens等(1993)(如上)所示的使用细菌宿主细胞，例如霍乱弧菌宿主细胞，来表达重组蛋白质，已经被证明比其他常用的原核表达系统有益，因为特定的重组产物可以大量地产生并分泌到培养基中，从而便于下游的纯化过程。霍乱弧菌宿主细胞这种有效的CTB分泌不同于大肠杆菌细胞的分泌过程，在大肠杆菌细胞中表达产物常常在周质间隙中装配(Neill等1983 Science。221289-290)。然而，近来，已经鉴定了大肠杆菌的产肠毒素菌株用于分泌热不稳定肠毒素(LT)的蛋白质分泌途径(Tauschek等(2002)PNAS 997066-7071)，由此有望由大肠杆菌宿主细胞有效地分泌重组蛋白质。
虽然在Sanchez和Holmgren 1989(如上)和Lebens等(如上)中公开的表达系统以看起来可接受的水平生产CTB，这些表达系统的缺点是，在培养基中需要抗生素，例如氨苄青霉素，通过选择和维持包含目标基因的质粒来维持最佳产量。在不存在氨苄青霉素的情况下，含有编码CTB亚基蛋白质的基因的质粒将不能稳定地维持，CTB的产量将会降低。此外，需要进一步的下游处理步骤来有效地从纯化的产品中除去所有的抗生素残留物。
由于许多原因，在重组蛋白质的生产中使用抗生素是不合需要的。除了由于添加抗生素作为生长培养基的补充物引起的成本明显增加之外，在生产用于人类或兽医用途的任何重组蛋白质中，使用抗生素被认为是成问题的。这主要有三个理由。第一，残余的抗生素可能在敏感的个体中引起严重的过敏反应。第二，存在从利用这种产物的那些天然细菌群落中选出抗生素抗性细菌的可能性。最后，编码抗生素抗性的DNA也可能转移到使用该产物的个体中的敏感细菌中，从而在其间传播不期望的抗生素抗性。
鉴于大规模生产没有抗生素残留物的重组蛋白质，例如CTB，在制药工业中有商业上的重要性，存在着以尽可能高的产量提供药学上可接受的CTB的需求。

发明内容
本发明涉及利用包含Vibrio cholerae宿主细胞的CTB生产系统来提高CTB产量，所述宿主细胞缺乏thyA基因功能，所述宿主细胞与新的表达载体一同使用来产生相对于用已知的细菌宿主细胞生产系统获得的产量出乎意料地高的CTB产量。
构建质粒表达载体，在其中编码胸苷酸合成酶(thyA)基因的基因被用作选择和维持含CTB基因的质粒的手段。相对于用于生产CTB的已知表达质粒，该质粒具有减小了的大小，因为CTB基因下游的基本上所有的非编码霍乱弧菌DNA都被除去了。
使用这种表达系统获得的意外的高CTB产量展现出了霍乱弧菌宿主细胞中异源基因的表达效率和霍乱弧菌宿主细胞株中通过互补thyA的缺失而维持的质粒稳定性。举例来说，即使在通过液体培养重复传代至100代，所有细胞都保持了质粒以及表达重组蛋白质的能力。
在此报道的表达系统是有益的，因为它利于以下用途的CTB的生产，其包括但不限于针对霍乱和LT引起的大肠杆菌腹泻的口服疫苗中的保护性免疫原；用于下调、调整、脱敏或重定向(re-directing)免疫反应的免疫调节物或耐受性诱导试剂或免疫偏离(immune-deviating)试剂；用于改变、增强、定向、重定向、强化或启动抗原特异性或非特异性免疫应答的佐剂；刺激针对一种或多种独立抗原的免疫反应的载体；和用来产生用于诊断或免疫诊断测试中的抗体(例如单克隆的或多克隆的抗体)的诊断试剂。
从作为疫苗组分的CTB的纯化和标准化的角度来看这是特别有益的，可以使用缺失thyA基因功能的稳定的细菌宿主细胞株来获得相对高的CTB产量。
特别地，本发明提供了用于生产霍乱毒素B亚基(CTB)的表达系统，其中所述表达系统包含(a)缺乏thyA基因功能的Vibrio cholerae宿主细胞；和(b)包含功能性thyA基因和CTB基因、大小小于5kb的表达载体，所述CTB基因基本上不含作为CTB基因来源的宿主细胞天然基因组中紧邻CTB基因的5′和3′末端的侧翼序列。
在根据本发明的表达系统的一个实施方式中，所述宿主细胞缺乏CTA基因的功能。在另一个实施方式中，所述表达载体的大小约3kb。在进一步的实施方式中，所述表达载体包含大肠杆菌thyA基因。在又一个实施方式中，所述表达载体具有SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。在再另一个实施方式中，所述表达载体进一步包含编码异源蛋白质的至少一个另外的核苷酸序列，例如热不稳定大肠杆菌肠毒素LT的无毒部分或形式，优选的所述LT的无毒部分是(LTB)的B亚基或其片段。
本发明还涉及生产CTB的方法，其中所述方法包括用包含功能性thyA基因和CTB基因、大小小于5kb的表达载体转化缺乏thyA基因功能的Vibrio cholerae宿主细胞，所述CTB基因基本上不含作为CTB来源的宿主细胞天然基因组中紧邻CTB基因的5′和3′末端的侧翼序列，和在允许产生CTB的条件下培养所述经转化的霍乱弧菌宿主细胞，任选的随后从所述宿主细胞分离和/或纯化所述CTB。
用于本发明的表达系统和方法的表达载体包括新的核酸构建体。
因而，本发明进一步涉及分离的核酸构建体，其包含thyA基因和CTB基因，所述CTB基因基本上不含作为CTB来源的宿主细胞天然基因组中紧邻CTB基因的5′和3′末端的侧翼序列，和所述核酸构建体的大小小于5kb。
在根据本发明的核酸构建体的实施方式中，所述核酸构建体大小约3kb。在另一个实施方式中，所述核酸构建体是质粒，例如以附

图13中所示的限制性内切酶图谱为特征的pMT-ctxBthyA-2。在又一个实施方式中，所述质粒具有核苷酸序列SEQ ID NOI。
因而，本发明提供了新的和改良的稳定表达系统，包括以下的组合(i)缺乏thyA基因功能的稳定霍乱弧菌宿主细胞株；和(ii)包含功能性thyA基因和CTB基因的稳定表达载体，所述CTB基因基本上不含作为CTB来源的宿主细胞天然基因组中紧邻CTB基因的5′和3′末端的侧翼序列。
该稳定表达系统是有益的，因为它(i)保证了CTB编码质粒的稳定维持(保证例如，100％的质粒保留在大规模生产发酵罐中)，这是有益的因为它保证了一致和可靠的CTB生产；和(ii)通过消除存在于CTB的N-末端的不均一性改良了CTB质量，其保证了相同CTB终产物的一致性生产。
本发明还提供了用于生产CTB的分离的稳定表达载体，其是对生产CTB的已知表达载体的改良，同时仍然包含功能性thyA基因。所述表达质粒具有减小的大小，因为它消除了CTB基因下游的基本上所有的霍乱弧菌DNA。不希望受理论的限制，据信，除去ctxB基因下游基本上所有的非编码霍乱弧菌DNA引起了所述表达载体的大小减小，有助于改善稳定性和改善CTB产物产量。对于改善质粒稳定性举例来说，当将霍乱弧菌宿主细胞用于所述表达系统时，即使在通过液体培养重复传代至100代之后，几乎所有的霍乱弧菌细胞保持了(1)包含CTB基因的质粒和(ii)表达重组CTB蛋白质的能力。
在所述表达载体中功能性thyA基因的存在是有益的，因为它弥补了霍乱弧菌宿主菌株中的thyA缺失；它允许所述菌株在不含胸腺嘧啶的生长培养基中生长；以及由于质粒的丧失导致宿主菌株的死亡，因此当在缺少外来胸腺嘧啶的培养基中生长时，它保证了霍乱弧菌宿主菌株的遗传稳定性。
对于某些实施方式，编码所述功能性胸苷酸合成酶(thyA)酶的核苷酸序列是大肠杆菌核苷酸序列或来自大肠杆菌。使用包含来源于大肠杆菌的编码thyA酶的核苷酸序列的质粒是有益的，因为霍乱弧菌thyA基因与来自大肠杆菌的相应thyA序列仅有约30％的同源性从而降低了重组事件的风险。
生产霍乱毒素B(CTB)亚基蛋白质的方法包括将所定义的稳定表达载体导入到缺乏thyA基因功能的霍乱弧菌宿主细胞中，并在产生CTB的条件下培养所述宿主细胞，该方法具有以下的益处(i)改善CTB的产量，相对于已知的CTB表达系统(例如，使用如Sanchez和Holmgren(1989)(如上)中描述的已知CTB表达系统产生的CTB水平)本发明的表达系统的CTB产量提高4-5倍；(ii)简化CTB的生产过程，因为可以消除从CTB除去抗生素残留物的下游步骤。因为在蛋白质大规模生产的成本方面的减少和消除了从表达的CTB产物除去任何抗生素残留物的“下游处理步骤”由此由简化的生产过程得到了更廉价的产物。
根据附随的权利要求和以下的说明书和附图，本发明的其他方面对于本领域的普通技术人员将是显而易见的。
详细说明在详细地描述本发明之前，需要理解的是本发明不限于具体例示的分子或处理参数，当然地，这些都可以变化。还需要理解的是，在此使用的专有名词仅是用于描述本发明的特定实施方式的目的，不意味着限制本发明。此外，除非另有陈述，本发明的实践将采用病毒学、微生物学、分子生物学、重组DNA技术和免疫学的常规方法，所有这些都在本领域普通技术人员的能力范围内。这些技术已经在文献中完整地说明了。参见，例如，Sambrook等，Molecular CloningA LaboratoryManual(2nd Edition，1989)；DNA CloningA Practical Approach，vol.I& II(D.Glover，ed.)；Oligonucleotide Aynthesis(N.Gait，ed.，1984)；A Practical Guide to Molecular Choning(1984)；和F undamentalVirology，2nd Edition，vol.I& II(B.N.Fields and D.M.Knipe，eds.)。
在此引用的所有出版物、专利和专利申请，无论是在上文中还是在下文中的，为了各种目将其整体并入本发明作为参考。要注意的是，如在本说明书和附随的权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数的指代物，除非上下文给出了明显地指示。
为了避免疑问，用语“包含”涵盖“包括”以及“组成”，举例来说，“包含”X的组合物可以仅由X组成，也可以包括X以外的其他事物，例如包括X和Y。
除非另作说明，在本申请中使用的所有科学和技术术语具有本领域常用的含义。遵循在例如E-L Winnacker，From Genes to Clones，VCH Publishers New York(1987)中使用的标准命名，来定义DNA限制性内切酶、限制性位点和限制性序列。寡脱氧核苷酸和氨基酸用常规的单字母和三字母缩写代码来表示。在实施例部分的开始处提供了IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议的单字母氨基酸符号。
如在本申请中使用的，以下的词和用语具有指定的含义。
表达系统本发明涉及包含宿主细胞和表达载体的组合的生产CTB的稳定表达系统。
术语“表达系统”是指宿主细胞和在适合的条件下维持的兼容表达载休的组合，例如，由所述载体携带并被导入到宿主细胞中的外源DNA编码的蛋白质的表达。对在此描述的表达系统来说，细菌存活所必需的thyA基因在细菌宿主细胞染色体上被变成无功能的。功能性thyA基因在弥补质粒上提供。thyA基因充当选择标记，因为质粒的丧失将意味着细菌宿主细胞不能存活。选择thyA基因作为非抗生素选择标记提供了以上所列出的特别的益处。
术语“表达(express)”和“表达(expression)”包括容许或使得基因或DNA序列中的信息得以体现，例如通过激活与相应基因或DNA序列的转录和翻译相关的细胞功能产生RNA(例如rRNA或mRNA)或产生蛋白质。由细胞表达DNA序列以形成“表达产物”，例如RNA(例如，mRNA或rRNA)或蛋白质。表达产物本身，例如，产生的RNA或蛋白质，可以称作被所述细胞“表达”。
宿主细胞在此使用的，术语“宿主细胞”是指任何有机体的任何细胞，其以任何方式被选择、修饰、转化、生长或使用或操作用于通过所述细胞产生某一物质。例如，宿主细胞可以是被操作以表达特定基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶的细胞。宿主细胞可以进一步用于筛选或其他分析。术语“宿主细胞”可以表示，例如，被用作或已经被用作重组载体或其他转化DNA的受体的细菌细胞，包括已经被转化的原始细胞的子代。要理解的是，由于天然的、偶然的或故意的突变，单个亲本细胞的子代不必在形态学或基因组或总DNA上与原始的亲本完全相同。举例来说，本发明的CTB可以在霍乱弧菌宿主细胞中表达。
在一个实施方式中，本发明涉及包含霍乱弧菌细菌宿主细胞的CTB生产系统，所述宿主细胞缺乏thyA基因功能，所述宿主细胞与新的表达载体一同使用，来产生相对于用已知的细菌宿主细胞生产系统获得的产量出乎意料地高的CTB产量。
霍乱弧菌宿主细胞本领域公知的是，血清群(serogroup)O1和O139的霍乱弧菌在受感染个体的肠道内增殖时，通过释放霍乱毒素(CT)可以引起严重的腹泻疾病，霍乱毒素引起肠上皮主动分泌电解液和水。通过类似的机制，几种其他的细菌，例如产肠毒素大肠杆菌细菌(ETEC)，也可以通过释放其他肠毒素引起腹泻，这些肠毒素可能与CT相关或无关。
CT是原型细菌肠毒素。它是由两种类型的亚基构建的蛋白质分子量为28,000的单个A亚基，和五个每个的分子量为11,600的B亚基。B亚基通过紧密的非共价键聚集成环形；A亚基连接于其上，可能通过较弱的非共价相互作用部分地插入到B五聚物环中。这两种亚基在中毒过程中具有不同的作用B亚基负责细胞结合，A亚基负责直接的毒性。
已经非常详细地阐明了毒素与肠细胞及其他哺乳动物细胞结合和随后通过A亚基(和其A1片段)的细胞内作用引起腺苷酸环化酶活化的事件的分子机制(参见，J Holmgren，Nature 292413-417，1981)。关于霍乱弧菌细菌的霍乱毒素合成、装配和分泌的遗传学和生物化学的更为新近的信息也是可获得的。
CT由A和B亚基的染色体结构基因分别编码。已经从几个菌株克隆了这些基因，已经测定了它们的核苷酸序列(参见，例如，Heidelberg等(2000)Nature 406477-483)。CT的A和B亚基的基因排列在单个转录单元中，A顺反子(ctxA)在B顺反子(ctxB)之前。对典型的和EI Tor生物型的霍乱弧菌菌株中CT基因结构的研究表明，在典型生物型菌株中存在两个CT基因的拷贝，而在大多数El Tor菌株中仅存在一个拷贝(J J Mekalanos等，Nature 306551-557，1983)。CT的合成由toxR基因正调节，所述toxR增加ctx的表达拷贝数(V LMiller and J J Mekalanos，Proc Natl Acad Sci USA，813471-3475，1984)。ToxR在转录水平起作用，存在于典型的和El Tor生物型的菌株中。ToxR可能通过编码正调节ctx启动子区域的调节蛋白来增强ctx转录。
缺乏thyA基因功能的霍乱弧菌宿主细胞菌株可以通过本发明的方法、或通过本领域技术人员已知的方法(Sambrook，J.E.F.Fritsch，andT.Maniatis，Molecular cloninga laboratory manual.2nd ed.1989ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y)来制备。制备缺乏thyA基因功能的霍乱弧菌菌株的合适的已知方法包括WO99/61634中概述的方法。
在本发明的上下文中，例如，如果基因已经通过，例如缺失而被除去，或如果通过例如钝化或定点诱变thyA基因遗传性地使基因失效，从而不表达thyA酶，则thyA基因功能缺失。可以通过thyA阳性基因转化thyA阴性载体，并选择在缺乏胸腺嘧啶的情况下不生长的菌株，来确定thyA基因功能的缺失。
THYA选择性标记系统弥补细菌宿主细胞染色体损害已存在利用质粒维持的手段。因而，霍乱孤菌染色体上无功能的thyA基因通过在弥补质粒上提供的功能性thyA基因的存在来弥补，其充当选择性标记并消除了对抗生素抗性选择标记的需求。由于质粒的丧失意味着霍乱弧菌细菌不能存活，从而使thyA基因充当了选择标记。
霍乱弧菌、E.coli和其他细菌的thyA基因编码的胸苷酸合成酶(thyA)催化脱氧尿苷酸(dUMP)到脱氧胸苷酸(dTMP)的甲基化，是用于掺入DNA的脱氧胸腺嘧啶核糖核苷三磷酸盐(dTTP)的生物合成中必需的酶。在缺乏这个酶的情况下，细菌将依赖外源的胸腺嘧啶，其通过由deo基因编码的补救途径掺入到dTTP中(Milton等1992J Bacteriol 1747235-7244)。
已知thyA基因是保守的基因，可以在噬菌体、原核生物和真核生物中发现。因为thyA酶是保守的，来自例如大肠杆菌的thyA基因能够弥补以下讨论的相关细菌物种的染色体中的突变thyA基因。质粒中的功能性thyA基因可以来自大肠杆菌以外的来源。在一个实施方式中，当宿主细胞是霍乱弧菌宿主细胞时，thyA基因与霍乱弧菌thyA基因具有低的同源性。
本领域的现有工作表明，在没有抗生素选择的情况下可通过用来自大肠杆菌的thyA基因弥补thyA突变，由此将重组质粒维持在霍乱弧菌中。最初使用携带E.coli的thyA基因的质粒和根据三甲氧苄二氨嘧啶抗性分离的自发的霍乱弧菌thyA突变体论证了这个原理(Morona等1991 Gene 107139-144)。
Carlin和同事们的进一步的工作从霍乱弧菌克隆和表征了thyA基因座，产生了稳定定义的受体霍乱弧菌菌株。Carlin和同事们测定的霍乱弧菌thyA基因的序列在EMBL(Genebank Accession NoAJ006514)中公开了。WO 99/61634教导了，所定义的霍乱弧菌thyA突变体可被用作适合的重组蛋白质生产菌株，所述重组蛋白质由通过thyA弥补来维持的质粒编码。
使用弥补质粒上的、与霍乱弧菌thyA基因有低同源性的thyA基因是有益的，因为与霍乱弧菌染色体“交换”的风险降低了。
弥补质粒上优选的thyA基因是与霍乱弧菌thyA基因具有低同源性的大肠杆菌thyA基因。作为说明，大肠杆菌thyA基因的公开的序列可以在Genebank登记号No J01709中找到。Carlin等(参见Genebank登记号No AJ006514)测定的霍乱弧菌thyA基因的序列(283个氨基酸的蛋白质)和大肠杆菌thyA基因(参见Genebank登记号NoJ01709)仅显示了32％的氨基酸同一性，在DNA水平上的454bp重叠区中仅反映约54％的同源性(参见WO 99/61634的附图7)。这方面是通过GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，WI.)中的FASTA软件在EMBLDNA和Swiss-Prot蛋白质数据库中进行同源性检索。
在此描述的CTB的表达可以由各种启动子驱动。优选的，启动子是异源启动子。在此使用的，术语“异源”是指自然状态下两种生物成分不一起存在。所述成分可以是调节区域，例如启动子。在此使用的，术语“异源启动子”是指与和它可操作连接的基因不相关的启动子。优选的，启动子是异源的原核启动子。特别优选地，所述启动子是适合于其所应用的宿主细胞的启动子。更优选的，在此描述的表达系统中CTB基因的表达由tacP启动子或T7 RNA聚合酶依赖性启动子驱动。在一个实施方式中，CTB可以在异源启动子，例如tacP启动子的控制下，以可诱导的方式(如需要刺激来启动表达)或组成型的方式(不断地产生CTB)表达。对可诱导表达来说，在需要时可以通过，例如向培养基中添加诱导物质，例如，地塞米松或异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来启动rCTB的产生，所述异丙基硫代半乳糖苷是乳糖操纵子的人工诱导物。
可以使用任何适合的转录终止序列，优选的是容许最小的转录或不转录的强转录终止序列。在本发明的优选的实施方式中，TrpA终止子位于CTB基因的下游，有效地终止mRNA转录。在实施例中描述的一个实施方式中，转录终止子的核苷酸序列在附图14中示出(从大约核苷酸2732到大约核苷酸2759)。
融合蛋白质提供了直接表达的备选方案。通常，将编码内源细菌蛋白质或其他稳定蛋白质的N-末端部分的DNA序列融合到异源编码序列的5′末端。在表达时，这个构建体将提供两个氨基酸序列的融合物。例如，通过产生编码融合蛋白质的嵌合DNA分子，也可以由细胞分泌外源蛋白，所述融合蛋白质包括用于在细菌中分泌外源蛋白的信号/前导区肽序列片段[参见例如美国专利No.4,336,336]。所述信号/前导序列片段通常编码信号肽，所述信号肽包括指导细胞分泌蛋白质的疏水氨基酸。蛋白质被分泌到生长培养基中(例如，对于革兰氏阳性细菌)或分泌到位于细胞的内膜和外膜之间的周质间隙中(例如，对于革兰氏阴性细菌)。优选的，在信号肽片段和外源基因之间编码了加工位点，其可以在体内或体外裂解。
编码适合的信号序列的DNA可以来源于分泌的细菌蛋白质的基因，例如大肠杆菌外膜蛋白基因(ompA)[Masui等(1983)，inExperimental Manipulation of Gene Expression；Ghrayeb等(1984)EMBO J.32437]和大肠杆菌碱性磷酸酶信号序列(phoA)[Oka等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.827212]。作为其他的实例，来自各种芽孢杆菌菌株的α-淀粉酶基因的信号序列可用于从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)分泌异源蛋白质[Palva等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA795582；EPO Publ.No.244 042]。
在此使用的，术语“前导序列”或“信号序列”是指任何核苷酸编码序列或蛋白质分子上编码的肽序列，其促进蛋白质的转运或输出，例如表达的CTB蛋白质跨越细胞膜和细胞壁(如果存在细胞壁的话)的转运或输出，或至少通过细胞膜进入具有细胞壁的细胞的周质间隙的转运或输出。在此使用的，术语“前导序列”或“信号序列”是指编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，所述多肽作为更大的多肽或前肽序列的成分，指导在所述细胞中合成的所述更大的多肽通过细胞的分泌途径(例如，从内质网到高尔基体，并进一步到分泌小泡)。所述更大的多肽在转运通过分泌途径期间通常被剪切以除去分泌肽。分泌信号序列可以编码任何信号肽，所述信号肽保证有效的指导表达的多肽进入细胞的分泌途径。所述信号肽可以是天然的信号肽、或其功能部分，或可以是合成的肽。
在一个实施方式中，所述前导序列来自肠毒素，例如大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)前导序列。在表1列出的序列中、在列出的G1登记号中提供了LT前导序列的实例。在一个优选的实施方式中，所述前导序列是大肠杆菌热不稳定肠毒素(LTB)前导序列)。用于生产本发明的CTB的LTB信号序列在表2中示出，为MNKVKFYVLFTALLSS LCAHG(SEQ ID NO2)。前导序列的其他实例包括但不限于表2中示出的前导序列和附图14中示出的序列的部分。
在所述实例中，CTB基因以可以利用天然的Sacl位点的方式与来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素的LTB信号肽融合。
DNA构建体通常，将上述成分，包括启动子、信号序列(如果需要)、目标编码序列和转录终止序列一同置于表达构建体中。具有插入或添加的DNA的DNA节段或序列，例如表达载体，也可称为“DNA构建体”或“核酸构建体”。如果需要，增强子、具有功能性剪接供体和受体位点的内含子、和前导序列也可以包括在表达构建体中。表达构建体通常维持在复制子中，例如能稳定维持在细菌等宿主中的染色体外元件(例如，质粒)。复制子具有复制系统，因而容许维持在原核宿主中，用于表达或用于克隆和扩增。此外，复制子可以是高拷贝数质粒或低拷贝数质粒。高拷贝数质粒一般具有约5到约200的拷贝数，通常是约10到约150。含有高拷贝数质粒的宿主优选的将含有至少约10个，更优选包含至少约20个质粒。根据在宿主细胞上载体和外源表达的蛋白质的效果，可以选择高拷贝数载体或低拷贝数载体。做为选择，上述成分中的某一些可以一同置于转化载体中。如上所述，转化载体通常包括选择性标记，所述选择性标记维持在复制子中，或衍化到整合载体中。
复制子在此使用的，“复制子”可以是任何遗传元件，例如，质粒、染色体、病毒、粘粒等，起到细胞内多核苷酸复制的自主单元的作用。复制子能够在自己的控制下复制，可以包括选择性标记。
载体在此使用的，“载体”是一种复制子，在其中连接了另一个多核苷酸片段，从而使所述连接的节段的复制和/或表达。术语“载体”包括表达载体和/或转化载体。术语“表达载体”是指能在体内或体外/先体外后体内表达的构建体。术语“转化载体”是指能从一个物种转移到另一个物种的构建体。载体的实例包括但不限于质粒、染色体、人造染色体或病毒。
质粒载体的常见类型是“质粒”，其一般是独立的、通常为细菌来源的双链DNA分子，可以容易地接受其他(例如异源的)DNA，并可以容易地导入适合的宿主细胞中。已经描述了用于在各种真核和原核宿主中复制和/或表达的许多载体，包括质粒和真菌载体。用于本发明的质粒可以是本领域已知的质粒，例如但不限于质粒如pBR322、pACYC177或pUC质粒衍生物或pBLUESCRIPT载体(Stratagene，LaJolla，CA)。
例如pJS162(如Sanchez and Holmgren(1989)(如上)在描述的)和pML358(如Lebens等1993(如上)中描述的)的质粒已经被用于在霍乱弧菌宿主细胞表达系统中生产CTB。本发明的表达载体不同于Sanchez-Holmgren(pJS162)和Lebens(pML358)的表达质粒，在于(i)因为已经除去了CTB基因下游基本上所有的非编码的霍乱弧菌DNA，该质粒具有较小的大小；和(ii)该质粒具有功能性thyA基因。
对此，表3提供了在此描述的表达载体与本领域已知的相关表达载体的比较分析。在一个实施方式中，在此描述的稳定的表达载体优选大小小于5kb。在更优选的实施方式中，所述稳定的表达载体大小约2.5kb到4kb。在再更优选的实施方式中，所述稳定的表达载体大小约3kb。
术语“约”或“大约”是指处于本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其在某种程度上取决于在测定系统的限制条件下该数值是如何测量和测定的。例如，根据本领域的实践，“约”可以指处于1或超过1的标准偏差之内。做为选择，“约”可以指给定值的20％、优选的达到10％、更优选的达到5％和更优选的达到1％的范围。做为选择，特别是对于生物系统或过程，该术语可以指在一定数量级内，优选的在某一数值的5倍、更优选的2倍以内。
更小的质粒大小是有益的，因为它使衍生物体外操作和构建更易进行，因为更小的DNA分子能更有效地连接在一起并转入例如霍乱弧菌等原核宿主内，提高了获得正确构建体的衍生物的机会。更小的大小还使得以更高的效率在通过例如转化将构建体导入受体细菌，以及提高质粒的稳定性。
表达载体在此使用的，术语“表达载体”是指运载工具，通过它可以将核苷酸序列(例如，异源核苷酸序列)导入到宿主细胞中，从而转化该宿主并促进导入的序列的表达(例如，转录和翻译)。
分离的表达载体在此使用的，术语“表达载体”包括分离的表达载体以及作为宿主细胞/表达载体组合的一部分的表达载体。术语“分离的”和“纯化的”是指分子，可以是核酸或氨基酸序列、或是核酸构建体，被从它们的天然环境移出和/或从与它们天然地结合的至少一个其他成分分离或隔离开。举例来说，如减少或消除了不相关材料所制备的表达载体，则表达载体可以认为是“分离的”，不相关材料例如，污染物，包括从中获得该材料的天然材料。进一步举例来说，如果基本上不含在细胞中与之结合的其他蛋白质或核酸，则纯化的蛋白质被认为是分离的。同样地，如果基本上不含在细胞中存在的蛋白质或其他不相关核酸分子，则纯化的核酸分子是分离的。蛋白质可以与不干扰该物质的预定目的的载运体或稀释剂混合，而仍认为基本上是分离的。
异源核苷酸序列一般地，异源核苷酸序列被插入到载体DNA的一个或多个限制位点，然后与可传递的载体DNA一同由该载体运送到宿主细胞中。在此使用的，术语“异源核苷酸序列”是指不是天然地位于细胞中或位于细胞的染色体位点中的、或不由细胞天然地表达的核苷酸序列。在此使用的，如果x不是以相同的方式与y相关；即，x不天然地与y相关，或不按与天然的方式相同的方式与y相关，则x对于y是“异源的”。在全文中，术语“异源核苷酸序列”与术语“外源”核苷酸序列或“客体”核苷酸序列或“细胞外”核苷酸序列或“外来”或“外源”核苷酸序列可互换地使用。异源核苷酸序列也可以是编码序列。
在此使用的，术语“基因”、“编码序列”或“编码”表达产物的核苷酸序列，所述表达产物例如RNA、多肽、蛋白质或酶，是指一种核苷酸序列，当被表达时引起所述RNA、多肽、蛋白质或酶的产生。也就是说，该核苷酸序列“编码”所述RNA，或它编码所述多肽、蛋白质或酶的氨基酸序列。术语“核苷酸序列”与术语“多核苷酸”同义。在细胞中，当RNA聚合酶将编码序列转录成RNA，然后进行反式RNA剪接(如果含有内含子)，和如果该序列编码蛋白质，翻译成蛋白质，则基因序列或核苷酸序列“处在”转录和翻译控制序列“的控制之下”，或与转录和翻译控制序列“可操作地连接”。核苷酸序列可以是基因组的或合成的或重组来源的DNA或RNA。不管是代表有义链或反义链还是它们的组合，核苷酸序列可以是双链或单链的。
编码序列在此使用的，“编码序列”是一种多核苷酸序列，当置于适合的调节序列的控制之下时其通常经由mRNA翻译成多肽。编码序列的边界由5′-末端的翻译起始密码子和3′-末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括，但不限于，cDNA和重组多核苷酸序列。“开放阅读框”(ORF)是编码多肽的多核苷酸序列区域；这个区域可以代表编码序列的一部分或整个编码序列。
可操作地连接的控制序列可以可操作地与编码序列连接。在此使用的，术语“可操作地连接”是指一种邻接，在其中，如此描述的成分处于允许它们以它们预定的方式起作用的关系之中。控制序列与编码序列“可操作地连接”是以这样的方式连接，从而在与所述控制序列相容的条件下实现所述编码序列的表达。
霍乱毒素(CT)和其B亚基(CTB)
在此使用的，术语“CT”是指霍乱毒素，“CTB”是指霍乱毒素的B亚基。在其他叙述中，它们有时分别称为“CT”或“Ct”，和“CtxB”或“CtB”。由本发明的表达系统生产的CTB也可称为重组CTB(rCTB)。
术语“CTB”还包括重组CTB DNA序列，其是编码其他序列的杂交CTB基因或其衍生物的部分。CTB衍生物可以是融合蛋白质，例如CTB基因融合蛋白质或连接了其他元件的CTB。
热不稳定肠毒素(LT)和其B亚基(LTB)在此使用的，术语“LT”在此是指大肠杆菌热不稳定肠毒素，“LTB”是指LT的B亚基。在其他叙述中，它们有时分别称为“Etx”或“Et”，和“EtB”或“EtxB”。产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的热不稳定毒素(LT)在结构上、功能上和免疫学上类似于CTB。这两种毒素是免疫学上交叉反应的。
CTB基因CTB基因或编码CTB的核苷酸序列基本上不含微生物中天然基因组中紧邻CTB编码序列的5′和3′末端的侧翼序列，所述CTB编码DNA来源于所述微生物。换句话说，所述CTB基因基本上不含与其宿主细胞基因组同源的5′和3′侧翼序列。对于某些应用，所述CTB基因或编码CTB蛋白质的核苷酸序列可以与天然的或天然型或野生型CTB相同。
“天然CTB”在此使用的，术语“天然CTB”是指具有与天然发生型或野生型CTB分子基本上相同的性质的CTB分子，所述性质例如活性(例如，GM-1结合活性)和/或免疫原性和/或免疫调节性质，所述天然发生型或野生型CTB分子能够结合GM1和/或具有CTB分子的免疫原性或免疫调节能力。术语“天然”、“天然的”、“野生”型CTB在全文中可互换地使用。
在一个实施方式中(如以下的实施例中描述的)，基本上纯的CTB基因被表述为附图14中从约核苷酸2402到约核苷酸2710的核苷酸序列。
对于某些应用，所述CTB基因或编码CTB蛋白质的核苷酸序列可以是天然发生或天然型CTB的变体、同源物、衍生物或其片段。
在此使用的，术语天然CTB分子的“变体、同源物、衍生物和其片段”，包括结构上不同于天然CTB分子(例如，就核苷酸序列而言)、但功能上表现得象天然CTB分子的CTB分子，特别在于其结合性质，例如与GM1神经节苷脂结合，和/或其免疫学性质，例如根据ELISA或GM1-ELISA测试检测的与CTB的抗血清反应。天然CTB分子的这些变体、同源物、衍生物和其片段包括但不限于来自大肠杆菌B的热不稳定肠毒素的B亚基(LTB)，和任何的或所有的突变、延伸、截断、或修饰型B亚基，或与GM1或所述类型的抗血清反应的任何其他蛋白质，以及编码满足这些条件但不具有任何ADP-核糖基化活性的蛋白质的任何核酸制品。
在另一个实施方式中，CTB基因被表述为附图14中从约核苷酸2402到约核苷酸2710所示序列的变体、同源物、衍生物或片段。
“成熟CTB”在此使用的，术语“成熟CTB”是指缺少信号序列的表达的CTB亚基蛋白质。
在此使用的，术语“氨基酸序列”是指肽、多肽序列、蛋白质序列或其部分。
在此使用的，术语“蛋白质”与术语“氨基酸序列”和/或术语“多肽”同义。在有些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在有些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“蛋白质”同义。
在此使用的，术语“多肽”是指氨基酸的聚合物，而不是指特定长度的产物。因而，肽、寡肽、和蛋白质包括在多肽的定义之内。这个术语也不指定或排除多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等等。包括在该定义中的有，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸，等)的多肽，具有取代的键以及本领域已知的其他修饰的肽，包括天然的和非天然的修饰。
多肽或氨基酸序列“来源于”指定的核酸序列，是指一种多肽，其具有与所述序列编码的多肽相同的氨基酸序列，或具有所编码的多肽的一部分，其中所述部分由至少3-5个氨基酸，更优选的至少8-10个氨基酸，再更优选的至少11-15个氨基酸组成，或者这种多肽可用所述序列编码的多肽免疫性地鉴定。这个专有名词还包括从指定核酸序列表达的多肽。
N-末端突变苏氨酸(T)是通常在来自天然或天然发生型CTB分子的成熟CTB中存在的第一个氨基酸。因而，一般地，成熟CTB分子的N-末端序列是Thr-Pro-Gln-Asn-Ile-Thr(TPQNIT)(SEQ ID NO3)。具有TPQNIT N-末端序列的成熟CTB分子的实例包括但不限于，来自霍乱弧菌菌株0395，classical Ogawa的CTB氨基酸序列，其在美国专利Nos 5268276、58234246和6043057、EP专利No 0368819和Sanchez与Holmgren(1989)(如上)的附图2中示出了。描述的实施方式提供了使用霍乱弧菌宿主细胞表达系统生产的、具有TPQNIT N-末端序列的CTB序列的实例。
在一个实施方式中，可以使用CTB序列的变体，其有利地具有APQNIT(Ala-Pro-Gln-Asn-Ile-Thr)(SEQ ID NO4)N-末端序列。举例来说，也在附图14中示出的CTB序列SEQ ID NO1，除了在蛋白质序列的氨基末端的单个突变以外，与来自霍乱孤菌菌株0395，classical Ogawa的CTB天然序列相同，其中丙氨酸(Ala)残基导入到CTB氨基酸序列的第一个位置替代苏氨酸(Thr＝T)。导入这个特定氨基酸(Ala)是有益的，因为与野生型或天然型CTB的氨基末端的苏氨酸(Thr)残基相比，它产生了规定的信号序列裂解位点。这个裂解位点在翻译后修饰中是很重要的。这个N-末端突变是有益的，因为通过消除使用已知CTB表达系统(例如Sanchez和Holmgren1989(如上)中描述的CTB表达系统)生产的CTB N-末端中的不均一提高了CTB质量，从而保证了相同CTB终产物的一致性生产。对此，修饰了eltBIctxB基因的连接，从而与用天然CTB分子获得的(参见，美国专利Nos 5268276、58234246和6043057，EP专利No 0368819和Sanchez与Holmgren(1989)(如上))多达约两种不同N-末端相比，在产生的CTB蛋白质中仅获得单一N-末端。
变体在此使用的，术语“变体”也可以用于表示不同于天然型序列的、修饰的或改变的基因、DNA序列、RNA、酶、细胞等。变体可以存在于相同的细菌菌株中，或可以存在于不同的菌株中。优选的，所述变体与天然或天然发生型CTB序列具有至少90％的序列同一性。优选的，所述变体在整个天然序列上具有20个或更少的突变。更优选的，所述变体在整个天然CTB序列上具有10个或更少的突变、最优选的5个或更少的突变。
突变体在此使用的，术语“突变体”和“突变”是指在遗传物质，例如，任何DNA上任何可检测的变化，或这种变化的任何过程、机制或结果。这包括基因突变，其中基因的结构(例如DNA序列)被改变，包括出自任何突变过程的任何基因或DNA，和由修饰的基因或DNA序列表达的任何表达产物(例如，RNA、蛋白质或酶)。突变体可以天然地出现，或可以人工地产生(例如，通过定点诱变)。优选的，所述突变体与天然或天然发生或野生型CTB序列具有至少90％的序列同一性。优选的，所述突变体在整个野生型CTB序列上具有20个或更少的突变。更优选的，所述突变体在整个野生型CTB序列上具有10个或更少的突变、最优选的5个或更少的突变。
举例来说，CTB变体可以包括任何亚基蛋白质，所述亚基蛋白质包括公开的CTB的位置1-103之间的残基的至少一个突变、添加或缺失。这种突变的实例包括任何点突变、缺失或对这些毒素、亚基或其他蛋白质的插入，以及对这些蛋白质的任何的肽延伸，不论是置于氨基末端、羧基末端或蛋白质中的其它地方，不管这些肽是否具有作为能刺激或偏离免疫反应的B细胞表位、T细胞表位等的免疫学性质。例如，已经在文献中描述了许多这种突变体(Backstrom等；Gene 1995；165163-171；Backstrom等，Gene 1996；169211-217；Schodel等，Gene1991；99255-259；Dertzbaugh等Infect.Immun.1990；5870-79)。
同源性在此使用的，术语“同源性”是指x和y之间的相似程度。可以通过本领域已知的技术确定一种型式与另一种型式的序列之间的相关性。例如，可以通过直接比较多核苷酸的序列信息来确定。做为选择，可以通过在同源区域直接形成稳定双链体的条件下杂交多核苷酸(例如，在S1消化之前使用的那些)，随后用单链特异性核酸酶消化，随后测定消化的片段的大小，来确定同源性。
同源物任何CTB序列，例如但不限于附图14中示出的，或在表1中的GI登记号码中记载的那些，在本发明中可能是有用的。在一个实施方式中，由本发明的霍乱弧菌宿主细胞表达的CTB蛋白质可以由下列编码(i)包含附图14中所示的、或表1中GenBank登记号指定的CTB基因的核苷酸序列的DNA分子；(ii)与(a)中核苷酸序列的互补物杂交的DNA分子；或(iii)编码与(a)或(b)的DNA分子相同的氨基酸序列、但是是(a)或(b)的DNA分子的简并形式的DNA分子。
如在此定义的，术语“同源物”是指一种实体，其与天然或野生型氨基酸序列和天然或野生型核苷酸序列具有某种同源性。在此，术语“同源性”等同于“同一性”。(i)中多核苷酸序列的同源物可用于本发明中。一般地，同源物与相应的指定序列具有至少40％的序列同一性，优选的至少60％、70％、80％或85％，更优选的至少90％、95％或99％的序列同一性。这种序列同一性可以在至少15个、优选的至少30个、例如至少40个、60个或100个或更多连续核苷酸的区域上存在。一般地，同源物将包含与目标氨基酸序列相同的活性位点等。尽管也可以根据相似性来考虑同源性(也就是说，具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)，在本发明的上下文中，优选的根据序列同一性来表述同源性。
测定多核苷酸同源性的方法是本领域已知的。可以通过目测、或更常见地，借助易获得的序列比较程序来进行同源性比较。这些商业上可获得的计算机程序能技术两个或多个序列之间的同源性百分比。可以在连续的序列上计算百分比同源性。也就是说，一个序列与另一个序列进行比对，在一个序列上的氨基酸与另一个序列上的相应氨基酸之间进行比较，每次一个残基。这称为“无缺口”的比对。一般地，这种无缺口比对仅在相对短的残基数上进行。
尽管这个方法是非常简单和一致的方法，它未能考虑到，例如，在不然就相同的序列对中，一个插入或缺失就将引起以后的氨基酸残基脱离比对，因而当进行全局比对时可能引起同源性百分比的大幅降低。因此，大多数序列比较方法被设计以产生最佳的比对，考虑了可能的插入和缺失，而不过度地影响总体同源性分值。通过在序列比对中插入“缺口”设法将局部同源性最大化来实现这一点。
然而，这些更复杂的方法为比对中出现的每个缺口分配“缺口罚分”，从而，对于相同数目的同一的氨基酸，具有尽可能更少缺口的、反映出两个比较的序列间更高相关性的序列比对，比具有许多缺口的比对将得到更高的分值。一般使用“Affine gap costs”，为缺口的存在分配相对高的成本(cost)，并为缺口中每个随后的残基分配较少的罚分。
这是最常用的缺口计分系统。高的缺口罚分将当然地产生具有更少缺口的比对。大多数比对程序容许修改缺口罚分。然而，当使用这种软件进行序列比较时，优选的是使用默认值。例如，使用GCGWisconsin Besffit程序包时，氨基酸序列的默认缺口罚分是一个缺口-12，每个延伸-4。
因而计算最大的同源性百分比首先需要产生最佳的比对，考虑到缺口罚分。用于进行这种比对的适合的计算机程序是GCG WisconsinBestfit程序包(University of Wisconsin，U.S.A.；Devereux等1984，Nucleic Acids Research 12387-395)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括，但不限于，BLAST程序包(参见Ausubel等1999如上18章)、FASTA(Atschul等1990，J.Mol.Biol.，403-410)和比较工具的GENEWORKS程序组。BLAST和FASTA都是可用于离线和在线检索(参见Ausubel等1999如上，第7-58页到7-60页)和Altschul(1993)J Mol Evol 36290-300或Altschul等(1990)J Mol Biol 215403-10.然而，对于某些应用，优选的是使用GCG Bestfit程序。称为BLAST 2 Sequences的新工具也是可获得的，用于比较蛋白质和核苷酸序列。(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2)247-50；FEMSMicrobiol Lett 1999 177(1)187-8和tatiana & commat；ncbi.nlm.nih.gov)。
虽然最终的同源性百分比可以根据同一性来测定，比对处理本身一般不根据或全或无的(all-or-nothing)配对比较。而是，一般使用换算的相似性计分矩阵，根据化学相似性或进化差距为每个成对比对分配分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵，BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般使用公众的默认值，或如果提供的话使用常规的符号比较表格(进一步的详情参见用户手册)。对于某些应用，优选的是对GCG程序包使用公众默认值，或对于其他软件，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。一旦软件产生了最佳的比对，就可能计算出同源性百分比，优选的序列同一性百分比。软件一般进行这个作为序列比较的部分并产生数值结果。
所述同源物可以不同于相应的指定序列，在同源物的至少30个、例如至少40、60或100或更多个连续核苷酸的区域上，不同至少1、2、5、10或更多个替换、缺失或插入。因而，所述同源物可以不同于相应的指定序列为至少1、2、5、10、30或更多个替换、缺失或插入。可以通过在适合的宿主中表达基因并测试与特异于特定CTB抗原的抗体的交叉反应性，来测试同源CTB基因。
用于本发明的表达质粒可以包含能与在此所示的核苷酸序列(包括在此所述序列的互补序列)杂交的核苷酸序列。同源物一般以显著高于背景的水平与相应的指定序列杂交。同源物和指定序列间的相互作用产生的信号水平一般是背景杂交的至少10倍，优选的至少100倍。可以通过例如，用32P对探针进行放射性标记，来测定相互作用的强度。
一般使用高严格性的培养基条件，例如约50℃到约60℃的0.03M氯化钠和0.003M柠檬酸钠，来实现选择性杂交。在优选的方面，本发明涵盖了能在严格条件(例如，65℃和0.1SSC)下与本发明的核苷酸序列杂交、与在此所示的核苷酸序列(包括在此所示序列的互补序列)杂交的核苷酸序列。
片段术语“片段”表示多肽包含野生型氨基酸序列的小部分。它可以包含序列的一个或多个大的连续部分，或多个小部分。优选的，多肽包含野生型序列的至少50％，更优选的至少65％，最优选的至少80％。
异源蛋白质/分子与A亚基单独的低免疫原性相比，LTB和CTB都是特别有效的免疫原。由于它们的免疫原性，LTB和CTB都已经被用作其他表位和抗原的载运体(Nashar等Vaccine 1993；11(2)235-40)，已经用作针对霍乱和大肠杆菌介导的腹泻疾病的疫苗成分(Jetborn等1992Vaccine 10130)。由在此描述的表达系统产生的CTB也可被用作其他免疫原性或耐受性分子例如异源分子的载运体，其可以通过化学连接与CTB连接，或可以制备为嵌合蛋白质的部分。
在此使用的，术语“异源分子”是指一种分子，其一般来自与宿主细胞不同的物种，但可以来自相同物种的不同或不相关的菌株。可以对宿主细胞工程化以表达超过一个异源多肽，在这种情况下，所述多肽可以来自相同的有机体或来自不同的有机体。在本发明的优选的实施方式中，异源核苷酸序列编码病原体的异源抗原。在另一个优选的实施方式中，可以表达来自不同病原体的两种或多种异源抗原。异源DNA或异源多肽可以是完整蛋白质或含有表位的蛋白质的一部分。在本发明的一个实施方式中，异源多肽可以是CT或LT的无毒的成分或形式。在另一个实施方式中，异源抗原可以是ETEC抗原，例如CFA1、CFAII(CS1、CS2、CS3)、CFA IV(CS4、CS5、CS6)菌毛抗原。在又一个实施方式中，异源抗原可以表达或制备为融合蛋白质的部分。对此，融合蛋白质可以包括两个或多个不同抗原或设计以提高异源多肽的免疫原性的抗原和区域。异源抗原可以选自由病毒、细菌、真菌、蛋白质、多肽或其免疫原性部分构成的组。在另一个实施方式中，免疫原性成分选自由百日咳鲍特氏菌(Bordetella pertussis)毒素亚基S2、S3、S4、S5，白喉毒素片段B，大肠杆菌菌毛K88，K99，987P，F41，CFA I，CFA II(CS1、CS2、CS3)；CFA IV(CS4、CS5、CS6)构成的组。
在本发明的某些实施方式中，由需要稳定化的质粒编码的异源多肽可以不同于编码异源抗原的序列，或附加于编码异源抗原的序列。例如，所述多肽可以调节或开启由细菌染色体或第二质粒上的序列编码的异源抗原的表达。做为选择，或附加地，由质粒编码的异源多肽可以是选择标记或是最优化携带所述质粒的细菌的生长所需的多肽。
对于起到调节作用的异源多肽来说，其可以结合于并激活，或提高编码异源抗原的序列的表达。所述调节可以是可诱导的，从而抗原的表达仅在合适的时间激活，例如当细菌处在合适的生长期时，或仅施与待接种的宿主。
这可以有助于避免、或降低对于携带质粒的细菌的早期选择压力，直到诱导表达时。
如上所指出的，一个或多个异源分子可以通过化学连接与由在此描述的表达系统产生的CTB连接，或可以制备为嵌合蛋白质的部分。在本发明的一个实施方式中，使用功能性交联试剂，例如异双功能性交联试剂，进行化学连接。更优选的，所述交联剂是N-y(-马来酰亚胺-丁氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBS)或N-琥珀酰亚胺基-(3-吡啶基-二硫基)-丙酸(SPDP)。术语“连接”包括直接的或间接的连接，例如，通过提供适合的间隔区基团。举例来说，连接的成分可以是共价连接的，形成单个活性部分/实体。做为选择，连接的成分也可以与另一个实体连接。WO 95/10301教导了抗原如何直接地或间接地与粘膜结合分子连接。
还描述了根据CTB或LTB制造融合蛋白质的方法，其中编码目标异源抗原的T或B表位之一或两者的核酸遗传性地融合到CTB的N-末端或C-末端之一或两者的编码序列，或置于CTB或LTB编码序列中的链内位置，或融合到CTA或LTA中的相似位置(Backstrom等，Gene 1995；165163-171，Backstrom等，Gene 1994；149211-217，Schdel等，Gene 1991；99255259)。还描述了将肽与CTA或LTA的羧基或氨基末端融合、以及与CTB或LTB共表达这些融合蛋白质的方法(Sanchez等FEBS Lett.1986；208194-198，Sanchez等FEBS Lett.1997；40195-97)。
举例来说，可以使用载体来制备遗传性融合物，所述载体含有用于表达融合蛋白质的启动子、霍乱毒素结合亚基CTB的DNA序列、和免疫原性肽编码序列。连接CTB和免疫原性肽编码序列，从而它们处在适当的阅读框中，产生融合蛋白质。表达、分泌和纯化融合蛋白质，用作疫苗。也可以根据WO 96/34893中的教导或根据本领域已知的任何方法来制备杂交CTB/LTB。这些表达的杂交蛋白可以包括成熟的CTB序列，在其中氨基酸残基被成熟LTB的相应氨基酸残基替代，其将LTB特异性表位的特征赋予所述免疫原性成熟CTB(产生，例如，称为LCTBA的杂交分子)。反之，这些表达的杂交蛋白可以包括成熟的LTB序列，在其中氨基酸残基被成熟CTB的相应氨基酸残基替代，其将CTB特异性表位的特征赋予所述免疫原性成熟LTB(产生，例如，称为LCTBB的杂交分子)。此外，设想了第三种杂交蛋白，其组合了LCTBA分子和LCTBB分子(参见WO 96/34893和Lebens等(1996)Infect and Immunity 64(6)；2144-2150)。
制造CTB的方法编码CTB的基因的实例包括但不限于也在附图14中示出的CTB基因SEQ ID NO1，和表1中的GI登记号指定的那些。将CTB基因插入到表达载体中。可以使用传统方法制造稳定的表达载体并转化到细菌中。
在此使用的，术语“转化”，是指将外源多核苷酸插入到宿主细胞、异源基因、核苷酸序列，例如DNA或RNA序列中，从而所述宿主细胞将表达导入的基因或序列，其一般是由导入的基因或序列编码的RNA，也可以是由导入的基因或序列编码的蛋白质或酶。可以使用任何方法进行插入，例如但不限于，直接摄取、转导、f-接合、使用CaCl2或其他试剂，例如二价阳离子和DMSO，或电穿孔。异源或外源多核苷酸可以维持为非整合载体，例如，质粒，或选择性地，可以整合到宿主基因组中。
转化过程通常根据待转化的细菌物种而变化。参见，例如，[Masson et al.(1989)FEMS Microbiol.Lett.60273；Palva et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 795582；EPO Publ.Nos.036 259 and 063 953；PCTPubl.No.Wo 84/04541，Bacillus]，[Miller et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85856；Wang etal.(1990)J.Bacteriol.172949，Campylobacter]，[Cohen et al.(1973)Proc.Natl.Acad.Sci.692110；Dower et al.(1988)Nucleic Acids Res.166127；Kushner(1978)″An improvedmethod for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids.In GeneticEngineeringProceedings of the International Symposium on Genetic Engineering(eds.H.W.Boyer and S.Nicosia)；Mandel et al.(1970)J.Mol.Biol.53159；Taketo(1988)Biochim.Biophys.Acta 949318；Escherichia]，[Chassy et al.(1987)FEMS Microbiol.Lett.25 44173Lactobacillus]；[Fiedler et al.(1988)Anal.Biochem 17038，Pseudomonas]；[Augustin et al.(1990)FEMS Microbiol.Lett.66203，Staphylococcus]，[Barany et al.(1980)J.Bacteriol.144698；Harlander(1987)″Transformation of Streptococcus lactis by electroporation，inStreptococcal Genetics(ed.J.Ferretti and R.Curtiss III)；Perry et al.(1981)Infec.Immun.321295；Powell et al.(1988)Appl.Environ.Microbiol.54655；Somkuti et al.(1987)Proc.4thEvr.Cong.Biotechnology 1412，Streptococcus]。
接受并表达导入的DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化”，是“转化体”或“克隆”。导入宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与不同属或物种的宿主细胞或细胞是相同属或物种的细胞。
将稳定的表达载体导入原核宿主细胞例如霍乱弧菌宿主细胞的方法是本领域已知的。适合的方法的实例包括但不限于电穿孔、接合和电泳。可以使用标准的筛选和选择步骤来筛选并选择正确摄取了的转化克隆。设计CTB的表达，从而使CTB在生长培养基中过度产生并积累。
在培养之后，通过例如层析、沉淀和/或密度梯度离心来纯化由在此描述的本发明的表达系统生产的CTB亚基蛋白质。这样获得的CTB蛋白质可以用作疫苗，或用于生产针对所述肽的抗体，所述抗体能用于被动免疫。
可以使用典型的硫酸铵沉淀、离子交换和亲和层析技术(如WO01/27144中概述的)从培养物滤液中纯化由在此描述的表达系统生产的CTB。使用GM-1 ELISA、比色蛋白质化验(A280，Lowry，Bradford，BCA)、Western印迹和单放射免疫扩散(SRI)和Mancini测验(如实施例中描述的)来表征CTB。优选的，纯化的材料基本上没有污染物，是至少50％的纯度；更优选的，至少90％的纯度，和更优选的至少99％的纯度。可以通过层析、凝胶电泳、免疫测定、组成分析、生物测定、和本领域已知的其他方法评估纯度。
分离的CTB可由在此描述的方法获得的分离的稳定表达的CTB基本上没有抗生素残留物，因为该表达系统不表达抗生素抗性标记，因而在该表达系统中使用抗生素添加物是不必要的。
在一个实施方式中，霍乱弧菌宿主细胞表达至少一个异源抗原。
在另一个实施方式中，霍乱弧菌宿主细胞表达多个不同的抗原，从而Vibrio choleae宿主细胞是多价的。
实施例下面通过实施例对本发明进行描述，其中参照附图对具体实施方式
进行描述。在说明书中任何地方使用这样的实例仅是说明性的，不作为限制本发明的范围和含义，或任何例示的术语的范围和含义。
附图的简要说明附图1显示了pUC19中1.4kb EcoRI/HindIII片段的克隆；附图2显示了将KanR抗性基因嵌段插入到pUC19中霍乱弧菌thyA基因的PstI位点；附图3显示了用于产生具有XbaI末端的thyA-Kan片段的PCR引物；附图4显示了将thyA Kan片段插入到XbaI限制性pNQ 705中；附图5显示了消除卡那霉素基因编码区域的开始部分，和thyA基因的部分；附图6显示了将ΔthyA ΔKan片段插入到XbaI限制性pDM4中；附图7显示了在pUC19中大肠杆菌thyA基因的PCR扩增和亚克隆；附图8显示了pMT-thyA/cat的产生；附图9显示了将来自pML-LCTBλ2的eltb-ctxB编码片段插入到pMT-thyA/cat中；附图10显示了将tac启动子插入到pMT-thyA/cat(ctxB)中，和pMT-ctxB/thyA(cat)的产生；附图11显示了除去cat基因，产生pMT-ctxB/thyA；附图12显示了从pMT-ctxB/thyA除去多余的霍乱弧菌DNA的PCR反应、产生pMT-ctxBthyA-2；附图13是已经在Master Seed lot上进行测序的pMT-ctxBthyA-2的部分和一致性批次(lot/lots)的图示；附图14示出了表达质粒pMT-ctxBthyA-2的DNA序列；(204-295；大肠杆菌thyA编码区；1192-1876；Col E1复制起点；2339-2710eltB-ctxB编码区；2402-2710ctxB编码区；和2732-2759trpA终止子)。
表1某些CTB/LTB序列

表2某些前导区/信号序列

表3已知的CTB质粒和在此描述的CTB质粒之间的比较


实施例IA.原材料ctxB基因的来源是霍乱弧菌血清型O1菌株395(Ogawa)[2]。eltB信号序列从质粒pMMB68[3]获得。在[4]中描述了eltB和ctxB基因的连接。
复制起点是从pBlueScript KS(Stratagene)获得的ColE1。
pMT-ctxBthyA-2中使用的tac启动子来自质粒pKK223-3(Pharmacia)。
用于PCR扩增大肠杆菌thyA基因的DNA序列是大肠杆菌SY327[5]。
在染色体霍乱弧菌thyA基因座的灭活中使用的KanR抗性基因嵌段获自pUC4K(Pharmacia)。
用于霍乱弧菌thyA基因座定点诱变的自杀载体是pNQ705[6]，和[7]中描述的pDM4。
由SBL Vaccin AB测定了霍乱弧菌thyA基因的序列，在EMBL/Genebank以登记号No AJ006514公开。
A.1构建用于生产rCTB的霍乱弧菌Inaba菌株401典型生物型。
A.1.2.构建宿主菌株霍乱弧菌JS1569 ΔthyAΔKan。
霍乱弧菌菌株JS1569 ΔthyAΔkan是典型的O1利福平抗性霍乱菌株，最初来源于霍乱弧菌菌株569B；ATCC No 25870。已经通过定点诱变缺失了两个拷贝的霍乱肠毒素基因。减毒包括缺失霍乱毒素A亚基基因。[9]。thyA基因的缺失和插入钝化如下所述。
A.1.3.霍乱弧菌JS1569中thyA基因的钝化。
在从JS1569[Carlin等，Genebank登记号no AJ006514)分离和测序thyA基因的过程中，将包括完整thyA基因的EcoRI-HindIII片段以1.4kb的DNA片段克隆到载体pUC19中。这个质粒称为thyA 1.4(附图1)。
A.1.4通过插入KanR基因嵌段钝化thyA基因。
用PstI裂解质粒pthyA1.4，与来自pUC4K(Pharmacia Biotech)的KanR基因嵌段的PstI片段连接。将连接混合物电穿孔大肠杆菌HB101，通过涂布到含有氨苄青霉素和卡那霉素的Syncase琼脂平板上选择转化体。这个质粒称为pthyA Kan。(附图2)。
使用产生高序列精确度的PCR片段的Taq和Pwo DNA聚合酶的混合物(ExpandTMHigh fidelity PCR系统，Boehringer Mannheim)从pthyA Kan PCR扩增thyA KanR基因。使用的引物是thyA-10 GCT CTA GAG CCT TAG AAG GCG TGG TTC(SEQ ID NO7)和thyA-11GCT CTA GAG CTA CGG TCT TGA TTT ACG GTA T(SEQ ID NO8)，产生具有XbaI末端的PCR片段(附图3)。
用XbaI消化这个片段，连接到已经如上指出的用XbaI消化并脱去磷酸的载体pMAL-C2中。通过限制性内切酶分析确认片段大小和方向。
A.1.5通过定点诱变在霍乱弧菌染色体中进行thyA基因的插入钝化。
自杀载体pNQ705[6](附图4)含有R6K复制起点，因而只能在携带pir基因的宿主中维持。它还含有mobRP4基因和CAT基因，允许氯霉素选择。
从pMAL-C2切下thyA KanR基因XbaI片段，与XbaI消化的pNQ705相连(附图4).将连接混合物电穿孔大肠杆菌SY327[Δ(lacpro)argE(Am)rif malA recA56]，在含有氯霉素的平皿上选择转化体。用限制性内切酶分析重划线的单个菌落，分析插入物的存在和方向。
通过电穿孔将产生的质粒pNQ705thyA KanR转化大肠杆菌S17-1(thi pro hsdR hsdM+recA RP4-2-Tc∷Mu-Km∷Tn7)。
JS1569 thyA-(thyA基因[10]在携带单个点突变的JS1569的三甲氧基二氨嘧啶(三甲氧基二氨嘧啶)抗性变体和大肠杆菌S17-1(pNQ705 thyA KanR)之间的接合在37℃在补充有利福平(50μg/ml)、胸腺嘧啶(200μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂单作为划线接合进行。将由接合产生的单个菌落转移到上述具有利福平、胸腺嘧啶和卡那霉素补充物的液体LB肉汤，在这个培养基中传代三天。
此时通过PCR检测连接合子以确定测试转化连接体，测试thyAKanR基因的插入。
将具有预期PCR片段的培养物挑到如上补充了的LB琼脂上。
现在挑出单个菌落测试对氯霉素的敏感性(25μg/ml)和对卡那霉素的抗性。将这些菌落重划线，冷冻单个菌落。在表型上，这个菌株的生长是胸腺嘧啶依赖性的。
A.1.6.KanR基因的插入钝化和thyA基因的缺失。
设计实验用截短的非功能形式替换功能性KanR基因，并除去thyA基因的实质部分，以进一步保证这个菌株中胸腺嘧啶依赖性的稳定性。对于这个实验，将具有XbaI末端的thyA Kan片段亚克隆入XbaI消化的pNEB193(New England Biolabs)。设计两个PCR引物thyA-14和thyA-15，其都包括XhoI可裂解末端。设计引物以消除thyA基因中的209个碱基对，并消除KanR基因中的144个碱基对(总共266bp来自KanR基因嵌段)。在KanR基因中的缺失包括KanR基因前48个氨基酸，这将产生成功的转接合子Kans。用XhoI裂解产生的PCR片段，并容许自连，转化大肠杆菌，在含有氨苄青霉素的琼脂上选择转化体。测试菌落的卡那霉素敏感性，用限制性内切酶分析证实所述缺失。
从这个质粒切除产生的ΔthyA ΔKan片段，作为XbaI片段。将这个片段插入到已经用XbaI消化的自杀载体pDM4中。pDM4起源于pNQ705，其是通过替换多克隆位点并插入来自枯草芽孢杆菌的SacB基因所得。SacB基因编码对革兰氏阴性细菌致命的levansucrase基因。将连接混合物转化大肠杆菌SY327，通过氯霉素选择转化体。通过限制性内切酶分析确认插入物的大小和方向。对于接合实验，将质粒pDM4 ΔthyAΔKan转化大肠杆菌S-17。在含有利福平、氯霉素和胸腺嘧啶的LB平皿上，在大肠杆菌S-17(pDM4 ΔthyA ΔKan)和JS1569 ΔthyA Kan之间进行接合。转接合子进一步在含利福平、氯霉素和胸腺嘧啶的LB肉汤中生长。在这个培养基中传代三天后，将菌落涂布到含有胸腺嘧啶和5％蔗糖的的LB平皿上。在这些平皿上出现的菌落通过在有和没有胸腺嘧啶、含有氯霉素的胸腺嘧啶平皿和含有卡那霉素的平皿上影印培养来测试生长情况。选出需要胸腺嘧啶的氯霉素和卡那霉素敏感性菌落，用合适的引物利用PCR中进行测试，测试ΔthyA ΔKan插入物对thyA KanR基因嵌段的置换。这个菌株的单个菌落进行重划线。对于这些菌落，进行基因型的再次确认(利福平抗性、ctxA基因座的缺失、胸腺嘧啶依赖性、氯霉素和卡那霉素敏感性)，将菌株称为JS1569 ΔthyA ΔKan。
进一步的表征包括在这个菌株中进行PCR扩增和对修饰的染色体thyA基因座的部分测序。发现，在用于第一接合实验的三甲氧基二氨嘧啶抗性thyA-菌株中的点突变已经变成野生型，即，这个菌株的胸腺嘧啶依赖性是由更下游thyA基因的缺失所引起。DNA测序也证实了thyA和Kan基因嵌段的缺失(数据未显示)。
B.表达质粒pMT-ctxBthyA-2B.1.1.大肠杆菌thyA基因的克隆。
为了克隆大肠杆菌thyA基因的克隆，使用公开的序列(Genebank登记号no J01709)来设计PCR引物MLthyA-16′GGG GGC TCG AGG TTT GTT CCT GAT TGG TTA CGG3′(SEQ ID NO9)粗体字母显示来自公开的序列的序列(有义链上碱基16-39)，斜体字母显示添加到该序列的XhoI位点。
MLthyA-25′GGG GGG TCG ACG TTT CTA TTT CTT CGG CGC ATC TTC3′(SEQ ID NO10)粗体字母显示来自公开的序列的序列(非有义链上碱基1152-1128)，斜体字母显示添加到该序列的SalI位点。
这些引物用于从大肠杆菌SY327扩增thyA基因。
产生的PCR片段用T4聚合酶进行钝末端修复，克隆到pBluescriptKS(Stratagene)中的EcoRV位点。将连接的质粒转化大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)。在补充有氨苄青霉素的LB平皿上，在存在X-Gal和IPTG的情况下根据蓝色/白色菌落选择转化体。通过限制性内切酶裂解确认插入的片段大小和方向。通过将重组质粒电穿孔入JS1569thyA-、选择氨苄青霉素抗性、在不含胸腺嘧啶的改良syncase培养基上生长，来确认thyA基因功能。这个质粒称为pML-thyA(XS)。
B.1.2.携带大肠杆菌thyA基因的克隆载体的产生。
为了克隆大肠杆菌基因，使用载体pML-X1(附图8)。这个质粒的来源是pBC SK-(Stratagene)。在pML-X1中，复制起点(ColE1)的侧翼是独特的BglII和StuI位点，它也携带来自pBC SK-的氯霉素(cat)基因(附图8)。用AgeI/StuI限制性内切酶消化pML-X1 DNA，用T4聚合酶修复钝末端。
用BamHI/SalI消化pML-thyA(XS)载体，也进行钝末端修复(附图8)。混合两个DNA制备物，并进行连接。将连接混合物电穿孔入JS15694.4(在其thyA基因中带有单个点突变的JS1569三甲氧基二氨嘧啶抗性变体)，利用胸腺嘧啶依赖性和氯霉素抗性进行选择。产生的质粒pMT-thyA/cat进行重划线，进行扩展的(extansive)限制性内切酶分析来证实它的不同成分的大小和方向(附图8)。
B.1.3.ctxB插入到pMT-thyA/cat中为了将期望的ctxB基因插入到pMT-thyA/cat质粒中，从质粒pML-LCTBλ2获得1.2kb EcoRl/XhoI片段。早先已经描述了质粒pML-LCTBλ2[4]，简要地说，从质粒pCVD30[2]分离ctxB基因。在pCVD30质粒[2]中含有的ctxB基因来源于霍乱弧菌血清型O1菌株395(Ogawa)。
pML-LCTBλ2中的ctxB基因利用天然的SacI位点上游融合到来自大肠杆菌的热不稳定肠毒素的eltB信号肽(附图9)。这也导入了丙氨酸作为N-末端氨基酸，而不是天然的苏氨酸。N-末端序列和信号肽的这个修饰导致了与早先使用的pJS752-3相比，从这个新的rCTB表达载体仅产生单个N-末端序列(参见以下的C.2节)。在来自pML-LCTBλ2的EcoRI/XhoI片段上ctxB基因的下游设置了强力的trpA终止子，有效地终止m-RNA转录。将来自pML-LCTBλ2的EcoRI/XhoI片段连接到已经用相同的酶消化的pMT-thyA/cat质粒中(附图10)，产生质粒pMT-thyA/cat(ctxB)，其缺少eltb信号肽上游的启动子。
B.1.4.将tac启动子插入到pMT-thyA/cat(ctxB)中。
将tac启动子插入，作为最初从克隆载体pKK223-3(Pharmacia)获得的256碱基对的BamHI/EcoRI片段(附图11)。将来自这个反应的连接的DNA导入霍乱弧菌JS15694.4中，根据缺少胸腺嘧啶时的生长和对氯霉素的抗性选择菌落。
通过对重组质粒进行限制性内切酶分析和通过CTB的生产来筛选转化体。根据GM1-ELISA的判断选出具有最高rCTB生产力的单个菌落。该重组质粒称为pMTctxB/thyA(cat)。
B.1.5.cat基因的去除。
为了除去cat基因，即，为了获得没有任何抗生素选择标记的表达质粒，用限制性内切酶BamHI和BglII消化pMT-ctxB/thyA(cat)质粒。重新连接切下的质粒，再次电穿孔入霍乱弧菌菌株JS1569 4.4。根据缺少胸腺嘧啶时和缺少氯霉素时的生长挑选转化体。根据对氯霉素的敏感性筛选单个菌落并在Wizard Miniprepps中检查质粒的存在。用限制性内切酶分析质粒。对来自这个菌落的培养物上清液进行GM1 ELISA。产生的质粒是pMT-ctxB/thyA(附图12)。
B.1.6.从pMT-ctxB/thyA除去多余的霍乱弧菌DNA，产生pMT-ctxB/thyA-2。
来自pML-LCTBλ2的EcoRI/XhoI片段包括大约1200个碱基对，在其中仅约400个碱基对编码ctxB基因。在与ctxB相反方向上的阅读框中存在一个开放阅读框，可能编码pyrF操纵子中的orfF蛋白质。这个序列是不完整的，因而可能不表达。为了除去不编码CTB的部分，设计PCR引物，设计第一个引物以包括ctxB基因的末端(以下的斜体)和SpeI位点(以下的粗体)。设计另一个引物包括trpA终止子(以下的斜体)和SpeI位点(以下的粗体)。
CTB3′5′GGG GGA CTA GTT TAA TTT GCC ATA CTA ATT GCG GCA ATC G3′(SEQ ID NO11)TrpA term5′GGG GGA CTA GTC AAT TGA AGC TTA AGC CCG CCT AAT GAG CG3(SEQ ID NO12)pMT-ctxB/thyA质粒充当PCR反应的模板。获得正确大小的PCR片段之后，进行凝胶纯化，并用SpeI消化。容许该质粒自连和电穿孔入霍乱弧菌菌株JS1569 4.4。根据不含胸腺嘧啶时的生长选择转化体，分离单个菌落，进行重划线，通过限制性内切酶分析来分析来自这个培养物的质粒DNA。除去了包括完整orfF编码序列的大约800碱基对的DNA。GM1 ELISA显示了这对CTB的表达没有影响。
产生的质粒称为pMT-ctxBthyA-2，是用于与宿主菌株霍乱弧菌JS1569 ΔthyΔkan共同使用以形成rCTB生产菌株霍乱弧菌菌株401的最终的构建体。
B.1.7.pMT-ctxBthyA-2插入到霍乱弧菌JS1569 ΔthyAΔkan中。
将来自霍乱弧菌JS1569 4.4中的pMT-ctxBthyA-2的质粒制备物电穿孔入霍乱弧菌JS1569 ΔthyΔAkan，从而形成菌株霍乱弧菌Inaba菌株401典型生物型。根据它们在不含胸腺嘧啶时的生长挑选转化体。使用同时特异于CTB和LTB(大肠杆菌热不稳定肠毒素)的单克隆抗体菌落转移到硝化纤维素滤膜上进行(如下所述的SBL测试方法PT00020)的单个菌株rCTB生产能力的测试。将菌落重划线获得单个菌落，来自这些菌落的和用于质粒分析和扩大的限制性分析，并最后进行冷冻。
SBL测试方法PT00020这是用于区分能生产rCTB的rCTB生产菌株菌落和丧失了这种能力的菌落的方法。该方法包括，使待测试的菌落来琼脂平板上生长，将菌落转移到硝化纤维素滤膜上。将这个滤膜与特异于五聚rCTB的单克隆抗体孵化，洗涤，然后与抗小鼠IgG碱性磷酸酶共轭物孵化。洗涤之后，对滤膜进行沉淀染色，rCTB菌落呈蓝黑色，而非生产菌落基本上无色。
C.对携带pMT-ctxBthyA-2表达载体的霍乱弧菌JS1569 ΔthyA Δkan菌株菌株霍乱弧菌401的说明C.1.ctxB基因的核苷酸序列和翻译的多肽的氨基酸序列。
C1.1.ctxB基因和侧翼区域的详细核苷酸序列。
使用CsCl梯度超速离心纯化质粒DNA并测序。质粒pMT-ctxBthyA-2的完整核苷酸序列在附图14中给出。在产生种子批次前的阶段已经测序了质粒的95％(待完成)。在Master Working Seed批次中，已经测序了来自Master Seed lot Bank的两个不同试管的ctxB基因(如附图13所示)。也已经测序了来自三个一致的批次的生产细胞的末端。从Master Seed批次以及一致的批次获得的序列显示了100％的同一性。
C.2.成熟重组蛋白质的氨基末端序列。
在附图15中将由菌株霍乱弧菌401生产的rCTB的氨基酸序列与天然CTB和来自大肠杆菌的天然LTB毒素的氨基酸序列进行比较。在附图15中可见，LTB和rCTB 401的信号肽的氨基酸序列是相同的，成熟蛋白质的N-末端氨基酸也是一样。天然CTB(典型生物型)和rCTB 401的比较显示了唯一的差异是N-末端氨基酸(天然CTB中是苏氨酸，rCTB 401中是丙氨酸)。这个修饰从先前rCTB 213分子的经验[9]得以证明，其也具有与ctxB序列相连的eltB信号序列。由于当时可用的DNA重组技术方法，在这个rCTB 213分子的序列连接区域中还包括四个其他的氨基酸[9]。
发酵规模的生产中使用rCTB 213的经验表明，可以分离出多达六种带有不同氨基末端的rCTB。
了解了这个知识后，设计rCTB 401的连接，从而在连接区域的额外氨基酸被除去，并且替换N-末端氨基酸使之与天然LTB的相同，即，丙氨酸。
这个修饰本身证明是有益的。在所有实验中和与发酵时间和条件无关的一致性rCTB 401批次中分离的rCTB 401中仅有一个N-末端。
C.3.表达方式。
带有ctxB基因的pMT-ctxBthyA-2质粒不含有强阻遏物的基因(lacIq)。在霍乱弧菌中，不知道基因组中是否存在阻遏物(lacI)。霍乱弧菌不发酵乳糖，但具有lacZ基因[12]。合理的假定是，可能有的阻遏物将不会象lacIq一样强力，并且它可能以比高拷贝数质粒上的启动子(tacP)小得多的数量存在。结果，agctb的表达实际上是组成型的。
D.表达系统的稳定性。
D.1.保存稳定性霍乱弧菌菌株401的Master和Working Seed批次已经在-65℃或更冷的温度分别保存了不到一年。在保存6个月后证明了Master和Working Seed批次的遗传稳定性，因为当进行生长以产生一致性批次的产物时，100％的菌落都产生rCTB。
使用rCTB生产菌株霍乱弧菌213的Seed批次系统的先前的经验显示，该菌株的稳定性是极好的，超过7年。将Mster和Working Seed批次包括在一个每5年进行测试的稳定性测试计划中。
D.2.延长的培养时间的稳定性在设计以研究质粒保留和rCTB生产的稳定性的实验中，霍乱孤菌菌株401在37℃Modified Syncase肉汤中在摇床上进行生长。每天将培养物在新鲜培养基中稀释10.000倍。这样进行11天。在第7和11天，将培养物涂布在Modified Syncase琼脂上，使用特异于LTB并与CTB交叉反应的单克隆抗体进行菌落印迹技术[如下所述的SBLVaccin测试方法PT00020]测试菌落生产rCTB的能力。在超过100次传代(11天的生长)后，100％的菌落保持了它们生产rCTB的能力。
SBL测试方法PT00020如上所指出(参见例如B.1.7节)，PT00020是用于区分能生产rCTB的rCTB生产菌株菌落和丧失了这种能力的菌落的方法。该方法包括，使待测试的菌落来琼脂平板上生长，将菌落转移到硝化纤维素滤膜上。将这个滤膜与特异于五聚rCTB的单克隆抗体孵化，洗涤，然后与抗鼠IgG碱性磷酸酶共轭物孵化。洗涤之后，对滤膜进行沉淀染色，rCTB菌落呈蓝黑色，而非生产菌落基本上无色。
D.3.生产稳定性霍乱弧菌菌株401的生产规模是500升。除了使用葡萄糖代替蔗糖外，培养基与以上使用的修饰的syncase培养基相同。为了研究质粒保留并显示一致性，从三个连续的500升生产发酵物中在停止点(breakpoint)采取样品。在37℃生长约18小时后，在主要的500升发酵罐中100％的细胞保持了它们生产rCTB的能力。
D.4.在生产发酵期间遗传构建体的稳定性。
为了显示遗传构建体的稳定性，从霍乱弧菌菌株401的停止点收获物制备DNA。通过CsCl纯化质粒DNA并测序，如附图13所列。共有序列中第一个碱基相应于pMT-ctxBthyA-2DNA中的碱基No2210，最后一个碱基相应于pMT-ctxBthyA-2中的碱基220。测序的区域包括tac启动子之前的区域、完整的eltB-ctxB和thyA基因编码区域内的末端18个碱基。从生产发酵期间采取的样品测定的序列显示了与从种子批次获得的相同的tac启动子、eltb-ctxB基因和侧翼DNA的DNA序列，从而证明了构建体的稳定性。
比较实施例I“401”菌株对“213”菌株213生产系统在现有技术的213霍乱弧菌表达系统中生产的rCTB成分概括如下用含有处在异源启动子控制下的CTB的基因序列的质粒(称为pJS752-3)转染缺失了ctxA的霍乱弧菌O1(JS1569)，其中CTB编码序列与编码异源前导区多肽的序列(大肠杆菌LT前导序列)连接，以促进宿主细胞分泌CTB。通过切下质粒JS162中的CTB基因并将该基因插入质粒载体PKK223-1中来制备pJS752-3质粒，质粒载体PKK223-1含有tacP启动子，但不含有决定IPTG依赖性的、PJS162中存在的lacIq基因(关于制备和使用这些质粒的方法的更多细节，在Sanchez和Holmgren(1989)如上和美国专利Nos 5268276、58234246和6043057和EP专利No 0368819B中提供和描述了)。
pJS752-3质粒进一步包含抗生素选择性标记(氨苄青霉素抗性标记)，以允许选择含有CTB序列的适合的质粒。具有表达载体(pJS752-3)的霍乱弧菌生产菌株(JS1569)是霍乱弧菌213菌株。
从213生产菌株以单体形式过量表达和分泌CTB，此后它装配成特征化的五体环状结构，提供具有约58kDa分子量的rCTB。这样，rCTB仅由霍乱肠毒素的无毒部分组成(因为有毒的A亚基已经从生产菌株遗传性地缺失)，但维持了结合肠上皮细胞表明的GM-1受体的能力(对于这个表达系统的细节，参见美国专利Nos 5268276、58234246和6043057，EP专利No 0368819和Sanchez等(1989)(ibid))。
“401”表达系统如在此所述的，已经产生了缺乏thyA基因功能的JS 1569霍乱弧菌生产菌株的衍生物(例如，thyA基因可以除去或遗传性地失效)。在表达质粒中提供功能性的thyA基因，这允许选择保持了该质粒的霍乱弧菌宿主细胞，其在缺少胸腺嘧啶时不能生长(如WO 99/61634中所述)。如在此所述的具有表达载体(pMT-CtxBthyA-2)的衍生的霍乱弧菌生产菌株(JS1569 ΔthyΔkan)是产生CTB的401霍乱弧菌菌株。
表4三次连续发酵中rCTB-401和rCTB-213的产量比较

表4中的数据显示，在发酵周期的结尾，缺失thyA的霍乱弧菌菌株(称为“401”菌株)的rCTB平均产量约1.4mg/ml，在“213”菌株的rCTB产量(0.4mg/ml)的3-4倍的范围内。
用于测定rCTB浓度的方法是单放射免疫扩散法(SRI)，也称为Mancini测试(Mancini等(1965)Immunochem 2235-254Immunochemical quantitation of antigen by single radialimmunodiffusion)，使用了针对高度纯化的rCTB的抗血清。用于制备标准曲线的rCTB标准是已经由许多蛋白质测试表征的高度纯化的rCTB。
这个产量(1.4mg/ml)是报道的野生型霍乱弧菌569B菌株的约50倍，是Sanchez和Holmgren(1989)所报道的约20倍。
讨论比较实施例I现有技术“213”生产系统和“401”系统中使用的表达质粒之间的主要区别在表3中列出。“401”菌株相对于“213”菌株，这些区别包括没有抗生素抗性标记，较小的质粒大小和较高的rCTB产量。
不希望受理论的限制，据信，除去ctxB基因下游的一部分非编码霍乱弧菌DNA产生了减小的表达载体大小，有助于改善稳定性和改善CTB终产物产量。对改善质粒稳定性举例来说，含有表达盒的质粒在甚至没有抗生素选择时100次传代后的培养物中仍然在100％的细菌细胞中存在。在“401”菌株中抗生素抗性标记的缺少，就安全性和更廉价的CTB终产物而言，也具有优点。生产的rCTB也是有优点的，因为产生了更为均质化的CTB产物。在这方面，当生产菌株是401菌株时，仅产生一种rCTB，这种rCTB序列不同于野生型CTB序列仅在于单个N-末端突变(苏氨酸(Thr)替换成丙氨酸(Ala))。相反，当产生菌株是213菌株时，最终的rCTB产物实际上含有稍有不同的rCTB氨基酸序列(参见Sanchez和Holmgren 1989(如上))，在CTB序列的N-末端残基中发生了至少两种不同的突变。
比较实施例II使用358菌株(Lebens)和401表达系统生产的CTB水平Lebens等(1993)(如上)的生产系统和“401”系统中使用的表达质粒之间的主要区别在表3中列出。
这些区别包括缺少抗生素抗性标记和更小的质粒大小。
Lebens等(1993)中描述的CTB表达系统只要使有机体生长就需要抗生素的存在。抗生素抗性标记是氨苄青霉素抗性标记。氨苄青霉素抗性是由于表达了裂解抗生素的酶，β-内酰胺酶。在Lebens表达系统中使用的称为“358”菌株的霍乱弧菌菌株需要培养基中持续存在氨苄青霉素来维持最佳产量。因而，使用Lebens表达系统获得的CTB产量仅在使用“选择压力和存在氨苄青霉素时”才获得。
使用WO 01/27144中公开的表达系统和“401”表达系统生产的CTB水平细菌中重组CTB的生产表达质粒MS-0(参见WO 01/27144的附图2)被用于表达rCTB和其变体。含有rCTB基因的MS-0称为pML-CTBtacl。质粒pML-CTBtacl令人惊讶地产生了多达比较质粒(Sanchez和Holmgren1989，如上，中公开的载体pJS162)所产生的五倍的产物。通过将CTB基因组区域的一部分和完整的CTB编码区域克隆入质粒MS-0，产生3.66Kb的表达质粒，构建了pML-CTBtacl。在克隆期间多聚接头中的PvuII位点被破坏。该质粒含有来自pKK223的tac启动子，EcoRI-BamHI多聚接头片段，可以在Genbank登记号No M77749找到。
编码的蛋白质与来自霍乱弧菌菌株569B(SEQ ID NO2)的序列相同。信号序列(SEQ ID NO3)也来自CTB霍乱弧菌典型菌株569BCTB基因。霍乱弧菌菌株569BCTB基因的完整核苷酸序列在WO01/27144的附图1(SEQ ID NO1)中示出。LTB的信号序列(SEQ IDNO13)是MNKVKCYVLFTALLSSLCAYG，也在WO 01/27144的序列表中示出，可用于产生LTB的突变体或变体。
与401表达系统比较WO 01/27144中公开的CTB生产系统和“401”系统中使用的表达质粒之间的主要区别在表3中列出。这些区别包括没有抗生素抗性标记，较小的质粒大小和与WO 01/27144中公开的表达系统获得产量相比“401”菌株的更高的rCTB产量。
综述已知高水平的转录和蛋白质翻译取决于许多因素。这些因素包括但不限于启动子强度、翻译起始序列、密码子选择、mRNA的二级结构、转录终止、质粒拷贝数、质粒稳定性和宿主细胞的生理机能。因而，不同蛋白质的表达可能显著地变化，仅使用强启动子不能保证成功地过量表达所需的蛋白质。
本发明公开了如何改善CTB产量，使用具有抗生素抗性标记以外的标记和合适的宿主细胞菌株的CTB生产系统，消除了对抗生素选择的需要。该CTB生产系统包含缺乏thyA基因功能的细菌宿主细胞，所述宿主细胞与新的表达载体一同使用来产生相对于用已知的细菌宿主细胞生产系统获得的产量出乎意料地高的重组霍乱毒素B亚基(rCTB)产量。
在一个实施方式中，本发明教导了如何使用一种CTB生产系统来改善CTB产量，所述CTB生产系统包含缺乏thyA基因功能的霍乱弧菌宿主细胞，所述宿主细胞与新的表达载体一同使用来产生相对于用已知的霍乱弧菌生产系统获得的产量出乎意料地高的重组霍乱毒素B亚基(rCTB)产量。
构建质粒表达载体，在其中大肠杆菌的胸苷酸合成酶(thyA)基因被用作选择和维持含CTB基因的质粒的手段。相对于用于生产CTB的已知表达质粒，该质粒具有减小了的大小，因为CTB基因下游的基本上所有的非编码霍乱弧菌DNA都被除去了。
使用这种表达系统获得的意外高的CTB产量表明了霍乱弧菌菌株中异源基因的表达效率和通过弥补thyA缺失而维持的质粒稳定性。
此外，发现该质粒是极其稳定的。即使在通过液体培养重复传代至100代以后，所有细胞都保持了质粒以及表达重组蛋白质的能力。
在此报道的表达系统是有益的，因为它便于用于以下用途的CTB的生产，包括但不限于针对霍乱和LT引起的大肠杆菌腹泻的口服疫苗中的保护性免疫原；用于下调/调整/脱敏/重定向(re-directing)免疫反应的免疫调节物或耐受性诱导试剂或免疫偏离(immune-deviating)试剂；用于改变、增强、定向、重定向、强化或启动抗原特异性或非特异性免疫应答的佐剂；刺激针对一种或多种独立抗原的免疫反应的载运体；和用来产生用于诊断或免疫诊断测试中的抗体(例如单克隆的或多克隆的抗体)的诊断试剂。
从CTB的纯化和标准化的角度这是特别有益的，因为可以使用缺乏thyA基因功能的稳定的细菌宿主细胞株来获得相对高的CTB产量的疫苗成分。
本发明还教导了如何获得稳定的、基本上没有抗生素残留物的CTB制品，产生用于人类使用的安全的产物。
本发明的精神和范围本发明不应被限定于在此描述的特定实施方式的范围中。实际上，除此处描述的之外本发明的各种修饰根据上述的说明书和附图对本领域技术人员是显而易见的。这样的修饰将处于本发明的范围之内。
进一步需理解的是，所有数值都是近似的，是为了说明而提供的。在本申请中引用的专利、专利申请、出版物、产品说明和方案，为了各种目的通过引用将其中公开的内容在此全部引入作为参考。如果存在不一致，当前公开的，包括定义，是优先的。
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序列表<110>SBL Vaccin AB<120>霍乱毒素B亚基的表达系统<130>110116401<160>13<170>Patentin version 3.1<210>1<211>2759<212>DNA<213>质粒pMT-ctxBthyA-2<400>1ctcgaggttt gttcctgatt ggttacggcg cgtttcgcat cattgttgag tttttccgcc 60agcccgacgc gcagtttacc ggtgcctggg tgcagtacat cagcatgggg caaattcttt120ccatcccgat gattgtcgcg ggtgtgatca tgatggtctg ggcatatcgt cgcagcccac180agcaacacgt ttcctgagga accatgaaac agtatttaga actgatgcaa aaagtgctcg240acgaaggcac acagaaaaac gaccgtaccg gaaccggaac gctttccatt tttggtcatc300agatgcgttt taacctgcaa gatggattcc ggctggtgac aactaaacgt tgccacctgc360gttccatcat ccatgaactg ctgtggtttc tgcagggcga cactaacatt gcttatctac420acgaaaacaa tgtcaccatc tgggacgaat gggccgatga aaacggcgac ctcgggccag480tgtatggtaa acagtggcgc gcctggccaa cgccagatgg tcgtcatatt gaccagatca540ctacggtact gaaccagctg aaaaacgacc cggattcgcg ccgcattatt gtttcagcgt600ggaacgtagg cgaactggat aaaatggcgc tggcaccgtg ccatgcattc ttccagttct660atgtggcaga cggcaaactc tcttgccagc tttatcagcg ctcctgtgac gtcttcctcg720
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<211>6<212>PRT<213>霍乱弧菌<400>3Thr Pro Gln Asn Ile Thr1 5<210>4<211>6<212>PRT<213>霍乱弧菌<400>4Ala Pro Gln Asn Ile Thr1 5<210>5<211>21<212>PRT<213>大肠杆菌<400>5Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser1 5 10 15Leu Cys Ala Tyr Gly20<210>6<211>28
<212>PRT<213>霍乱弧菌<400>6Met Asn Lys Val Lys Phe Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser1 5 10 15Leu Cys Ala His Gly Ala Pro Gly Tyr Ala His Gly20 25<210>7<211>27<212>DNA<213>霍乱弧菌<400>7gctctagagc cttagaaggc gtggttc 27<210>8<211>31<212>DNA<213>霍乱弧菌<400>8gctctagagc tacggtcttg atttacggta t31<210>9<211>33<212>DNA<213>大肠杆菌<400>9gggggctcga ggtttgttcc tgattggtta cgg 33
<210>10<211>36<212>DNA<213>大肠杆菌<400>10ggggggtcga cgtttctatt tcttcggcgc atcttc36<210>11<211>40<212>DNA<213>霍乱弧菌<400>11gggggactag tttaatttgc catactaatt gcggcaatcg40<210>12<211>41<212>DNA<213>霍乱弧菌<400>12gggggactag tcaattgaag cttaagcccg cctaatgagc g 41<210>13<211>21<212>PRT<213>大肠杆菌<400>13
Met Asn Lys Val Lys Cys Tyr Val Leu Phe Thr Ala Leu Leu Ser Ser1 5 10 15Leu Cys Ala Tyr Gly20
权利要求
1.用于生产霍乱毒素B亚基CTB的表达系统，其中所述表达系统包含(a)缺乏thyA基因功能的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)宿主细胞；和(b)包含功能性thyA基因和CTB基因、大小小于5kb的表达载体，所述CTB基因基本上不含作为CTB基因来源的宿主细胞天然基因组中紧邻CTB基因的5’和3’末端的侧翼序列。
2.根据权利要求1的表达系统，其中所述宿主细胞缺乏CTA基因的功能。
3.根据权利要求1或2的表达系统，其中所述表达载体大小约3kb。
4.根据权利要求1-3的任何一项的表达系统，其中所述表达载体包含大肠杆菌thyA基因。
5.根据权利要求1-4的任何一项的表达系统，其中所述表达载体具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-5的任何一项的表达系统，其中所述表达载体进一步包含编码异源蛋白质的至少一个另外的核苷酸序列。
7.根据权利要求6的表达系统，其中所述表达载体进一步包含编码热不稳定大肠杆菌肠毒素LT的无毒部分或形式的核苷酸序列，优选的所述LT的无毒部分是LTB的B亚基或其片段。
8.生产CTB的方法，其中所述方法包括用包含功能性thyA基因和CTB基因、大小小于5kb的表达载体转化缺乏thyA基因功能的霍乱弧菌宿主细胞，所述CTB基因基本上不含作为CTB基因来源的宿主细胞天然基因组中紧邻CTB基因的5’和3’末端的侧翼序列，和在允许CTB产生的条件下培养转化的霍乱弧菌宿主细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述方法进一步包括从所述宿主细胞分离和/或纯化所述CTB。
10.一种分离的核酸构建体，其包含thyA基因和CTB基因，所述CTB基因基本上不含作为CTB基因来源的宿主细胞天然基因组中紧邻CTB基因的5’和3’末端的侧翼序列，且所述核酸构建体的大小小于5kb。
11.根据权利要求10的核酸构建体，其中所述核酸构建体大小约3kb。
12.根据权利要求10或11的核酸构建体，其中所述核酸构建体是质粒。
13.根据权利要求12的核酸构建体，其中所述质粒是以附图13中限制性内切酶图谱为特征的pMT-ctxBthyA-2。
14.根据权利要求12的核酸构建体，其中所述质粒具有SEQ IDNO1的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供了用于获得改善的霍乱毒素B亚基(CTB)产量的表达系统，其中所述表达系统包括缺乏thyA基因功能的Vibrio cholerae宿主细胞；和包含功能性thyA基因和CTB基因的表达载体，所述CTB基因基本上不含作为CTB基因来源的宿主细胞天然基因组中紧邻CTB基因的5’和3’末端的侧翼序列。本发明还提供了生产CTB的方法，和在表达系统中用作表达载体的分离的核酸构建体。
文档编号C12N15/74GK1902316SQ200480039628
公开日2007年1月24日 申请日期2004年10月29日 优先权日2003年10月31日
发明者N·卡林, M·勒本斯 申请人:Sbl疫苗有限公司