具有n－末端游离硫羟基的新的重组蛋白的制作方法

专利名称：具有n－末端游离硫羟基的新的重组蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及可以通过重组方法生产并且可以进一步进行化学衍生的新的修饰蛋白。具体地，本发明涉及具有改变的生物化学、生理化学和药代动力学性质的促红细胞生成素缀合物化合物。
背景技术：
促红细胞生成素(EPO)是一种天然形成的糖蛋白，其功能是作为集落刺激因子并作为主要因子参与红细胞合成的调节。促红细胞生成素通过刺激骨髓中的前体细胞、促使它们分裂并分化成为成熟红细胞而起作用。这个过程在体内是严格控制的，这样红细胞在循环中的破坏或清除才能与新细胞的形成速度匹配。天然存在的EPO是在肾脏中产生的一种糖蛋白(Jacobs等人，Nature 313(6005)，806-810(1985))。这样，除了骨髓中的前体产生成红细胞低或不足的状况，任何肾功能损害或破坏的状况，如末期肾脏疾病，代表了红细胞生成素反应状况。
已经证明了多种细胞类型产生EPO，除了红细胞祖细胞外，很多细胞表达EPO受体，包括毛细血管内皮细胞和脑内细胞。星形细胞反应于缺氧而产生EPO(Masuda，S.et al.1994J Biol Chem 26919488-19493)，并且外源EPO能够保护附近的神经细胞免受动物模型中的缺血损伤(Sakanaka M.，et al.1998，Proc Natl Acad Sci USA 954635-4640)，因此，EPO可能在预防神经破坏或疾病和从神经破坏或疾病恢复中起作用。最近，发现红细胞生成素保护视网膜神经元免受急性缺血再灌注损伤(Junk，et al.2002，Proc.Nat.Acad.Sci.9910659-10664)并且增强从实验性脊髓损伤的神经恢复(Gorio et al.，2002，Proc.Nat.Acad.Sci.999450-9455)。影响神经系统中的神经元或胶质细胞的致病神经状况，可能是由于缺血、凋亡、坏死、氧化或自由基损伤和兴奋毒性(excitotoxicity)。神经病理包括，例如，脑和脊髓缺血、急性脑损伤、脊髓损伤、视网膜病和神经退化疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和ALS。因此，目前认为外源EPO对这些疾病的某些或全部具有保护或预防作用。
实际上，EPO证明了在多种细胞和组织类型中的内分泌(激素)、自分泌和旁分泌功能(对自身和邻近细胞类型的激活或刺激作用)(参见，Lappin，T.R.et al.，2002，Stem Cells 20485-492的综述)，所述细胞和组织类型包括心肌组织(Parsa，C.J.et al，2003，J Clin Invest.112(7)999-1007)和胃肠组织(Fatouros，M.S.，2003，Eur J Surgery 165(10)986-992)。因此，给予EPO的潜在治疗适应症已经大大超过了肾功能不全和贫血。
已经利用重组DNA技术来生产促红细胞生成素，其通过克隆EPO基因并在中国仓鼠卵巢细胞中表达(Lin，US 5618698)。重组生产的EPO已经作为一种治疗各种形式贫血的有效治疗剂供应，所述贫血包括与慢性肾衰竭、叠氮胸苷治疗的HIV感染患者以及骨髓抑制性化疗的癌症患者相关的贫血。EPO糖蛋白经肠胃外给药，其在含有人血清白蛋白(HSA)为载体的常规缓冲水溶液中作为静脉(IV)或者皮下(SC)注射剂。这种制剂以EPOGEN和PROCRIT为商品名在美国市场上销售。这些产品含1ml单剂无防腐剂或2ml多剂防腐管形瓶中的红细胞生成素。
尽管这些制剂被证明非常成功，某些缺陷也与该产品相关。目前，诸如促红细胞生成素的蛋白质治疗剂的生物活性周期受到短的血浆半衰期和对蛋白酶降解易感性的限制。诸如EPO这样的治疗性蛋白质的短半衰期，使得频繁给予成为必要。这对慢性状况的治疗是不利的，并可能导致病人依从性差，因此达不到最佳效果。因而进行了很大努力来增加EPO的血浆半衰期。
近年来，诸如聚乙二醇(PEG)的非抗原性水溶性聚合物被运用于对治疗和诊断有重大意义的多肽的共价修饰上。例如，PEG共价连接到诸如白介素(Knauf，M.J.等人，J.Biol.Chem.1988，263，15，064；Tsutsumi，Y.等人，J.Controlled Release 1995，33，447)、干扰素(Kita，Y.等人，Drug Des Delivery 1990，6，157)、过氧化氢酶(Abuchowski，A.等人，J.Biol Chem.1977，252，3，582)、超氧化物岐化酶(Beauchamp，C.O.等人，Anal Biochem.1983，131，25)以及腺苷脱氨酶(Chen，R.等人，Biochim，Biophys.Acta.1981，660，293)的治疗性多肽上，已经报道了延长它们的体内半衰期、和/或降低它们的免疫原性和抗原性。
衍生的聚乙二醇化合物以前就已公开(US5438040)。这种翻译后衍生的方法同样适用于EPO。例如，WO94/28024公开了一种具有促红细胞生成素活性的碳水化合物修饰的聚合物缀合物，其中PEG通过被氧化的碳水化合物连接。US 4904584公开了缺失了赖氨酸的多肽变体的聚环氧烷缀合物，包括EPO。WO 90/12874描述了单甲氧基-PEG-EPO(mPEG-EPO)的制备，其中EPO包含了一个由基因工程导入的半胱氨酸残基，特定PEG试剂被共价连接到它上面。其它PEG-EPO组合物在EP 605693、US 6,077,939、WO01/02017和EP539167中公开。
申请人的共同未决的申请USSN 09/431,861公开了用PEG修饰抗体和抗体片段，并且证明了PEG能够增加小鼠和灵长类动物中的循环半衰期。衍生化的PEG被用于修饰抗体c7E3的Fab片段。循环半衰期的增加与PEG的分子量成正比。随着PEG的分子量增加，化合物在体外抑制ADP诱导的血小板聚集的能力降低，而通过BIAcore测量的与纯化GPIIb/IIIa的结合不受影响。向PEG(PEG3.4K-DSPE[二硬脂酰磷脂酰乙醇胺])加入脂肪酸或脂质，产生了比PEG5K更长的循环半衰期。尽管c7E3 Fab’(PEG5K)相对于c7E3 Fab的体外活性降低，但c7E3Fab’(PEG3.4K-DSPE)2的活性与c7E3Fab相同。
申请人的另外一个共同未决的申请美国系列号60/377,946公开了修饰EPO的方法，其中EPO与非抗原性亲水聚合物共价缀合，所述聚合物与有机分子连接，该有机分子使组合物的循环血清半衰期的增加比添加单独的亲水聚合物增加得多。所述方法包括使具有促红细胞生成活性的蛋白或糖蛋白与具有用于将聚合物连接于糖蛋白的连接基团的基本非抗原性的官能化的亲水聚合物反应的步骤。制备方法包括使EPO与激活形式的聚环氧烷反应，激活形式的聚环氧烷将与EPO上的官能团反应。这包括激活的聚环氧烷，如活性酯、酰肼、肼、氨基脲、氨基硫脲马来酰亚胺或卤代乙酰基聚环氧烷。
许多用纯化学方法通过缀合到PEG上(“聚乙二醇化”)修饰蛋白质的方法都经常有一个受限制的方面，那就是与存在于可接近的赖氨酸残基上和/或蛋白质的N端胺上的氨基无差别和不完全的反应。其它的化学方法要求碳水化合物基团的氧化作为修饰策略的一部分，这同样会导致不完全或不连续反应以及不明确的产物组成。这样，考虑目前所拥有的选择，一种在温和的、位点特异性方式下修饰诸如EPO的治疗性蛋白的方法是更有利的。
修饰或添加基序到天然存在的分子上将带来多种风险，这对那些正在进行目的是为治疗性蛋白质提供生产方法的基因工程技术实践的人员来说是公知的。这些效果中最明显的就是丧失或部分丧失生物活性。在其它情况下，构建的表达载体的表达水平对于生产细胞系低的无法接受。偶联或融合一种来自天然存在的蛋白质的异源序列的另一种方法的可能缺点是产生抗原表位并在患者体内引起不必要的免疫反应，这最终限制了治疗性蛋白质的长期功效。此外，利用攻击最具反应性的官能团赖氨酸的化学方法来修饰蛋白质也改变了蛋白质的等电点和pKa，这可能影响蛋白质的结构和活性。因此，当目的是提供安全并经济生产的产品时，明白这些限制是非常重要的。
已经证明了导入赖氨酸残基是在蛋白上导入用于定点修饰的独特位点的有效方法(Kuan，Chien Tsun et al.Journal of BiologicalChemistry 269，7610-7616(1994))。N末端半胱氨酸具有特别独特的生化特性。由于α-胺和侧链硫羟基紧密相邻，N末端半胱氨酸残基与酯部分反应，形成稳定的酰胺键(Tam，James P.et al.Biopolymers 51，311-332(2000))。这使得肽、蛋白和其它分子以高度选择和稳定的方式与蛋白的N末端缀合。半胱氨酸上的游离α-胺的存在使得局部pH更碱性，导致N末端硫羟基相对于内部胱氨酸上的硫羟基反应性更高。因此，另一个优点是可以在更低的pH下进行缀合反应，导致蛋白更加非特异性的衍生。将半胱氨酸的硫羟基转化为硫酯的进一步的优点是它不导致半胱氨酸等电点或电荷的改变。
但是，在分泌的蛋白中，半胱氨酸残基通常作为二硫化胱氨酸存在，并且导致蛋白三级结构的稳定化。添加额外的半胱氨酸残基导致了破坏蛋白的危险。例如，EPO含有4个参与二硫桥的半胱氨酸残基。因此，存在这样的可能性，即，在N末端导入第五个半胱氨酸残基可能会干扰正确的折叠并因此干扰受体识别。
当修饰分泌的蛋白时，在成熟N末端导入氨基酸提供了有趣的挑战，即，破坏信号序列切割位点。翻译了大量分泌的蛋白，其在N末端具有额外的区域，生物合成从此处开始(称作信号或前导序列)，该区将蛋白导向于内质网(ER)。信号序列共有某些特征他们通常具有大约20-25个氨基酸，在N末端是碱性的，在中部是高度疏水的，并且在信号肽酶对其进行切割的位点之前具有小的不带电残基。疏水区对于与ER受体复合物的相互作用是关键的，并且促进氧化环境中的翻译和折叠。在从膜分泌时，在蛋白的功能成熟N末端氨基酸酶促切割信号序列，所述氨基酸成为蛋白中仅有的游离α胺。保留了信号部分，在细胞中降解。这样，向将成为新的N末端氨基酸的前体蛋白序列添加氨基酸，需要在信号序列和正常的成熟N末端之间插入额外的残基，因此改变对切割和分泌效率具有未知影响的天然切割位点。人EPO前体多肽具有27个氨基酸的信号序列。一旦位于细胞的ER腔室中，在信号肽的甘氨酸27和成熟EPO链的丙氨酸28之间切割信号肽。
可以通过添加或改变核酸编码序列，用基因工程方法向蛋白加入氨基酸或改变氨基酸。因此，本领域技术人员将意识到采用标准技术，通过操作编码序列或cDNA制备新的治疗蛋白序列的可能性，所述治疗蛋白序列具有位于天然存在的N末端氨基酸残基N末端的半胱氨酸残基。为了增加工程化的蛋白的N末端是半胱氨酸的可能性，通常，内源信号序列必须被已知能有效将蛋白靶定于ER，并且产生合适的切割位点的序列代替。
例如，采用用于在酵母(US4775622和Elliott，S.et al.(1989)Gene79，167-180)和哺乳动物细胞(Kim，Chang H.et al.(1997)Gene199，293-301)中表达EPO的替代信号序列，已经将异源信号序列成功用于对蛋白的成熟N末端工程化。但是，还没有关于将异源信号序列用于分泌N末端工程化形式的治疗蛋白的报道。
发明概述本发明提供了一种具有生物活性的多肽缀合物(conjugate)的组合物，其中修饰了编码多肽的多核苷酸序列，以产生具有N末端半胱氨酸的缀合配偶体肽，并且所述配偶体共价和位点特异性地缀合到非抗原性亲水性聚合物上，所述聚合物也可以共价地连接到一个有机分子上，两种修饰都增加组合物的循环血清半衰期。
更具体地，本发明的一个实施方案涉及如下式所描述的EPO衍生物(M)n-X-A-cys-EPO(I)其中EPO是促红细胞生成素部分，选自促红细胞生成素或具有至少一个与野生型人EPO氨基酸不同的氨基酸的促红细胞生成素变体，或任何具有导致骨髓细胞对红细胞的生产增加的生物学性质的其药学可接受的衍生物；cys代表半胱氨酸，并且存在于相对于促红细胞生成素部分的氨基酸序列的-1位；A表示用于将X化学连接于-1Cys的硫羟基的残基部分的结构；X是水溶性聚合物，如聚亚烷基二醇或其它聚合物；M是增加构建体的循环半衰期的有机分子(包括肽和蛋白)；并且n是0到15的整数。A和X之间或X和M之间可以包括其它分子，以提供用于偶联或价的合适官能度。有机分子M是任选的。X优选是聚环氧烷，如聚乙二醇，并且也是任选的。
本发明也提供了治疗贫血或与内源促红细胞生成素或红细胞生成减少相关的其他状况或者期望增加红细胞的状况的方法。本发明的方法也包括使用本发明的组合物治疗不直接与红细胞生成缺陷相关，但可能与EPO的抗凋亡作用相关的状况，所述EPO的抗凋亡作用与维持或增强肌肉、粘膜组织、生殖腺功能和认知功能相关。本发明的方法进一步包括使用本发明的组合物预防、维持或治疗神经组织或其它组织的缺血、化学或机械损伤。在本发明的这一方面，治疗包括给予需要所述治疗的哺乳动物有效量的此处描述的缀合物。作为本发明的结果，提供了在体内具有充分延长的促红细胞生成素活性的缀合物和制备所述缀合物的方法。
这里所公开的技术的优点是通过含有N末端半胱氨酸残基并且EPO的半衰期增加的EPO变体的表达，获得了基本上确定的终产物组成。
附图简述

图1显示了基于166个氨基酸的人形式和有方框中的-1cys残基和粗体表示的信号序列的重新工程化的前体促红细胞生成素分子的氨基酸序列。
图2显示通过化学方法确定的纯化的cys-EPO和纯化的cys-EPO的N末端序列的染色的SDS PAGE分析，(N)表示占位符。
图3是显示比较cys-EPO与EPO的UT-7细胞增殖测定结果的照片。
图4显示各泳道中表示的样品的4-12％SDS-PAGE凝胶(1)分子量标记；(2)EPO+0mM MEA；(3)EPO+0mM MEA+马来酰亚胺-PEG；(4)EPO+15mM MEA；(5)EPO+15mM MEA+马来酰亚胺-PEG；(6)EPO+20mM MEA；(7)EPO+20mM MEA+马来酰亚胺-PEG；(8)EPO+25mM MEA；(9)EPO+25mM MEA+马来酰亚-PEG；(10)EPO标准。
图5显示各泳道中表示的样品的4-12％SDS-PAGE凝胶(1)分子量标记；(2)Cys-EPO+0mM MEA；(3)Cys-EPO+0mM MEA+马来酰亚胺-PEG；(4)Cys-EPO+15mM MEA；(5)Cys-EPO+15mMMEA+马来酰亚胺-PEG；(6)Cys-EPO+20mM MEA；(7)Cys-EPO+20mM MEA+马来酰亚胺-PEG；(8)Cys-EPO+25mM MEA；(9)Cys-EPO+25mM MEA+马来酰亚胺-PEG；(10)Cys-EPO标准。注意相应于与PEG缀合的Cys-EPO的条带由白色箭头示出。
图6是EPO、EPO+0mM MEA+马来酰亚胺-PEG和EPO+25mMMEA+马来酰亚胺-PEG的SELDI质谱。28,000附近的峰相应于未修饰的EPO。
图7是Cys-EPO、Cys-EPO+0mM MEA+马来酰亚胺-PEG和Cys-EPO+25mM MEA+马来酰亚胺-PEG的SELDI质谱。8,000附近的峰相应于未修饰的EPO，存在相应于加入5,960MW PEG的峰。
发明详述本发明的蛋白是治疗性蛋白的N-cys变体，并且具有使得能够实现特异和稳定的化学修饰的N末端游离硫羟基或“NTFI”。非常少的天然存在或重组制备的蛋白是以使得半胱氨酸残基是分子的成熟N末端的方式加工。本发明的方法采用异源信号序列“强制”在成熟的、天然存在的人蛋白或具有治疗价值的工程化蛋白的N末端出现添加的半胱氨酸。采用异源信号序列避免了需要的N末端半胱氨酸残基的不准确或错误加工的可能，这种情况在内源前导序列不能与所述改变相容时会发生。不良加工或不准确加工导致a)信号序列的不良切割效率，从而导致不良的表达速度，或b)N末端的不准确切割，这样或者根本不保留半胱氨酸，或者使其保留在+2、+3或+n位。在后一种情况下，蛋白的特异性和化学修饰的容易性将不如半胱氨酸位于成熟蛋白的+1位时理想。
早在1972年就针对免疫球蛋白注意到了包含靶定用于细胞外分泌的特定蛋白的加工或“信号”肽的前体蛋白，近年来，更详细研究了这些序列的亚结构和相关的加工步骤以及酶(概述可参见Dalbey，et al.(1997)Protein Sci.61129-1138)。
一种特别优选的信号序列是人生长激素前导序列(SEQ IDNO2)，但是，理论上，存在许多可以有效和准确产生需要的N末端的哺乳动物异源前导序列。产生成熟N末端半胱氨酸蛋白的包含信号肽的其它哺乳动物前体多肽是与干扰素α基因家族相关的那些。已经开发了in silico预测算法，如SigCleave，它是加权的矩阵法(EMBOSS)，和SigPfam，它是基于隐藏的Markov模型(HMM)，以便预测蛋白包含信号肽和最可能包含切割位点的概率。表1示出了来自人前体蛋白的多种信号序列和用SignalP第3版(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/；Bendtsen et al.J.Mol.Biol.，340783-795，2004)预测的与作为需要的成熟蛋白的N-Cys-EPO偶联时的切割位点。SignalP第3版从实验验证的切割位点的Swiss-Prot数据库提供了在真核蛋白上培养的神经网络(NN)并且提供了HMM。基于这些预测(表1)，表明预测天然的EPO前导序列不适于作为N-Cys-EPO的前导序列，而预测hGH前导序列和一些，但不是所有干扰素(IFN)蛋白信号肽产生具有N末端Cys的蛋白。
表1
多种哺乳动物表达载体已经成功地用于表达重组蛋白。通过本发明的方法生成的示例的组合物包含利用强病毒启动子、共有Kozak序列、编码感兴趣的蛋白的前体(hHG信号肽EPO)的DNA、六His标记、终止密码子和聚腺苷酸化信号的单一表达载体，所述聚腺苷酸化信号来源于例如SV40(猿猴病毒)聚腺苷酸化信号或牛生长激素聚腺苷酸化信号。
一旦构建了含有本发明的组合物的表达载体，就采用转染宿主细胞的常规方法表达新的蛋白。可以采用瞬时转染或稳定转染方法，并且可以采用能够加工哺乳动物信号序列的任何宿主细胞(优选哺乳动物细胞)。有用的宿主细胞系的例子是VERO和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、W138、293、BHK、COS-7和MDCK细胞系。从细胞培养物回收和纯化蛋白的方法是本领域技术人员公知的，包括添加用于所谓的纯化“标记”的氨基酸基序的编码区，所述“标记”如六组氨酸或FLAG。
当由原核生物表达时，通常含有N末端甲硫氨酸或甲酰基甲硫氨酸并且不糖基化的多肽就不是优选的。但是，本领域技术人员将意识到，本发明不限于使用前面所述的含有哺乳动物信号肽的载体和哺乳动物宿主细胞，特别是当目的不在于产生糖基化蛋白时。已经了解并且使用了用于表达和分泌蛋白的细菌系统。例如，已经将金黄色葡萄球菌核酸酶信号肽编码序列用于产生胰岛素原和芽孢杆菌的构建体，例如，参见EP0176320A1。多种分泌信号肽序列可以用于芽孢杆菌，并且进行操作，能够产生本发明的N末端半胱氨酸多肽。所述分泌编码序列包括，但不限于，解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶信号肽序列、蜡状芽孢杆菌的O-内酰胺酶I型信号肽序列、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶信号肽序列和解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶信号肽序列。上述分泌编码序列可以适当连接在载体的转录和翻译激活序列与编码功能性N末端半胱氨酸多肽的序列之间。
EPOEPO主要在肾脏中产生，其作用是通过结合到前体细胞上的受体二聚体而导致红细胞的分化以及随后的增殖(Livnah，O.等人.Science1999，283，987-990)。EPO通过两个结合面结合到受体上，其中一个结合受体的亲和力比另外一个强。EPO的晶体结构已经被分辨(Syed，等人.Nature 395(6701)，511-516(1998)；Cheetham，J.C.等人.Human Erythropoietin，NMR minimized average structure，1998年9月8日。蛋白质数据库ID 1BUY)。结合到其受体上的EPO的晶体结构也已经被描述(见Stroud，R.M.和Reid，S.W.，Erythropoietin complexed with extracellular domains of erythropoietinreceptor.蛋白质数据库ID1CN4)。
促红细胞生成素基因具有编码193个氨基酸的多肽原的5个外显子(SEQ ID NO1)。从多肽原的氨基末端切除27个氨基酸的前导序列，产生166个氨基酸的功能性多肽。但是，在中国仓鼠卵巢细胞中表达的重组人促红细胞生成素仅仅含有165个氨基酸，缺失了arg166。其机理是未确定的，并且不知道在血浆中循环的促红细胞生成素是否也缺乏arg166或进一步的C末端截短。促红细胞生成素的核苷酸和氨基酸序列在哺乳动物中都是高度保守的。
修饰成本发明的生物活性形式的EPO的原料优选是人促红细胞生成素(SEQ ID NO.1)或des-166Arg SEQ ID NO1，或已知具有生物活性的其它变体，或具有导致骨髓细胞对网织红细胞和红细胞的生产增加的生物学性质的其它衍生物。可从天然来源获得EPO糖蛋白或用在此引入作为参考的U.S.4,703,008；5,441,868；5,547,933；5,618,698和5,621,080中描述的程序重组产生。在野生型人EPO中，第24、38和83位的Asn残基代表三种天然存在的N-连接的糖基化位点。这三个位置的糖基化和一个O-连接的位点(Ser123)占天然和哺乳动物细胞培养物中产生的重组EPO的大约40重量％。已经制备了基因修饰的变体，其具有更多、更少或不同的糖基化位点。也可以将具有需要的生物学活性的非糖基化形式、低糖基化形式或高糖基化形式的促红细胞生成素用于本发明的组合物中。可以由原核生物产生非糖基化的蛋白，因此将对哺乳动物蛋白进行了密码子适应的核酸序列用于采用原核细胞，如大肠杆菌的表达系统中，导致了产生非糖基化蛋白产物的能力。所述方法教导于WO00/32772中。也描述了具有生物学活性的其它变体，它们具有通过将第24、38或83位的Asn中的任何一个进行氨基酸交换而产生的改变的糖基化模式(Yamaguchi，K.，et al.，1991，J.Biol.Chem.26620434-20439)。
制备高糖基化EPO的方法教导于WO0249673和EP640619。可以将其它N-连接的碳水化合物链加入rHuEPO分子。在哺乳动物细胞中，在用于添加碳水化合物的共有序列(Asn-X-Ser/Thr)将N-连接的碳水化合物连接于多肽主链，其中X是除Pro或Asp之外的氨基酸。该过程发生在细胞内质网中，并且是由膜结合的寡糖转移酶催化的。识别共有序列的知识是由基因工程师发现的，从而通过在要克隆的DNA的序列中制造需要的改变而将新的碳水化合物连接位点导入多肽主链中。当然，必须将共有序列加在与碳水化合物添加相容的位置，例如，不干扰受体结合或不损害分子的折叠、构象或稳定性的位置。促红细胞生成素类似物NSEP是通过将2个成功糖基化的4条链的类似物的碳水化合物添加位点合并到一个分子中而产生的。NESP的氨基酸序列与人促红细胞生成素的序列在5个位置上不同(Ala30Asn、His32Thr、Pro87Val、Trp88Asn和Pro90Thr)，使得其它寡核苷酸连接在第30和80位的天冬酰胺残基(Elliott et al，Blood 9682a(2000))。专利申请公开WO0181405中公开的高糖基化变体添加了三个额外的N-连接的糖基化位点30、53和88；30、55和114；或30、88和114。
US6583272和US6340742中也描述了糖基化改变的聚乙二醇化的EPO变体，其中添加的糖基化共有序列主要位于30、57、59、67、88、89、136和138位。
对蛋白重新工程化的方法采用本领域公知的一些方法中的任何一种，可以制备本发明的多肽变体或其功能性片段。定向于寡核苷酸的诱变是公知的用于系统性导入突变的有效过程，不依赖于它们的表型，因此适于蛋白工程化的定向进化方法。该方法是灵活的，允许导入精确的突变，不需要使用限制酶，并且是相对便宜的。重组和酶促合成，包括聚合酶链反应和其它扩增方法可以参见，例如Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Third Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(2001)和Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1999)。
可以实施采用定向于寡核苷酸的诱变合成的突变多肽的有效合成和表达方法，并且该方法是本领域公知的，描述于Adelman et al.，(1983)DNA，2183和Kunkel Proc Natl.Acad.Sci.USA，82488-492(1985)，在此引入作为参考。
同样，例如，可以用编码突变氨基酸的寡核苷酸，例如基于PCR的定点诱变(例如QuikChange TM，Stratagene)中使用的那些，产生单个或多个氨基酸突变。也可以用在此引入作为参考的Higuchi et al.，Nucleic，Acids Res.167351-7367(1988)中描述的技术实现编码野生型或母体蛋白的cDNA的定点诱变。概言之，该过程要求使用两组引物第一对引物位于要突变的蛋白的完整cDNA的侧翼，并且因此在PCR扩增时将产生cDNA的全长拷贝，第二对引物彼此互补，并且含有需要的突变。这些引物最初产生两组产物，一组具有在3’末端附近导入的突变，另一组具有在5’末端附近导入的突变。但是由于这两种产物彼此互补，并且与PCR引物互补，两组产物可以形成在两个方向延伸的重叠的双链体。这样，cDNA在两组引物存在下的PCR扩增，可以用于产生编码图1所示需要的构建体的全长cDNA(SEQ ID NO14)。
基因或基因片段的合成，或至少是无细胞制备方法也是本领域公知的。通过顺序退火寡核苷酸而和合成大核酸聚合物的方法可以参见，例如，Evans的PCT申请No.WO99/14318和美国专利No.6,521,427。用体外方法合成改变的基因或完整编码序列的方法以前已经用于人EPO例如，参见US159687和US6537746。体内引起突变以产生具有改变的性质的EPO的方法教导于EP0843725和US6444441。
可以用具有需要的生物学活性的蛋白的任意变异或突变形式实施本发明的将半胱氨酸添加在活性蛋白，如EPO或EPO变体多肽的N末端的方法。该方法可以在用真核细胞系统表达的糖蛋白，特别是EPO上实施，或者可以在未唾液酸化或未糖基化的蛋白或EPO上实施。
水溶性聚合物一种特别优选的水溶性聚合物是PEG几个种类中的一种。PEG包含一个基本的碳单元，HO-(CH2)2-OH，并通过以下名称以各种形式出售聚乙二醇(各种分子量)；PEG200；PEG(各种分子量)；聚环氧乙烷；Carbowax；α-氢-ω-羟基聚(氧-1，2-乙二醇)；乙氧基化的1，2-乙二醇；聚氧乙烯醚(Polyoxyethylene ether)；Emkapol 200；Gafanole 200；Pluriol e 200；Polydiol 200；Polyox WSR-301；Macrogol以及PolyoxyethleneIn。在本发明的使用了基于PEG的聚合物的方面，它们优选具有从大约200到大约100,000道尔顿的平均分子量，并优选从大约2,000到大约20,000道尔顿。2,000到12,000道尔顿的分子量是最优选的。
其它的水溶性聚合物质包括了诸如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、多糖、淀粉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或其它类似的非免疫原性聚合物的材料。本领域普通技术人员能够理解，前面所述的只不过是例证性的，并不打算限制在这里适用的非抗原聚合物的类型。
赋予延长的药代动力学体内半衰期的有机分子有机部分可以连接到亲水性聚合物上，以增加包括脂肪酸、二羧酸、二羧酸的单酯或单酰胺、含有饱和脂肪酸的脂质、含有不饱和脂肪酸的脂质、含有饱和与不饱和脂肪酸混合物的脂质、简单的碳水化合物、复杂的碳水化合物、碳环化合物(如类固醇)、杂环化合物(如生物碱)、氨基酸链、蛋白质、酶、酶辅因子或者维生素的半衰期。
在一个实施方案中，亲水性聚合物基团被1到大约6个烷基、脂肪酸、脂肪酸酯、脂质或磷脂基团取代(正如此处所述，例如式I)。优选地，被取代的亲水性聚合物基团是直链的或含支链的PEG。优选地，被取代的亲水性聚合物基团是被脂肪酸、脂肪酸酯、脂质或磷脂基团或者烃末端取代的直链PEG(如PEG二胺)。被烷基、脂肪酸、脂肪酸酯、脂质或磷脂基团取代的亲水性聚合物可以使用合适的方法来制备。例如，修饰剂可以用单保护的PEG二胺与活化的脂肪酸(例如棕榈酰氯)反应来制备。所得产物可以用来生产包含被脂肪酸基团取代的PEG的修饰EPO。许多其它合适的合成方案都可以使用。例如，含有胺的聚合物可以被偶联到此处所述的脂肪酸或脂肪酸酯，在脂肪酸或脂肪酸酯上的活化的羧酸酯(如用N，N′-羰基二咪唑活化的)可被偶联到聚合物的羟基上。这样，就可构建许多合适的具有所期望的性质的直链或含支链的多聚结构，并最终连接或修饰为含有可以作为转谷氨酰胺酶胺供体的伯胺。
适用于本发明的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的或者可以包含一个或多个不饱和单元。在一个优选的实施方案中，脂肪酸和脂肪酸酯包括大约6个到大约40个碳原子，或大约8个到大约40个碳原子。适合用来在本发明的方法中修饰EPO的脂肪酸包括，例如n-十二烷酸酯(C12，月桂酸酯)、n-十四烷酸酯(C14，豆蔻酸酯)、n-十六烷酸酯(C16，软脂酸酯)、n-十八烷酸酯(C18，硬脂酸酯)、n-二十烷酸酯(C20，花生酸酯)、n-二十二烷酸酯(C22，山萮酸酯)、n-三十烷酸酯(C30)、n-四十烷酸酯(C40)、顺-Δ9-十八碳烯酸酯(C18，油酸酯)、全顺式Δ5.8.11.14-二十烷酸酯(C20，花生四烯酸酯)、辛二酸、十四碳二烯酸、十八碳二烯酸，二十二碳二烯酸以及类似物。合适的脂肪酸酯包括含有直链或含支链低级烷基的二羧酸的单酯。低级烷基可以包括1到大约12个碳原子，优选1个到大约6个碳原子。用于修饰本发明蛋白质的合适的脂肪酸酯包括，例如十八烷酸甲酯、十八烷酸乙酯、十八烷酸丙酯、十二烷酸丁酯、十二烷酸仲丁酯、十二烷酸叔丁酯、十二烷酸新戊酯、十四烷酸己酯、顺-Δ9-十八碳烯酸甲酯以及类似物。
制备用于转移到N末端Cys多肽的底物包含连接于亲电试剂的两种或三种或更多成分的组合物可以作为本发明方法中合适的缀合底物。
底物的制备优选是逐步进行的，在最终的步骤中形成单个硫羟基反应化合物。由还原剂如DTT切割的二硫键和硫酯键，以及在还原条件下不可切割的硫酯键可以用于本发明的组合物中。
二硫桥的形成是采用含硫羟基的底物或活化的二硫化物，即，PEG-邻吡啶基-二硫化物实现的(C.Woghiren，B.Sharma，S.Stein，Protectedthiol-polyethylene glycola new activated polymer for reversible proteinmodification，Bioconjugate Chem 4(1993)314)。硫酯键通常是采用马来酰亚胺活化的底物或PEG-碘乙酰胺形成的。也已经证明了基于向PEG-乙烯砜双键添加硫羟基的相对新的试剂(M.Morpurgo，O.Schiavon，P.Caliceti，F.M.Veronese，Covalent modification ofmushroom tyrosinase with different amphiphic polymers forpharmaceutical and biocatalysis applications，Appl Biochem Biotechnol56(1996)59-72)。将有机分子缀合于聚合物的其它方法是公知的，包括使用与硫羟基反应的试剂，例如，丙烯酰、吡啶基二硫化物、5-硫羟基-2-硝基苯甲酸硫羟基(TNB-硫羟基)等。
反应基团可以直接键合到亲水性聚合物、缀合物复合物或者通过接头部分如C1-C12烃基。如这里所使用的，“烃基”是指烃链，其中一个或多个碳原子任选被诸如氧、氮或硫的杂原子取代。合适的接头部分包括，例如四甘醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-以及-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。
可以在将最终底物缀合到蛋白的N末端半胱氨酸之前，并且采用本领域公知的任何化学或酶促方法连接水溶性聚合物X和亲脂试剂M。这样，例如，如果用诸如包括甲苯磺酸酯、甲磺酰酯、卤素(氯、溴、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)、取代的苯基酯、酰卤等亲电基团的胺反应基团用于偶联水溶性聚合物和有机分子，伯胺在大多数情况下必须被保护。其它缀合有机分子到聚合物上的方法是公知的，包括使用能与硫羟基反应的试剂诸如马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-硫羟基-2-硝基苯甲酸硫羟基(TNB-硫羟基)以及类似物。醛或酮基官能团可以偶联到含有胺或酰肼的分子上，叠氮基可以与三价磷基团反应生成氨基磷酸酯或磷酸亚胺键。将这种硫羟基反应基团引入分子的合适方法在现有技术中是公知的(比如参见Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic PressSanDiego，CA(1996))。反应基团可以直接键合到亲水性聚合物、缀合物复合物或者通过连接部分如C1-C12烃基。如这里所使用的，“烃基”是指烃链，其中一个或多个碳原子被诸如氧、氮或硫的杂原子任选地取代。合适的接头部分包括，例如四甘醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-以及-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。
包括接头部分的修饰试剂可以这样产生，比如通过将单-叔丁氧羰基-烷基二胺(如单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸在存在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)时进行反应以在游离胺和脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键。用三氟乙酸(TFA)处理可以使Boc保护基团从产物上除去以暴露可被偶联到另一个羧酸酯上的伯胺，或者可与马来酸酐反应、环化所得到的产物以生成脂肪酸的活化马来酰亚胺衍生物(参见，例如Thompson等人的WO 92/16221，其全部教导引入这里作为参考)。
将底物缀合于多肽的N末端Cys一旦选择聚合物部分用于缀合到多肽的N末端cys并且是合成制备的，如果没有活化，必须在需要与多肽的N末端连接的位置用硫羟基反应基团活化。
砜用于制备聚乙二醇和相关聚合物的活性砜的合成途径教导于US5446090(Shearwater)，在此全文引入作为参考。根据该专利中的教导，该方法包括至少4个步骤，其中硫与聚合物分子结合，然后通过一系列反应转化为活性砜官能团。进一步的反应(5)是在碱性条件下将卤代烷砜转化为乙烯砜。下面示出了用于每个步骤中的特别优选的试剂，但也可以使用其它试剂(1)(2)(3)(4)(5)步骤1是亲水聚合物上可利用的羟基的“活化”。通常可以通过两种途径，即羟基酯化或取代中的一种途径活化羟基部分，本领域技术人员也可以使用其它方法。羟基酯化是通过将酸或酸衍生物，如酸卤化物与PEG反应形成反应性酯而完成的。典型的酯是磺酸酯、羧酸酯和磷酸酯。适用于实施本发明的磺酸卤化物包括甲磺酰氯和对-甲苯磺酰氯。
在取代反应中，亲水聚合物的羟基被反应性更高的部分，一般是卤化物取代。例如，结构上表示为SOCl2的亚硫酰二氯可以与PEG反应以形成更反应性更高的氯代PEG。
步骤2是将硫直接连接于聚合物中的碳原子，并且形成乙砜或具有相似反应特性的乙砜衍生物。2碳“乙基”部分是需要的，以便链中远离砜基团的第二个碳原子提供用于将硫羟基部分与砜连接的反应位点。
步骤3涉及将碳连接于砜基团--SO2的硫的有限氧化。存在许多这样的氧化剂，包括过氧化氢和过硼酸钠。可以使用催化剂，如钨酸。
在步骤4，通过羟基的活化或通过用反应性更高的基团取代羟基，将第2步中添加的羟基部分转化为反应性更高的形式，与反应顺序中的第1步类似。
得到的聚合物活化的乙砜是稳定的，可分离的，并且适于硫羟基选择性偶联反应。例如，PEG氯乙砜在大约7或更低的pH下是稳定的，但在碱性pH直到高达至少约pH9的条件下可以用于使硫羟基选择性偶联反应有利。PEG乙烯砜也是稳定的并且可分离的，可以形成硫羟基选择性、水解稳定的键。
可以在合成中添加步骤5，以便将活化的乙砜转化为乙烯砜或其活性衍生物之一，用于硫羟基选择性偶联反应中。聚合物乙烯砜比其乙砜对应物更迅速与硫羟基反应，并且在低于约11的pH下，在至少数天内对水解是稳定的。
预计反应产生这样的产物，其中乙基或乙烯基的碳保留为最终缀合物的一部分。US5446090和其中的教导提供了任何分子量并且可以是线性或含支链的活性PEG砜，其可以是取代或未取代的。砜部分对水解的稳定性使其特别适用于双官能或杂双官能应用。
聚合物乙烯砜及其前体和衍生物可以用于直接连接于表面和具有硫羟基的分子。但是，更典型地，杂双官能团亲水聚合物，如PEG，在通常位于聚合物末端的一个位置具有乙烯砜部分，同时在相反末端具有不同的官能团。在一个末端具有砜部分，在另一个末端具有胺特异性部分的杂双官能PEG可以连接在例如相同或不同蛋白的半胱氨酸和赖氨酸部分。或者，可以用杂双官能化分子掺入此处描述的第二有机部分，以至于在未反应的砜部分的反应之前，可以形成稳定的胺键。
可以从多种化合物中选择用于杂双官能活化的PEG的其它活性基团。对于生物和生物技术应用，通常可以从反应部分选择取代基，所述反应部分通常用于PEG化学以活化PEG，如醛、三氟乙磺酸酯(有时也称作tresylate)、n-羟基琥珀酰亚胺酯、氰尿酰氯、氰尿酰氟、酰叠氮、琥珀酸酯、对-重氮苄基、3-(对-重氮苯氧基)-羟基丙氧基、马来酰亚胺等。
也可以通过酯化学将肽、蛋白、PEG和其它聚合物连接于含有N末端半胱氨酸的EPO。对于肽和蛋白，可以合成或表达这两者，以使其在C末端含有酯部分(优选硫酯)。在温和水性条件下，硫酯化合物可以与含有N末端半胱氨酸的EPO反应，终产物是通过在半胱氨酸残基的α氨基和所述硫酯的羧基碳之间形成的酰胺键与所述硫酯化合物缀合的EPO(Tam，J.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.92，12485-12489(1995))。
衍生化的促红细胞生成素化合物的实例是M-PEG-A-Cys-EPO，其中Cys代表相对于生物活性促红细胞生成素氨基酸序列的Cys-1，M是脂质、碳水化合物、多糖、脂肪酸、脂肪酸衍生物、脂肪醇或蛋白；A代表亲电硫羟基反应基团，优选马来酰亚胺的载体或反应产物。
(M-PEG)2-A-Cys-EPO，其中Cys代表相对于生物活性促红细胞生成素氨基酸序列的Cys-1；其中M-PEG在A上酯化为两个不同的羧基，并且A进一步包含代表亲电硫羟基反应基团，优选马来酰亚胺的载体或反应产物的部分；并且其中M是脂质、碳水化合物、多糖、脂肪酸、脂肪酸衍生物、脂肪醇或蛋白。也包括更高级的多聚物。
(M-PEG)2-R-A-Cys-EPO，其中Cys代表相对于生物活性促红细胞生成素氨基酸序列的Cys-1；其中A代表亲电硫羟基反应基团，优选马来酰亚胺的载体或反应产物；其中(M-PEG)2-R连接于A上的两个不同的羧基；其中M是脂质、碳水化合物、多糖、脂肪酸、脂肪酸衍生物、脂肪醇或蛋白，并且R是增强价的构建体。也包括更高级的多聚物。
M-A-Cys-EPO，其中Cys代表相对于生物活性促红细胞生成素氨基酸序列的Cys-1；其中M是蛋白或肽，并且A是所述蛋白或肽上的游离半胱氨酸侧链。
M-A-Cys-EPO，其中Cys代表相对于生物活性促红细胞生成素氨基酸序列的Cys-1；其中M是脂质，并且A代表亲电硫羟基反应基团，优选马来酰亚胺的载体或反应产物。
M-A-Cys-EPO，其中Cys代表相对于生物活性促红细胞生成素氨基酸序列的Cys-1；其中M是生物素、丹酰或者其它给EPO赋予能用于研究、诊断或治疗目的的生物物理特性的部分；并且其中A代表亲电硫羟基反应基团，优选马来酰亚胺的载体或反应产物。在生物素或另一个具有已知结合配偶体的部分被引入到这个缀合物时，预期所述缀合物能以复合物的形式与其已知的结合配偶体如生物素-抗生物素蛋白复合物用于研究、诊断或治疗。
M-A-Cys-EPO，其中Cys代表相对于生物活性促红细胞生成素氨基酸序列的Cys-1；其中M是生物素、丹酰或者其它给EPO赋予能用于研究、诊断或治疗目的的生物物理特性的部分；并且其中A代表酯或硫酯基团与Cys-1之间的反应产物。
治疗给药本发明的NTFT促红细胞生成素缀合物适合用作治疗血液病的肠胃外制剂，所述血液病的特征为低的或有缺陷的红细胞产生，如各种形式的贫血，包括与慢性肾衰竭、叠氮胸苷治疗的HIV感染患者以及化疗的癌症病人相关联的贫血。它也可以应用于治疗各种疾病状态、失调以及血液学方面不规律的状态，例如镰刀细胞病、β-地中海贫血病、囊性纤维化、妊娠和月经不调、早期早发贫血、脊髓损伤、宇航病、急性失血、衰老以及类似病症。它也可应用于期望增加红细胞的情形，例如外科手术前的患者。优选地，本发明的NTFT促红细胞生成素缀合物经肠胃外给予(例如IV、IM、SC和IP)。
有效剂量可望根据治疗的状况和给药途径进行相当程度的改变，不过预期在0.1到100μg/kg(约7到7000U)体重的活性物质。治疗贫血状况的优选剂量是大约50到大约300单位/kg每周三次。
本发明的NTFT促红细胞生成素缀合物制剂可以用于治疗神经病理，特别是中枢神经系统的那些，包括，但不限于脑和脊髓缺血、急性脑损伤、脊髓损伤、视网膜病和神经退化性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和ALS。除神经病理外，本发明的EPO制剂可用于治疗由于缺血或缺氧应激如心肌梗塞导致的其它组织损伤、手术介入导致的软组织损伤，包括结缔组织和器官损伤、以及由于创伤和免疫介导的炎症导致的组织损伤，或促进这些损伤的愈合。
药物组合物根据本发明制备的治疗性NTFT蛋白可通过现有技术中公知的方法用药学可接受的载体或赋形剂制剂化为适于注射的药物组合物。例如，WO97/09996、WO97/40850、WO98/58660以及WO99/07401中描述了合适的组合物。用于配制本发明产品的优选的药学可接受的载体包括人血清白蛋白、人血浆蛋白质等。本发明的化合物可以在pH值为7的10mM磷酸钠/钾缓冲液中，其中含有渗透压调节剂如132mM氯化钠中制剂化。任选地，药物组合物可含有防腐剂。药物组合物可含有不同量的促红细胞生成素产品，如10-2000μg/ml，如50μg或400μg。
添加诸如生育酚、丁基化羟甲苯、丁基化羟基苯甲醚、棕榈酸抗坏血酸酯的抗氧化剂或者诸如乙二胺四乙酸二钠的乙二胺四乙酸盐，该组合物的稳定性可以被进一步增强，其中乙二胺四乙酸盐额外结合可能存在的重金属。此外，该组合物还可以通过添加防腐剂来增强稳定性，例如苯甲酸以及如对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯这样的对羟基苯甲酸酯。
对特征为低的或者有缺陷的红细胞产生的血液病的治疗一方面，本发明的NTFT促红细胞生成素缀合物的给药导致人体内红细胞的形成。因此，NTFT促红细胞生成素缀合物的给药补充或代替了对红细胞的产生很重要的天然EPO蛋白质的功能。含有NTFT促红细胞生成素缀合物的药物组合物可配制成有效强度，足以通过各种方法给药于正经受特征为低的或有缺陷的红细胞产生的血液病的人患者，这种低的或有缺陷的红细胞产生是单独的或作为一种状况或疾病的部分。可以通过诸如皮下注射、静脉注射或者肌肉注射等注射方法来给予药物组合物。NTFT促红细胞生成素缀合物的平均量可能会变化，特别地应当基于有执照的医师的建议和处方。缀合物的精确量要优先考虑诸如被治疗状况的确切类型、被治疗病人的状况以及组合物的其它成分等因素。比如，0.01到10μg每千克体重，优选0.1到10μg每千克体重，可以一个星期给药一次。
另一方面，本发明的NTFT促红细胞生成素缀合物制剂的用途是针对需要介入的人类患者，以保护、恢复或加强神经组织，特别是中枢神经系统的神经组织，以及由于以下疾病导致的减少、破坏或损失的功能脑和脊髓缺血、急性脑损伤、脊髓损伤、视网膜病和神经退化性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和ALS。本发明的NTFT促红细胞生成素缀合物制剂的用途也可以是治疗需要介入的人类患者，以保护、恢复由于缺血或缺氧应激如心肌梗塞导致的其它组织损伤、手术介入导致的软组织损伤，包括结缔组织和器官损伤、以及由于创伤或免疫介导的炎症导致的组织损伤，或促进其愈合。
本申请中参考了各种出版物。这些出版物的公开内容引入这里是为了更充分地描述现有技术的状态。
本发明通过下面的实施例进一步进行阐述，这些实施例的存在是以例证本发明化合物和组合物的制备为目的的，而不是限制性的。
实施例1克隆cys-EPOEPO的N末端不参与受体结合，并且其位置离开EPO-受体复合物。因此，EPO的N末端提供了用于掺入化学修饰的理想位置，该修饰至少应该对受体结合具有立体影响，因此对生物活性也有影响。因此，在N末端导入半胱氨酸残基使得能够对EPO进行定点修饰，而不破坏受体结合。
因此，通过操作EPO基因序列或cDNA，制备了具有在丙氨酸残基的N末端的半胱氨酸残基的hEPO。但是，in silico分析提示仅仅在EPO前体编码序列中加入半胱氨酸残基，会使信号肽中推测的切割位点向上游移动到24位的脯氨酸和25位的缬氨酸之间，使val25成为新的N末端残基，或导致cys(-1)和ala1之间的切割，以有效地完全除去添加的半胱氨酸(SignalP 3.0；www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。为了增加工程化的EPO的N末端是半胱氨酸的可能性，提出了用已知能够有效将蛋白靶定于内质网的肽，如人生长激素的前26个氨基酸替代内源hEPO信号肽(Morris，A.E.et al.(1999)Journal of BiologicalChemistry 274，418-423)。当通过计算机模型分析时，预测该异源蛋白(图1，SEQ.ID.NO3)产生具有N末端半胱氨酸的成熟蛋白。
为了实现可以用于表达在N末端具有添加的半胱氨酸的构建体的生产，将人生长激素前导序列与半胱氨酸密码子一起工程化到用于表达新蛋白的载体中。
从pEG15扩增EPO的核酸序列。从源自XGH5(Nichols Diagnostic)的载体扩增hGH信号序列的核酸序列。将hGH-EPO构建体连接到称作pSUE质粒的质粒中。下文描述了用于制备编码SEQID NO3(图3)的多肽的多核苷酸的方法。
引物设计用第一PCR引物对(SEQ ID NOS15和16)制备含有HindIII-Kozac-hGH-CYS-ApaLI的107bp片段。
5’.HindIII.Kozac.hGH 5’-ATG CAA GCT TGC CAC CAT GGC TACAG-3’3’.hGH.cys.ApaLIB 5’-GTG GTG GTG CAC AGG CAC TGC CCTC-3’用第二PCR引物对(SEQ ID NOS17和18)制备含有CYS-ApaLI-EPO-BamHI的518bp片段。
5’.cys.ApaLI.EPO 5’-ATG CGC ATG TGC ACC ACC ACG CCTC-3’3’EPO.BamHI 5’-GCA TGG ATC CTC TGT CCC CTG-3’克隆用第一引物对制备用于最终构建体的hGH信号序列片段(SEQ IDNO2)。PCR梯度条件是95℃×2分钟，然后是30个循环的95℃×2分钟，50-60℃30秒，72℃30秒，然后是72℃下最终延伸3分钟，然后4℃下维持。用第二引物对制备最终构建体的EPO片段。PCR条件是94℃2分钟，然后是30个循环的94℃×30秒，60℃×30秒，72℃×3分钟，然后是72℃下最终延伸7分钟，然后4℃下维持。扩增后，将10μL每一种PCR反应物与1μL 10×加样染料混合，并且用1Kb序列梯(Invitrogen，Carlsbad，CA)在1％SeaKem凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上电泳。hGH PCR反应在每个温度下产生了在大约100bp位置迁移的条带；切下该条带并且合并在一起，根据QIAQuickGel萃取柱(Qiagen，Valencia，CA)进行萃取，并且在30μL dH2O中洗脱。类似地，切下并萃取在大约500bp位置迁移的EPO条带。
用BamHI和ApaLI消化EPO片段，用HindIII和ApaLI消化hGH片段，用HindIII和BamHI消化载体pSUE。按上文所述，10μL pSUE消化物在1％SeaKem凝胶上电泳。切下约10Kb处的载体条带，按照上文所述萃取。用小牛肠碱性磷酸酶(New England BioLabs，Beverly，MA)处理全部30μL洗脱物，然后根据QIAQuick PCR纯化柱(Qiagen)的说明书纯化，并且在30μL dH2O中洗脱。用QIAQuick PCR纯化柱纯化片段消化物，在30μL dH2O中洗脱。
用Roche快速连接试剂盒(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)连接各个片段和载体。将连接反应转化到TOP10 OneShot化学感受态细胞(Invitrogen)，并且铺板在含有100μg/mL氨苄青霉素(Teknova，Half Moon Bay，CA)的Luria-Bertani(LB)平板上。将各个集落挑选到选择性液体LB培养基中，在37度下225rpm振荡生长过夜。用QiagenSpin Miniprep试剂盒(Qiagen)提取质粒DNA，并且洗脱到75μL dH2O中。用限制酶消化所有克隆，以筛选用于插入。用荧光染料-终止子和具有载体的内部引物的ABI3 100基因分析仪(Applied Biosystems，Foster City，CA)对阳性克隆测序。通过测序鉴定了两种阳性克隆；但是，这两种都含有hHG信号序列中的突变(Q22R)。该突变不影响预测的C末端半胱氨酸处的切割。最终的质粒称作pSUEcysEPO。
在本研究中，我们采用了简单的表达载体，该载体利用强病毒启动子、共有Kozak序列、感兴趣的基因(EPO)、六His标记、终止密码子和来源于牛生长激素基因的聚腺苷酸化信号。或者，可以制备表达cys-EPO的稳定哺乳动物细胞系，以表达基因产物。采用了HEK293E细胞，但是，也可以使用能够加工哺乳动物信号序列的任何宿主细胞(优选哺乳动物细胞，但不是必须的)。
实施例2cys-EPO的表达用瞬时转染表达新的EPO蛋白，其中DNA由哺乳动物细胞摄取，运输到细胞核并且转录。采用该技术，以快速方式实现蛋白表达的脉冲。转染后5天，从条件培养基收集产物，即，cys-EPO，并且用位于蛋白C末端的六His标记纯化。
用阳离子脂质试剂(LF2K)将编码cys-EPO的DNA(pSUEcysEPO)转染到HEK 293E细胞中。然后，在10层的细胞培养箱中的无血清培养基(2934-SFMII)中培养细胞，4天后回收条件培养基，用TALONIMAC纯化cys-EPO。透析和浓缩后，通过SDS PAGE分析纯化产物的纯度(图2)，进行N末端测序和UT-7生物测定(图3)。
分析前，在生物测定中，在具有L-谷氨酸和5％PBS而不具有Epo的IMDM中使UT-7细胞饥饿24.5小时。洗涤细胞，以每孔30,000个细胞铺板。以双份加入EPO(2.5-0.0024ng/mL)和cys-EPO(20-0.01952ng/mL)。47.2小时后，37℃下用Promega′s MTS溶液测量每孔的细胞数，以1、2和3小时的间隔进行OD读数。所得值是用SoftMaxPro校正的背景，平均背景是0.327OD单位(图3)。
从上清液回收cys-EPO的事实证明了由转染到细胞中的核酸成功表达了蛋白，并且表明通过人生长激素信号序列将该蛋白靶定于内质网，正确折叠，并且分泌。
材料的考马斯亮蓝染色的SDS PAGE(图2)在大约31KDa处显示明显的条带，其与由人和哺乳动物细胞产生的天然糖基化产物导致的34KDa匹配很好。相反，非糖基化的EPO是大约18kDa。
N末端测序证明正常成熟丙氨酸残基上游的单个氨基酸的存在。示出了从该条带除去的材料的N末端序列，*的解释如下由于半胱氨酸残基不容易被N末端测序方法识别，除非该蛋白以某些方式衍生化，否则只能将N末端氨基酸(N在括号中)设计为存在，即，由测序仪“呼叫”，并因此表明蛋白不具有封闭的N末端。此外，可以确定该(N)不是衍生自hGH信号序列的C末端，因为这是可以由测序方法鉴定的丙氨酸(A)。此外，第一次呼叫后的氨基酸系列(N)相当于成熟的人EPO基因(APP等)。
编码该构建体的核酸序列示于SEQ ID NO19。
实施例3Cys-EPO的化学修饰实验1在pH7.0(PBS)，用1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，用磷酸缓冲液对Cys-EPO进行缓冲液交换。在37℃下将Cys-EPO(0.7mg/ml，溶于PBS+100mM磷酸盐，pH 6.8)和EPO(0.7mg/ml，溶于PBS+100mM磷酸盐，pH6.8)与0mM、15mM、20mM和25mM b-巯基乙胺(MEA)(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)一起温育2小时。然后按照制造商的说明用磷酸缓冲液(50mM，pH 6.8)平衡的Biospin-6脱盐柱(Biorad Laboratories，Hercules，CA)从样品中除去MEA。然后在室温下将样品与0.75mM马来酰亚胺-PEG(平均分子量5960)(Nektar，Huntsville，AL)一起温育1小时。1小时后，将半胱氨酸加至0.75mM的浓度，并且在室温下温育20分钟。然后加样并且在4-12％SDS-PAGE凝胶上电泳。也通过SELDI质谱(Ciphergen，Fulton，CA)，在采用sinnapic acid的基质并且按照制造商的推荐制备的H-4反相芯片上分析样品。以相同的方式处理野生型EPO。
EPO样品的凝胶(图4)显示，在研究的任一条件下，没有发生明显EPO的聚乙二醇化。这是由缺乏代表相对于未修饰的EPO标准的分子量偏移的条带而表明的。样品的SELDI-MS(图6)也显示没有分子量差异，再次表明在这些条件下没有发生聚乙二醇化。
cys-EPO样品的凝胶(图5)显示在研究的每一条件下都发生了明显的cys-EPO的聚乙二醇化。这是通过代表相对于未修饰的EPO标准的分子量偏移的条带(用白色箭头表示)而显示的(注意为了更好显示杂质的存在，cys-EPO标准是以更高的浓度加样的，并且描述的分子量偏移是与相对于用标准物观察到的主要条带)。
在样品的SELDI质谱分析中(图6和7)，28,000附近的峰相当于未修饰的EPO或cys-EPO。注意图7中相当于添加5,960MW PEG的峰的存在，其是与预期的聚乙二醇化产物的分子量成比例的分子量差异。由于PEG的异质性和EPO上的糖基化，该峰很宽，并且分子量必须视为是大约的。但是，相对分子量表明PEG与还原和未还原的Cys-EPO的连接，再次表明在这些条件下确实发生cys-EPO的聚乙二醇化。同样，聚乙二醇化的程度似乎相对于用于还原的MEA浓度有所增加。这表明，cys-EPO上的N末端半胱氨酸的至少一些是与另一硫羟基，如半胱氨酸或谷胱甘肽通过二硫桥连接的，并且可以采用此处描述的条件选择性还原这些二硫化物。综上所述，这些数据表明，cys-EPO上的N末端硫羟基是可接近的，并且可以用硫羟基特异性试剂，如马来酰亚胺-PEG进行修饰。
实验2在pH7.0(PBS)，用1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，用磷酸缓冲液对Cys-EPO进行缓冲液交换。在此溶液中加入3倍摩尔过量的马来酰亚胺活化的二硬脂酰(steroyl)磷脂酰乙醇胺，其中含有马来酰亚胺和脂质之间(mal-PEG-DSPE)的分子量为14-20,000的聚合物接头(如PEG)。在20-25摄氏度温育反应混合物1小时。然后将反应混合物加样到zorbax GF-250XL大小排阻HPLC柱上，用PBS以2ml/分钟的流速洗脱。然后合并含有得到的修饰蛋白峰的级份，检测生物活性。
实验3在溶于二甲基甲酰胺(DMF)的28.7ml 0.5M的HOBt/HBTU(1-羟基苯并三唑/2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基uronium六氟磷酸酯)中加入14.35ml 2M二异丙基乙胺(DIEA)，然后加入5g(14.35mmol)3-(S，三苯甲基)-巯基丙酸(Bachem，King of Prussia，PA)。将该溶液加入5gMBHA树脂(0.8mmol/g)(Bachem)，搅拌30分钟。用几体积的DMF、DCM和甲醇连续洗涤树脂，在真空中干燥。得到的树脂用于采用标准Boc化学进行肽合成。用标准Boc化学合成长度为2-50个残基的肽，在90％HF、10％对-甲酚、-5℃、1.5h的条件下完成切割。将肽沉淀在乙醚中，冻干，并且通过制备反相HPLC(RP-HPLC)纯化。然后将肽与溶于PBS(pH 7.0)中的Cys-EPO+1mM EDTA一起温育12-48小时。用分析大小排阻层析HPLC(SEC-HPLC)监测反应，进行SDS凝胶电泳和/或SELDI质谱。最后的缀合物加样到Zorbax GF-250XL大小排阻HPLC柱上，用PBS以2ml/分钟的流速洗脱。然后合并含有得到的修饰的蛋白峰的级份，并且检测生物活性。
实施例4UT7细胞增殖测定UT7细胞是一种已经适应于成为EPO依赖的人白血病细胞系(Komatsu，N.，等人.血液(Blood)82(2)，456-464，1993)。UT7细胞在PBS中漂洗3次，并在分析前进行EPO饥饿24小时。UT7细胞在含有添加的L-谷氨酰胺和5％FBS(I5Q)的IMDM培养基中饥饿。细胞在50ml DPBS中漂洗一次，在DPBS中悬浮时计数，并以最终浓度为6×105个细胞/mL悬浮于适当培养基中(产生的最终浓度为每孔30000个细胞)。EPO标准样是通过将EPO的贮存液(1.7mg/mL)稀释到0.85μg/mL(2μL加入4mL培养基中)而制备的。贮存液稀释2∶340到5ng/mL，紧接着1∶2连续稀释，使其浓度降到I5Q培养基中的0.0098ng/mL。所得稀释液提供了浓度为2.5ng/mL到0.0024ng/mL的标准。测试样品用类似的方法稀释。将50μL的UT-7细胞悬浮液等份试样转移到相应的孔中，并且将平板在37℃温育48小时。细胞增殖是使用Promega′s MTS溶液(Promega，Madison，WI)来评估的，每孔加20μL。在加入MTS1小时后开始读数。
图3显示在未修饰和N末端cys修饰的EPO上进行的UT7细胞测定中EPO材料的浓度依赖性图。由未修饰的EPO计算的EC50是1.795×10-11M，修饰的EPO是2.948×10-11M。这些数据表明分泌的材料是有活性的。
实施例5在小鼠中刺激造血在过滤顶塑料笼中饲养条件下对从Charles RiversLaboratories(Raleigh，NC)获得的体重大约18-20克的BDF1雌性小鼠分组(每笼10只)。
在研究的第5天，将动物分成1-3个治疗组(PBS对照、EPO和M-PEG-A-Cys-EPO)，每组15只动物。用CO2麻醉动物，通过眶后窦将血样采集在EDTA包被的试管中，靶血体积是0.05mL/样品，从而建立基线水平。将血液放置在可商购的EDTA制备的微量离心管中。将等分样品置于血细胞比容管中，用粘土密封管，离心5分钟。在可商购的血细胞比容测定卡上对血细胞比容管读数，获得细胞压积(PCV/血细胞比容)。采用10μl血液，用CoulterTM计数器确定血红蛋白水平。在第0天和第2天，动物接受0.94mL(112.8mL/kg)PBS(pH 7.4)、EPO(0.333/mL溶于PBS)或溶于PBS中的本发明的M-PEG-A-Cys-EPO组合物(其量等同于由实施例4的UT-7测定校准的生物活性)的腹膜内注射。在第4、7、10、14、17和21天，采集血样，等分到用粘土密封的血细胞比容管中，离心5分钟。在可商购的血细胞比容测定卡上对血细胞比容管读数，获得细胞压积(PCV/血细胞比容)。采用10μl样品，用CoulterTM计数器确定血红蛋白水平。
序列表<110>Centocor，Inc.
Cunningham，MarkMills，JulianePool，Chadler<120>具有N-末端游离硫羟基的新的重组蛋白<130>CEN 5046
<110>Centocor，Inc.
Cunningham，MarkMills，JulianePool，Chadler<120>具有N-末端游离硫羟基的新的重组蛋白<130>CEN 5046<150>60/533617<151>2003-12-31<160>20<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>193<212>PRT<213>人<220>
<221>信号<222>(1)..(27)<220>
<221>成熟肽<222>(28)..(193)<220>
<221>变体<222>(193)..(193)<223>截短，desArg<400>1Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu-25 -20 -15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu-10 -5 -1 1 5Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu10 15 20Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu25 30 35Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg40 45 50Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu55 60 65
CEN5026 Cys-EPO listing.ST25.txtLeu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser70 75 80 85Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly90 95 100Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu105 110 115Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile120 125 130Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu135 140 145Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp150 155 160 165Arg<210>2<211>26<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu1 5 10 15Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala20 25<210>3<211>19<212>PRT<213>鼠<400>3Met Ala Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser1 5 10 15Ile Gln Ala<210>4<211>25<212>PRT<213>鼠
<400>4Met Gly Ile Lys Met Glu Thr His Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu1 5 10 15Leu Trp Leu Ser Gly Ser Val Glu Gly20 25<210>5<211>23<212>PRT<213>人<400>5Met Ala Ser Pro Phe Ala Leu Leu Met Val Leu Val Val Leu Ser Cys1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly20<210>6<211>23<212>PRT<213>人<400>6Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu Val Leu Ser Cys1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly20<210>7<211>23<212>PRT<213>人<400>7Met Ala Leu Ser Phe Ser Leu Leu Met Ala Val Leu Val Leu Ser Tyr1 5 10 15Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly20<210>8<211>23<212>PRT<213>人<400>8Met Ala Leu Pro Phe Val Leu Leu Met Ala Leu Val Val Leu Asn Cys
1 5 10 15Lys Ser Ile Cys Ser Leu Gly20<210>9<211>23<212>PRT<213>人<400>9Met Ala Leu Pro Phe Ala Leu Leu Met Ala Leu Val Val Leu Ser Cys1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Ser Leu Asp20<210>10<211>23<212>PRT<213>人<400>10Met Ala Ser Pro Phe Ala Leu Leu Met Ala Leu Val Val Leu Ser Cys1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly20<210>11<211>23<212>PRT<213>人<400>11Met Ala Leu Pro Phe Ala Leu Met Met Ala Leu Val Val Leu Ser Cys1 5 10 15Lys Ser Ser Cys Ser Leu Gly20<210>12<211>23<212>PRT<213>人<400>12Met Ala Phe Val Leu Ser Leu Leu Met Ala Leu Val Leu Val Ser Tyr1 5 10 15
Gly Pro Gly Gly Ser Leu Gly20<210>13<211>23<212>PRT<213>人<400>13Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr1 5 10 15Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly20<210>14<211>193<212>PRT<213>人<220>
<221>变体<222>(22)..(22)<223>Q22R<400>14Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu1 5 10 15Cys Leu Pro Trp Leu Arg Glu Gly Ser Ala Cys Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu165 170 175Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp180 185 190Arg<210>15<211>26<212>DNA<213>人<400>15atgcaagctt gccaccatgg ctacag 26<210>16<211>25<212>DNA<213>人<400>16gtggtggtgc acaggcactg ccctc 25<210>17<211>25<212>DNA<213>人<400>17atgcgcatgt gcaccaccac gcctc 25<210>18<211>21<212>DNA<213>人<400>18gcatggatcc tctgtcccct g 21<210>19<211>606<212>DNA<213>人
<220>
<221>信号肽<222>(1)..(78)<220>
<221>CDS<222>(1)..(603)<220>
<221>变异<222>(64)..(66)<223>Q22R<220>
<221>N_区<222>(79)..(81)<223>用于N末端添加的Cys的TGT密码子<220>
<221>成熟肽<222>(79)..(579)<220>
<221>misc_结合<222>(580)..(603)<223>仅仅用于纯化的聚His标记<400>19atg gct aca ggc tcc cgg acg tcc ctg ctc ctg gct ttt ggc ctg ctc48Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15tgc ctg ccc tgg ctt cga gag ggc agt gcc tgt gca cca cca cgc ctc96Cys Leu Pro Trp Leu Arg Glu Gly Ser Ala Cys Ala Pro Pro Arg Leu-10 -5 -1 1 5atc tgt gac agc cga gtc ctg gag agg tac ctc ttg gag gcc aag gag144Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu10 15 20gcc gag aat atc acg acg ggc tgt gct gaa cac tgc agc ttg aat gag192Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu25 30 35aat atc act gtc cca gac acc aaa gtt aat ttc tac gcg tgg aag agg240Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg40 45 50atg gag gtc ggc cag cag gcc gta gaa gtc tgg cag ggc ctg gcc ctg288Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu55 60 65 70ctg tcg gaa gct gtc ctg cgg ggc cag gcc ctg ttg gtc aac tcg agc336Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser75 80 85cag ccg tgg gag ccc ctg caa ctg cat gtg gat aaa gcc gtc agt ggc384Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly90 95 100ctt cgc agc ctc acc act ctg ctt cgg gct ctg gga gct cag aag gaa432Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu105 110 115
gcc atc tcc cct cca gat gcg gcc tca gct gct cca ctc cga aca atc480Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile120 125 130act gct gac act ttc cgc aaa ctc ttc cga gtc tac tcc aat ttc ctc528Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu135 140 145 150cgg gga aag ctg aag ctg tac aca ggg gag gca tgc agg aca ggg gac576Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp155 160 165aga gga tcc cat cat cac cat cac cat tga606Arg Gly Ser His His His His His His170 175<210>20<211>201<212>PRT<213>人<400>20Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15Cys Leu Pro Trp Leu Arg Glu Gly Ser Ala Cys Ala Pro Pro Arg Leu-10 -5 -1 1 5Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu10 15 20Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu25 30 35Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg40 45 50Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu55 60 65 70Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser75 80 85Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly90 95 100Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu105 110 115Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile120 125 130
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Ash Phe Leu135 140 145 150Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp155 160 165Arg Gly Ser His His His His His His170 17权利要求
1.制备治疗性蛋白缀合物的方法，该缀合物具有缀合到治疗性蛋白的N末端半胱氨酸的聚合物，其中所述半胱氨酸残基的硫羟基参与所述缀合物的共价键的形成，该方法包括a)获得所述治疗性蛋白的核酸序列，b)选择用于在细胞中表达所述蛋白的信号序列，并且获得所述信号序列的核酸序列，c)通过将(b)的信号序列工程化到(a)的蛋白序列，并且将密码子TGT插入这两者之间使得信号序列在TGT上游，定向形成构建体，d)使所述构建体在细胞中表达，e)回收由所述构建体编码的多肽，和f)在N末端半胱氨酸将所述多肽缀合于聚合物。
2.权利要求1的方法，其中所述定向步骤是定向于寡核苷酸的诱变。
3.权利要求1的方法，其中所述选择步骤包括使用公众可获得的计算机方法。
4.权利要求3的方法，其中可能的信号序列选自人生长激素前导序列(SEQ ID NO2)、抗体重链前导序列(SEQ ID NO3)、抗体轻链前导序列(SEQ ID NO4)、人干扰素δ1前导序列(SEQ ID NO12)和人干扰素ω1序列(SEQ ID NO13)。
5.一种促红细胞生成素缀合物，具有导致骨髓细胞对红细胞的生产增加的生物学性质，包含式(M)n-X-A-cys-EPO(I)所示的部分，其中EPO是促红细胞生成素部分，选自促红细胞生成素或具有至少一个与野生型人EPO不同的氨基酸的促红细胞生成素变体，或任何具有导致骨髓细胞对红细胞的生产增加的生物学性质的其药学可接受的衍生物，cys代表半胱氨酸，并且存在于相对于促红细胞生成素部分的氨基酸序列的-1位；A是硫羟基反应部分的残基；X是亲水聚合物，并且是任选的；M是能够增加所述部分的循环半衰期的有机分子；并且n是0到15的整数。
6.权利要求3的导致骨髓细胞对红细胞的生产增加的促红细胞生成素缀合物，所述增加在给予所述促红细胞生成素缀合物之后维持的时间比给予未缀合的促红细胞生成素后维持的时间长。
7.权利要求4的促红细胞生成素缀合物，其中维持的效果是由于相对未修饰的哺乳动物促红细胞生成素的增加的血清半衰期。
8.权利要求3的促红细胞生成素缀合物，其中M部分包含1-大约6个有机部分，其各自独立地选择脂肪酸基团、脂肪酸酯基团、脂质或磷脂。
9.权利要求4的促红细胞生成素缀合物，其中所述亲水聚合物是聚环氧烷。
10.权利要求3的促红细胞生成素缀合物，其中所述促红细胞生成素或促红细胞生成素部分选自重组和非重组哺乳动物促红细胞生成素。
11.权利要求7的促红细胞生成素缀合物，其中所述聚环氧烷是取代的聚环氧乙烷。
12.权利要求7的促红细胞生成素缀合物，其中所述聚环氧烷选自聚乙二醇均聚物、聚丙二醇均聚物、烷基-聚环氧乙烷、二聚环氧乙烷和聚环氧烷的共聚物或嵌段共聚物。
13.权利要求7的促红细胞生成素缀合物，其中所述聚环氧烷是分子量为大约200-大约100,000的聚乙二醇均聚物。
14.权利要求3的促红细胞生成素缀合物，其中所述亲水聚合物是线性或含支链的聚亚烷基二醇链、碳水化合物链、氨基酸链或聚乙烯吡咯烷酮链，并且其中所述亲水聚合物的分子量是大约800-大约120,000道尔顿。
15.权利要求12的促红细胞生成素缀合物，其中所述亲水聚合物是线性或含支链的聚亚烷基二醇链，其分子量大于2,000道尔顿。
16.权利要求12的促红细胞生成素缀合物，其中所述亲水聚合物是线性或含支链的聚乙二醇链或线性或含支链的取代的聚乙二醇链，并且有机部分M选自烷基、C6-C40脂肪酸基团、C6-C40脂肪酸酯基团、脂质基团和磷脂基团。
17.权利要求14的促红细胞生成素缀合物，其中所述亲水聚合物是线性或含支链的聚乙二醇链，其由选自烷基、C6-C40脂肪酸基团、C6-C40脂肪酸酯基团、脂质基团或磷脂基团的有机部分末端取代。
18.权利要求15的促红细胞生成素缀合物，其中所述有机部分是棕榈酰基。
19.权利要求15的促红细胞生成素缀合物，其中所述有机部分是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
20.权利要求3的缀合物，其中A是乙基，X是PEG或其它聚合物，并且是任选的，并且M是生物素、丹酰或者其它给EPO赋予能用于研究、诊断或治疗目的的生物物理特性的部分。
21.权利要求3的缀合物，其中A是乙基。
22.权利要求3的促红细胞生成素缀合物，其中EPO是红细胞生成素部分，选自a)SEQ ID NO1的从第28位到至少165位，b)具有至少一个与SEQ ID NO1不同的氨基酸的促红细胞生成素变体，或c)(a)或(b)的任何药学可接受的衍生物；并且cys代表半胱氨酸，并且存在于相对SEQ ID NO1或变体的第28位氨基酸的N末端位置；A表示硫羟基反应部分的残基；X是亲水聚合物；M是烷基、C6-C40脂肪酸基团、C6-C40脂肪酸酯基团、脂质基团或磷脂基团；并且n是0到15的整数。
23.制备权利要求3的促红细胞生成素缀合物的方法，包括使在N末端具有半胱氨酸残基的cys-EPO部分接触预先构建的式Y-X-(M)n的亲水聚合物-有机部分复合物，其中Y是硫羟基反应部分，所述硫羟基反应部分在形成EPO-cys-聚合物-缀合物的条件下含有或成为残基A。
24.权利要求21的方法，其中所述聚合物是聚环氧烷。
25.权利要求22的方法，其中所述聚环氧烷是α-取代的聚环氧烷。
26.权利要求23的方法，其中所述聚环氧烷是聚乙二醇。
27.权利要求21的方法，其中所述硫羟基反应部分是砜。
28.权利要求25的方法，其中所述硫羟基反应部分是乙砜。
29.权利要求21的方法，其中所述硫羟基反应部分是二硫化物。
30.权利要求21的方法，其中所述硫羟基反应部分是马来酰亚胺。
31.权利要求21的方法，其中X是肽或蛋白，并且A是Cys-1和硫酯或酯部分的反应产物。
32.权利要求21的方法，其中所述硫羟基反应部分是碘乙酰胺。
33.权利要求21的方法，其中A是乙基，X是PEG或其它水溶性聚合物，并且是任选的，并且M是生物素、丹酰或者其它给EPO赋予能用于研究、诊断或治疗目的的生物物理特性的部分。
34.治疗贫血的方法，包括给予治疗有效量的权利要求3的缀合物。
35.权利要求32的方法，其中所述缀合物的特征在于与缀合的促红细胞生成素相比增加的血清半衰期。
36.一种促红细胞生成素蛋白或蛋白缀合物，含有重组或非重组的哺乳动物促红细胞生成素，其中通过重组、酶促或化学方法添加了具有游离α胺的半胱氨酸残基，以提供反应性游离硫羟基，并且所述反应性游离硫羟基不干扰蛋白折叠、分泌或生物活性，并且所述硫羟基可以衍生化，从而增加所述促红细胞生成素蛋白的循环半衰期或改进所述促红细胞生成素蛋白的生物活性。
37.式Z-cys-EPO所式的部分，其中EPO是促红细胞生成素部分，选自促红细胞生成素或具有至少一个与野生型人EPO氨基酸不同的氨基酸的促红细胞生成素变体，或任何具有导致骨髓细胞对红细胞的生产增加的生物学性质的其药学可接受的衍生物，cys代表半胱氨酸，并且存在于相对于促红细胞生成素部分的氨基酸序列的-1位；并且Z是异源信号序列。
38.权利要求35的部分，其中异源信号序列是人生长激素前导序列(SEQ ID NO.2)。
全文摘要
本发明涉及具有N末端游离硫羟基的新的修饰的蛋白，其可以通过重组方法生产，并且可以用于进一步化学衍生化。具体地，本发明涉及具有改变的生物化学、生理化学和药代动力学特性的促红细胞生成素缀合物化合物。更具体地，本发明的一个实施方案涉及式(M)
文档编号C12N15/85GK1902311SQ200480039650
公开日2007年1月24日 申请日期2004年12月23日 优先权日2003年12月31日
发明者C·普尔, J·米尔斯, M·昆宁哈姆 申请人:森托科尔公司