新的钠通道的制作方法

专利名称：新的钠通道的制作方法
新的钠通道 相关申请的交叉引用
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背景
所有细胞都依靠无机离子跨细胞膜的受调节的运动来进行基本的 生理功能。电兴奋性、突触可塑性和信号转导是在其中离子浓度变化 起到重要作用的过程的实例. 一般地，允许这些变化的离子通道是由 一个或多个亚基组成的蛋白质孔洞，每个亚基含有两个或多个跨腹结 构域.大多数离子通道依靠对大小和电荷的物理偏爱性对特定的离 子，主要是Na+、 K\ Ca2+、或CT具有选择性.电化学力，而不是主 动转运，驱动了离子跨越膜，因而单个通道可能容许每秒数百万的粒 子通过.取决于通道的子类，通道开放、或"闸门"受电压的变化或 受配体结合的紧密控制.由于涉及许多生理学过程，因此离子通道是 吸引人的治疗靶点，而产生对特定组织类型中的特定通道具有特异性 的药物仍然是主要的挑战.
电压门控的离子通道响应于膜电位的变化而开放.举例来说，可 兴奋细胞例如神经元的去极化引起Na+离子的短暂流入，这传播了神经 冲动。这种Na+浓度的变化由电压门控的K+通道感知，其然后允许1^+离子流出。K+离子的流出使膜复极化.其他细胞类型依靠电压门控的 Ca"通道来产生动作电位。在不可兴奋细胞中电压门控的离子通道也 执行重要的功能，例如分泌的调节、体内平衡过程和有丝分裂过程. 配体门控的离子通道可以由细胞外的刺激，例如神经递质(例如，谷 氨酸、5-羟色胺、乙酰胆碱)或细胞内刺激(例如，cAMP、 Ca"和裤 酸化)打开.
钠(Na+)通道包括电压门控的和非电压门控的种类.电压门控 的Na+通道介导神经元中动作电位的再生所需的短暂Na+离子流入. 电压门控的Na+通道可以进一步分为亚型；已经克隆了至少九种独特 的电压门控的Na+通道a亚基(Navl.l-1.9)，并已经克隆了至少三种 相关的P亚基.电压门控的Na+通道的a亚基类似于电压门控的Ca2+ 通道的a亚基，含有四个重复区域，每个重复区域含有六个跨膜结构 域。电压门控的Na+通道在脑、肌肉、心脏、脊髄、子宫和感觉神经 元中表达.a亚基与辅助亚基相连，所述辅助亚基通过例如修改a亚 基的门控来调节通道的功能。
离子通道功能的遗传的或药理学扰动可能具有显著的临床后果。 长QT综合症、癫痫症、嚢性纤維化和偶发的共济失调是由离子通道亚 基中的突变引起的遗传性疾病的几个实例，由某些药物触发的毒性副 作用，例如心律不齐和发作(seizure)是由于对离子通道功能的干扰 (Sirois and Atchison, TVei/rWojdco/ogy, 17 (1 ) :63-84， 1996; Keating, M.T.，&i'em^272:681-685， 1996).调节离子通道活性的药物具有在治 疗许多病理状况方面的应用，包括疼痛、高血压、心绞痛、心肌缺血、 孝喘、膀胱机能过度、脱发、疼痛、心力衰竭、痛经、H型糖尿病、 心律不齐、移植排斥、发作、惊厥、癲痫症、中风、胃运动过强、精 神病、癌症、肌肉萎缩和发作性睡病(Coghlan， M.J.，"a/.，/. CAe肌 44:1627-1653， 2001; Ackerman. M.J.， and Clapham， D.E.，A^ 336:1575-1586,1997).鉴定的离子通道的数目增多和对它们的复杂性 的进一步了解今后将有助于在修改离子通道功能的治疗方面的努力.
概述
在此提供了新的Na+通道亚基多肽、核酸和所述多肽和核酸的片 段。还提供了使用所述新的亚基多肽、核酸和其片段的方法.在一个方面，本发明表征了分离的钠通道HI型a亚基(mNav1.3 a亚基)多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列，在一 个实施方式中，所述多肽基本上由SEQIDNO:2的氨基酸序列组成.
在另一个方面，本发明表征了包括SEQ ID NO:2的至少IO个连 续氨基酸的分离的mNav1.3 a亚基多肽，其中所述多肽包括以下氨基酸 中的一个或多个异亮氨酸289、脯氨酸518、丝氨酸728、丝氨酸1355、 天冬酰胺1909、苏氨酸1910和纈氨酸1921.
在另一个方面，本发明表征了编码在此描述的多肽的分离的 mNav1.3 a亚基核酸分子，所述多肽例如包括SEQ ID NO:2的氨基酸序 列的钠通道III类型a亚基(mNav1.3 a亚基)多肽.在一个实施方式 中，所述核酸包括SEQIDNO:l的核苷酸序列.在一个实施方式中， 所述核酸分子基本上由SEQ ID NO:l的核苷酸序列组成。在一个实施 方式中，所述核酸分子是SEQIDNO:l的核酸序列的等位基因.
在另一个方面，本发明表征了编码在此描述的多肽的分离的 mNav1.3 a亚基核酸分子的片段，所述多肽例如包括SEQ ID NO:2的氨 基酸序列的钠通道III类型a亚基(mNav1.3 a亚基)多肽，在一个实
施方式中，所述片段编码以下的氨基酸中的一个或多个异亮氨酸 289、脯氨酸518、丝氨酸728、丝氨酸1355、天冬酰胺1909、苏氨酸 1910和纈氨酸1921.
在另一个方面，本发明表征了包括与启动子可操作连接的、编码 在此描述的mNav1.3 a亚基的核酸或其片段的表达载体.
在另一个方面，本发明表征了包括编码在此描述的mNav1.3 a亚 基的核酸或其片段的宿主细胞，
在另一个方面，本发明表征了与mNavl.3 a亚基多肽优先地结合 的试剂，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列，
在另一个方面，本发明表征了与mNav1.3 a亚基多肽选择性结合 的试剂，其中所述多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸序列，和其中所述 试剂不与钠通道I型或II型a亚基多肽结合.在一个实施方式中，所 述试刑是小分子、核酸或蛋白.在一个实施方式中，所述试剂调节 mNa4.3a亚基多肽活性.在一个实施方式中，所述试剂是抗体或其抗 原结合片段.在一个实施方式中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗 体。在另一个方面，本发明表征了药物组合物，包括与mNav1.3 a 亚基多肽选择性结合的试剂，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基 酸序列；和药学上可接受的栽体.
在另一个方面，本发明表征了调节细胞中mNav1.3 a亚基多肽活 性的方法，该方法包括提供包括mNavl.3a亚基多肽的钠通道，其中 所述niNav1,3 a亚基多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列；使所述通 道与一定量的、有效调节所述mNav:L3a亚基多肽的活性的mNav1.3 a 亚基多肽调节物接触.在一个实施方式中，所述调节物是小分子、核 酸或蛋白.
在另一个方面，本发明表征了鉴定调节mNav1.3 a亚基多肽活性 的试剂的方法，该方法包括提供包含mNavl.3a亚基多肽的第一钠通 道，其中所述mNav1.3 a亚基多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列； 使所迷通道与测试化合物接触；以及评估所述钠通道的活性，其中相 对于参考值的活性变化是该化合物是调节所述通道的试剂的指示。
在一个实施方式中，所述测试化合物是小分子、肽或核酸.在一 个实施方式中，所迷钠通道包含在生物样品中，在一个实施方式中， 所述通道与多种测试化合物接触.
在一个实施方式中，所述样品包含细胞膜.在一个实施方式中， 所述样品包含细胞.在一个实施方式中，所述细胞是真核细胞.在一 个实施方式中，所述细胞是非洲爪塘(Xenopus)卵母细胞.在一个实 施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。
在一个实施方式中，所述活性包括调节钠浓度.在一个实施方式 中，所述评估包括检测钠排出(Sodium flux),在一个实施方式中， 所述接触在不存在测试化合物的情况下发生，产生第一钠排出量.在 一个实施方式中，所述评估包括使用Na+流量分析(Na+flux assay). 在一个实施方式中，所述分析使用膜片钳电生理学.在一个实施方式 中，所述分析使用二电极电压钳电生理学.在一个实施方式中，所迷 评估包括使用钠敏感性染料.在一个实施方式中，所述分析是高通量 分析，
在一个实施方式中，所述方法进一步包括步骤提供包含mNay1.3 a亚基多肽的第二钠通道，其中所述mNav1.3 a亚基多肽不同于第一 mNavl.3a亚基多肽(例如，第二钠通道不同于包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的mNavl.3tt亚基多肽)；使所述第二钠通道与所述测试化合 物接触；评估所述第二钠通道的活性.
该方法可进一步包括比较存在测试化合物的情况下笫一钠通道的 活性和存在测试化合物的情况下第二钠通道的活性.在一个实施方式 中，提供了多种钠通道.
在另一个方面，本发明表征了鉴定在治疗与钠通道电流(sodium channel current)调节有关的失调方面有用的试剂的方法，该方法包 括提供包含mNav1.3 a亚基多肽的钠通道，其中所述多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列；使所述通道与测试化合物接触；以及评估所述通 道的活性，其中相对于参考值的活性变化是所述测试化合物是在与钠 电流有关的失调方面有用的试剂的指示.在一个实施方式中，所述失 调是疼痛、感觉异常、中风、头外伤、神经变性失调、或与神经元的 超兴奋性有关的失调.
所述方法可以进一步包括体内施用所述化合物(例如，使用动物 模型).所述方法可以进一步包括为了体内使用而修饰所述化合物. 所述方法可以进一步包括评估由所述化合物对相关的人类Nav1.3 a亚 基多肽的调节.
在另一个方面，本发明表征了治疗患有与钠通道电流相关的失调 的受试者的方法，所述方法包括鉴定选择性结合mNavL3a亚基多肽 的试剂，向需要这种治疗的受试者施用药理学试剂，所述药理学试剂 对于包含mNav1.3 a亚基多肽的钠通道是有选择性的.
在一个实施方式中，所述失调是疼痛、感觉异常、中风、头外伤、 神经变性失调、或与神经元的超兴奋性有关的失调.
附图的简要说明
附

图1描述了新的鼠Nav1.3 a亚基氨基酸序列与两种人类Nav1.3 a 亚基序列和大鼠Nav1.3 a亚基序列的氨基酸序列比对，
附图2描述了新的鼠Nav1.3 a亚基氨基酸序列与GenBank Acc. No.NM一018732的部分核苷酸序列编码的氨基酸序列的氨基酸序列比 对。来自克隆mNavl.3野生型的预测的氨基酸序列与公开的部分小鼠 NavL3蛋白(登记号码NM—018732)进行比对.相同的残基高亮度显 示，终止密码子显示为灰色，部分小鼠mNavl.3蛋白与克隆mNavl.3的比对从氨基酸853到1115.264-289的区域可能代表mNavl.3的可变 剪接区域.
附图3是描述用新的鼠Nav1.3 a亚基转染的、以一定电压范闺去极 化的非洲爪蟾印母细胞中的钠电流的图表，
附图4是描述用新的鼠Nav1.3 a亚基转染的、以一定电压范围去极
化的非洲爪蟾卵母细胞中平均电流/电压相互关系的图表， 附图5描述SEQ IDNOs:l-ll。
详细说明
本发明部分基于对新的Na+通道III型a (Nav1.3 )亚基的鉴定. 该新的cDNA是从鼠脑组织分离的.该cDNA的编码序列(SEQ ID NO:l)相应于表l中所示序列的核苷酸8到核苷酸5947.该新的亚基 的预测的氨基酸序列在SEQ ID NO:2示出.在GenBank⑧中登记号码 NM一006922、 AF225986和NM一013U9中发现了相关的人类和大鼠亚 基核苷酸序列(SEQIDNO:4、 SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8).已 经克隆了相关的鼠Na+通道cDNA的片段，在GenBank⑧登记号 NM—018732 (SEQ ID NO:IO)中发现.SEQ ID NO:2与这个序列的比 对在附图2中示出.
该新的鼠核酸序列含有与相关的人类和大鼠序列相比的差别.预 计这些差别编码了独特的多肽序列.在附图1中描述了该新的小鼠 3+ 通道a亚基的预测的氨基酸序列与相关的大鼠和人类亚基进行的比 对，
电压门控的Na+通道
电压门控的Na+通道是多亚基跨膜蛋白，具有大约260千道尔顿 (kD)的a亚基、大约35 kD的P 1亚基和大约35 kD的P 2亚基。这 些通道介导钠离子流入细胞.a亚基形成通道的电压敏感性的成孔部 分，p亚基调节a亚基的门控和细胞 一 细胞相互作用，Na+通道的ot亚 基含有四个重复的结构域(I-IV).这些重复结构域的每一个都含有六 个跨膜片段(S1感S6)(综述在Baker， MD， and Wood, JN. rremfa !Vi 泡,m22 ( 1 ) :27-31， 2001 ) a
电压门控的Na+通道响应膜极化的变化经历静止(极化；关通道； 可激活)、开放(去极化；开通道；激活)和关闭(去极化，关通道；钝化)状态的循环.大多数电压门控的Na+通道从开放快速地(即，数 毫秒内)关闭.离子导电a亚基的带电区域对膜极化的变化敏感。
Na+通道允许电脉冲在可兴奋细胞中产生和传播.举例来说，在 初级感觉神经元(例如，脊后根神经节(DRG)神经元、三叉神经神 经元)中表达的Na+通道响应刺激产生去极化上升支，其也是感觉信息 的传递所需的.
根据对河豚毒素(TTX)抑制的敏感性可以辨别Na+通道的亚型， 河豚毒素是河豚表达的胍盐毒素.TTX以纳摩尔范围内的浓度阻断 Navl.l、 Navl,2和Nav1.3 a亚基通道的活性.通道的所有三种类型都 在脑中表达.响应于损伤的Na+通道水平的去调节(disregulation)可 以导致神经元Na+通道的超兴奋性.这种类型的去调节被认为促进了 慢性疼痛.例如，轴突橫断引起某些Na+通道的下调和Nav1.3 a亚基 通道的上调(综述在Waxman，S,G.，iVa似re及ev. 2:652-659， 2001)，这 导致神经元的不适当的重复发放(firing).
如在此使用的，"钠通道a亚基"或"Na+通道a亚基"是指在 细胞，例如神经元细胞，例如，背根神经节中涉及接收、传导和发送 信号的蛋白。"鼠Na4.3a亚基"或"mNav1.3 a亚基"是指在此描述 的鼠的HI型a亚基.
如在此使用的，"Na+通道介导的活性"是指涉及Na+通道，例如， 脑细胞或肌细胞中的Na+通道的活性、功能或反应.Na+通道介导的活 性是在例如神经系统(例如，中枢神经系统和外周神经系统)、肌肉 组织、心脏组织和其他细胞和组织中接收、传导和发送信号所涉及的 活性.Na+通道介导的活性包括，例如，Na+流入细胞的调控和感觉刺 激的传递.并且，如在此可互换使用的，"Na+通道a亚基活性"、"mNav1.3 通道活性"、"Na+通道a亚基的生物学活性"、或"Na+通道a亚基 的功能活性"，是指Na+通道a亚基蛋白、多肽或核酸分子的活性、功 能或反应。
本发明的分离的蛋白，例如在此描述的mNav1.3 a亚基蛋白，具 有与SEQIDNO:2的氨基酸序列足够同源的氨基酸序列，或由与SEQ IDNO:l足够同源的核苷酸序列编码，如在此使用的，术语"足够同源 的"是指第一氨基酸或核苷酸序列，其含有与第二氨基酸或核苷酸序 列足够或最小数量的同一或等同(例如，具有相似側链的氨基酸残基)有共同的结构域或基序或共同的功能活性.编码SEQ ID NO:2的SEQ ID NO:l的核苷酸序列的所有筒并变体都认为是与SEQ ID NO:l "足 够同源的".
因此，本发明的另一个实施方式表征了具有niNav1.3 a亚基活性
的分离的11^3^.3 0[亚基蛋白和多肽、片段和其变体.
长度约5940个核苷酸的新的mNav1.3 a亚基编码序列(SEQ ID NO:l)编码长度约1980个氨基酸残基的蛋白.编码这个新的亚基的基 因在脑中表达，例如，在脑、心脏和骨骼肌中表达Na"J通道.Nav1.3 通道可以在给定组织中以低水平或高水平表达.某些在神经元中表达 的Nav1.3通道在神经元损伤后被上调(Waxman， SG， et al. J5/vw"及d 8886:5-14， 2000; Kim， CH， et al. MoZ. J5nn/t及d 95:153-161， 2001 ),
在以下小节中进一步详细地描述本发明的多种方面.
分岸^凝拔为、于
本发明的一个方面涉及编码niNav1.3 a亚基多肽或其生物学活性
部分的分离的核酸分子，以及核酸片段，其足以用作杂交探针来鉴定 编码在此描述的mNav1.3 a亚基的相关同种型的核酸分子，和用作PCR 引物用于mNav1.3 a亚基核酸分子的扩增或突变的片段.如在此使用 的，术语"核酸分子"意图包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA) 和RNA分子(例如，mRNA )和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA 的类似物.核酸分子可以单链的或双链，但优选的是双链DNA,
"分离的"核酸分子是与存在于该核酸的天然来源中的其他核酸 分子分离了的核酸分子."分离的"核酸不含在得出所述核酸的有机 体的基因组DNA中天然地側翼于所述核酸的序列(即，位于所述核酸 的5，和3，末端的序列).例如，在各种实施方式中，分离的mNav:L3a 亚基核酸分子可以含有少于约5kb、 4kb、 3 kb、 2kb、 1 kb、 0.5 kb或 0.1 kb的核苦酸序列，所述核苷酸序列在得出所述核酸的细胞的基因组 DNA中天然地側翼于所述核酸分子.此外，"分离的"核酸分子，例 如cDNA分子，当通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞物质、 或培养基，或当化学合成时可以基本上不含化学药品前体或其他化学 药品。可以使用标准的分子生物学技术和在此提供的序列信息来分离本
发明的核酸分子，例如具有SEQ ID NO:l的核苷酸序列的核酸分子， 或其部分.使用SEQ ID NO:l的核酸序列的全部或部分作为杂交探 针，可以使用标准的杂交和克隆技术分离mNav1.3 ct亚基核酸分子。(例 如,描述于Sambrook, J.， Fritsh， E. F.， and Maniatis， T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd， ed.， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor， N.Y"1989),
此外，包括SEQIDNO:l的全部或部分的核酸分子可以使用根据 SEQ ID NO:l的序列设计的合成寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应 (PCR)来分离.
本发明的核酸可以使用cDNA、 mRNA或可选择地使用基因组 DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩 增.这样扩增的核酸可以被克隆到合适的栽体中并通过DNA序列分析 来表征.此外，可以通过标准的合成技术，例如，使用自动化DNA合 成仪来制备相应于Na+通道a亚基核苷酸序列的寡核苷酸.
在另一个实施方式中，本发明的分离的核酸分子包含mNav1.3 a 亚基核酸分子，其是SEQIDNO:l所示核苷酸序列的互补物，或这些 核苷酸序列的部分.与SEQ ID NO:l所示核苷酸序列互补的核酸分子 是一种与SEQ ID NO:l所示核普酸序列足够互补从而可以与SEQ ID NO:l所示核苷酸序列杂交的核酸分子.
在再另一个实施方式中，本发明的分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:l所示核苷酸序列的完整长度有至少约75。/。、 85%、 95%或更高同 源性的核苷酸序列，或这个核苷酸序列的部分。
此外，本发明的核酸分子可以仅包含SEQIDNO:l的核酸序列的 一部分，例如，能用作探针或引物的片段或编码mNavl.3a亚基蛋白的 生物学活性部分的片段.根据克隆mNav1.3 a亚基cDNA确定的核苷酸
序列容许产生探针和引物，其被设计用于从其他物种鉴定和/或克隆相 关的同种型以及同源物.所述探针/引物一般包含基本上纯化的寡核苷 酸。所述寡核苷酸一般包含在严格条件下与SEQ ID NO:l的正义序 列、或SEQIDNO:l的反义序列、或SEQ ID NO:l的天然发生的等位 变体或突变体的至少约12或15个、优选的约20或25个、更优选的约30、 35、 40、 45、 50、 55、 60、 65或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序 列区域.
根据mNa4.3 a亚基核苷酸序列的探针可以用于检测编码相关同 种型的转录产物.所述探针可进一步包括连接于其上的标记基团，例 如，所述标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子， 这种探针可用作诊断测试试剂盒的部分，用于鉴定表达或错误表达 mNavl,3tt亚基蛋白的细胞或组织，例如，通过测量来自受试者的细胞 样品中编码mNavl,3a亚基的核酸的水平，例如，检測迈Nayl.3a亚基 mRNA水平或测定在将会影响mNav1.3 a亚基同种型表达的区域中基 因组mNav1.3 a亚基基因是否已经突变或删除.
通过分离编码具有mNav1.3 a亚基生物学活性(在此描述了 mNavl.3a亚基蛋白的生物学活性)的多肽的、SEQIDNO:l的核苷酸 序列的一部分，表达所编码的mNavl.3a亚基蛋白的部分(例如，通过 体外重组表达)，并评定所编码的mNavl.3 tt亚基蛋白的部分的活性，
可制备编码"11^34.3(1亚基蛋白的生物学活性部分"的核酸片段。
本发明进一步包括，由于遣传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列、并由此编码与SEQIDNO:l所示核苷酸序列 所编码的相同的mNav1.3 a亚基蛋白的核酸分子.在另一个实施方式
中，本发明的分离的核酸分子具有编码一蛋白的核普酸序列，所述蛋 白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列.
除了 SEQ ID NO:l所示的mNav1.3 a亚基核苷酸序列之外，本领 域技术人员应当理解的是，在群体中可能存在着导致mNav1.3 a亚基蛋 白的氨基酸序列变化的DNA序列多态性.由于天然的等位变异，这种 在mNav1.3 a亚基基因中的遗传多态性可能存在于群体的个体之间.如 在此使用的，术语"基因"和"重组基因"是指包含编码mNav1.3 a
亚基蛋白的开放阅读框的核酸分子.这种天然的等位变异一般可引起 mNav1.3 a亚基基因的核苷酸序列中1-5%的变化，在mNav1.3 a亚基
基因中，作为天然等位变异的结果并且不改变mNav1.3 a亚基蛋白的功 能活性的、任何的和所有的这种核苷酸变异以及产生的氨基酸多态
性，都包括在本发明的范闺之内.
此外，编码其他mNav1.3 a亚基通道家族成员并由此具有不同于 SEQ IDNO:l的mNav1.3 a亚基序列的核芬酸序列的核酸分子，包括在本发明的范围之内.例如，根据mNavl.3a亚基的核苷酸序列(例如， SEQIDNO:l)可以鉴定另一个mNavl,3a亚基cDNA,此外，编码来
自不同物种的mNav1.3 a亚基蛋白并由此具有不同于SEQ ID NO:l的 mNavl.3a亚基序列的核苷酸序列的核酸分子，包括在本发明的范围之内.
相应于本发明的mNav1.3 a亚基cDNA的天然等位变体和同源物 的核酸分子，可以根据它们与在此公开的mNav1.3 a亚基核酸的同源性 使用在此公开的cDNA或其部分作为杂交探针根据标准杂交技术在严 格杂交条件下来分离.
因此，在另一个实施方式中，本发明的分离的核酸分子长度是至 少15、20、25、30或更多个核苷酸，并在严格条件下与包含SEQ ID NO:l 的核苷酸序列的核酸分子杂交.优选的，所述分子在高度严格条件下 杂交.在其他实施方式中，所述核酸长度是至少30、 300、 500、 700、 850、 950或2000个核苷酸.如在此使用的，术语"在严格条件下杂交" 意图是描述杂交和洗涤的条件，在这种条件下彼此具有至少60%、 85 %或95%同源性的核苷酸序列一般仍然相互杂交.杂交条件是本领域 技术人员已知的，可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.， 6.3 a subuniU-6.3 a subunit.6, 1991中找到.中度 杂交条件定义为相当于在2X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在30TC下杂 交，随后在IXSSC、 0.1% SDS中在50TC下洗涤，高度严格条件定义 为相当于在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在45TC下杂交，随后在0.2 XSSC、 0.1%SDS中在651C下洗涤.
在中度或高度严格条件下与SEQ ID NO:l的序列杂交的本发明 的分离的核酸分子可以相应于天然发生的核酸分子.如在此使用的，
"天然发生的"核酸分子是指具有在自然中发生的核苷酸序列的RNA 或DNA分子(例如，编码天然蛋白).
除了可能存在于群体中的mNav1.3 a亚基序列的天然发生的等位 变体之外，本领域技术人员将进一步理解的是，可以通过突变向SEQ ID NO:l的核苷酸序列中导入变化，从而引起所编码的mNav1.3 a亚基蛋 白的氨基酸序列的变化，而不改变mNa4,3a亚基蛋白的功能能力.例 如，可以在SEQlDNO:l的序列中进行导致在"非必需"氨基酸残基
."非必需"氨基酸残基是可以在mNav1.3a亚基的野生型序列中改变而不改变生物学活性的残基，而"必需"氨 基酸残基是生物学活性所需的，例如，在本发明的mNavL3a亚基蛋白 之间保守的氨基酸残基，预计是特别不能改变的.此外，在本发明的 mNav1.3 a亚基蛋白和其他mNav1.3 a亚基通道亚基之间保守的其他氨 基酸残基很可能是不能改变的.
因此，本发明的另一个方面涉及编码mNa4.3 a亚基蛋白的核酸 分子，所述mNavl,3a亚基蛋白含有对于活性不必需的氨基酸残基的变 化.这种mNav1.3 a亚基蛋白在氨基酸序列上与SEQ ID NO:2不同， 而又保持了生物学活性.生物学活性可以通过在此描述的分析来测 量，例如Na+通道活性分析，例如Na+流入分析，在一个实施方式中， 分离的核酸分子包含编码一蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白包含与 SEQIDNO:2有至少约65。/。、 75%、 85%、 95%或更高同源性的氨基
酸序列.
可以通过向SEQ ID NO:l的核苷酸序列中导入一个或多个核苷 酸替换、添加或删除，从而在所编码的蛋白中导入一个或多个氨基酸 替换、添加或删除，来产生编码与SEQID NO:2的蛋白同源的mNav1.3 a亚基蛋白的分离的核酸分子.可以通过标准技术，例如定点诱变和 PCR介导的诱变来向SEQIDNO:l中导入突变，可以在一个或多个预 测的非必需氨基酸残基处进行保守性氨基酸替换，"保守性氨基酸替 换"是在其中氨基酸残基被替换为具有相似側链的氨基酸残基的一种 替换.本领域已经定义了具有相似側链的氨基酸残基的家族.这些家 族包括带有碱性側链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性側链 (例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天 冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性 側链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、甲硫氨酸、色氨酸)、beta-分支的側链(例如，苏氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸)和芳香族側链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨 酸)的氨基酸.由此，在mNavl.3a亚基蛋白中预测的非必需氨基酸残 基优选的被来自相同側链家族的另 一个氨基酸残基替换。在对SEQ ID NO:l诱变之后，可以表达编码的蛋白并且可以测定该蛋白的活性。
可以分析突变mNavl,3a亚基蛋白的(1)与非mNav1.3 a亚基蛋 白质分子，例如，Na+通道pi或p2亚基，或TTX相互作用；或(2)调节膜兴奋性的能力.
除了如上所述编码mNav1.3 tt亚基蛋白的核酸分子之外，本发明 的另一个方面涉及与其反义的分离的核酸分子."反义"核酸包含与 编码蛋白的"正义"核酸互补的核苷酸序列，例如，与双链cDNA分 子的编码链互补，或与mRNA序列互补.因此，反义核酸可以与有义 核酸氢结合(hydrogen bond).反义核酸可以与整个mNav1.3 a亚基 编码链互补，或仅与其一部分互补.在一个实施方式中，反义核酸分 子与编码mNa4,3a亚基的核苷酸序列的编码链的"编码区"反义.术 语"编码区"是指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区 域(例如，mNavl,3a亚基的编码区相应于SEQIDNO:l).在一个实 施方式中，反义核酸分子与编码mNav1.3 a亚基的核苷酸序列的编码链 的"非编码区"反义.术语"非编码区"是指側翼于编码区不被翻译 成氨基酸的5，和3，序列(即，也称为5，和3，非翻译区).
给出在此公开的编码mNav1.3 a亚基的编码链序列(例如，SEQ ID NO:l)，本发明的反义核酸可以根据Watson和Crick碱基配对的规则 来设计.反义核酸分子可以与mNav1.3 a亚基mRNA的完整编码区互 补，但更优选的是与mNav1.3 a亚基mRNA的编码或非编码区的仅一 部分反义的寡核苷酸.例如，反义寡核苷酸可以与围绕着mNav1.3 a 亚基mRNA的翻译起始位点的区域互补.反义寡核苷酸的长度可以 是，例如，约5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45或50个核苷酸. 本发明的反义核酸可以使用化学合成和酶连接反应使用本领域已知的 方法来构建.例如，可以使用天然发生的核苷酸或不同地修改的核苷 酸来化学合成反义核酸(例如，反义寡核苷酸)，目的是提高分子的 生物学稳定性或提高反义和正义核酸之间形成的双链体的物理稳定 性，例如，可以使用硫代磷酯衍生物和吖啶取代的核苷酸.可用于产 生反义核酸的修改的核苷酸的实例包括5-氟尿嘧咬、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧咬、5-碘尿嘧啶、次黄噪呤、黄噪呤、4-acetylcy tosine、 5-(羧 基鞋基甲基)尿嘧咬，1，5-carboxymethylami nomethyl-2-硫尿嘧咬、5-
黄苷、N6-异丙烯基腺嘌呤、1-甲基鸟噪呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基 鸟噪呤、2-甲基腺噪呤、2-甲基鸟噪呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、 N6-腺噪呤、7-甲基鸟嚷呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-
氢尿嘧咬、beta-D-galactosylqueosine、 次硫尿嘧焚、beta-D-mannosylqueosiiie、 5 ,-甲氧基羧甲基尿嘧梵、5-甲 氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、 wybutoxosine、伪尿嘧咬、queosine、 2-碟胞嘧咬、5-甲基-2-疏尿嘧咬、 2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、S-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿 嘧啶-5-氧乙酸(v) 、 5-甲基-2-硫尿嘧啶、3- (3-氨基-3-N-2-羧丙基) 尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤.做为选择，可以使用表达栽体生物学地产生 反义核酸，在所述表达栽体中已经按反义方向亚克隆了核酸(即，从 该插入的核酸转录的RNA将是感兴趣的目标核酸的反义反向的，在以 下小节中进一步描迷了).
一般地将本发明的反义核酸分子施用给受试者或在原位产生，从 而它们与编码mNav1.3 a亚基蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂 交或结合，从而抑制该蛋白的表达，例如，通过抑制转录和/或翻译。 根据常规的核苷酸互补性进行杂交来形成稳定的双链体，或，例如， 对于与DNA双链体结合的反义核酸分子来说，通过双螺旋的大沟中的 特异性相互作用来杂交.本发明的反义核酸分子的施用途径的实例包 括在组织部位直接注射.做为选择，可以修改反义核酸分子以靶向选 定的细胞，然后全身地施用.例如，对于全身性施用，可以修改反义 分子使得它们特异性结合选定细胞表面表达的受体或抗原，例如，通 过将反义核酸分子连接到与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体上。 也可以施用在此描述的栽体将反义核酸分子递送给细胞.为了达到反 义分子的足够的细胞内浓度，预想了栽体构建体，在其中反义核酸分 子被置于强pol H或pol III启动子的控制下.
在又一个实施方式中，本发明的反义核酸分子是a-异头核酸分 子.a-异头核酸分子与互补RNA形成特殊的双链杂交物，其中，与普 通的P单元相反,链是相互平行的(Gaultier et al. 7V"c7e/c JaVfa. 15:6625-6641， 1987).反义核酸分子也可以包含2 '-o-甲基核糖核苷酸 (Inoue et al. ( 1987) iV"c/e!c爿c!Vfc15:6131-6148)或嵌合的 RNA-DNA类似物(Inoue et al. Ffi^S JLe汰215:327-330， 1987 ),
在再另一个实施方式中，本发明的反义核酸是核酶。核酶是具有 核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其能够裂解含有与它们互补的区 域的单链核酸，例如，mRNA,因而，核酶(例如，锤头核酶(描述于 (Haselhoff and Gerlach iV似",e 334:585-591， 1988))可用于催化性裂解mNav1.3 a亚基mRNA转录产物从而抑制mNav1.3 a亚基mRNA的 翻译.可以根据在此公开的mNavl,3a亚基cDNA的核苷酸序列(即， SEQ ID NO:l)设计具有对mNav1.3 a亚基编码核酸的特异性的核酶. 例如，可以构建四膜虫L"19IVSRNA的衍生物，其中活性部位的核苷 酸序列与mNav1.3 a亚基编码mRNA中要裂解的核苷酸序列互补.参 见，例如，Cech et al.美国专利No.4，987，071;和Cech et al.美国专利 No.5，116，742,做为选择，mNav1.3 a亚基mRNA可用于从RNA分子库 (pool)中挑选具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA,参见，例 如，Bartel， D. and Szostak， J. W. Scie/ice 261:1411-1418， 1993.
在本发明的另一个实施方式中，RNA干扰(RNAi)可以用于抑制 mNavl.3tt亚基蛋白的表达.可以降低各种抑制性RNAi分子，那些抑 制mNav1.3 a亚基表达的分子可以配制为药物组合物，来在在此描述的 治疗方法中施用。
RNAi是一种术语，用于指一种机制，通过这种机制特定的mRNA 在宿主细胞中被降解，为了抑制mRNA，相应于待沉默的基因(例如， 编码mNa4.3 a亚基多肽的基因)的一部分的双链RNA (dsRNA)被 导入到细胞中.dsRNA被消化成21-25个核苷酸长度的双链体，称为 短干扰RNA (或siRNA)，其与核酸酶复合物结合形成所称的RNA 诱导的沉默复合物(RISC).通过在siRNA链之一和内源mRNA之 间的碱基配对相互作用，RISC靶向同源的转录产物.它然后裂解 mRNA的从siRNA 3，端起约12个核苷酸.(参见Sharp " a/.， Ge/ies "ev. 15:485-490， 2001， and Hammond " fl/" iVa似re及ev. (Jew. 2:110-119, 2001).研究在人类细胞，包括人类胚肾细胞和Hela细胞中成功地证 明了RNAi(参见，例如，Elbashir W a/.，7Vfl似re 411:494-498， 2001). 通过进行RNA发夹序列的内源表达(参见Paddison " fl/.， iVoc. A^/. Jcarf. 99:1443-1448， 2002)或通过小的(21-23nt) dsRNA的
转染(综述在Caplen，7VemfeiVi历WecA. 20:49-51,2002)，可以在哺乳
动物细胞中诱导基因沉默。
RNAi技术利用了标准的分子生物学方法.dsRNA(在此，例如， 其相应于编码mNav1.3 a亚基多肽的序列)可以通过标准方法产生(例 如，通过用T7 RNA聚合酶同时转录相应于mNav1.3 a亚基序列的模板 DNA的两条链；RNA也可以化学合成或重组产生).生产dsRNA的试剂盒是商业上可获得的(来自，例如，New England Biolabs，Inc), 用于介导RNAi的RNA可以包括合成的或修改的核苷酸，例如硫代磷 酯核普酸。用dsRNA或用工程化以产生dsRNA的质粒转染细胞的方 法也是本领域常规的.
已经报道了在用mRNA-cDNA杂交构建体转染的哺乳动物细胞中 与RNAi所观察到的相类似的基因沉默效果(Lin "a/.，历oc/^饥 J8/印/^s.281:639-644， 2001)。因此，含有mNav1.3 a亚基 序列的mRNA-cDNA杂交物，以及含有mNav1.3 a亚基序列的双链体 (例如，含有21-23 bp单体的双链体)，在本发明的范围之内.可以 根据在此描述的分析测试杂交物和双链体的活性(即，它们可以充当 测试试剂)，展现出抑制活性的那些可以用来治疗患者，所述患者患 有，或可能发展出与mNavl.3a亚基活性有关的疾病或状况，例如神经
性疼痛.
本发明的dsRNA分子(相应于mNav1.3 a亚基基因的一部分的双 链RNA分子)可以按各种方式变化，例如，它们可以包括3，羟基以及， 如上所述，可以含有21、 22或23个连续核苷酸的链.此外，在3，末 端、5，末端、或在两端，它们可以是平端的，或包括突出末端.例如， RNA分子的至少一条链可以具有长度约1到约6个核苷酸的3，突出(例 如，1-5、 1-3、 2-4或3-5个核苷酸(无论是嘧啶核苷酸还是嘌呤 核苷酸).当两条链都包括突出时，对于每条链，突出的长度可以是 相同的或不同的.为了进一步提高RNA双链体的稳定性，可以针对降 解来稳定3，突出(通过，例如，包括入噪呤核苷酸，例如腺苷酸或乌 嚷呤核苷酸，或通过修改的类似物替换嘧啶核苷酸(例如，用2'-脱 氧胸腺嘧啶核苷来替换尿嘧啶核苷2核苷酸3，突出的替换，有耐受性 并且不影响RNAi的效率)，构成双链体或杂交抑制物的，或仅作为反 义RNA寡核苷酸的单链mNav1.3 a亚基RNA分子，也在本发明的范 围之内。任何dsRNA都可以用于本发明的方法，只要它与感兴趣的目 标基因，例如，mNa4.3a亚基基因有足够介导RNAi的同源性.虽然 如上所述双链体具有21-23个核苷酸，但本发明不受此限制；在可以 施用的dsRNA的长度方面没有上限(例如，dsRNA可以从基因的约21 个碱基对到基因的全长，或更多(例如，50-100、 100-250、 250-500、 500-1000，或超过1000个碱基对).当将这些核酸施用给人类时，它们可以降低mNavl,3 a亚基 mRNA水平，从而抑制mNav1.3 a亚基的表达，将细胞或有机体维持 在某些情况下，在这些情况中mNav1.3 a亚基mRNA被降解，从而在 细胞或有机体中介导RNAi.做为选择，可以从个体获得细胞，在体外 处理，并重新导入到个体中.
在又一个实施方式中，本发明的mNav1.3 a亚基核酸分子可以在 碱基部分、糖部分或磷酸醋主干进行修改来改善，例如，分子的稳定
主干来产生肽核酸，(参见Hyrup B. et al. 说'卯rgflm'c在Aferf/ci/tfl/ CAe附^/j 4( 1): 5-23， 1996).如在此使用的，术语"肽核酸"或"PNA" 是指核酸模拟物例如DNA模拟物，在其中脱氧核糖裤酸醋主干被伪肽 主千替代，仅保留四个天然的核碱基.已经显示了 PNA的中性主干允 许在低离子强度的条件下与DNA和RNA特异性杂交.可以使用标准 的固相肽合成方案，例如在Hyrup B. et al. supra; Perry-O'Keefe et al. 尸wc. iVW/. Jcarf. 5W. 93: 14670-675， 1996中描述的，来进行RNA寡聚 物的合成.
mNav1.3 ot亚基核酸分子的PNA可以用于治疗和诊断应用.例 如，PNA可以用作反义或抗基因(antigene)试剂，用于通过例如诱导 转录或翻译延滞或抑制复制来序列特异性地调节基因表达.mNav1.3 a 亚基核酸分子的PNA也可以用于基因中的单碱基对突变分析，(例如， 通过PNA指导的PCR钳)；当与其他酶组合使用时作为"人工限制 性内切酶"，(例如，SI核酶(Hyrup B.,同上))；或作为探针或 引物用于DNA测序或杂交(Hyrup B. et al"同上；Perry-O'Keefe, 同上)。
在另一个实施方式中，通过给PNA连接亲油性的或其他辅助基 团，通过PNA-DNA嵌合体的形成，或通过使用脂质体或本领域已知 的其他药物递送技术，可以修改mNav1.3 a亚基的PNA (例如，来增 强它们的稳定性或细胞摄取).
在其他实施方式中，寡核苷酸可以包括其他附加的基团，例如肽 (例如，用于体内靶向宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运(参见， 例如Letsinger et al. /Voc. TVfl". Jcflrf. 5W. US. 86:6553-6556， 1989j Lemaitre et al.7Va汰5W.84:648-652， 1987; PCT '〉开No.W088/09810))或跨血脑屏障转运(参见，例如，PCT公开 No.W089/10134)的试剂.此外，可以用杂交触发的裂解试剂(参见， 例如Krol et al.说o-rec/im^ies 6:958-976， 1988)或插入试剂(参见， 例如Zon 7V^/m5:539-549， 1988)来修饰寡核苷酸.为此，寡核 苷酸可以与另一个分子结合(例如，肽、杂交触发的交联剂、转运试 剂、或杂交触发的裂解试剂).
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本发明一个方面涉及分离的mNav1.3 a亚基蛋白和其生物学活性 部分，以及适合用作免疫原来产生抗mNavl.3 a亚基抗体的多肽片段， 在一个实施方式中，可以使用标准的蛋白纯化技术通过合适的纯化方 案从细胞或组织来源分离天然mNav1.3 a亚基蛋白.在另一个实施方式 中，通过重组DNA技术产生mNa4,3a亚基蛋白.作为对重组表达的 替代，可以使用标准的肽合成技术来化学地合成mNav1.3 a亚基蛋白或 多肽。
"分离的"或"纯化的"蛋白或其生物学活性部分基本上不含来 自得出该mNav1.3 a亚基蛋白的细胞或组织来源的细胞物质或其他污 染蛋白，或当化学合成时基本上不含化学药品前体或其他化学药品. 用语"基本上不含细胞物质"包括制备mNavl.3a亚基蛋白，其中蛋白 从细胞的细胞组分分离，所述蛋白分离自所述细胞或由所述细胞重组 产生。在一个实施方式中，用语"基本上不含细胞物质"包括制备 mNav1.3 a亚基蛋白，所述mNav1.3 a亚基蛋白具有低于约30% (干重) 的非mNavL3a亚基蛋白(在此也称为"污染蛋白")，更优选的低于 约20%、 10%或5%的非mNavl,3a亚基蛋白，当所述mNav1.3 a亚基 蛋白或其生物学活性部分是重组产生的时，同样优选的是它基本上不 含培养基，即，培养基低于蛋白制品体积的约20%、 10%或5%.
用语"基本上不含化学药品前体或其他化学药品"包括制备 mNav1.3 a亚基蛋白，其中所述蛋白从在该蛋白的合成中所涉及的化学 药品前体或其他化学药品中分离.用语"基本上不含化学药品前体或 其他化学药品"包括制备niNav1.3 a亚基蛋白，其具有低于约30%、 20%、 10%或5% (干重)的化学药品前体或非mNa4.3a亚基化学药如在此使用的，mNav1.3 a亚基蛋白的"生物学活性部分"包括 mNav1.3 a亚基蛋白的片段，其参与mNav1.3 a亚基分子与非mNav1.3 a 亚基分子之间的相互作用.mNav1.3 a亚基蛋白的生物学活性部分包括 包含氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列来源于mNav1.3 a亚基蛋白的氨 基酸序列，例如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或与之足够同源， 所述肽包括比全长mNavl.3a亚基蛋白少的氨基酸，并展现出mNav1.3 a亚基蛋白的至少 一种活性. 一般地，生物学活性部分包含具有mNavl .3 a亚基蛋白的至少一种活性的结构域或基序，所述活性例如结合P 1或 0 2 Na+通道亚基.mNav1.3 a亚基蛋白的生物学活性部分可以用作把 点，用于开发调节Na+通道介导的活性的试剂，
在一个实施方式中，mNav1.3 a亚基蛋白的生物学活性部分包含 至少一个跨膜结构域。mNav1.3 a亚基蛋白的生物学活性部分介导 mNav1.3 a亚基活性并包括mNav1.3 a亚基蛋白的一种或多种特征.在 其中蛋白的其他区域被删除的生物学活性部分，可以通过重组技术来 制备，并对其评估天然mNav1.3 a亚基蛋白的一种或多种功能活性.
在一个实施方式中，mNav1.3 a亚基蛋白具有SEQ ID NO:2所示 的氨基酸序列，或基本上与SEQIDNO:2同源，并保持了 SEQIDNO:2 的蛋白的功能活性，而由于天然的等位变异或突变在氨基酸序列上又 不同，如在关于核苷酸的小节中详细描述的.
因此，在另一个实施方式中，mNavl .3 a亚基蛋白是包含与SEQ ID NO:2有至少约50。/n、 75%、 85%、 95%、 99%或更高特异性的氨基酸 序列的蛋白.
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源性百分比，根据最优 的比较目的对序列进行比对(例如，可以在笫一氨基酸或核酸序列中 导入缺口来优化与笫二氨基酸或核酸序列的比对，并且对于比较目的 可以忽略非同源序列).用于比较目的比对的参考序列的长度可以是 该参考序列长度的至少50%、甚至70%、 80%或90%.然后比较相应
氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸.当第一序列中的 一个位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据 时，则该分子在这个位置是同源的(即，如在此使用的，氨基酸或核 酸"同源性"相当于氨基酸或核酸"同一性").两个序列之间的同 源性百分比是序列共有的同一的位置数目的函数(即，同源性％ -同一的位置数/总位置数x100).
可以使用数学算法来完成两个序列之间的序列比较和同源性百分 比的确定.用于序列比较的数学算法一个非限制性实例是Karlin and Altschul iVfl汰t/A4 87:2264-68， 1990的算法，在Karlin and Altschul尸roc. iVa". Jcc^. 5W. t/5L4 90:5873-77， 1993中进行了修 改，这种算法被合并到Altschul， et al. / Mo/. 215:403-10， 19卯的 NBLAST和XBLAST程序中(版本2.0).可以用NBLAST程序进行 BLAST核苷酸检索，分值- 100，字长- 12,来获得与本发明的mNav1.3 ot亚基核酸分子同源的核苷酸序列.可以用XBLAST程序进行BLAST 蛋白检索，分值-50，字长-3，来获得与本发明的mNav1.3 oc亚基蛋 白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对， 可以利用如Altschul et al" iV"c/"c25 (17) : 3389-3402， 1997 中描述的Gapped BLAST.当利用BLAST和Gapped BLAST程序时， 可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST )的默i人参数。参见 国家生物技术信息中心的网站，用于序列比较的数学算法的另一个非 限制性实例是Myers and Miller, CABIOS (1989)的算法.这种算法被 合并到ALIGN程序(版本2.0)中，其是GCG序列比对软件包中的一 部分.当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可以使用PAMI120 加权残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分.
本发明还提供了 mNav1.3 oc亚基嵌合或融合蛋白.如在此使用 的，mNav1.3 ot亚基"嵌合蛋白"或"融合蛋白"包含与非mNav1.3 a 亚基多肽可操作连接的mNav1.3 ct亚基多肽。"mNav1.3 oc亚基多肽" 是指具有相应于mNav1.3 cc亚基的氨基酸序列的多肽，而"非mNav1.3 a亚基多肽"是指具有相应于与mNav1.3 ct亚基蛋白基本上不同源的 蛋白的氨基酸序列，所述蛋白例如，不同于mNa4,3 a亚基蛋白并来 源于相同或不同有机体的蛋白，或不含有在此描述的mNav1.3 a亚基 蛋白的一种或多种特征的蛋白，在mNav1.3 ot亚基融合蛋白中， mNav1.3 ot亚基多肽可以相应于mNav1.3 a亚基蛋白的全部或部分. 在特定的实施方式中，mNavl.3 a亚基融合蛋白包含mNa4.3 cx亚基 蛋白的至少一个生物学活性部分.在另一个实施方式中，mNav1.3 a 亚基融合蛋白包含mNav1.3 a亚基蛋白的至少两个生物学活性部分. 在所述融合蛋白中，术语"可操作连接的"意图是指出niNav1.3 ct亚基多肽和非inNav1.3 a亚基多肽是按阅读框相互融合的，非mNav1.3 ot亚基多肽可以与mNavl,3 a亚基多肽的N-末端或C-末端融合.
例如，在一个实施方式中，所述融合蛋白是GST-mNav1.3 ot亚 基融合蛋白，其中mNavl.3 a亚基序列被融合到GST序列的C-末端. 这种融合蛋白可以便于重组mNav1.3 ot亚基的纯化，
在另一个实施方式中，所述融合蛋白是在其N-末端含有异源信号 序列的mNa4.3 oc亚基蛋白.在某些宿主细胞(例如，哺乳动物宿主 细胞)中，mNav1.3 ot亚基的表达可以通过使用异源信号序列来提高.
本发明的mNav1.3 ot亚基融合蛋白可以掺入药物组合物并体内 施用给受试者，mNav1.3 oc亚基融合蛋白可以用来影响mNav1.3 ct亚 基底物的生物利用率.对于治疗与Na+通道活性有关的失调，例如，神 经性疼痛，使用mNav1.3 a亚基融合蛋白可能是治疗上有用的。
此外，本发明的mNa4.3 a亚基融合蛋白可用作免疫原来在受试 者中产生抗niNav1.3 a亚基抗体，来纯化mNav1.3 a亚基配体，和用 于筛选分析以鉴定抑制mNavl.3 a亚基与mNav1.3 a亚基底物的相互 作用的分子.
本发明的mNav1.3 a亚基嵌合或融合蛋白可以通过标准的重组 DNA技术产生.例如，根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片 段按阅读框连接在一起，例如，通过使用平端的或交错端的末端用于 连接，限制性内切酶消化以提供合适的末端，视情况填补粘性末端， 碱性磷酸酶处理以避免不希望的接合，和酶连接.融合基因可以通过 常规技术，包括自动化DNA合成仪，来合成.做为选择，可以使用锚 引物来进行基因片段的PCR扩增，所述锚引物产生两个连续基因片段 之间的互补的突出，其随后可以退火和再扩增以产生嵌合基因序列(参 见,例如Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992 ).此外许多以及编码融合部分的表达栽体(例 如，GST多肽)是商业上可获得的.mNa4.3a亚基编码核酸可以克隆 到这种表达栽体中，从而融合部分按阅读框连接到mNav1.3 a亚基蛋白 上.
本发明还涉及作为mNav1.3 a亚基激动剂(模拟物)或作为 mNavl.3a亚基拮抗剂起作用的mNav:L3a亚基蛋白的变体.可以通过 诱变，例如，离散点突变或对inNav1.3 a亚基蛋白的截断来产生mNav1.3a亚基蛋白的变体.mNav1.3 a亚基蛋白的激动剂可以基本上保持 mNav1.3 a亚基蛋白的天然发生形式的相同的生物学活性，或其生物学 的活性的子集.mNav1.3 a亚基蛋白的拮抗剂可以通过例如竟赛地调节 mNav1.3 a亚基蛋白的Na+通道介导的活性，来抑制mNav1.3 a亚基蛋 白的天然发生的形式的一种或多种活性。因而，通过用有限功能的变 体处理可以引发特定的生物学效果.在一个实施方式中，用具有所述 蛋白的天然发生形式的生物学活性子集的变体治疗受试者，相对于用 mNav1.3 a亚基蛋白的天然发生形式治疗，在受试者中有较少的副作 用。
在一个实施方式中，作为mNa4,3 a亚基激动剂(模拟物)或作 为mNav1.3 a亚基拮抗剂起作用的mNav1.3 a亚基蛋白变体可以通过根 据mNav1.3 a亚基蛋白激动剂或者拮抗剂活性筛选mNav1.3 a亚基蛋白 的突变体，例如，截断突变体的组合库来鉴定.在一个实施方式中， mNavl.3 a亚基变体的多样化的库通过核酸水平的组合诱变来产生，并 由多样化的基因文库编码。可以通过例如，将合成寡核苷酸的混合物 酶连接到基因序列中，从而作为单独的多肽或选择性地作为其中含有 mNav1.3 a亚基序列组的更大的融合蛋白的组(例如，对于噬菌体展 示)，可能的mNav1.3 a亚基序列的简并组是可表达的，来产生mNav1.3 a亚基变体的多样化库.存在着可用于从简并寡核苷酸序列产生可能的 mNav1.3 a亚基变体库的各种方法.可以在自动DNA合成仪中进行简 并基因序列的化学合成，合成基因然后可以连接到适合的表达栽体 中。使用基因的简并组允许在混合物中提供编码期望的、可能的 mNav1.3 a亚基序列组的所有序列.合成简并寡核苷酸的方法是本领域 已知的(参见，例如Narang， S. A. 7^rflAWrort 39:3， 1983; Itakura et al.
及ev.53:323， 1984; Itakura et al. 5"度e 198:1056， 1984; Ike et al. iVwc/e/c ^c/rf及m. 11:477， 1983
此外，mNav1.3 a亚基蛋白编码序列的片段的库可以用来产生 mNav1.3 a亚基片段的多样化群体，用于mNav1.3 a亚基蛋白变体的筛 选和随后的选择.
在此描述的mNav1.3 a亚基蛋白可以用可检测物质直接或间接地 标记，以便于检测结合的或未结合的结合试剂.适合的可检测物质包 括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性物质.分离的mNav1.3 a亚基蛋白或其部分或片段可被用作免疫原来使 用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术产生结合mNav1.3 a亚基的抗 体，可以使用全长mNavl,3a亚基蛋白，或做为选择，本发明提供了用 作免疫原的mNav1.3 a亚基的抗原性肽片段.mNav1.3 a亚基的抗原性 肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2的氨基酸序列的 至少8个氨基酸残基，并包括mNavl,3a亚基的表位，从而针对该肽产 生的抗体与mNavl,3a亚基形成特定的免疫复合物.优选的，抗原性肽 包含至少IO、 15、 20或30个氨基酸残基.
mNav1.3 a亚基免疫原一般用于通过使用该免疫原免疫适合的受 试者(例如，兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)来制备抗体.适合的 免疫原性制品可以含有，例如，重组表达的mNavl,3a亚基蛋白或化学 合成的mNavl,3a亚基多肽.该制品可以进一步包括佐剂，例如弗氏完 全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激性试剂.用免疫原性mNav1.3 a 亚基制品免疫适合的受试者诱导了多克隆抗mNav1.3 a亚基抗体反 应.
因此，本发明的另一个方面涉及抗mNav1.3 a亚基抗体.如在此 使用的术语"抗体"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活 性部分，即，含有特异性地与抗原例如mNa4Ja亚基结合(免疫反应) 的抗原结合位点的分子.免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括F (ab)和F (ab') 2片段，可通过用酶，例如胃蛋白酶处理抗体产生。 本发明提供了结合mNav1.3 a亚基的多克隆和单克隆抗体，如在此使用 的，术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"是指抗体分子的群 体，其仅含有能与mNav1.3 a亚基的特定表位免疫反应的一类抗原结合 位点.因而单克隆抗体组合物一般展现了对于其免疫反应的特定 mNav1.3 a亚基蛋白的单一结合亲合性。
如上所述通过用mNav1.3 a亚基免疫原免疫适合的受试者可以制 备多克隆抗mNavl,3a亚基抗体.可以通过标准技术，例如，用使用了 固定化mNavl.3a亚基的酶联免疫吸附分析(ELISA)，可以监视免疫 的受试者中在时间上抗mNavl.3a亚基抗体滴度.如杲需要，可以从哺 乳动物(例如，从血液)分离针对mNavl.3a亚基的抗体分子，通过已 知技术，例如蛋白A层析来进一步纯化，以获得IgG级分.在免疫后 的适当时间，例如，当抗mNav:L3a亚基抗体滴度最高时，可以从受试者获得抗体生产细胞，用于通过标准技术制备单克隆抗体，例如，最
初由Kohler and Milstein (l975) JVa似"256:495_497描述的杂交瘤技 术(也参见Brown et al. / /附附mwo/. 127:539-46， 1981; Brown et al. j.
Oie/ft 255:4980-83， 1980; Yeh et al. iVoc. Wa".爿caA 5W. 76:2927-31， 1976; and Yeh et al. /W. / Cancer 29:269-75， 1982 )，更新 近的人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al. 7> w"/io/ 7V，rf^ 4:72， 1983 ), EBV杂交瘤技术(Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss， Inc., pp, 77-96， 1985)或三瘤(trioma)技术。 生产单克隆抗体杂交瘤的技术是公知的(一般参见R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); E. A. Lerner Yale / 脂.脸rf.， 54:387-402， 1981; M. L. Gefter et al. Somatic Cell Genet. 3:231-36， 1977),简要地，将永生细胞系( 一般是骨髄瘤)与来自用 如上所述mNav1.3 a亚基免疫原免疫的哺乳动物的淋巴细胞( 一般是脾 细胞)融合，筛选产生的杂交瘤细胞的培养物上清液来鉴定产生结合 mNav:L3a亚基的单克隆抗体的杂交瘤.
可以将许多用于融合淋巴细胞和永生细胞系的已知方案的任何一 种，应用于产生抗mNa4.3a亚基单克隆抗体的目的(参见，例如，G. Galfre et al.266:55052, 1977j Gefter et al. S頻Wc CW/ ( 麼t， cited supra; Lemer， Yale / J :'o/. AfedL， cited supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, cited supra).此夕卜，技术人员将能理解，存在 着也会有用的这些方法的许多变体.
作为对制备单克隆抗体分泌杂交瘤的选择，可以通过用mNav1.3 a 亚基筛选重组组合免疫球蛋白库(例如，抗体噬菌体展示库)从而分 离结合mNav1.3 a亚基的免疫球蛋白库成员，来鉴定和分离单克隆抗 mNav1.3 a亚基抗体.用于产生和筛选噬菌体展示库的试剂盒是商业上 可获得的(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, CatalogNo.27-9400-01 ).另外，对于产生和筛选抗体展示库特别有用 的方法和试剂的实例可以在例如Ladner et al.美国专利No.5，223，409; Kang et al. PCT国际公开No.WO 92/18619;和McCafferty et al. iVa似^ 348:552-554， 1990中找到.
另外，可以使用标准重组DNA技术产生的重组抗mNavl.3 a亚基抗体，例如包含人类和非人类部分的嵌合和人源化单克隆抗体，在本 发明的范闺之内.这种嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知
的重组DNA技术产生，例如，使用以下描述的方法，Robinsonetal.国 际申请No.PCT/US86/02269; Akira， et al.欧洲专利申请184,187; Taniguchi， M.，欧洲专利申请171,496; Morrison et al.欧洲专利申请 173,494; Neuberger et al. PCT国际公开No.WO 86/01533; Cabilly et al. 美国专利No.4，816，567; Cabilly et al.欧洲专利申请125,023; Better et al. 5We"ce 240:1041-1043， 1988; Liu et al. iVoc. iVfl比爿ow/. t/5L4 84:3439-3443， 1987; Liu et al. / /附w"wo/. 139:3521-3526， 1987; Sim et al. iVoc.胸/. ]carf. 84:214-218， 1987; Nishimura et al. Omc.
47:999-1005， 1987; Wood et al. iVa似re 314:446-449， 1985;和Shaw et al. / Omcer Jto. 80:1553-1559， 1988) ; Moirison， S. L. 5V:iV脏 229:1202-1207， 1985; Oi et al. 5/orecA附《"es 4:214， 1986; Winter美国 专利No.5，225，539; Jones et al. Atore 321:552-525， 1986; Verhoeyan et al. 5We/ice 239:1534， 1988;和Beidler et al. / /m/mmo/. 141:4053-4060， 1988。
抗mNa4.3 a亚基抗体(例如，单克隆抗体)可用于通过标准技 术，例如亲和层析或免测沉淀来分离11^34.3 0[亚基。抗mNavl,3a亚 基抗体可以便于来自细胞的天然mNav1.3 a亚基、和在宿主细胞中表达 的重组产生的mNavl.3a亚基的纯化，此外，抗mNav1.3 a亚基抗体可 用于检测mNavl,3a亚基蛋白(例如，在细胞的溶胞产物或细胞上清液 中)来评估mNav1.3 a亚基蛋白表达的丰度和模式.可以诊断性使用抗 mNav1.3 a亚基抗体来监视组织中的蛋白水平，作为临床试验过程的一 部分，例如，来确定给定治疗方法的效力。可以通过将抗体联结(即， 物理连接)到可检测物质来便于检测。可检测物质的实例包括各种酶、 辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性物质。适合的酶 的实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶； 适合的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋 白/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形稱、荧光素、异硫氰酸荧 光素、罗丹明、二氯三喙基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材 料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、萤光素和 水母发光蛋白，适合的放射性物质的实例包括1251、 35S、或311.本发明的另一个方面涉及栽体，优选的表达栽体，含有编码
mNavl,3a亚基蛋白的核酸(或其部分).如在此使用的，术语"栽体" 是指能够转运与之连接的另一个核酸的核酸分子. 一种类型的栽体是 "质粒"，是指在其中可以连接其他DNA片段的环状双链DNA环. 另一种类型的栽体是病毒栽体，其中其他的DNA片段可以连接到病毒 基因组中.某些栽体能够在导入它们的宿主细胞中自主复制(例如， 具有细菌复制起点的细菌栽体和游离哺乳动物栽体).其他类型的栽 体(例如，非游离哺乳动物栽体)在导入宿主细胞中时被整合到宿主 细胞的基因组中，从而随宿主基因组一起复制。此外，某些栽体能够 指导与它们可操作连接的基因的表达.这种栽体在此称为"表达栽 体". 一般地，在重组DNA技术中有实用性的表达栽体常常是质粒的 形式.在此，"质粒"和"栽体"可互换地使用，因为质粒是最常用 的载体形式。然而，本发明意图包括其他形式的表达栽体，例如病毒 栽体(例如，复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺病毒相关病毒)， 其提供了等同的功能.
本发明的重组表达包含以适合于宿主细胞中核酸表达形式存在的 本发明的核酸，这意味着所述重组表达栽体包括一个或多个根据用于 表达的宿主细胞选择的调节序列，所述调节序列要表达的核酸序列可 操作连接.在重组表达载体内，"可採作连接的"意指感兴趣的核苷 酸序列以允许所述核苷酸序列表达的方式与调节序列连接(例如，在 体外转录/翻译系统中，或当载体导入宿主细胞中时在宿主细胞中). 术语"调节序列"意图包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例 如，多聚腺苦酸信号)，例如，在Goeddel; Gene Expression Technology-Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 中描述了这种调节序列.调节序列包括在许多种类的宿主细胞中指导 核苷酸序列的组成型表达的那些，和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸 序列表达的那些(例如，组织特异性调节序列).本领域技术人员要 理解的是，表达栽体的设计可以取决于一些因素，例如，要转化的宿 主细胞的选择、希望的蛋白表达水平，等等，本发明的表达栽体可以 被导入宿主细胞，从而生产由在此描述的核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽(例如，mNavl,3 a亚基蛋白、mNav1.3 a亚基蛋白的突 变形式、融合蛋白，等等).
本发明的重组表达栽体可以被设计为在原核或真核细胞中表达 mNav1.3 a亚基蛋白.例如，mNav1.3 a亚基蛋白可以在细菌细胞例如 E,coli、昆虫细胞(使用杆状病毒表达栽体)、酵母细胞、两栖动物细 胞或哺乳动物细胞中表达，在Goeddel， Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185， Academic Press, San Diego， Calif. (1990) 中进一步讨论了适合的宿主细胞.做为选择，重组表达栽体可以体外 转录和翻译，例如，使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
原核生物中的蛋白表达最常见地在带有栽体的E.coli中进行，所 述栽体含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或可诱导启动子.
例如，纯化的融合蛋白可以用于mNav1.3 a亚基活性分析，(例 如，以下详细描述的直接分析或竟争性分析)，或用以产生特异于 mNav1.3 a亚基的抗体.
在另 一个实施方式中，mNav1.3 oi亚基表达栽体是酵母表达栽体. 用于在酵母S. cerivisae中表达的栽体的实例包括pY印Secl( Baldari， et al.， 1987， EMBO J. 6:229-234. )、pMFa( Kurjan and Herskowitz， Cell 30 : 933-943， 1982 ) 、 pJRY88 ( Schultz et al" Gene 54 : 113-123， 1987)、 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego， Calif.)和picZ (InVitrogen Corp， San Diego， Calif.)。
做为选择，mNav1.3 a亚基蛋白可以使用杆状病毒表达栽体在昆 虫细胞中表达.可用于在培养的昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中表达蛋 白的杆状病毒栽体包括pAc系列(Smith et al.似o/. CW/说W. 3:2156-2165， 1983)和pVL系列(Lucklow and Summers 170:31-39， 1989),
在又一个实施方式中，本发明的核酸使用哺乳动物表达栽体在哺 乳动物细胞中表达，哺乳动物表达栽体的实例包括pCDM8 (Seed, B. iVa似re 329:840， 1987 )和pMT2PC (Kaufman et al. 义6:187-195，
1987)。当在哺乳动物细胞中使用时，通常通过病毒调节元件来提供 表达栽体的控制功能.例如，常用的启动子来源于多形瘤、腺病毒2、 巨细胞病毒和猿猴病毒40.关于原核和真核细胞的其他适合的表达系 统,参见Sambrook, J.， Fritsh， E. F.， and Maniatis, T. Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2nd， ed， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.， 1989的第 16和17章.
在另一个实施方式中，重组哺乳动物表达栽体能够指导核酸优先 地在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调节元件来表达核 酸).组织特异性调节元件是本领域已知的.适合的组织特异性启动 子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert et al, GWi" Z)ev. 1:268-277， 1987)、淋巴特异性启动子(Calame and Eaton jrfv. /附附imo/. 43:235-275， 1988 )、特别是T细胞受体(Winoto and Baltimore / 8:729-733， 1989 )和免疫球蛋白(Banerji et al. CW/ 33:729-740， 1983; Queen and Baltimore CW/ 33:741-748， 1983 )的启动子、神经元 特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne and Ruddle
86:5473-5477， 1989)、鼓腺特异性启动子(Edlund et al. 5Wewce 230:912-916， 1985)，和乳腺特异性启动子(例如，乳清启动 子；美国专利No.4，873，316和欧洲专利公开No.264，166).还包括发育 调节的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel and Gruss iSWe"ce 249:374-379， 1990)和a-甲胎蛋白启动子(Campes and Tilghman GWt^y Dev. 3:537-546， 1989 )
本发明进一步提供重组表达栽体，其包含以反义方向克隆到表达 栽体中的本发明的DNA分子.也就是说，DNA分子以一定方式与调 节序列可操作地连接，这种方式允许表达(通过DNA分子的转录)与 mNavl.3a亚基mRNA反义的RNA分子.可以选择与按反义方向克隆 的核酸可操作连接的调节序列，其指导反义RNA分子在各种细胞类型 中的连续表达，例如，病毒启动子或增强子，或可以选择调节序列， 其指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达.反义 表达栽体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中在高效率 调节区域的控制下产生反义核酸，其活性可通过其中导入了该栽体的 细胞类型来测定。对于使用反义基因调节基因表达的论述参见 Weintraub， H. et al" Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, 2>e/ /s i>t Gewd， Vol. 1 (1) 1986,
本发明的另一个方面涉及宿主细胞，在所述宿主细胞中导入了本 发明的核酸，例如，mNavl.3tt亚基mRNA或重组表达栽体，术语"宿主细胞"和"重组宿主细胞"在此可互换地使用.要理解的是，这种 术语不仅仅指特定的受试者细胞，还指这种细胞的子代或可能的子 代。由于突变或环境影响在继承的一代中可能出现某些改变，实际上， 这种子代可能不与母细胞完全相同，但仍然包括在此处使用的该术语 的范闺内.
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如，mNav1.3 a亚基蛋 白可以在细菌细胞例如E. coli、昆虫细胞、酵母细胞、非洲爪塘细胞 例如非洲爪蟾卵母细胞、或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞 (CHO )或COS细胞)中表达.其他适合的宿主细胞是本领域技术人 员已知的.
可以通过常规转化或转染技术将栽体DNA导入到原核或真核细 胞中.如在此使用的，术语"转化"和"转染"意指用于将外源核酸 (例如DNA)导入宿主细胞的各种本领域已知的技术，包括礴酸钙或 氯化钩共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔.可以在 Sambrook， et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd， ed， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.， 1989)和其他实验室手册中找到转化或转染 宿主细胞的适合的方法。也可以通过显微注射导入核酸，
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知的是，取决于使用的表达栽 体和转染技术，仅小部分细胞可能将外源DNA整合到它们的基因组 中.为了鉴定和选择这些整合体， 一般与感兴趣的基因一起将编码选 择性标记(例如，抗生素抗性)的基因导入宿主细胞.选择性标记包 括赋予对药物，例如G418、匀霉素和氨甲蝶呤的抗性的那些.编码选 择性标记的核酸可以在编码mNav1.3 a亚基蛋白的相同栽体上导入宿 主细胞，或可以在独立的栽体上导入.用导入的核酸稳定转染的细胞 可以通过药物选择来鉴定(例如，掺入了选择性标记基因的细胞将生 存，而其他细胞将死亡).
本发明的宿主细胞，例如培养物中的原核或真核宿主细胞，可被 用于产生(即，表达)mNavl,3a亚基蛋白，因此，本发明进一步提供 了使用本发明的宿主细胞生产mNavl.3 a亚基蛋白的方法.
本发明的核酸分子可以插入到栽体中，用作基因治疗栽体.可以 通过，例如，静脉内注射、局部施用(参见美国专利No.5，328，470)或通过立体策略(stereotactic)注射(参见，例如Chen et al. /Voc. iVii". y4cW5W. tASL4 91:3054-3057， 1994)，将基因治疗栽体递送给受试者。 基因治疗栽体的药物制剂可以包括处在可接受的稀释剂中的基因治疗 栽体，或可以包含基因递送赋形剂包埋于其中的緩释基质.做为选择， 当可以从重组细胞完整地产生完整基因递送栽体时，例如，逆病毒栽 体，药物制刑可以包括产生该基因递送系统的一个或多个细胞，
本*银邦>^^弄才法
在此描述的核酸分子、蛋白、蛋白同源物和抗体可被用于一种或 多种以下方法a)筛选分析；b)预测性药物(例如，诊断分析、预 后分析、监视临床试验和药物遣传学)；和c)治疗方法(例如，治疗 和预防).
本发明的分离的核酸分子能被用于，例如，表达mNa4.3ot亚基 蛋白(例如，在基因治疗应用中通过在宿主细胞中的重组表达栽体)， 检测mNav1.3 a亚基mRNA (例如，在生物样品中)或编码mNav1.3 a 亚基蛋白的基因中的遣传改变，和调节mNavl,3a亚基活性，如以下进 一步描述的.mNavl,3a亚基蛋白可用于治疗失调，所述失调以不足的 或过度的mNav1.3 a亚基底物产生或mNav1.3 a亚基抑制物产生为特 征.此外，mNavL3a亚基蛋白可用于筛选天然发生的mNavl,3a亚基 底物，用于筛选调节mNa4.3a亚基活性的药物或化合物，以及用于治 疗失调，所述失调以不足的或过度的mNav1.3 a亚基蛋白产生或与 mNav1.3 a亚基野生型蛋白相比具有降低的或异常活性的mNav1.3 a亚 基蛋白的产生为特征.此外，本发明的抗mNavl.3a亚基抗体可用于检 测和分离mNav1.3 ot亚基蛋白以及调节mNav1.3 a亚基活性. ,这》、浙
本发明提供了鉴定与包含在此描述的mNav1.3 a亚基的Na+通道 结合的调节物，即候选或测试化合物或试剂(例如，蛋白、肽、拟肽、 类肽、小分子或其他药物)的方法.这样鉴定的化合物可以用于调节 这些Na+通道的活性，例如，在治疗方案中.
在一个实施方式中，本发明提供了用于筛选作为Na+通道的底物 的测试化合物的分析，所述Na+通道包括在此描述的mNavL3a亚基或 所述亚基的生物学活性部分。在另一个实施方式中，本发明提供了用于筛选候选或测试化合物的分析，所述候选或测试化合物与这些Na+ 通道结合或调节它们的活性，
可以通过体内(例如，基于细胞和非细胞的)或体外方法鉴定离 子通道调节化合物，在一个实施方式中，离子流入分析被用于测量 8+ 通道活性.
测量离子通道活性的分析包括流量分析、膜片钳电生理学和二电 极电压钳电生理学(参见，例如Lin etal"iVeM/wi 18:153-166， 1997). 膜片钳生理学可以如下进行，简要地，将含有小电极的吸管尖端压到 细胞膜上以产生吸管和膜之间的紧密封闭(tightseal).电极俘获流经 吸管尖端的边缘划定的膜的离子.可以采用各种结构来测量细胞内或 膜片内或整个细胞上的电流.
二电极电压钳(TEVC)生理学如下进行.简要地，将两个尖锐 的微电极压穿细胞膜. 一个电极监视膜电位，另一个电极注入电流来 将膜电位保持在期望的水平.膜片钳和TEVC技术都提供了关于离子 通道电流的动力学和强度的信息.
可以进行高通量电生理学，例如，如U.S. 6，268，168和U.S. 6，048，722中描述的，通过引用将它们的内容合并在此.
可以使用测量离子浓度变化的分析，例如，可以用可检测的Na+ (例如，放射性标记的Na+)加栽测试系统。对Na+的检测可以给出 Na+浓度变化的指标.在一个实施方式中，所述分析包括在对测试系统 (例如，细胞或封闭的膜制备物)施加电压进行刺激之后检测Na+.钠 敏感性染料，例如钠绿或冠红，也可用于测量离子浓度的变化.
在一个实施方式中，使用非洲爪蟾卵母细胞系统分析Na+通道调 节.对于离子通道的短暂表达和来自非洲爪蟾卵母细胞的数据 (recording)的详细说明,参见,例如Xu and Lipscombe， / iVeMmyc/, 21 (16) :5944-5951， 2001; Lin et al.，同上),在另一个实施方式中， 所述分析是基于哺乳动物细胞的分析，例如，使用人类或小鼠细胞。 通过转染到不表达其他Na+通道的细胞类型中，可以独立地研究特定的 Na+通道,例如mNav1.3 a亚基通道，
化合物
本发明的测试化合物可以单独的获得，或使用本领域已知的组合 库方法中的许多手段的任何一种来获得，包括生物学库；类肽库(具有肽的功能，但带有新的对酶促降解有抗性但仍保持了生物活性的非
肽主干的分子的库；参见，例如，Zuckermann， R.N* WaA， / il/erf. C/ie附. 37:2678-85， 1994);空间可寻址的平行固相或液相库；需要去褶合的 合成库方法；"一个珠一个化合物"库的方法；和利用亲和层析选择 的合成库方法.生物学库和类肽库的方法限于肽库，而其他四种方法 对肽、非肽寡聚物或化合物的小分子库都是适合的(Lam，爿"Z/c朋cer /),"g/)d 12:145,1997).
用于分子库合成的方法的实例可在本领域中找到，例如 DeWitt W u/" iVoc. iVa".爿carf. Sa: 90:6909， 1993; Erb W a/"
iVfl汰4cflw/. t/5^ 91:11422， 1994; Zuckermann Cflt/" / CAe抓 37:2678， 1994; Cho W a/" 5W潔e 261:1303， 1993., Carrell" fl/" CA隱/"A嵐五wg/, 33:2059， 1994j Carell" fl乙，Ot隐嵐嵐 33:2061， 1994;和Gallop W fl/" / 37:1233， 1994。
化合物的库可以存在于溶液中(例如，Houghten，丑/o&cA/fi々"es 11:412-421， 1992 )、 或珠子上(Lam， A^"re 354:82-84， 1991)、芯片 上(Fodor， iVa似;^ 364:555-556， 1993 ) ， bacteria (Ladner， U.S. Patent No.5，223，409)、 孢子上(Ladner U.S. Patent No.S，223，409)，质粒上 (Cull W fl/"Wa"爿carf 5W (AS^ 89:1865-1869， 1992 )或嗛菌体上 (Scott and Smith, 249:386-390， 1990; Devlin， 5We脏
249:404-406， 1990; Cwirla W a/. Pwc. iVa".87:6378-6382， 1990; Felici，丄胁/.胁/. 222:301-310， 1991; Ladner训戸.)。
用作测试化合物(即，可能的抑制物、拮抗刑、激动剂)的化学 化合物可以从商业来源获得，或可以从易于获得的起始材料使用本领 域技术人员已知的标准合成技术和方法来合成.通过在此描述的方法 鉴定的化合物的合成中有用的合成化学转化和保护基团方法(保护和 解保护)是本领域已知的，包括，例如在R. Larock， Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989) ; T. W. Greene and P. G. M. Wuts， Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd .ed.， John Wiley and Sons (1991) ; L. Fieser and M. Fieser， Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons ( 1994);和L Paquette， ed.， Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John. Wiley and Sons (1995)以及它们的后续版本中描述的那些.在一个方面，所述化合物是有机小分子，即，化合物具有小于1,000 amu的分子量，优选的在350-750 arau之间.在其他方面，所述化合物 是(i)非肽类的那些；(ii)具有1到5个之间，包括杂环基或杂芳 基环基团的那些，其可以进一步带有取代基；(iii)处于各自的药学上 可接受盐的形式的那些；或(iv)肽类的那些.
术语"杂环基"是指非芳香族的3-8元的单环的、8-12元的二 环的、或11-14元的三环的环系统，如果为单环具有l-3个杂原子， 如果为二环具有1-6个杂原子，或如果为三环具有1-9个杂原子， 所述杂原子选自O、 N或S(例如，如果为单环、二环或三环，分别为 碳原子和N、 O或S的1-3、 1-6、或l-9个杂原子)，其中每个环 的0、 1、 2或3个原子可以被取代基取代.
术语"杂芳基"是指芳香族的5-8元的单环的、8-12元的二环 的、或11-14元的三环的环系统，如果为单环具有1-4个杂原子， 如果为二环具有1 _6个杂原子，或如果为三环具有1 — 9个杂原子， 所述杂原子选自O、 N或S(例如，如果为单环、二环或三环，分别为 碳原子和N、 O或S的1-4、 1-6、或l-9个杂原子)，其中每个环 的0、 1、 2、 3或4个原子可以被取代基取代.
术语"取代基"是指在烷基、环烷基、芳基、杂环基或杂芳基基 团上在基团的任何原子处被"取代"的基团.适合的取代基包括，无 限制地，烷基、烯基、炔基、烷氧基、面素、羟基、氰基、硝基、氨 基、S03H、全氟烷基、全氟烷氧基、亚甲二氧基、亚乙二氧基、羧基、 氧基、硫代、亚氨基(烷基、芳基、芳烷基)、S (O) n烷基(其中n 是0-2) 、 S (O) n芳基(其中n是0-2) 、 S (O) 杂芳基(其中n是 0-2) 、 S (O) 杂环基(其中n是0-2)、胺(单、二、烷基、环烷基、 芳烷基、杂芳烷基，和其组合)、酯(烷基、芳烷基、杂芳烷基)、 跣胺(单、二、烷基、芳烷基、杂芳烷基，和其组合)、磺胺(单、
二、烷基、芳烷基、杂芳烷基，和其组合)、未被取代的芳基、未被 取代的杂芳基、未被取代的杂环基、和未被取代的环烷基.在一个方 面，基团上的取代基独立地是上述取代基的任一单个，或上述取代基 的任何子集，
在本发明预想的化合物中取代基和可变项的组合，仅是引起稳定 化合物形成的那些。如在此使用的，术语"稳定"是指化合物，其具有的稳定性足以允许制造，并且其维持化合物的完整性达到足够时 间，对在此详述的目的是有用的(例如，转运、保存、分析、向受试 者治疗性施用).
此处的化合物的药学上可接受的盐包括来源于药学上可接受的无 机的和有机的酸和碱的那些.适合的酸性盐的实例包括醋酸盐、己二 酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸
盐、柠檬酸盐、digluconate、乙烷磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、羟乙 酸盐、半硫酸盐、heptanoate、已酸盐、氢氯酸盐、氬溴酸盐、氢硤酸 盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、 硝酸盐、palmoate、 pectinate、过硫酸盐、辨酸盐、苦酸盐、特戊酸盐、 丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、碗酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯 磺酸盐和十一酸盐。
在此描述化合物可以含有一个或多个不对称中心，因而作为外消 旋物和外消旋混合物、单个对映异构体、单独的非对应异构体和非对 映混合物存在.这些化合物的所有这样的同分异构形式特意地包括在 本发明中.在此描述化合物也可以以互变异构形式存在，所有这些都 包括在此.化合物也可以以顺式-或反式-或E-或Z-双鍵同分异构形 式存在.这种化合物的所有这样的同分异构形式特意地包括在本发明 中.
结合分析
还可以评估測试化合物与包含mNav1.3 ot亚基的Na+通道结合的 能力.虽然Na+通道结合不是通道调节活性的先决条件，结合Na+通道 的化合物在调节通道的活性方面可能是有用的。例如，通过将化合物 例如底物与放射性同位素或酶标记联结，从而化合物例如底物与Na+ 通道的结合可以通过检测复合物中的标记化合物例如底物来确定，可 以实现这一点.做为选择，包含在此描述的mNav1.3 a亚基的Na+通道 可以与放射性同位素或酶标记联结来监视测试化合物调节复合物的能 力。例如，可以用12SI、 3SS、 "C、或SH直接或间接地标记化合物，放 射性同位素可由放射的直接计数或闪烁计数来检测.做为选择，可以 用例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶或荧光素酶来酶标记化合物，酶标 记可以通过检测合适底物到产物的转化来测定。
可以评估测试化合物与包含mNav1.3 a亚基的Na+通道相互作用的能力，或在没有标记任何反应物的情况下评估.例如，在不标记化
合物或Na+通道的情况下可以使用微物理计(microphysiometer)来检 测化合物与Na+通道的相互作用(McConneH， H. M. e, fl/" 5We"ce 257:1906-1912， 1992 ).如在此使用的，"微物理计"(例如，细胞传 感器)是一种分析仪器，使用光可寻址的电势传感器(light-addressable potentiometricsensor, LAPS)测量细胞酸化其环境的速率，酸化速率 的变化可用作化合物和Na+通道之间的相互作用的指标.
在又一个实施方式中，提供了无细胞的分析，其中用测试化合物 接触在此描述的Na+通道或其生物学活性部分，并评估测试化合物结合 所述通道或其生物学活性部分的能力.优选的，所述无细胞分析包含 膜，无细胞分析涉及制备目标基因蛋白和测试化合物的反应混合物， 在一定条件下并持续足够的时间，以容许两种成分相互作用和结合， 从而形成可以除去和/或检测的复合物.
例如，也可以使用荧光能量转移(FET)(参见，例如Lakowicz et al.，美国专利No.5，631，169; Stavrianopoulos et al.，美国专利 No.4，868，103)来检测两种分子之间的相互作用，选择在第一个"供体" 分子上的荧光团标记，从而它发射的荧光能量被第二个"接受体"分 子上的荧光标记吸收，由于吸收的能量，其随后能够发出荧光，另一 方面，"供体"蛋白分子可能仅利用色氨酸残基的天然荧光能量.选 择发射不同的光波长的标记，从而"接受体"分子的标记可以与"供 体"的区别开来.由于在标记之间能量转移的效率与分隔分子的距离 有关，可以评定分子之间的空间关系.当结合在分子之间发生的情况 下，在分析中"接受体"分子标记的荧光发射应是最大的。通过本领 域公知的标准荧光检测手段(例如，使用荧光计)可以方便地测量FET 结合事件.
在另一个实施方式中，测定测试化合物结合在此描述的Na+通道 的能力可以使用实时生物分子互相作用分析(Biomoecular Interaction Analysis, BIA)来测定(参见，例如，Sjolander， S. and Urbaniczky， C.， J朋/. Of諷63:2338-2345， 1991; and Szabo e"/.， Cm/t. O/w". Ar"".
5:699-705， 1995 ),"表面胞质团共振(surface plasmon resonance)"或"BIA"实时地检测生物特异性相互作用，而不用标 记任何反应物(例如，BIAcore).在结合表面处质量的改变(指示结合事件)引起接近该表面的光线的折射率改变(表面胞质团共振(SPR) 的光学现象)，产生可检测信号，该信号可用作生物分子之间实时反 应的指示.
在一个实施方式中，包含Na+通道或测试化合物的样品被锚定在 固相上.锚定在固相上的通道/测试化合物可以在反应结束进行检测。
期望的是，固定Na+通道、抗Na+通道抗体或其靶分子，以便于从 一种或两种蛋白的未复合形式中分离复合了的形式，以及便于适应分 析的自动化.在存在或不存在候选化合物的情况下，化合物与Na+通道 的结合，或Na+通道与靶分子的相互作用，可以在任何适于容纳反应物 的容器中完成.这种容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。 在一个实施方式中，可以提供融合蛋白，其添加了容许一种或两种蛋 白与基质结合的结构域，例如，谷胱甘肽-S-转移酶/mNa4.3 a亚基融 合蛋白或谷胱甘肽-S-转移蘇/靶融合蛋白可以被吸附在谷胱甘肽琼脂 糖珠(Sigma Chemical, St. Louis, MO)或谷胱甘肽衍化的微量滴定板 上，其然后与测试化合物或包含Na+通道的测试化合物和样品化合，所 述Na+通道包含GST标记的亚基，并在有助于复合物形成的条件(例 如，盐和pH值的生理条件)下孵化混合物.在觯化之后，洗涤珠子或 微量滴定板加样孔以除去任何未结合的成分，对珠子的情况来说，例 如，如上所述直接或者间接地测定基质固定化的复合物，
将Na+通道亚基的复合物固定在基质上的其他技术包括使用生物 素和链霉抗生物素蛋白的接合.例如，生物素化的mNav1.3 a亚基蛋白 可以使用本领域已知4支术(例如，biotinylation kit, Pierce Chemicals, Rockford， IL)从生物素-NHS (N-羟基-琥珀酰亚胺)制得，并固定在 链審抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemical)的加样孔中。
为了进行分析，将非固定化的成分添加到含有锚定成分的包被的 表面，在反应完全后，在一定条件下除去未反应的成分(例如，通过 洗涤)，从而任何形成的复合物仍保持固定在固体表面上，可以用许 多途径实现锚定在固体表面的复合物的检测.当早先的非固定化成分 被预先标记时，检测到表面上固定的标记指示了复合物形成。当早先 的非固定化成分没有预先标记时，可使用间接标记来检测锚定在表面 上的复合物；例如，使用特异于固定化成分的标记的抗体(该抗体随 后可以用例如标记的抗Ig抗体直接标记或间接标记).在一个实施方式中，利用抗体进行这种分析，所述抗体与Na+通 道上的表位反应但是不干扰所述通道与目标分子的结合.这种抗体可 以衍生化到平板的加样孔，和未结合的靶点或通过抗体接合捕获在加 样孔中的Na+通道上.检测这种复合物的方法，除了以上对于GST-固定化的复合物描述的之外，包括使用与Na+通道的成分有反应性的抗 体进行复合物的免疫检测，以及依靠检测与通道相关的酵活性的酶联 分析.
做为选择，可以在液相中进行无细胞的分析.在这种分析中，通 过许多标准技术的任何一种，包括但不限于差速离心(参见，例如 Rivas， G.， and Minton， A.P.， 7Vew必丑fOcAe附Sci' 18:284-7， 1993 );层对斤 (凝胶过滤层析、离子交换层析)；电泳和免測沉淀(参见，例如， Ausubel， F. ef flZ" eds, (1999) Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley: New York)，将反应产物从未反应的成分分离.这种树脂和层 析技术是本领域技术人员已知的(参见，例如，Heegaard，N.H.，/Mo/ 及ecogm7 11:141-8， 1998; Hage， D.S.， and Tweed, S.A.， / CT^o/mitogr丑 5W j外，/. 699:499-525， 1997).进一步的，也可以方便地使用 如在此描述的荧光能量转移来检测结合而不需要进一步从溶液中纯化 复合物，优选的，例如，通过包括膜成分或人工膜成分，无细胞分析 保持了 Na+通道复合物的结构，
在特定的实施方式中，所述分析包括使Na+通道或包含mNaY1.3 a 亚基的生物学活性部分的通道与结合所述通道的已知化合物接触以形 成分析混合物，用测试化合物接触分析混合物，并测定所述测试化合 物与Na+通道相互作用的能力，其中测定所述测试化合物与Na+通道相 互作用的能力包括，与已知化合物相比，测定所述测试化合物与Na+ 通道优先结合的能力，或调整通道活性的能力.
在此描述的Na+通道可以在体内与一种或多种细胞或细胞外大分 子，例如蛋白相互作用。为了这项论述，这种细胞和细胞外大分子在 此称为"结合配偶体".破坏这种相互作用的化合物在调节目标基因 产物的活性方面可能是有用的.这种化合物可以包括，但不限于例如 抗体、肽和小分子的分子.
为了鉴定干扰Na+通道与细胞外结合配偶体之间的相互作用的化 合物，制备含有目标基因产物和结合配偶体的反应混合物，在一定条件下并维持足够的时间，以容许两种产物形成复合物.为了测试抑制 试剂，在存在或不存在测试化合物的情况下提供反应混合物.测试化
合物可以最初就包括在反应混合物中，或可以在添加Na+通道和它的细 胞或细胞外结合配偶体之后一次添加.在没有测试化合物或有安慰剂 的情况下辨化对照反应混合物.然后检测在Na+通道和细胞或细胞外结 合配偶体之间任何复合物的形成.在对照反应中而不在含有测试化合 物的反应混合物中复合物的形成表示，该化合物干扰了目标基因产物 和互相作用的结合配偶体之间的相互作用.另外，在含有测试化合物 和正常目标基因产物的反应混合物内的复合物形成，也可以与含有测 试化合物和包含一个或多个突变亚基的Na+通道的反应混合物内的复 合物形成进行比较.在希望鉴定破坏突变体而不是正常目标基罔产物 的相互作用的化合物的情况下，这种比较是很重要的.
这些分析可以以多相的或同相的形式进行.多相的分析包括将 Na+通道或结合配偶体锚定在固相上，并在反应结束时检测锚定在固相 上的复合物.在同相的分析中，完整的反应在液相中进行，在任何一 种方法中，添加反应物的顺序可以不同，以获得关于被测化合物的不 同信息.例如，通过例如竟争来干扰目标基因产物和结合配偶体之间 的相互作用的测试化合物，可以通过在存在测试物质的情况下进行反 应来鉴定.做为选择，破坏已形成的复合物的测试化合物，即，从复 合物中替换出成分之一、具有更高结合常数的化合物，可以通过在已 经形成复合物之后将测试化合物添加到反应混合物中来检测。以下简 述各种形式，
在多相分析系统中，目标基因产物或互相作用的细胞或细胞外结 合配偶体被锚定在固体表面(例如，微量滴定板)上，而非锚定种类 被直接或间接地标记.可以通过非共价的或共价的连接来固定化锚定 的种类.做为选择，特异于被锚定种类的固定化抗体可用于将该种类 锚定到固体表面.
为了进行分析，固定化种类的配偶体被暴露于有或者没有测试化 合物的包被的表面.在反应完全后，在一定条件下除去未反应的成分 (例如，通过洗涤)，任何形成的复合物仍保持固定在固体表面上. 当早先的非固定化种类被预先标记时，检测到表面上固定的标记指示 了复合物形成.当早先的非固定化种类没有预先标记时，可使用间接标记来检测锚定在表面上的复合物；例如，使用特异于最初的非固定 化种类的标记的抗体(该抗体随后可以用例如标记的抗Ig抗体直接标 记或间接标记).取决于添加反应成分的顺序，可以检测抑制复合物 形成的测试化合物或破坏已形成的复合物的化合物。
做为选择，可以在存在或不存在测试化合物的情况下在液相中进 行反应，从未反应的成分分离反应产物，并检测复合物；例如，使用 特异于结合成分之一的固定化抗体来锘定溶液中形成的任何复合物， 和使用特异于另一个配偶体的标记的抗体来检测锚定的复合物.再一 次，取决于向液相中添加反应物的顺序，可以鉴定抑制复合物形成的 测试化合物或破坏已形成的复合物的化合物.
在本发明的可选实施方式中，可以使用同相的分析.例如，制备 目标基因产物和互相作用的细胞或细胞外结合配偶体产物的预先形成 的复合物，其中Na+通道亚基或它们的结合配偶体被标记，但是由标记 产生的信号由于复合物形成而淬灭(参见，例如，美国专利 No.4，109，496，其利用了这种方法进行免疫测定)，添加与之竟争并从 预先形成的复合物替换出种类之一的测试物质，将引起高于背景的信 号的产生.这样，可以鉴定破坏目标基因产物-结合配偶体相互作用 的测试物质，
在又一个方面，Na+通道蛋白或其片段可被用作双杂交分析或三 杂交分析中的"诱饵蛋白"(参见，例如，美国专利No.5，283，317; Zervos W fl/" CW/ 72:223-232， 1993; Madura " a/" 胁/. C7^饥268:12046-12054， 1993; Bartel" a/"胁《ec/^一es 14:920-924， 1993j Iwabuchi" a/.， Owo^e"e 8:1693-1696， 1993;和Brent WO94/10300)来鉴定其他蛋 白，所述蛋白结合或与Na+通道蛋白相互作用("Na+通道结合蛋白" 或"Na+通道-bp")并涉及Na+通道活性.这种Na+通道-bp可能是Na+ 通道或Na+敏感性目标发送信号的活化物或抑制物。
双杂交系统基于大多数转录因子的模块特性，其由可分的DNA 结合和活化结构域组成。简要地，该分析利用了两种不同的DNA构建 体.在一个构建体中，编码Na+通道a亚基蛋白或其片段(即，相应于 亚基的细胞外结构域的可溶部分)的基因被融合到编码已知转录因子 (例如，GAL-4)的DNA结合结构域的基因.在另一个构建体中，来 自DNA序列库、编码未鉴别的蛋白("被捕物(prey)"或"样品")的DNA序列被融合到编码已知转录因子的活化结构域的基因。(做为 选择，Na+通道亚基可以与活化结构域融合.)如果"诱斜"和"被捕 物"蛋白能够在体内相互作用，形成Na+通道亚基依赖性复合物，转录 因子的DNA结合和活化结构域被带至紧密邻近.这种邻近容许报告基 因(例如，lacZ)的转录，所述报告基因与对所述转录因子起反应的转 录调节位点可操作连接.可以检测报告基因的表达，可以分离含有功 能性转录因子的细胞克隆，并用于获得编码与Na+通道亚基相互作用的 蛋白的基因.
在另一个实施方式中，鉴定Na+通道亚基表达的调节物.例如， 用候选化合物接触细胞或无细胞混合物，相对于不存在该候选化合物 的情况下mNav1.3 a亚基mRNA或蛋白的表达水平，评估mNav1.3 a 亚基mRNA或蛋白的表达，当存在候选化合物的情况下mNav1.3 a亚 基mRNA或蛋白的表达大于不存在的情况时，该候选化合物被鉴定为 mNav1.3 a亚基mRNA或蛋白表达的刺激物.另外地，当存在候选化 合物的情况下mNav1.3 a亚基mRNA或蛋白的表达小于(统计学上显 著的小于)不存在的情况时，该候选化合物被鉴定为mNav1.3 a亚基 mRNA或蛋白表达的抑制物.可以通过在此描述的用于检测mNav1.3a 亚基mRNA或蛋白的方法来测定mNav1.3 a亚基mRNA或蛋白表达的 水平.
在另一个方面，本发明涉及在此描述的两种或多种分析的组合， 例如，可以使用基于细胞的或无细胞的分析来鉴定调节试剂，试剂调 节Na+通道的能力可以在体内，例如，在动物体内证实，所述动物例如 疼痛失调的或与中风或外伤性脑损伤有关的失调的动物模型.
本发明进一步涉及通过上述筛选分析鉴定的新的试剂.因此，在 本发明的范围内的是，进一步在合适的动物模型中使用如在此描述鉴 定的试剂(例如，mNavl.3a亚基通道调节试剂、相应于在此描述的一 种或多种Na+通道亚基的反义核酸分子、通道特异性抗体、或mNayl.3 a亚基通道结合配偶体)来确定用这种试剂治疗的效力、毒性、副作用 或作用机制.此外，通过上述筛选分析鉴定的新的试剂可用于在此描 述的治疗.
本发明的诊断和预后分析包括评定mNav1.3 a亚基的表达水平和 鉴定mNav1.3 a亚基分子的核苷酸或氨基酸序列中的变异和突变的方法.
表达监视和分布型.通过从测试受试者获得生物样品，用能够检
测inNav1.3 a亚基蛋白或编码mNav1.3 a亚基蛋白的核酸(例如， mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触该生物样品，从而在该生 物样品中检测所述蛋白或核酸的存在，可以评估在生物样品中mNav1.3 a亚基蛋白或核酸的存在、水平或缺乏.术语"生物样品"包括从受试 者分离的组织、细胞和生物学液体，以及存在于受试者体内的组织、 细胞和液体.优逸的生物样品是脑组织.可以用许多方法测量mNav1.3 ot亚基基因的表达水平，包括但不限于測量mNa4,3a亚基基因编码 的mRNA;测量mNavl.3 a亚基基因编码的蛋白的数量；或测量mNavl.3 a亚基编码的蛋白的活性.
在细胞中与mNav1.3 a亚基基因相应的mRNA的水平可以通过原 位的和通过体外的形式来测定.
分离的mRNA可被用于杂交或扩增分析，包括但不限于，Southern 或Northern分析、聚合酶链式反应分析和探针阵列.检测mRNA水平 的一种诊断方法包括用能够与要检测的基因编码的mRNA杂交的核酸 分子(探针)与分离的mRNA接触.核酸探针可以是，例如，全长Na+ 通道a亚基核酸，例如在此描述的核酸或其部分，例如长度至少7、 15、 30、 50、 100、 250或500个核苷酸，并足以在严格条件下与Na+通道a 亚基mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸，所述探针可以布 置在阵列，例如以下所述阵列的地址上.在此描述了用于诊断分析的 其他适合的探针.
在一种形式中，mRNA (或cDNA)被固定在表面上并与探针接 触，例如通过通过使分离的mRNA在琼脂糖凝胶上跑动并将mRNA从 凝胶转移到膜，例如硝化纤维上.在一种选择性的形式中，探针被固 定在表面上，用探针接触mRNA (或cDNA)，例如，在以下所述的 二维基因碎片阵列中，技术人员可以修改已知的mRNA检测方法，用 于检测mNav1.3 a亚基基因编码的mRNA的水平.
样品中由mNa4,3a亚基基因编码的mRNA的水平可以用核酸扩 增，例如，通过rtPCR ( MuUis (1987)美国专利No.4，683，202)、连 接酶链式反应(Barany， /Voc. Wfl".爿carf. 5W. CASJ 88:189-193， 1991)、 自持的序列复制(Guatelli" a/.， /Voc. iVa". Jcarf. fAS/i 87:1874-1878，1990)、转录放大系统(Kwoh rt a/" iVoc. iVa". ^cflw/. Sd. tASJ 86:1173-1177， 1989) 、 Q-Beta复制酶(Lizardi W fl/"所0/recA朋/05y 6:1197,1988)、滚环复制(Uzardi e/fl/.， U.S. Patent No.5，854，033)或 任何其他核酸扩增方法，随后使用本领域已知的技术检测扩增的分子 来进行评估，如在此使用的，扩增引物被定义为核酸分子对，其可以 与基因的5，或3，区域退火(分别为正链和负链，或反之)并在中间含 有短的区域. 一般地，扩增引物的长度约10到30个核苷酸，側翼是 长度约50到200个核苷酸的区域.在适合的条件下使用适合的试剂， 这种引物允许扩增包含该引物的側翼核苷酸序列的核酸分子.
对于原位方法，可以制备/加工细胞或组织样品并固定在支持物、 一般是玻璃栽片上，然后与能和要分析的mNav1.3 a亚基基因编码的 mRNA杂交的探针接触.
在另一个实施方式中，此处的方法进一步包括用能够检测 mNav1.3 a亚基mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触对照样品， 然后比较对照样品中mNavl,3 a亚基mRNA或基因组DNA的存在和测 试样品中mNav1.3 a亚基mRNA或基因组DNA的存在.在再另一个实 施方式中，如美国专利No.5，695，937中描述的基因表达的系列分析被用 于检测mNav1.3 a亚基转录产物水平.
可以使用各种方法来确定mNav1.3 a亚基基因编码的蛋白的水 平. 一般地，这些方法包括用选择性结合该蛋白的试剂，例如抗体与 样品接触，来评估样品中的蛋白水平.在特定的实施方式中，所述抗 体带有可检测的标记.抗体可以是多克隆的，或更优选的，是单克隆 的.可以使用完整抗体或其片段(例如，Fab或F(ab')2).术语"标 记的"关于探针或抗体时，意图包括通过将可检测物质联结(即，物 理地连接)到探针或抗体上直接标记探针或抗体，以及通过与可检测 物质的反应性间接标记探针或抗体，在此提供了可检测物质的实例。
所述检测方法可以用于体外和体内检测生物样品中的mNav1.3 a 亚基蛋白。检测蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、 免测沉淀、免疫荧光、酶免疫测定(EIA)、放射性免疫测定(RIA)、 和Western blot分析.检测蛋白的体内技术包括向受试者中导入标记 的抗mNav:L3a亚基抗体.例如，可以用放射性标记物标记抗体，在受 试者中放射性标记物的存在和位置可以通过标准成像技术来检测.在另一个实施方式中，样品被标记，例如，被生物素化，然后与抗体接
触，例如，位于抗体阵列(如下所述)中的抗mNav:L3a亚基抗体。可 以用例如与荧光标记联结的抗生物素蛋白检测样品.
在另 一个实施方式中，所述方法进一步包括用能够检测mNav1.3 a 亚基蛋白的化合物或试剂与对照样品接触，并比较对照样品中蛋白的 存在和测试样品中蛋白的存在.
本发明还包括用于检测生物样品中mNav1.3 a亚基蛋白的存在的 试剂盒.例如，所述试剂盒可以包括能够检测生物样品中mNav1.3 a 亚基蛋白或mRNA的化合物或试剂；和标准.所述化合物或试剂可以 包装在适合的容器中。所述试剂盒可以进一步包括使用该试剂盒检测 mNavl,3a亚基蛋白或核酸的说明，
对于基于抗体的试剂盒，该试剂盒可以包括(l)与相应于本发 明的标记物的多肽结合的第一抗体(例如，附着于固相支持物)；和， 任选的，(2)结合所述多肽或所迷第一抗体、并与可检测试剂连接的 第二种不同的抗体.
对于基于寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒可以包括U)寡核苷 酸，例如，可检测地标记的寡核苷酸，其与编码相应于本发明的标记 物的多肽的核苷酸序列杂交，或(2)对于扩增相应于本发明的标记物 的核酸分子有用的引物对。所述试剂盒还可以包括緩冲剂、防腐剂或 蛋白稳定剂.所述试剂盒还可以包括检测所述可检测试剂(例如，酶 或底物)所需的成分.所述试剂盒还可以含有对照样品或一系列对照 样品，其可以被分析并与所含的测试样品比较.试剂盒的每种成分可 以封闭在单独的容器内，所有各种容器可以在单个包装内，伴有用于 解释使用该试剂盒进行分析的结果的说明.
在此描述的诊断方法可以鉴定患有与Na+通道表达或活性有关的 疾病或失调、或有发展出所述疾病或失调的风险的受试者.如在此使 用的，术语"不需要的"包括在生物反应例如神经性疼痛中涉及的不 需要的现象。
在一个实施方式中，鉴定与Na+通道表达或活性有关的疾病或失 调.从受试者获得测试样品，评估一种或多种Na+通道蛋白或核酸(例 如，mRNA或基因组DNA)，其中Na+通道蛋白或核酸的水平，例如， 存在或不存在，是受试者患有与Na+通道表达或活性有关的疾病或失调、或有发展出所述疾病或失调的风险的诊断依据。如在此使用的， "测试样品"是指从感兴趣的受试者获得的生物样品，包括生物液体 (例如，血清)、细胞样品、或组织，例如脑组织.
在此描述预后分析可用于确定受试者是否可以施用试剂(例如，
激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白、肽、核酸、小分子或其他药物候
选者)来治疗与mNav1.3 a亚基表达或活性有关的疾病或失调.例如， 这种方法可用于确定受试者是否可以用试剂有效地治疗疼痛失调或外 伤性脑损伤.
在另一个方面，本发明表征了具有大量数字编码的数据记录的计 算机媒介.每个数据记录包括代表样品中mNav1.3 a亚基通道的表达水 平或活性的值和对样品的描述.对样品的描述可以是样品的标识符、 处理该样品的化合物、得出该样品的受试者(例如，患者)、诊断、 或治疗(例如，优选的治疗).在特定的实施方式中，所述数据记录 进一步包括代表除mNavl,3a亚基通道以外的基因(例如，与失调相关 的其他基因，所述失调与mNa4,3a亚基通道的活性有关，或阵列上的 其他基因)的表达水平的值.所述数据记录可以构造为表格，例如， 作为数据库的部分的表格，所述数据库例如关系数据库(例如，Oracle 或Sybase数据库环境中的SQL数据库).
还表征的是评估样品的方法.所述方法包括提供样品，例如来自 受试者的样品，并测定该样品的基因表达分布型，其中所述分布型包 括代表mNav1.3 a亚基通道表达或活性的水平的值，所述方法可进一步 包括与参考值或参考分布型比较所述值或所述分布型(即，多个值).
可以通过在此描述的任何方法获得样品的基因表达分布型(例如，通 过提供来自样品的核酸并使核酸与阵列接触，或通过分析样品中 mNav1.3 a亚基通道的活性).所述方法可以用于诊断受试者中的失 调，其中mNav1.3 a亚基表达的变化是所述受试者患有或倾向于患有失 调的指示。所述方法可用于监视受试者中的治疗，例如，疼痛的治疗. 例如，可以确定来自经历了治疗的受试者的样品的基因表达分布型. 所述分布型可以与参考分布型、或与从治疗前或疾病发作前的受试者 获得的分布型进行比较(参见，例如，Golub W "/ ， 5Wewce 286:531， 1999)
在又一个方面，本发明表征了评估测试化合物的方法(也参见，上文的"筛选分析").所述方法包括提供细胞和測试化合物；用测 试化合物接触细胞；获得对于接触的细胞的受试者表达分布型；和将 所述受试者表达分布型与 一个或多个参考分布型进行比较.所迷分布 型包括代表mNav1.3 a亚基活性或表达的水平的值.在特定的实施方式 中，将受试者活性或表达分布型与目标分布型比较，例如，标准细胞 的分布型或细胞的期望条件的分布型.扭比从未接触的细胞获得的表 达分布型，如果所述受试者表达分布型更类似于目标分布型，测试化 合物被好意地(favorably)评估.
在另一个方面，本发明表征了评估受试者的方法.所述方法包括 a)从受试者获得样品，例如，从护理者获得，例如，从受试者获取样 品的护理者；b)测定该样品的受试者表达分布型.任选的，所述方法 进一步包括以下步骤之一或两个c)将所述受试者表达分布型与一个 或多个参考表达分布型比较；和d)选择与受试者参考分布型最相似的 参考分布型.受试者表达分布型和参考分布型包括代表mNav1.3 a亚基 活性或表达的水平的值.可以使用各种常规的统计度量来比较两种参 考分布型. 一个可能的度规是作为两种分布型之间的差异的距离向量 的长度.每个受试者和参考分布型被表示为多维的向量，其中每个维 度是分布型中的值。
所述方法可以进一步包括将结果传送给护理者.所述结果可以是 受试者表达分布型、或受试者表达分布型与另一个分布型比较的结 果、或任何上述的描述.所述结果可以在计算机网络上传送，例如， 所述结果可以处于计算机传输的形式，例如，嵌入在栽波中的计算机 数据信号.
还表征的是具有可执行代码的计算机媒介，所述可执行代码实现 以下步骤接收受试者表达分布型(例如，在此描述的任何受试者表 达分布型)；访问参考表达分布型的数据库；和i)选择最相似于所述 受试者表达分布型的匹配参考分布型，或ii)为所述受试者表达分布型 与至少一个参考分布型的相似性确定至少一个比较分值。受试者表达 分布型和参考表达分布型各自包括包括代表mNav1.3 a亚基活性或表 达的水平的值。
阵列和其用途
在另一个方面，本发明表征了包括具有多个地址的底物的阵列。所述多个地址(plurality)的至少一个地址包括俘获探针，所述俘获探 针特异性地结合相应于Na+通道a亚基的分子，例如mNavl,3 ot亚基 核酸或多肽，所述阵列可以具有至少10、 100、 l，OOO或10,000或更多 个地址/ 112的密度，并在这之间变动.所述底物可以是二维的底物， 例如玻璃栽片、薄片(例如，硅质或塑料的)、质谱平板，或是三维 底物例如凝胶垫.除了多个地址以外的地址可以布置在阵列上.
在特定的实施方式中，多个地址的至少一个地址包括核酸俘获探 针，所述核酸俘获探针与mNav1.3 oc亚基核酸，例如正义或反义链特 异性杂交.多个地址的地址子集可以是编码mNav1.3 a亚基的Na+通 道基因的核酸俘获探针.子集的每个地址包括与mNav1.3 oc亚基核酸 的不同区域杂交的俘获探针。所述阵列可用于通过杂交来给基因测序 (参见，例如，美国专利No.5，695，940),
可以通过各种方法产生阵列，例如，通过光刻法(参见，例如， 美国专利Nos. 5,143,854; 5,510,270;和5，527，681)、机械方法(例如， 如美国专利No.5，384，261中描述的导向流动方法)、基于针的方法(例 如，如美国专利No.5，288，514描述的)，和基于珠子的技术(例如，在 PCT US/93/04145中描述的).
在另一个实施方式中，多个地址的至少一个地址包括多肽俘获探 针，所述多肽俘获探针与mNa4.3 a亚基多肽或其片段特异性结合。 所述多肽可以是mNav1.3 ot亚基多肽的天然发生的相互作用配偶体. 优选的，所述多肽是抗体，例如在此描述的抗体(参见"抗niNav1.3 cx 亚基抗体")，例如单克隆抗体或单链抗体.
在另一个方面，本发明表征了分析mNa4.3 a亚基表达的方法. 所述方法包括提供如上所述的阵列；用样品接触所述阵列，并检测 mNav1.3 a亚基分子(例如，核酸或多肽)与所述阵列的结合.任选 的所述方法进一步包括在与所述阵列接触之前或期间从样品扩增核 酸.
在另一个实施方式中，所述阵列可用于分析组织中的基因表达以 确定在所述阵列中基因的组织专一性，特别是mNav1.3 a亚基的表 达.如果分析了足够数量的各种样品，群集(clustering)(例如，分 级群集、k-means群集、Bayesian群集等等)可被用于鉴定与mNavl.3 a亚基共调节的基因.例如，所述可用于多个基因的表达的定量。因而，不仅是组织专一性，而且组织中基因套组(battery of genes)的表 达水平也被确定.定量数据可根据它们本身的组织表达和在该组织中 的表达水平用于给基因分组(例如，分群).
例如，基因表达的阵列分析可以用于评定细胞-细胞相互作用对 mNav1.3 ot亚基表达的影响.可以扰动笫一组织，可以分析来自笫二 组织、与笫一组织相互作用的核酸.关于这一点，可以测定响应于生
物学刺激一种细胞类型对另一种细胞类型的影响，例如，来监视细胞-细胞相互作用在基因表达水平的影响.
在另一个实施方式中，细胞与治疗剂接触，使用阵列测定细胞的 表达分布型，将该表达分布型与未与所述试刑接触的类似细胞的分布 型进行比较.例如，所述分析可用于确定或分析治疗试剂的不需要的 影响的分子基础.如果治疗性施用试剂来治疗一种细胞类型，但对另 一种细胞类型具有不需要的影响，本发明提供了一种分析来确定这种 不需要的影响的分子基础，因而提供了共施用抵抗试刑或治疗不需要 的影响的机会。类似地，即使在单个细胞类型中，可以在分子水平测 定不需要的生物学影响.因而，可以确定和抵消试剂对目标基因以外 的基因的表达的影响.
在另 一 个实施方式中，所述阵列可以用于监视在阵列中与时间有 关的一个或多个基因的表达。例如，从不同时点获得的样品可以用所 述阵列探察。这种分析可以鉴定和/或表征与Na+通道活性有关的疾病 或失调的发展.这种方法也可以评估Na+通道相关疾病或失调的治疗和 /或发展，
这种阵列对于确定一个或多个基因在正常和异常的细胞中的差别
表达模式也是有用的.这提供了可以充当诊断或治疗介入的分子靶点 的基因的套组(例如，包括编码mNav1.3 a亚基的基因).
在另一个方面，本发明表征了包括具有多个地址的阵列.多个地 址的每一个地址包括独特的多肽.多个地址的至少一个地址之上已经 布置了 mNav1.3 a亚基多肽或其片段。本领域描述了产生多肽阵列的 方法，例如在De Wildt" a/" 7Vfl似re丑/Wed 18: 989-994， 2000; Lueking W a/" ^iwfl/.丑,oc/^肌270:103-111， 1999; Ge， H.， A^iic/e/c 28:e3， I-VII， 2000; MacBeath， G.， and Schreiber， S丄.，5W潔e 289:1760-1763， 2000;和WO 99/51773A1中.在特定实施方式中，多个地址的每一个地址在其上已经布置了至少60%-99%相同于mNav1.3 ot亚基多肽或其片段的多肽，例如，mNav1.3 a亚基多肽的多种变体 (例如，等位变体编码的、针对位点的突变体、随机的突变体或组合 突变体)可被置于多个地址的单个地址上.
多肽阵列可用于检测Na+结合化合物，例如，在来自受试者的样 品中与mNav1.3 a亚基多肽有特异性的抗体，或检测Na+通道结合蛋白 或配体的存在.
在另一个方面，本发明表征了分析多种探针的方法.例如，对于 分析基因表达，所述方法是有用的.所述方法包括提供具有多个地 址的二维阵列，多个地址的每一个在位置上可以相互区分，多个地址 具有独特的俘获探针，例如，其中所述俘获探针来自表达包含mNa4.3 a亚基的Na+通道的细胞或受试者，或来自在其中已经引发了 Na+通道 介导的反应的细胞或受试者，例如，通过用Na+通道mNav1.3 a亚基核 酸或蛋白接触所述细胞，或向所述细胞或受试者施用Na+通道mNa4.3 a亚基核酸或蛋白；提供具有多个地址的二维阵列，多个地址的每一个 在位置上可以相互区分，多个地址具有独特的俘获探针，例如，其中 所述俘获探针来自不表达Na+通道mNavl.3 a亚基s (或不象俘获探针 的Na+通道mNavl.3a亚基阳性多个地址的情况下表达那么高)的细胞 或受试者，或来自其中没有引发了 Na+通道介导的反应的细胞或受试者 (或比笫一样品引发了较小的程度)；用一个或多个查询探针与阵列 接触，(其优选的不同于Na+通道mNa4.3a亚基核酸、多肽或抗体)， 从而评估多个俘获探针.结合，例如，对于核酸来说，在多个地址的 地址上与俘获探针的杂交，通过例如附着于核酸、多肽或抗体的标记
产生的信号来检测.
在另一个方面，本发明表征了分析mNavl,:Ja亚基的方法，例如， 分析结构、功能、或与其他核酸或氨基酸序列的关系.所述方法包括 提供mNav1.3 a亚基核酸或氨基酸序列；将该序列与来自序列集合的一 个或多个，优选的多个序列进行比较，所述序列集合例如，核酸或蛋 白序列数据库；从而来分析mNa4,3a亚基亚基.
麵俯
在此鉴定的cDNA序列的部分或片段(和相应的完整基因序列)可以在多种方面用作多核苷酸试剂.
例如，多核苷酸试剂可用于诊断分析、预后分析，监视临床试验 被用于预后(预测)目的从而来预防性地治疗个体.因此，本发明的 一个方面涉及确定在生物样品(例如，血液、血清、细胞、组织)的
环境中inNav1.3 a亚基蛋白和/或核酸表达以及mNav1.3 a亚基活性的 诊断分析，从而来确定个体是否患有疾病或失调，或存在发展出失调 的风险，所述疾病或失调与异常的或不需要的mNav1.3 a亚基表达或活 性有关.本发明还提供了预后(或预测)分析，用于确定个体是否存 在发展出与mNav1.3 a亚基蛋白、核酸表达或活性有关的失调的风险. 例如，可以分析生物样品中编码mNav:L3a亚基的基因中的突变，并用 于预后或预测目的.
本发明的另一个方面涉及监视试剂(例如，药物、化合物)对体 内mNavl.3a亚基的表达或活性的影响.
监视试剂(例如，药物)对mNavl.3 a亚基蛋白的表达或活性的 影响(例如，调节膜兴奋性)不仅可应用于基础药物筛选，还可应用 于临床试验.例如，通过在此描述的筛选分析确定的试剂提高mNav1.3 a亚基基因表达、蛋白水平或上调mNavl.;3a亚基活性的有效性，可以 在对展现出降低或升高的mNav1.3 a亚基基因表达、蛋白水平，下调 mNavl.3 a亚基的受试者的临床试验中监视.与例如Na+通道相关的失 调有关的其他基因可用作特定细胞的表型的标记。
本发明的另一个方面涉及为了治疗目的调节mNav1.3 a亚基表达 或活性的方法.因此，在示范性的实施方式中，本发明的调节方法包 括用mNav1.3 a亚基或试剂接触细胞，所述试剂调节与细胞相关的 mNavl.3a亚基蛋白活性的一种或多种活性。调节mNa4.3a亚基蛋白 活性的试剂可以是在此描述的试剂，例如核酸或蛋白、mNav:L3a亚基 蛋白的天然发生的靶分子(例如，mNav1.3 a亚基底物)、mNav1.3 a 亚基抗体、mNav1.3 a亚基激动剂或拮抗剂、mNav1.3 a亚基激动剂或 拮抗剂的肽模拟物、或其他小分子.在一个实施方式中，所述试剂刺 激一种或多种mNav1.3 a亚基活性.这种刺激试剂的实例包括活性 mNav1.3 a亚基蛋白和已经被导入细胞、编码mNav1.3 a亚基的核酸分子.在另一个实施方式中，所述试剂抑制一种或多种mNavl.3ot亚基活 性.这种抑制试刑的实例包括反义mNav1.3 a亚基核酸分子、抗mNav1.3 a亚基抗体和mNav1.3 ot亚基抑制物.这些调节方法可以在体外进賴例 如，通过培养细胞和所述试剂)，或作为选择，在体内进行(例如， 通过向受试者施用所述试剂)。因而，本发明提供治疗患有疾病或失 调的个体的方法，所述疾病或失调以mNav1.3 a亚基蛋白或核酸分子的 异常或不需要的表达或活性为特征.在一个实施方式中，所述方法包 括施用试刑(例如，通过在此描述的筛选分析鉴定的试剂)、或调节 (例如，上调或下调)mNa4.3a亚基表达或活性的试剂的组合，在另 一个实施方式中，所述方法包括施用mNav1.3 a亚基蛋白或核酸分子作 为治疗来补偿降低的或异常的mNav1.3 a亚基表达或活性.
在mNav1.3 a亚基被异常地下调和/或在提高mNav1.3 a亚基活性 可能具有有益效果的情况下，剌激inNavlJa亚基活性是可取的。活性 的拮抗也可能是可取的.例如，对于疼痛，例如神经性疼痛、头部外 伤和神经变性疾病的治疗，调节物是可取的.神经变性疾病包括多发 性硬化、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、或其他形式的痴呆、肌萎缩 性側索硬化、Down's综合症、Huntington舞蹈病和脊小脑变性'例如，
在治疗伴随着包括大脑出血的脑血管损伤或外伤的各种失调，所述大 脑出血例如高血压脑内出血和蛛网膜下出血，短暂的脑缺血反应发 作，脑动脉硬化和它们的后遣症，以及心动停止后恢复时的脑损伤、 脑手术之前或之后的脑功能障碍、由于氧不足、低血糖、脑或脊损伤、 药物或气体中毒、糖尿病、抗癌试剂的施用、酒精等等造成的神经系 统的失调方面，调节NavL3通道可能是有用的.
秀炎逸合炎
如在此使用的，本发明的化合物，例如，通过在此描述的方法鉴 定的Na+通道调节物，被定义为包括其药学上可接受的衍生物或前体药 物。"药学上可接受的衍生物或前体药物"是指本发明的化合物的任何 药学上可接受的盐、酯、酯盐或其他衍生物，在向受试者施用时能够 提供(直接地或间接地)本发明的化合物.特别有利的衍生物和前体 药物是，当将这种化合物施用给哺乳动物时提高本发明的化合物的生 物利用率的那些(例如，通过容许口服施用的化合物被更容易地吸收到血液中)，或相对于亲本种类能增强亲本化合物向生物代谢区(例 如，脑或淋巴系统)的递送的那些.前体药物包括衍生物，其中增强 水溶性或穿肠膜主动转运的基团被附加到在此描述的化学式的结构 上.
本发明的化合物可以通过附加合适的功能进行修改来增强选定的 生物学性质。这种修改是本领域已知的，包括提高对给定生物代谢区 (例如，血液、淋巴系统、中枢神经系统)的生物学穿透性、提高口 服利用率、提高溶解性以容许通过注射施用、改变新陈代谢和改变排 出速率的那些修改.
本发明的化合物的药学上可接受的盐包括来源于药学上可接受的 无机的和有机的酸和碱的那些.适合的酸性盐的实例包括醋酸盐、己 二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁
酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、digluconate、十二烷基硫酸 盐、乙烷碌酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、glucoheptanoate、羟乙酸盐、 半硫酸盐、heptanoate、已酸盐、氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸 盐、烟酸盐、硝酸盐、palmoate、 pectinate、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、 碑酸盐、苦酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、 酒石酸盐、硫氛酸盐、甲苯磺酸盐和imdecanoate.其他酸，例如草酸， 虽然本身不是药学上可接受的，可以用于盐的制备，所述盐作为中间 物在获得本发明的化合物和它们药学上可接受的加酸盐方面是有用 的.来源于合适的碱的盐包括碱金属盐(例如，钠)、碱土金属(盐 例如，镁)、铵盐和N-(烷基)4+盐.本发明还预想了在此公开的化 合物的含碱性氮基团的季铵反应.通过这种季铵反应可以获得水溶或 油溶或可分散的产物.此处任何化学式的化合物的盐形式可以是羧基 的氨基酸盐(例如，L-精氨酸盐、L-赖氨酸盐、L-组氨酸盐).
在此描述的化学式的化合物可以，例如，通过静脉内、动脉内、 真皮下、腹膜内、肌内内或皮下注射；或口头地、口腔地、鼻地、穿 粘膜地、表面地、以眼用制品的形式，或通过吸入，剂量范围约0.5到 约100 mg/kg体重，做为选择的剂量在1 mg和1000 mg/剂之间，每4 到120小时，或根据特定药物的要求来施用。此处的方法考虑施用有 效量的化合物或化合物组合物来实现期望的或声明的效果. 一般地，本发明的药物组合物每天约1次到约6次地施用，或作为选择，作为 连续输注来施用.这种施用可以用作慢性的或急性的治疗。与栽体物 质组合产生单个剂量形式的活性成分的数量可以取决于治疗的宿主和 施用的特定模式而变化。典型的制品将含有约5%到约95%的活性化 合物(w/w).做为选择，这种制备含有约20%到约80%的活性化合 物.
比以上叙述的更低或更高的剂量可能是所需的.对于任何特定患 者的特定剂量和治疗服法取决于各种因素，包括采用的特定化合物的 活性、年龄、体重、 一般健康状况、性别、饮食、施用时间、排出速 率、药物组合、疾病、状况或症状的严重程度和病程、疾病、状况或 症状的患者分布、和治疗医师的判断.
在改善患者状况时，如果必要，可以施用维持剂量的本发明的化 合物、组合物、或组合.随后，当症状被减轻到期望的水平时，施用 的剂量或频率、或这两者，可以作为症状的函数被降低到维持改善的 状况的水平.然而，根据疾病症状的任何复发，患者可能需要长期的 间歇性治疗.
在此描绘的组合物包括有效实现调节疾病或疾病症状的数量的此 处描绘的化学式的化合物，以及如果存在的话其他的治疗试剂，所述 疾病或疾病症状包括离子通道介导的失调或其症状，
术语"药学上可接受的栽体或佐剂"是指可以与本发明的化合物 一同施用给患者的栽体或佐剂，当以足够递送治疗数量的所述化合物 的剂量施用时，不破坏其药理学活性并且是无毒的，
可用于本发明的药物组合物的药学上可接受的栽体、佐剂和赋形 剂包括但不限于，离子交换刑、矾土、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药 物递送系统(SEDDS)例如d-a-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐、用于 药物剂型的表面活性剂例如Tweens或其他类似的聚合递送基质、血清 蛋白例如人血清白蛋白、緩冲剂例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨 酸钟、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，例如硫 酸鱼精蛋白、裤酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸 镁、聚乙烯基吡咯烷稱、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维 素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧化丙烯-块多聚体、聚乙二醇和羊 毛脂。环糊精例如a-、 P-和Y-环糊精，或化学上修饰的衍生物例如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-P-环糊精，或其他增溶的衍生 物，也可以有利地用于增强在此描述的化学式的化合物的递送.
本发明的药物组合物可以口头地、胃肠外地、通过吸入喷雾、表 面地、直肠地、鼻地、口腔地、阴道地、或通过植入的储库来施用， 优选的通过口服施用或通过注射施用.本发明的药物组合物要是可以 含有任何常规的无毒的药学上可接受的栽体、佐剂或赋形剂.在某些 情况下，可以用药学上可接受的酸、碱或緩冲液调节制剂的pH值，来 增加配制的化合物或它的递送形式的稳定性.如在此使用的术语胃肠 外的包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、 胸骨内、鞘内、病灶内和颅内的注射或输注技术.
所述药物组合物可以是无菌可注射制品的形式，例如，为无菌可 注射的水性或油性悬浮液.这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使 用适合的分散刑或润湿剂(例如，Tween糾)和悬浮刑来配制，无菌 可注射制剂也可以是处于无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂，例 如，1,3-丁二醇溶液中的无菌可注射溶液或悬浮液。在可接受的赋形剂 和溶剂之中，可以使用的有甘露醇、水、Ringer，s溶液和等渗氯化钠溶 液.此外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质.为此，可以 使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油醋或二甘油酯。脂肪 酸，例如油酸和它的甘油酯衍生物在注射剂的制备中是有用的，天然 的药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，特别是它们的聚氧乙撑
化型式也是一样.这些油溶液或悬浮液也可以含有长链的醇稀释剂或 分散剂，或羧甲基纤維素或类似的分散剂，它们通常用于药学上可接 受的剂型例如乳剂和或悬浮液的配制，通常用于药学上可接受的固 体、液体或其他剂型的制造的其他常用的表面活性剂，例如Tweens或 Spans其他类似的乳化剂或生物利用率增强剂，也可以用于制剂目的.
本发明的药物组合物可以以任何口服可接受的剂型，包括但不限 于，胶囊剂、片剂、乳剂和水悬浮液、分散体和溶液来口头地施用， 对于口服用途的片剂来说，常用的栽体包括乳糖和玉米淀粉。 一般也 添加润滑剂，例如硬脂酸镁.对于以胶嚢剂形式口服施用，有用的稀 释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉.当口头地施用水性悬浮液和/或乳剂 时，活性成分可以悬浮于或溶于油相，与乳化剂和/或悬浮剂组合，如 果需要，可以添加某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂.本发明的药物组合物也可以以用于直肠施用的栓剂形式来施用. 可以通过将本发明的化合物与适合的无刺激性赋形剂混合来制备，所 迷赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体，因而将在直肠中融 化释放活性组分.这种材料包括，但不限于，可可脂、蜂蜡和聚乙二 醇.
当希望的治疗涉及通过表面施用容易达到的区域或器官时，本发 明的药物组合物的表面施用是有用的.对于向皮肤的表面应用，药物 组合物应配制为含有悬浮于或溶于栽体的活性组分的适合的软骨剂. 用于表面施用本发明的化合物的栽体包括但不限于，矿物油、液体石 油、白石油、丙二醇、聚氣乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水.做为 选择，药物组合物可配制为适合的洗液或乳奮剂，其含有悬浮于或溶 于栽体的活性化合物，所述栽体有适合的乳化剂.适合的栽体包括但
不限于，矿物油、单硬脂酸山梨糖醇酐酯、聚山梨酸酯60、十六烷基 酯蜡、cetearyl alcohol、 2-辛基十二醇、苯甲醇和水，本发明的药物组
低位肠i.表面地穿表皮贴片也包括在本发明中. -
本发明的药物组合物可以通过真气雾剂或吸入来施用。根据药物 制剂领域公知的技术来制备这种组合物，可以制备为盐水的溶液，采 用苯甲醇或其他适合的防腐剂，采用吸收促进剂来增强生物利用率， 和/或本领域已知的其他增溶剂或分散刑。
具有此处的化学式的化合物和其他试剂的组合物(例如，治疗试 剂)可以使用可植入装置来施用.可植入装置和相关的技术是本领域 已知的，当希望连续的或定时释放来递送在此描绘的化合物或组合物 时作为递送系统是有用的.另外，可植入装置递送系统对于靶向化合 物或组合物递送的特定位点(例如，局部位置、器官)是有用的。Negrin et al" Biomaterials， 22 (6) :563 (2001 )。包括可选择性的递送方法的 定时释放技术也可用于本发明.例如，基于多聚体技术、持续释放技 术和密封技术的定时释放制剂(例如，聚合物、脂质体)也可用于递 送在此描绘的化合物和组合物。
还处在本发明的范闺内的是递送此处的活性化学治疗组合物的贴 片.贴片包括材料层(例如，聚合物、布、纱布、绷带)和如在此描 绘的此处的化学式的化合物.材料层的一面可以具有附着于其上的保护层来抵抗化合物或组合物的通过，貼片可以另外包括粘附剂来将贴 片保持在受试者上.粘附剂是一种组合物，包括天然或合成来源的那 些，当与受试者的皮肤接触时，暂时地附着到皮肤上.其可以是抗水 的。粘附剂可以置于贴片上，以保持贴片与受试者的皮肤接触持续一 延长的时间。所述粘附剂被制成具有一定胶粘性或粘附强度，从而它 将装置保持在进行了偶然接触的部位，然而，在一定的积极行为时(例 如，撕、剥、或其他有意的去除)，所述粘附剂给施于该装置或粘附剂 本身的外部压力让路，并允许粘附接触的解除.粘附剂可以是压力敏 感的，也就是说，这可以容许通过对粘附剂或装置施加压力(例如， 按、擦)将粘附剂(和要附着于皮肤的装置)置于皮肤上.
当本发明的组合物包含在此描述的化学式的化合物和一种或多种 其他治疗或预防试剂的组合时，所述化合物和所述其他试剂都应以约1
到100%的剂量水平存在，更优选的为单治疗(monotherapy)服法中 通常施用的剂量的约5到95%之间.所述其他试剂可以独立于本发明 的化合物作为多次剂量服法的部分来施用.做为选择，这些试剂可以 是单个剂型的部分，在单个组合物中与本发明的化合物混合在一起。 以上描述的化合物和方法可以用于治疗性调节Na+通道功能。 通过以下非限制性实施例进一步描述本发明的特定实施方式
实施例1:新的Na+通道a亚基的鉴定
1. 首先，4吏用用于RT-PCR的Superscript First-Strand Synthesis System (InVitrogen )从小鼠脑polyA RNA ( Stratagene and Clontech) 产生cDNA.设计引物用于扩增小鼠Navl,:3a亚基.相应于小鼠Na4.3 a亚基的部分序列的cDNA (GenBank Acc. No.NM_018732 )与公开 的大鼠cDNA序列的中部(NM—013119;从起始密码子开始的核苷酸 2461 )进行比对.为了鉴定小鼠Nav1.3 a亚基的全长序列，使用BLAST
(Blake JA， et al. MGD: The Mouse Genome Database.池c/e/c J"Vfc 及es31: 193-195, 2003)将大鼠序列(NM_013199)与小鼠基因组进行 比较.
2. 设计5，引物与推定的起始密码子上游的7个核苷酸退火，设计3，引 物与推定的终止密码子下游的124个核苷酸退火.每个引物在末端含有NotI限制性位点。设计引物与非翻译区退火.与非翻译区退火的引 物较少可能扩增非Navl,3a亚基基因，即，小鼠Navl.l和Nav1.2 a亚 基基因.用于扩增mNav1.3的3，引物被设计为与相应于大鼠Navl.l、 Nav1.2和Nav1.3 a亚基3，非翻译区之间的高变区域的非翻译区退火， 来提高对mNav1.3的特异性.在大鼠Navl a亚基基因中的这个区域中， 大鼠Na4.1在32个核苷酸中有17个与大鼠Na4.2不同，大鼠Navl.2 在32个核苷酸中有13个与大鼠Na丄3不同.这个翻译区在大鼠和小 鼠序列之间还具有高度的同源性；32个核苷酸中的仅29个是保守的.
3. 使用Herculase Hotstart DNA聚合酶(Stratagene; 30循环)从小 鼠脑cDNA扩增出编码小鼠Nav1.3 a亚基的小鼠Navl.3 a亚基cDNA 的克隆.通过琼脂糖凝胶电泳分辨PCR产物，使用Qiaquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen )从凝胶中提取RCP产物.使用TOPO XL PCR克隆试剂盒(Invitrogen )将提取的产物亚克隆到pCR-XbTOPO 栽体中，将产生的栽体转化到XL10 Gold Ultracompetent细胞
(Stratagene)中'培养转化的细菌.使用Aurum Miniprep ( Biorad) 从转化的细菌分离DNA.
通过对未切的DNA和Notl (New England Biolabs)消化的DNA 进行琼脂糖凝胶分析来鉴定含有小鼠Nav1.3 a亚基插入物的克隆.进 行两个克隆的5，和3，末端的序列分析(A和B; SeqWright)来证实小 鼠Navl,3 a亚基插入物的存在.
通过maxi prep ( Qiagen)培养含有克隆A和B的细菌用于制备 更大量的DNA.
4. 进行克隆A和B的全长测序(SeqWright).确定克隆A和B中是 否存在PCR错误，将两个克隆的核普酸序列相互比较、与小鼠Na4.3 a亚基基因组序列比较、与大鼠Nav1.3 a亚基cDNA的序列
(NM_013199 )比较，和与两个人类Nav1.3 a亚基cDNAs( NM—006922 和AF225986)比较.此外，产生由克隆A和B的核苷酸序列编码的预 测的氨基酸序列，并与大鼠和人类Nav1.3 a亚基蛋白序列进行比较。
克隆A含有相对于鼠基因组序列和人类Nav1.3 a亚基序列的一个 核苷酸改变.克隆A还含有相对于克隆B的83个核苷酸删除.克隆A和克隆B都含有在一列六个A中的额外的A,这很可能是 由PCR错误导入的.在编码序列中这个核苷酸的存在将移动阅读框， 并编码1504个氨基酸的蛋白(与已知的Nav a亚基多肽中大约1940氨 基酸个相对比).并且，额外的A不存在于基因组鼠序列中.大鼠和 人类序列在该位置也缺少額外的核苷酸.
克隆B含有不存在于克隆A或鼠、大鼠和人类基因组序列中相应 基因组区域中的两个核苷酸改变，因而被确定为是错误.克隆B还具 有不存在于克隆A或鼠、大鼠和人类基因组序列中相应位置中的额外 核苷酸，其也被确定为是错误.
5. 使用以下步骤对小鼠Navl,3a亚基克隆中发现的突变进行修复，对 于修复的步骤l,通过用来自克隆B的相应片段替换突变的片段，来纠 正克隆A中的突变和83个核苷酸剁除，如下.用Xcml (New England Biolabs)消化克隆A和B。对克隆A的大片段(其没有突变和删除) 和克隆B的小片段(替换克隆A的片段)进行分辨，使用QiaquickGel Extraction试剂盒从琼脂糖凝胶中提取。使用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)连接消化的片段.将连接的产物转化入MAX Efficiency Stbl2感受态细胞(Invitrogen )'培养细菌，用Aurum miniprep分离DNA,通过对未切的DNA和用Smal和Narl (New England Biolabs)消化的DNA进行琼脂糖凝胶分析，鉴定含有合适的 Xcml片段的克隆。
对几个克隆进行序列分析(SeqWright),来鉴定其中突变和83 个核苷酸删除被修复的DNA,并证实两个额外核普酸的存在(一个额 外核苷酸存在于克隆A中， 一个随克隆B的XcmI片段带来).
6. 对于修复分离的小鼠Na4.3 a亚基cDNA的步骤2，使用了在其中 突变和83个核苷酸删除已经修复了的克隆.用QiiickChange XL定点 诱变试剂盒(Stratagene)纠正了这个克隆中的一个额外的核苷酸。设 计定点诱变引物.进行诱变反应，将反应的产物转化入XL10 Gold Ultracompetent细胞(Stratagene),培养转化的细菌，通过Aurum miniprep分离DNA.用DNA的Smal消化来分析克隆.对几个克隆进 行序列分析来鉴定其中額外的核苷酸被修复的DNA.重新生长来自正确克隆的细菌，从而含有額外核苷酸的插入物可以转移到pcDNA6B并 被修复.
7. 为了将含有一个额外核苷酸的小鼠Nav1.3 a亚基cDNA从pCR-XL-TOPO转移到pcDNA6B，用EcoRV和Spel( New England Biolabs) 消化该克隆.用EcoRV和Xbal( New England Biolabs )消化pcDNA6B. 对消化片段进行分辨，使用Quiaquick Gel Extraction试剂盒从琼脂糖 凝胶中提取，使用T4 DNA连接酶进行连接.将连接的产物转化入XL10 Gold Ultracompetent细胞.培养细菌,用Aurum miniprep分离DNA。 通过对未切的DNA和Smal消化的DNA进行琼脂糖凝胶分析来鉴定含 有小鼠Navl.3 a亚基插入物的克隆.重新生长一个克隆用于最后的修 复步骤.
8. 对于修复过程的步骤3,在pcDNA6B中在小鼠Nav1.3 a亚基中含有 额外核苷酸的片段用如下新扩增的片段进行替换.设计引物来扩增小 鼠Nav1.3 a亚基的内部片段(从起始密码子开始的核苷酸3950-4675). 使用PfuTurbo Hotstart DNA聚合醃(Stratagene)从小鼠脑cDNA (在 步骤1产生)扩增这个片段，通过琼脂糖凝胶电泳分辨，用Quiaquick Gel Extraction试剂盒从琼脂糖凝胶提取.将该片段亚克隆入pCR-XL-TOPO载体，并转化入One Shot TOP10感受态细胞(Invitrogen )。 培养转化的细菌，通过Aurum minipr印分离DNA.通过对用EcoRI 消化的和用ScaI和BglI (New England Biolabs)双消化的DNA进行 琼脂糖凝胶分析来鉴定含有小鼠Nthev1.3 a亚基片段的克隆。对几个克 隆进行序列分析来鉴定没有突变的DNA克隆。重新生长一个克隆.
用来自pCR-XL-TOPO的正确片段置换pcDNA6B中小鼠Nav1.3 a亚基中含有额外核苷酸的片段如下进行.用Hpal和BstEII (New England Biolabs)消化两个克隆.对消化的片段进行分辨，使用 Quiaquick Gel Extraction试剂盒从琼脂糖凝胶中提取.使用T4 DNA 连接醉连接片段，将连接的产物转化入MAX Efficiency Stbl2感受态细 胞，培养细菌，用Aurum miniprep分离DNA,通过用Hpal、 BstEII 和Smal限制消化来分析克隆.对几个克隆的"交换"片段进行测序 (SeqWright)来鉴定其中额外的核苷酸被修复的克隆.进行单个克隆的全长测序来证实在定点诱变方法期间(修复的步骤2)没有产生新的 突变.
实施例2:编码序列的确定
表l.描绘了小鼠Nay1.3 a亚基的编码序列.cDNA的编码序列相 应于表l中所示序列的核苷酸8到核苷酸5947. SEQIDNO:l相应于 表l所示序列的编码序列部分.SEQ ID NO:l的预测的氨基酸序列在 SEQ ID NO:2和表2中示出.SEQ ID NO:3相应于表1所示的完整序 列.核苷酸8-10的粗体、下划线的ATG序列，和核苷酸5945-5947的 粗体、下划线的TGA序列分别代表编码序列的起始和终止密码子.
Table l.小鼠Nav1.3 a亚基的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)
51 101 151 201 251 301 351 401 451 501 551 601 651 701 751 801 851 9Q1 951 1001 1051 1101 1151 1201 1251 1301 1351 1401 1451 1501 1551 1601 1651 1701 1751
TGAAAAGATO GCCCAGGCAC TGCTGGTACC GCCTTTT^SH TCGAGMTCT CTTGCTGCTA GAGAAAGCCA AGAAACCCAA GAAAGAACAA GCCAAAGCCA AACAGTGACT TGGAAGCTGG ATGGAGACAT TCCTCCAGAG ATGGTGTCGG CCCTACTACG TCAGTAAGAA AACTTTTGTA AATTTTTCGA TTCAGTGCCA CCTCCGCCTT ACCCCGTTAG GAAAATTGCT ATTAAGATTT ATGCTTATCA TGTGCACTAT TTTGACCAAC CAATCCTCCT GACTGGACGA AGAATGTAGA ATACCTTTGA GTCACTTATA AAGATCTTGG GATTTCACAT TTCTTCGTGA CCCATGGAAC CGTGATGGCA TATGTGACAG AGTTTGTGGA TGAGAACGTT CAGAGTTCTC CGAGCATTGA GGTTTAAAGA CCATCGTGGG GGCCCTGATC TGACGTCATG ATACTCACTG TGTTCTGTCT GGCTGCAGCT CTTCATGGGC AACCTGAGGA CCAAGCGATT CTGCTTTTGA GATCAACACT AATGGACTCA AATGGGACAT TTGTTAATGT GGAAGGACTA TATCGCAGAT GACAGCCACT AAAGATCCTT TACTTTGTGG AAATGGGTCC AGGGTACATC TGTGTGAAGG CTGGACGAAA GCTTTGACAC ATTTAGCTGG GCCTTCTTAT CAAGACTACT GGGAGAACCT TTACCAGTTG AACCTACATG ATCTTTTTCG TCCTGGTAAT TGGTGAACTT GATCCTGGCT GTGGTGGCCA CAGGCCACAC TGGAGGAGGC TGAGCAGAM GTTGGAGCAG TTGAAAAAGC AGCAAGAGGA CCTCAGCAGC GTCCAGAGAC TTCAGTGGGA CTGGAGAGTT CTTCAGAAGC TTCCAAGTTG GTGGAGGAAT CGGAGGAA6A AGAGGAGACA ACCACAGACC CGAAGGAGAC AGGTTTCCCA GTCAAGCGAA GGAGTTTCCT GTTCTCCCTG CGACAAGAAG CTGTGCTCTC CCCATCAGTC CCCTGTTTTC CCCAAGACGC AATAGCAAAA GGTCGGGCGA AGGACGTGGG GTCTGAGAAT
CCCGGGACCT TCGAAAAGCG GACATTGACG GAAGAACCTT AGCCTCTGGA GTGTTGAATA GTATATTTTA TGGTACACTC TGTGTATTTA GTACACATTC CCAGAGGATT TGGCTGGATT CCTGGGCAAT AAACAATATC CAGTCGGTGA GAGCGTCTTT ATAAATGCTT ACTTCCTACT AACAATGAGC TTTATGTTTT GATGCAGGAC CCCCAACTAC CGCTGTTTCG ACATTACGTG TTTCTTGGGC TGGCCTATGA GAGGCGGAGT GGCTCAGGCG TAGGAGGGTT AGCTCCAAGA GAGGGAGCAC AGTCGGAATC GATGGGAACC TCTCTTGAGT CGAGCATTTT GACTTTGCGG
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4701 GATACTACTA CTTCACGATT GGCTGGAACA TCTTTGACTT TGTGGTGGTG
4751 ATTCTCTCAA TTGTAGGAAT GTTCCTTGCT GAGCTGATAG AGAAGTATTT
4801 TGTGTCTCCT ACCCTGTTCC GAGTCATCCG CCTGGCCAGG ATTGGACGAA
4851 TCCTACGCCT GATCAAAGGC GCCftAGGGGA TCCGCACGCT GCTCTTTGCT
4901 CTGATGATGT CCCTTCCTGC GCTGTTCAAC ATCGGCCTCC TGCTTTTCCT
4951 CGTCATGTTC ATCTACGCCA TCTTTGGGAT GTCCAACTTT GCCTATGTTA
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5101 GTTGGCCCCC ATCGTCAACA GTGCACCTCC TGACTGTGAC CCTGATGCAA
5151 TTCACCCTGG AAGCTCAGTG MGGGAGACT GTGGGAACCC ATCTGTGGGG
5201 ATTTTCTTTT TTGTCAGCTA CATCATCATA TCCTTCCTGG T窗GGTGAA
5251 CATGTACATT GCTGTCATCC TGGAGAACTT CAGCGTTGCC ACAGAAGAAA
5301 GTGCAGAGCC CCT6AGT(3AG GACGACTTTG AGATGTTCTA CGAGGTCTGG
5351 GAGAAGTTCG ACCCTGACGC CACCCA(3TTC ATAGAGTTCT GCAAGCTCTC
5401 TGACTTTGCA GCTGCCCTGG ATCCTCCCCT CCTCATCGCA AAGCCAAACA
5451 AAGTCCAGCT CATT6CCATG GACCTGCCCA TGGTGAGTGG AGACCGCATC
5501 CACTGCCTGG ACATCTTATT TGCTTTTACA AAGCGGGTCC TGGGTGAGAG
5551 TGGAGAGATG GATGCCCTTC GAATCCAGAT GGAAGATCGG TTCATGGCTT
5601 CCAATCCCTC CAAGGTCTCT TATGAGCCCA TTACCACCAC TCTGAAGCGC
5651 AAACAAGAGG AGGTGTCTGC TGCTATCATT CAGCG*AATT ACAGATGTTA
5701 TCTTTTAAAG CAAAGGTTAA AARACATATC AAATACGTAT GACAAAGAGA
5751 CAATCAAGGG GAGGATTGTC TTGCCTATAA AAGGAGATAT GGTTATTGAC
5801 AAATTAAATG GGAATTCCAC CCCAGAAAAG ACAGATGGGA GTTCCTCTAC
5851 CACCTCCCCT CCTTCCTATG ACAGTGTAAC AAAACCAGAT AAGGAAAAGT
5901 TT6AGAAAGA CAAACCAGAA AAAGAAAGCA AAGGGAAAGA GGTCTGAGAG
5951 AATCAAAAGT AAAAAAACAA AACAAAAAAA ATTTCAAAAA TTTaSSSaGG
6001 AAACAAAGAA ATGTCTTTGT AATCAATTGT TTACAGCCTC TGAAGGTAAA
6051 GTGTCCGTGT CAACTGGACT C
表2.mNavl.3a亚基的氨基酸序列(SEQIDNO:2)
MAQALLVPPGPESFRLFTRESLAAIEKRAAEEKAKKP咖QDIDDE抓PK PNSDLEAGKNIiPFIYGDIPPEMV3EPIjEDIiDPYYVSKKTFVVIiNKGKAIF RFSATSALYILTPL赔RKIAIKILVHSIiFSMLIMCTILTNCVFMTIiSNP PDWTKNVEYTFTGIYTFESIiIKILARGFCLEDFTFIiRDPWNWLDFSVIVM
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KLCSPHQSIiIiSIRGSX^SPRRNSKTSIFSFRGRAKDVGSENDFADDEHST FEDSESRRDSLFVPHRPGERRNSNVSQASMSSRMVPGLPANGKMHSTVDC NGWSLGTTTETEVRKRRLSSYQISMEMLEDSSGRQRAMSIASII/raTME ELEESRQKCPPCWYRFANVFLIWDCCDSWLKVKHLVNIiIVMDPFVDLAIT ICIVLNTLFMAMEHYPMTEQFSSVLTVGNLVFTGIFTAEMVLKI副DPY YYFQEGWMIFDGIIVSIiSIiMEIi(3IANVEGili3VXRSFRIjLRVFKIAK3WPT LNMLIKIIGNSVGALGNLTLVLAIIV打FAWGMQLPGKSYKECVCK画 DCKL卿H柳DFFHSFLIVFRVLCGEWIET柳DCMEVAGQTMCIiIVFMLVMVIG肌WL肌FLALLLSS咖咖LAATDDD鄉鄉NLQIAVGRMQKGIDY
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GMVPDFVTOQVPDISIMILICLNMVTlilMVETDDQSKYMTLVLSRINLVFI
VLFTGEFLLKLISLRYyYFTIG卿IB"DFVWILSIVGMFLAELIEKYFVS
PTLFRVIRLARIGRILRLIKGAKGIRTLLFALMMSLPALPNIGLLLFLVM
ETYAIFGMSNFAYVKKEAGIDDMFNFETFGNSMICLFQITTSAGWDGLLA
PILNSAPPDCDPDAIHPGSSVKGDCGNPSVGIPFFVSYIIISFLWVNMy
IAVILENFSVATEESAEPLSEDDFEMFYEVWEKFDPDATQFIEFCKLSDF
AAALDPPLLIAKPMKVQLIAMDLPMVSGDRIHCLDILFAFTKRVLGESGE
MDALRIQMEDRFMASNPSKVSYEPITTTLKRKQEEVSAAIIQ咖YRCYLL
KQRLKNISNTYDKETIKGRIVLPIKGDMVIDKLNGNSTPEKTDGSSSTTS
PPSYDSVT咖KEKFEKD咖KESKGKEV
实施例3:新的Na+通道a亚基的表达
在非洲爪蟾卵母细胞表达系统中使用二电极电压钳技术分析实施 例1中分离的小鼠Nav1.3 a亚基的功能特征.通过标准克隆方法扩增 Nav1.3 a亚基cDNA并亚克隆入pcDNA6栽体(Invitrogen)。将小鼠 Navl,3a亚基(2ng/nl) cDNA的约46纳升注射到去滤泡的非洲爪檐 卵母细胞中，5天后测量电流，在1.8mMCaCl2、 5mMHEPES-Na、 2 mMKC1、1 mM MgCl和96 mMNaAc，pH 7.5的溶液中4吏用0.5-1.0 MQ 电阻(3M KC1)的电极记录六个细胞的钠电流.将卵母细胞保持在-100 mV,去极化到电压-80 mV到50 mV.使用P/4泄漏减去(leak subtraction )方案得到数据.附困3显示了在不同的去极化电压下代表 性的钠电流.六个细胞的标准化、平均化的峰值电流-电压相互关系在 附图4中显示.在-40 mV通道开始打开，在0mV达到最大电流，这 些数据显示，Na4,3acDNA编码的通道是功能性的，它展现了这种通 道的预期的生物物理学性质.
在此引用的所有参考文献，不论是印刷的、电子的、计算机可读 存储介质还是其他形式，特意地通过引用完全合并，包括但不限于， 摘要、论文、学报、出版物、文本、文集、因特网网站、数据库、软 件包、专利和专利出版物.已经描述了本发明的许多实施方式.尽管 如此，要理解的是，可以进行各种修改而不背离本发明的精神和范闺. 因此，其他实施方式在以下的权利要求的范围之内.
权利要求
1. 一种分离的钠通道III型α亚基(mNav1.3α亚基)多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
2. 权利要求l的多肽，其中该多肽基本上由SEQIDNO:2的氨基 酸序列组成.
3. 包含SEQ ID NO:2的至少10个连续氨基酸的分离的mNav1.3 a亚基多肽，其中所述多肽包括以下氨基酸中的一个或多个异亮氨酸 289、脯氨酸S18、丝氨酸728、丝氨酸1355、天冬酜胺l卯9、苏氨酸 1910和纈氨酸1921.
4. 编码权利要求1-3的任何一个的多肽的分离的mNav1.3 a亚基核 酸分子.
5. 权利要求4的核酸分子，其中所述核酸包含SEQIDNO:l的核 苷酸序列。
6. 权利要求5的核酸分子，其中所述核酸分子基本上由SEQ ID NO:l的核苷酸序列组成.
7. 权利要求4的核酸分子，其中所述核酸是SEQIDNO:l的核酸序列的等位基因.
8. 权利要求4的mNav1.3 a亚基核酸分子的片段，其中所述片段 编码以下的氨基酸中的一个或多个异亮氨酸289、脯氨酸518、丝氨 酸728、丝氨酸1355、天冬酰胺1909、苏氨酸1910和纈氨酸1921。
9. 一种表达栽体，包含与启动子可操作连接的权利要求4的 mNav1.3 a亚基核酸分子，
10. 包含权利要求4的核酸的宿主细胞。
11. 优先地结合权利要求1的mNav1.3 ct亚基多肽的试剂.
12. —种试剂，其与权利要求l的mNavl.:3a亚基多肽选择性地结 合，并且不与钠通道I型或II型a亚基多肽结合.
13. 权利要求12的试剂，其中所述试剂是小分子、核酸或蛋白。
14. 权利要求12的试剂，其中所述试剂调节mN^1.3 a亚基多肽 活性.
15. 权利要求13的试剂，其中所述试剂是抗体或其抗原结合片段.
16. 权利要求15的试剂，其中所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。
17. 包含权利要求12的试剂和药学上可接受的栽体的药物组合物.
18. 调节细胞中mNav:L3a亚基多肽活性的方法，所述方法包括 提供包含mNav1.3 a亚基多肽的钠通道，其中所述mNav1.3 a亚基多肽是根据权利要求1 _ 3的任何一项的多肽；使所述通道与有效调节mNav1.3 a亚基多肽的活性的量的mNav1.3 a亚基多肽调节物接触.
19. 权利要求18的方法，其中所述调节物是小分子、核酸或蛋白.
20. 鉴定调节mNavl.3a亚基多肽活性的试剂的方法，所述方法包括提供包含mNav1.3 a亚基多肽的第 一钠通道，其中所述mNav1.3 a 亚基多肽是根据权利要求1 - 3的任何一项的多肽； 使所述通道与测试化合物接触；以及评估所述钠通道的活性，其中相对于参考值的活性变化是该化合物是调节所述通道的试剂的指示。
21. 权利要求20的方法，其中所述测试化合物是小分子、肽或核酸。
22. 权利要求20的方法，其中所述钠通道被包含在生物样品内.
23. 权利要求20的方法，其中所述通道与多种测试化合物接触.
24. 权利要求20的方法，其中所述样品包含细胞膜.
25. 权利要求24的方法，其中所述样品包含细胞。
26. 权利要求25的方法，其中所述细胞是真核细胞，
27. 权利要求26的方法，其中所述细胞是非洲爪蟾卵母细胞。
28. 权利要求26的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞.
29. 权利要求20的方法，其中所述活性包含钠浓度的调节.
30. 权利要求20的方法，其中所述评估包括检测钠排出'
31. 权利要求20的方法，其中所述接触在不存在测试化合物，产生第一钠排出量的条件下发生.
32. 权利要求20的方法，其中所述评估包括使用Na+流量分析。
33. 权利要求20的方法，其中所述分析使用膜片钳电生理学.
34. 权利要求20的方法，其中所述分析使用二电极电压钳电生理学.
35. 权利要求20的方法，其中所述分析包括使用钠敏感性染料.
36. 权利要求20的方法，其中所述分析是高通量分析.
37. 权利要求20的方法，进一步包括步骤提供包含mNavl,3a亚基多肽的第二钠通道，其中所述mNavl.3a 亚基多肽不同于根据权利要求1 - 3的mNav1.3 a亚基多肽； 用测试化合物接触所述第二钠通道； 评估所述第二钠通道的活性.
38. 权利要求37的方法，进一步包括比较存在测试化合物的情况 下第一钠通道的活性和存在测试化合物的情况下笫二钠通道的活性.
39. 权利要求37的方法，其中提供多个钠通道.
40. 权利要求20的方法，其中所述mNav1.3 a亚基多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列.
41. 鉴定在治疗与钠电流调节有关的失调中有用的试剂的方法，所 述方法包括提供包含根据权利要求1 一 3的任何一个的mNavl.3 a亚基多肽的 钠通道；用测试化合物接触所述通道；和评估所述通道的活性，其中相对于参考值的活性变化是测试化合 物是在与钠电流有关的失调中有用的试剂的指示.
42. 权利要求41的方法，其中所述失调是疼痛、感觉异常、中风、头部外伤、神经变性失调或与神经元的超兴奋性有关的失调.
43. 权利要求41的方法，进一步包括体内施用所述化合物。
44. 权利要求41的方法，进一步包括为了体内使用而修饰所述化 合物.
45. 权利要求41的方法，进一步包括评估由所述化合物对相关的 人类NavL3a亚基多肽的调节.
46. 治疗患有与钠通道电流有关的失调的受试者的方法，所述方法 包括鉴定与mNav1.3 a亚基多肽选择性结合的试剂，和 向需要这种治疗的受试者施用药理学试剂，所述药理学试剂对于 包含mNav1.3 a亚基多肽的钠通道有选择性.
47.权利要求46的方法，其中所述失调是疼痛、感觉异常、中风、 头部外伤、神经变性失调或与神经元的超兴奋性有关的失调.
全文摘要
在此公开了新的钠通道核酸和多肽。还公开了使用这种新的核酸和多肽的方法。
文档编号C12NGK101421300SQ200480041649
公开日2009年4月29日 申请日期2004年12月10日 优先权日2003年12月12日
发明者A·霍恩斯滕, R·弗兰科 申请人:塞恩药品公司