专利名称：吡咯喹啉醌合成相关基因及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种吡咯喹啉醌合成相关基因及其编码蛋白。
背景技术：
吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)是20世纪70年代末发现的一种辅酶，这是一种不同于NADP、FAD的新辅酶，多种细菌的脱氢酶依赖这种辅酶。PQQ最初系从甲醇营养菌(Methylotropic bacteria)培养物中分离得到，已经发现它广泛存在于革兰氏阴性菌中。以PQQ为辅酶的氧化还原酶称为醌蛋白，如甲基营养菌(Methylobacterium extorquens AM1)的甲醇脱氢酶，乙酸不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)的葡萄糖脱氢酶。PQQ还存在于许多动物组织中，并作为细胞培养实验和人类疾病动物模型的一种必需营养成分、抗氧化剂和氧化还原调节物。由于PQQ具有多种生理功能，而人和动物细胞自身不能合成，故被认为是一种新的B族维生素。
PQQ的生物合成相关基因一般为4～7个(pqqA，B，C，D，E，F，G)。这些基因在染色体上成簇排列，关于它们的功能目前还不很清楚。已经鉴定了几种细菌的PQQ合成相关基因，不同来源的PQQ合成相关基因序列有一定同源性。
在维生素C(Vc)两步发酵生产过程中，从L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸的转化(糖酸转化)系由一种以PQQ为辅酶的山梨糖脱氢酶(SDH)参与完成。
发明内容
本发明的目的是提供一种吡咯喹啉醌合成相关基因及其编码蛋白。
本发明所提供的吡咯喹啉醌合成相关基因，来源于氧化葡糖杆菌Gluconobacteroxydans 1.637，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №1由3137个碱基组成。该序列包含5个PQQ合成相关基因pqqA、pqqB、pqqC、pqqD和pqqE，各基因的开放读框位置分别是pqqA，自序列1的第1-81位碱基(自序列7的5′端第2034-2114位碱基)，编码具有序列2的氨基酸残基序列的PqqA；pqqB，自序列1的第171-1085位碱基(自序列7的5′端第2204-3118位碱基)，编码具有序列3的氨基酸残基序列的PqqB；pqqC，自序列1的第1082-1801位碱基(自序列7的5′端第3115-3834位碱基)，编码具有序列4的氨基酸残基序列的PqqC；pqqD，自序列1的第1798-2073位碱基(自序列7的5′端第3831-4106位碱基)，编码具有序列5的氨基酸残基序列的PqqD；pqqE，自序列1的第2070-3137位碱基(自序列7的5′端第4103-5170位碱基)，编码具有序列6的氨基酸残基序列的PqqE。
pqqA有单独的启动子，pqqB、pqqC、pqqD和pqqE组成类似操纵子的结构，前一个基因的终止子TGA与后一个基因的起始密码子ATG重叠。
本发明的吡咯喹啉醌合成相关基因与Gluconobacter oxydans ATCC9937序列同源性最高，相同性为68％，与其它菌的同源性较低。
含有本发明的吡咯喹啉醌合成相关基因的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
上述吡咯喹啉醌合成相关基因的编码蛋白，是由具有序列表中的序列2，序列3，序列4，序列5和序列6的氨基酸残基序列的五个多肽组成的蛋白质，或将所述五个多肽经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与吡咯喹啉醌合成相关的蛋白质。
序列表中的序列2是由26个氨基酸残基组成的多肽PqqA，序列表中的序列3是由304个氨基酸残基组成的多肽PqqB，序列表中的序列4是由239个氨基酸残基组成的多肽PqqC，序列表中的序列5是由91个氨基酸残基组成的多肽PqqD，序列表中的序列6是由355个氨基酸残基组成的多肽PqqE。
上述吡咯喹啉醌合成相关基因的编码蛋白与对应的Gluconobacter oxydansATCC9937的Pqq合成蛋白同源性最高，氨基酸相同性为PqqA 100％、PqqB 81％、PqqC91％、PqqD 74％、PqqE 86％，平均值为83％。与其它细菌对应蛋白的同源性则相对较低。
可按照常规方法将上述吡咯喹啉醌合成相关基因克隆入表达载体得到重组表达载体，导入宿主细胞，表达得到吡咯喹啉醌合成相关蛋白。
用于构建所述重组表达载体的出发载体可为基因工程领域中的质粒表达载体、病毒表达载体、酵母表达载体等载体，如pGEX系列载体、pET系列载体、Cosmid载体、pPIC9K。宿主选择与上述表达载体相适应的宿主。
本发明的吡咯喹啉醌合成相关基因及其编码蛋白将在研究PQQ生物合成、改良和构建PQQ生产菌株和生产PQQ中起到重要作用。
图1为质粒pMD18-PC-SDH图谱图2为PAGE检测JM109/pMD18-PC-SDH的SDH活性结果图3为DCIP检测JM109/pMD18-PC-SDH的SDH活性结果图4为PAGE检测整合子JM109s/pKD46的SDH活性结果图5为DCIP检测整合子JM109s/pKD46的SDH活性结果图6为DCIP检测JM109/pMD18-C-SDH的SDH活性结果图7为DEAE Sepharose Fast Flow柱层析结果图8为PAGE检测DEAE Sepharose Fast Flow柱层析收集液SDH酶活性结果图9为Q Sepharose High Performance柱层析结果图10为PAGE检测Q Sepharose High Performance柱层析收集液SDH酶活性结果图11为纯化酶的SDS-PAGE检测结果图12为Gluconobacter oxydans 1.637PQQ提取液的PAGE检测图13为Gluconobacter oxydans 1.637染色体DNA部分酶切图谱图14为载体pKC505酶切图谱图15为基因文库中部分重组子的电泳检测结果图16为基因文库的PAGE筛选图17为pqq基因结构示意18为PAGE检测PQQ合成相关基因在大肠杆菌中表达并合成PQQ的情况图19A为提取产物的吸收光谱分析图19B为PQQ标准品的吸收光谱分析具体实施方式
材料1、工具酶及试剂限制性内切酶Sau3AI、HpaI、PstI、EcoRI、核酸Marker、碱性磷酸酶CIAP、T4DNA连接酶等购自TaKaRa公司；麦芽糖购于北京欣经科生物技术有限公司。凝胶回收纯化试剂盒SK192，质粒提取试剂盒SK131购自上海生工公司。PCR纯化试剂盒购自Promega公司。
PQQ购自Sigma公司；噬菌体包装蛋白为Promega公司产品。2，6-二氯吲哚酚(DCIP)、氯化硝基四氮唑兰(NBT)、吩嗪硫酸甲脂(PMS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)为Sigma产品；DEAE Sepharose Fast Flow，Q Sepharose High Performance为安发马西亚生物技术有限公司产品。
2、主要培养基及溶液1)LB培养基(1L)10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母提取物，10.0g NaCl，pH 7.2。
2)HJY培养基(1L)15g山梨糖，3g酵母膏，3g玉米浆，15g蛋白胨，4g尿素，2g葡萄糖，4g CaCO3，5g KH2PO4，0.2g MgSO4·12H2O，pH 6.8。
3)Phage buffer20mmol/L Tris-HCl(pH7.4)，100mmol/L NaCl，10mmol/L MgSO4。
4)CTAB/NaCl溶液(10％CTAB，0.7mmol/L NaCl)在80mL H2O中溶解4.1g NaCl，缓慢加入10g十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)，同时加热搅拌，定容终体积至100mL。
5)洗菌液25mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，0.9％NaCl，5mmol/L MgCl2，1mmol/L PMSF。
6)破菌液25mmol/L含0.5mmol/L PMSF的Tris-HCl(pH8.0)。
7)洗脱液含1mol/L NaCl的25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。
8)TMB溶液3.03g Tris，2.9g马来酸，用80mL去离子水溶解，用NaOH调至pH8.0，水定容至100mL。
9)DCIP检测试剂0.5mmol/L DCIP，0.2g山梨糖，5mg PMS溶于5mL去离子水。
10)糖酸转化反应液200μL TMB缓冲液，200μL 0.625mol/L山梨糖，6mg PMS，10mg NBT溶于600μL去离子水中。
3、主要仪器低温冷冻离心机 2K15C Sigma公司。
恒温循环器 Pharmacia LKB MultiTempII Pharmacia公司。
常温高速离心机 1-13Sigma公司。
恒温振荡摇床 CERTOMATH B.Braun Biotech International公司。
电泳仪 DYIII 3A型北京六一仪器厂。
低温冷冻离心机 J2-MI Centrifuge BECKMAN公司。
凝胶成像仪 Image MasterVDA Pharmacia Biotech公司。
纯化仪 650E，Waters。
分离柱 1.6×14cm，Pharmacia Biotech。
纯水仪 Milli-Q，MILLIPORE。
4、引物引物合成由上海博亚生物技术公司完成。引物P1和P2系根据ptsG和氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol aceyl transferase，CAT)基因(cat)序列设计，可供扩增氯霉素抗性完整基因，扩增片段两翼各包含一段长为40bp的ptsG基因两端的序列(表1中带下划线的碱基)，靠近3’端的17个碱基与cat基因序列同源。引物P3、P4系根据pQE60-SDH序列设计，用于扩增T5启动子控制下的sdh基因。引物P5和P6系根据ptsG基因上下游序列设计，位于同源重组序列外侧，用于重组子检测(表1)。
表1.本发明采用的引物序列
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
基因组DNA的提取、DNA的酶切、连接、转化参照科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》(第三版，萨母布鲁克等编，黄培堂等译)进行。序列测定由上海博亚公司完成。
实施例1、本发明的吡咯喹啉醌合成相关基因的获得一、sdh基因在大肠杆菌染色体整合与表达1、重组质粒pMD18-PC-SDH的构建pQE60-SDH系含普通生酮基古龙酸菌SCB329 sdh基因的质粒，其中pQE60购自Qiagen公司，将
发明者张惟材, 汪建华 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所