专利名称：小金海棠Fe(Ⅱ)转运蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一个来源于苹果属小金海棠的Fe(II)转运蛋白及其编码基因与其在培育耐缺铁植物中的应用。
背景技术：
铁是植物必需的营养元素，它在植物体内参与叶绿素合成、氧化还原反应、电子传递以及呼吸作用等多种生理作用，影响包括氮素代谢、有机酸代谢、碳水化合物代谢及原生质性状等多项生理活动。铁营养问题现已成为果树营养生理研究的重要内容和研究热点之一，并在近年来取得了显著的成就。
全世界约有40％土壤上的植物会发生缺铁失绿症，果树缺铁问题更是十分严重，特别是在干旱半干旱的石灰性土壤上尤为严重。一方面是由于土壤的pH值过高，铁多以不溶态存在，不能被果树根系所吸收；另一方面有时尽管铁的含量较高，但土壤的钙化导致可溶性铁的含量降低，可被植物吸收利用的可溶性铁的含量不到10-10mol/L。缺铁对果树的生长发育、产量和品质均会产生严重的不良影响。
铁转运蛋白如锌铁转运蛋白ZIP家族中Irt基因的发现，很好地解释了铁吸收转运途径中的重要问题。Irt基因是从植物中分离出来的第一个Fe(II)转运蛋白基因，该基因编码的Fe(II)转运蛋白作为一种质膜蛋白，在将膜外的Fe(II)转运进胞质中起到关键性的作用。
作为机制I型植物吸收铁素的关键成分之一，Irt基因与植物的抗缺铁能力有极大关系。研究表明，Irt基因在植物根部表达且受缺铁胁迫的诱导，另外Irt基因也可在其它一些金属离子如Cd2+、Co2+、Mn2+、Zn2+等的转运中起作用。Irt1作为铁转运蛋白首先在拟南芥中被发现，转运底物是二价铁离子，随后在拟南芥中又相继发现了Irt2、Irt3两个铁转运蛋白；近来，IRT家族又增加了许多新成员，如人和小鼠的ZIrt1基因、西红柿LeIrt1和LeIrt2基因、水稻OsIrt1基因。
小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)是第一个由中国人命名的苹果属植物品种。该品种不仅具有耐盐、耐旱、耐热、耐涝、抗寒等众多抗逆境特性，还对白粉病和苹果潜隐病毒有一定的抗性，用其作砧木嫁接不仅亲合性好，而且具有矮化效应和高度的无融合生殖特性，在苹果的育种及繁殖中具有重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一个小金海棠Fe(II)转运蛋白及其编码基因。
本发明所提供的小金海棠Fe(II)转运蛋白，名称为MxIrt1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有Fe(II)转运作用的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №1由364个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第1位-第30位氨基酸残基为信号肽序列；自氨基端第184位-第192位氨基酸残基序列为ZIP家族的功能保守区；自氨基端第54位-第76位、第91位-第113位、第129位-第151位、第209位-第231位、第276位-第292位、第307位-第329位和第339位-第361位氨基酸残基序列为跨膜螺旋区，其中，自氨基端第184位-第192位氨基酸残基序列为第3、4个跨膜螺旋间富含组氨酸的区域。
上述小金海棠Fe(II)转运蛋白编码基因(MxIrt1)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的SEQ ID №2由1398个碱基组成，其编码序列为自5’端第51-第1145位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第1-第90位碱基为信号肽的编码序列，编码30个氨基酸；自5’端第550-第576位碱基为ZIP家族功能保守区的编码序列；自5’端第160-第228位、第271-第339位、第385-第453位、第625-第693位、第826-第876位、第919-第987位、第1015-第1083位碱基为跨膜螺旋区的编码序列，其中，自5’端第550-第576位碱基为第3、4个跨膜螺旋间富含组氨酸区域的编码序列；自5’端第1146-第1398位碱基为3’端非翻译区。
含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
扩增MxIrt1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
利用植物表达载体，将本发明的小金海棠Fe(II)转运蛋白MxIrt1的编码基因导入植物细胞，可获得对缺铁胁迫耐受力增强的的转基因细胞系及转基因植株。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。本发明的MxIrt1基因的3’端非翻译区域亦可被用于在植物中表达。
使用MxIrt1构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
携带有本发明MxIrt1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是拟南芥、番茄、烟草、草坪草、苹果等双子叶植物。
本发明的小金海棠Fe(II)转运蛋白在植物抗缺铁机制中起主要作用，MxIrt1对培育耐缺铁植物品种将具有重要意义。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1为Southern杂交分析MxIrt1在小金海棠基因组中组成的情况图2A为MxIrt1在缺铁诱导条件下表达状态的Northern检测结果图2B为提取的四种样品RNA的琼脂糖凝胶检测结果图3为PCR法检测MxIrt1转基因烟草植株的结果图4为MxIrt1转基因烟草植株在缺铁条件下存活的植株具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生物工程公司合成。
实施例1、MxIrt1基因的克隆植物材料将苹果砧木小金海棠植株用完全营养液(每升营养液中各营养元素含量为N 73mg，P 31mg，K 78.2mg，Ca 70.47mg，Mg 20.8mg，S 16.7mg，B 0.11mg，Mn 0.5mg，Mo 0.5mg，Zn 0.3mg，Cu 0.25mg，Na 0.54mg，Cl 0.5mg，Fe 1.311mg，pH 6.0)进行培养。培养过程中，保证定时通气，光照时间为16h/8h(光/暗)，光强4001x，室温保持24-28℃，相对湿度85％。待幼苗长出12-14片真叶时对其进行缺铁胁迫处理，方法为将幼苗置于不含铁元素的培养液中继续培养，营养液中其它成分与完全营养液相同。
一、缺铁胁迫下苹果砧木小金海棠根系cDNA文库的构建将用上述方法培养的小金海棠植株白色新生根的根尖部分于液氮中速冻、研磨，用SDS-苯酚法提取总RNA，再经mRNA纯化试剂盒(Clontech公司)处理得到mRNA；以此mRNA为模板，在引物P15’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’和引物P25’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’的引导下，使用SMARTTMcDNA合成试剂盒(Clontech公司)并参照试剂盒说明书合成其双链cDNA；将得到的双链cDNA与载体λTripIEx2(Promega公司)16℃连接过夜，得到含有双链cDNA的重组载体；最后用λ噬菌体包装蛋白(Promega公司)对重组载体进行体外包装，得到经缺铁胁迫处理的苹果砧木小金海棠根系的cDNA文库。经检测该cDNA文库的滴度为1.298×106，大小为1.122×106，插入片断大小平均为1kb，重组率大于99％，文库扩增后滴度为1.652×1010。
二、小金海棠根系cDNA文库中编码Fe(II)转运蛋白基因片段的筛选根据Genbank中公布的Fe(II)转运蛋白基因家族的功能保守区域设计一对常规PCR引物，引物序列如下引物P35’-CAGCTTCTCCGTTATCGTGT-3’引物P45’-AACTTCAAGCCCATTTAGCC-3’以小金海棠缺铁胁迫处理的根系cDNA文库的λDNA为模板，在引物P3和引物P4的引导下进行PCR扩增，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，表明扩增出了约490bp的特异性条带，对该PCR扩增产物进行测序并将测序结果进行序列比对，表明该cDNA片段与番茄和豌豆的Fe(II)转运蛋白基因分别具有86％和84％的氨基酸序列同源性，从而证明该PCR扩增产物是Fe(II)转运蛋白家族基因片段。
三、利用RACE法克隆小金海棠根系中Fe(II)转运蛋白cDNA全长序列以步骤二筛选出的长度为490bp的cDNA片断为模板，分别进行3’和5’RACE反应，引物序列如下引物P5(3’RACE引物)5’-CAGCTTCTCCGTTATCGTGT-3’引物P6(5’RACE引物)5’-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC-3’结果3’RACE扩增出了一条长度为758bp的特异性条带，测序结果表明该基因片段含有终止密码子、AATAAA加尾信号和poly(A)尾巴，证明是完整的3’末端序列，同源性比较结果表明该扩增产物是Fe(II)转运蛋白家族基因片段。5’RACE扩增出了一条长度为1135bp的特异性条带。根据3’和5’RACE测序结果拼读出一条完整的cDNA序列，该序列具有序列表中SEQ ID №2的多核苷酸序列，由1398个碱基组成，其编码序列为自5’端第51-第1145位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质；自5’端第1-第90位碱基为信号肽的编码序列，编码30个氨基酸；自5’端第550-第576位碱基为ZIP家族功能保守区的编码序列；自5’端第160-第228位、第271-第339位、第385-第453位、第625-第693位、第826-第876位、第919-第987位、第1015-第1083位碱基为跨膜螺旋区的编码序列，其中，自5’端第550-第576位碱基为第3、4个跨膜螺旋间富含组氨酸区域的编码序列；自5’端第1146-第1398位碱基为3’端非翻译区。证明克隆到了小金海棠Fe(II)转运蛋白基因，将其命名为MxIrt1。
实施例2、MxIrt1在小金海棠基因组中的分析提取小金海棠基因组总DNA，分别用EcoRI、HindIII和XhoI三种限制性内切酶对其进行消化。然后将用不同酶消化的DNA分别转到Hybond-N+尼龙膜(GIBCO公司)上，再以MxIrt1部分序列作探针，该探针序列为序列表中的SEQ ID №3，用a-P32-dCTP标记后进行Southern杂交分析。在高严谨度条件下洗膜(65℃，0.1×SSC，0.1％SDS)，结果均只得到一条杂交条带，如图1所示，图中E代表EcoRI酶切产物、H代表HindIII酶切产物、X代表XhoI酶切产物，表明MxIrt1在小金海棠基因组中以低拷贝形式存在。
实施例3、小金海棠根系MxIrt1在缺铁胁迫下的表达特征对在完全营养液中生长4-6周的小金海棠，在缺铁条件下分别处理1、3、6天，分别剪取经不同时间缺铁处理的白色初生根经液氮速冻，提取RNA作Northern分析。Northern杂交反应中以正常供铁条件下的小金海棠白色初生根RNA为对照。结果如图2A所示，CK表示未经缺铁处理的对照，1、2、3分别表示经缺铁胁迫1、3、6天的样品；图2B为提取的上述四种样品RNA的琼脂糖凝胶检测结果。表明MxIrt1的转录受到缺铁胁迫的诱导。
实施例4、MxIrt1基因的烟草转化及转基因植株的生理分析实验一、MxIrt1基因的烟草转化及转基因植株的检测
1、植物表达载体的构建及农杆菌的转化把MxIrt1基因用Xba I和Sac I限制性内切酶酶切后与用相同酶酶切的载体pBI121连接得到植物表达载体，命名为pBMxIrt1；将pBMxIrt1用CaCl2法转化大肠杆菌DH5a，提质粒进行酶切鉴定，挑出阳性克隆测序，表明获得了整合有植物表达载体pBMxIrt1的重组子，将其转化到农杆菌EHA105中。
2、烟草转化1)烟草的培养将烟草种子均匀播在营养土与蛭石混合比例为1∶1的土壤中，约30d后，待植物长出约10-15片真叶，高约40cm，可用于下述转化。
2)农杆菌的培养挑取转化有pBMxIrtl的农杆菌单菌落接种于3mL YEB(Kan 50mg/L，利福平50mg/L)液体培养基中，28℃250rpm培养30小时；按1∶400转接入200mL新鲜的YEB(Kan50mg/L，利福平50mg/L)液体培养基中，28℃250rpm培养约14小时，测OD600≈1.5；在4℃7500rpm下离心10min收集菌体；重悬菌体于二倍体积(400mL)的渗透液(1/2 MS盐+5％蔗糖，pH5.7，121℃灭菌15min；用之前加入终浓度为0.044u M6-BA，VB61mg/L，VB110mg/L，SILWET 0.02％)。
3)转化烟草剪取面积为20-25cm2，较靠近植株顶部，叶面较平整，肥厚，绒毛较少的烟草叶片3-5片，将其置于一个直径为10cm的平皿中，倒入次氯酸钠溶液(有效氯浓度为2.0％)，不断用镊子轻轻将叶片压入次氯酸钠溶液，浸泡20分钟；然后将叶片用镊子夹入盛放无菌水的平皿中漂洗约4-6次。用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基，在28℃下暗培养；三天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基(配方为MS+3mg/L+6-BA+0.2mg/L+NAA+Kan 100μg/mL+cef250mg/L)中进行培养；待抗性芽生长至2-3cm高时，切下小芽转入生根培养基(配方为MS基本培养基+Kan 100mg/L+cef 250mg/L)中诱导生根。
3、PCR检测转基因烟草转基因烟草基因组DNA的提取，包括以下步骤1)取0.1-0.2g转基因烟草植物叶片，在液氮中研磨，转移至1.5mL离心管中。
2)加入0.7mL CTAB(含Tris 100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，CTAB 2％，巯基乙醇0.1％)，60℃水浴30分钟，每隔10分钟，颠倒一次。
3)加0.7mL酚氯仿(1∶1)，颠倒几次，10000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管，加等体积的氯仿异戊醇(24∶1)，混匀，10000rpm离心5分钟。转移上清至一新的离心管。
4)加等体积的异丙醇，颠倒混匀，10000rpm离心10分钟，除去上清，用70％乙醇洗一次，抽干，将DNA沉淀溶于50μL无菌水中，用于PCR检测。
根据pBI121中35S启动子序列和MxIrt1的基因序列设计引物，引物序列如下引物75’-GGAAGGTGGCTCCTACAAATGC-3’引物85’-GACATGGCATATGAATCAGGC-3’以转基因烟草的基因组DNA为模板，在引物7和引物8的引导下，进行PCR反应，PCR反应体系为(20μL)转基因植株DNA 1μL(20ng-50ng)，10×PCR缓冲液2μL，MgCl2(2.5mM)2μL，Taq酶0.2μL，dNTP(2.5mM)2μL，引物7和引物8各10μM，加无菌水至20μL。PCR反应条件为先94℃5分钟；再94℃45秒，60℃45秒，72℃60秒，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。反应结束后对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，泳道1为DNA ladder，泳道2为阴性对照烟草PCR结果，泳道3为转基因烟草PCR结果，结果表明转化有MxIrt1基因的阳性植株可扩增出610bp大小的目的条带(图中箭头所指)。
二、MxIrt1转基因烟草植株的抗缺铁实验把MxIrt1转基因植株与未转基因植株置于MS培养基中生长2-3周，在低铁MS(正常供铁量的1/10)培养基中处理14天，结果MxIrt1转基因植株的存活率为90％，叶片多数仍能保持绿色；未转基因的植株存活率为20％，存活植株叶片枯黄(图4)，表明MxIrt1基因能够明显提高植株的抗缺铁能力。
序列表<160>3<210>1<211>364<212>PRT<213>苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)<400>1Met Ala Ala Thr Lys Ser His Leu Lys Leu Ile Pro Ile Ile Phe Phe1 5 10 15Ile Leu Ile Ile Ser Ile Leu Thr Pro Lys Ala Tyr Ser Gln Ser Glu20 25 30Glu Asp Glu Cys Ser Thr Glu Asn Thr Ser Ser Cys Asn Asp Lys Ser35 40 45Gly Ala Val Pro Leu Lys Ile Ile Ala Leu Val Ser Ile Leu Val Thr50 55 60Ser Met Ile Gly Val Ser Phe Pro Leu Val Thr Arg Ser Ile Pro Ala65 70 75 80Phe His Pro Asp Arg Asn Leu Phe Val Ile Val Lys Cys Phe Ala Gly85 90 95Gly Ile Ile Leu Ala Thr Gly Phe Met His Val Leu Pro Asp Ser Tyr100 105 110Ala Met Leu Gln Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Pro Trp His Lys Phe115 120 125Pro Phe Ser Gly Phe Val Ala Met Leu Ser Ala Ile Leu Thr Leu Met130 135 140Val Asp Ser Met Ala Thr Ser Ile Tyr Ser Arg Arg Cys Arg Thr Gly145 150 155 160Val Ile Pro Asp Lys Gly Glu Thr Pro Ala Leu Glu Val Asp Gln Glu165 170 175
Met Ala Val Val Gly Ala Gly His Gly His Phe His Ala His Asn His180 185 190Val Val Asp Lys Gly Glu Asn Gly Asp Ser Gln Gln Leu Ser Arg Tyr195 200 205Arg Val Val Ala Met Val Leu Glu Leu Gly Ile Ile Val His Ser Val210 215 220Val Ile Gly Leu Ser Leu Gly Ala Ser Asn Asn Thr Cys Thr Ile Lys225 230 235 240Gly Leu Val Ala Ala Leu Cys Phe His Gln Met Phe Glu Gly Met Gly245 250 255Leu Gly Gly Cys Ile Leu Gln Ala Glu Tyr Lys Phe Met Lys Lys Ala260 265 270Ile Met Val Phe Phe Phe Ser Thr Thr Thr Pro Phe Gly Ile Ala Ile275 280 285Gly Met Ala Met Thr Lys Ser Tyr Lys Glu Asn Ser Pro Lys Ser Leu290 295 300Ile Ala Val Gly Leu Leu Asn Ala Ser Ser Ala Gly Leu Leu Ile Tyr305 310 315 320Met Ala Leu Val Asp Leu Leu Ala Ala Asp Phe Met Gly Pro Lys Leu325 330 335Gln Arg Ser Ile Lys Leu Gln Ile Lys Ser Tyr Ile Ala Val Leu Leu340 345 350Gly Ala Gly Gly Met Ser Val Leu Ala Lys Trp Ala355 360<210>2<211>1398<212>DNA<213>苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)<400>2cacggccggg ggatagtacc aataatagct tgagctaaaa atcagggtca atggctgcca60
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权利要求
1.一个小金海棠Fe(II)转运蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有Fe(II)转运作用的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述序列表中SEQ ID №1的自氨基端第184位-192位氨基酸残基序列为ZIP家族的功能保守区。
3.编码权利要求1或2所述小金海棠Fe(II)转运蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于它具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.含有权利要求3或4所述小金海棠Fe(II)转运蛋白基因的植物表达载体。
6.含有权利要求3或4所述小金海棠Fe(II)转运蛋白基因的转基因细胞系。
7.含有权利要求3或4所述小金海棠Fe(II)转运蛋白基因的宿主菌。
8.扩增权利要求3或4所述基因中任一片段的引物。
9.权利要求1或2所述的小金海棠Fe(II)转运蛋白在培育耐缺铁植物中的应用。
10.权利要求3或4所述的小金海棠Fe(II)转运蛋白基因在培育耐缺铁植物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个小金海棠Fe(II)转运蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一个来源于苹果属小金海棠的Fe(II)转运蛋白及其编码基因与其在培育耐缺铁植物中的应用。该小金海棠Fe(II)转运蛋白， 是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有Fe(II)转运作用的蛋白质。本发明的小金海棠Fe(II)转运蛋白在植物抗缺铁机制中起主要作用，MxIrt1对培育耐缺铁植物品种将具有重要意义。
文档编号C12N15/29GK1680437SQ200510005039
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月31日 优先权日2005年1月31日
发明者韩振海, 许雪峰, 戚金亮, 曹冬梅, 王忆 申请人:中国农业大学